KR20100016165A - 제초제-저항성 브라시카 식물 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 AHAS-억제성 제초제에 대한 내성 수준이 개선된 트랜스제닉 또는 비-트랜스제닉 식물을 제공한다. 본 발명은 아세토히드록시산 신타제 (AHAS: acetohydroxyacid synthase) 대형 서브유닛의 돌연변이체를 코딩하는 핵산, 발현 벡터, 단일, 이중 또는 그 이상의 돌연변이를 함유하는 AHASL 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물, 1개, 2개 또는 그 이상의 AHASL 서브유닛 단일 돌연변이체 폴리펩티드를 포함하는 식물, 이의 제조 및 사용 방법, 및 잡초의 제어 방법을 또한 제공한다.
아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL), 제초제 저항성 AHASL 단백질, 브라시카 식물

Description

제초제-저항성 브라시카 식물 및 사용 방법{HERBICIDE-RESISTANT BRASSICA PLANTS AND METHODS OF USE}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2007년 4월 4일에 출원된 미국 가출원 번호 60/910,008을 우선권으로 청구하고, 이에 의해 상기 특허의 전체 내용은 거명에 의해 본원에 포함된다.
본 발명은 제초제-저항성 브라시카(Brassica) 식물, 및 야생형 및 이미다졸리논-저항성 브라시카 아세토히드록시산 신타제(acetohydroxyacid synthase) 대형 서브유닛 단백질을 코딩하는 신규 폴리뉴클레오티드 서열, 종자, 및 이같은 식물의 사용 방법에 관한 것이다.
아세토히드록시산 신타제 (AHAS; EC 4.1.3.18, 아세토락테이트 신타제 또는 ALS로 또한 공지됨)는 분지쇄 아미노산인 발린, 류신 및 이소류신의 생화학적 합성을 촉매하는 최초의 효소이다 ([Singh (1999) "Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine", Plant Amino Acid, Singh, B.K., ed., Marcel Dekker Inc. New York, New York, pp. 227-247]). AHAS는 술포닐우레아 ([Tan et al. (2005) Pest Manag. Sci. 61:246-57]; [Mallory-Smith and Retzinger (2003) Weed Technology 17:620-626]; [LaRossa and Falco (1984) Trends Biotechnol. 2:158-161]), 이미다졸리논 ([Shaner et al. (1984) Plant Physiol. 76:545-546]), 트리아졸로피리미딘 ([Subramanian and Gerwick (1989) "Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines", Biocatalysis in Agricultural Biotechnology, Whitaker, J.R. and Sonnet, P.E.. eds., ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington, D.C., pp. 277-288], [Tan et al. (2005) Pest Manag. Sci. 61:246-57]; [Mallory-Smith and Retzinger (2003) Weed Technology 17:620-626]), 술포닐아미노-카르보닐트리아졸리논 ([Tan et al. (2005) Pest Manag. Sci. 61:246-57]; [Mallory-Smith and Retzinger (2003) Weed Technology 17:620-626])이 포함되는 5가지의 구조적으로 다른 제초제 패밀리들의 작용 부위이다. 이미다졸리논 및 술포닐우레안 제초제는 매우 낮은 적용률에서의 유효성 및 동물에서의 상대적인 무독성으로 인해 현대 농업에서 광범위하게 사용된다. AHAS 활성을 억제함으로써, 이러한 패밀리의 제초제들은 다수의 잡초 종을 포함하는 감수성 식물들의 추가적인 성장 및 발달을 방지한다. 시판되는 이미다졸리논 제초제의 여러 예는 PURSUIT® (이마제타피르), SCEPTER® (이마자퀸) 및 ARSENAL® (이마자피르)이다. 술포닐우레안 제초제의 예는 클로르술푸론, 메트술푸론 메틸, 술포메투론 메틸, 클로리무론 에틸, 티펜술푸론 메틸, 트리베누론 메틸, 벤술푸론 메틸, 니코술푸론, 에타메트술푸론 메틸, 림술푸론, 트리플루술푸론 메틸, 트리아술푸론, 프리미술푸론 메틸, 시노술푸론, 아미도술푸론, 플루자술푸론, 이마조술푸론, 피라조술푸론 에틸 및 할로술푸론이다.
높은 유효성 및 낮은 독성으로 인해, 이미다졸리논 제초제가 넓은 면적의 초목의 위쪽에서 분무하는 것에 의한 적용에 대해 선호된다. 광범위한 초목의 위쪽에서 제초제를 분무하는 능력은 재배지 조성 및 유지와 관련된 비용을 감소시키고, 이같은 화학제품을 사용하기 전의 장소 준비에 대한 요구를 감소시킨다. 원하는 내성 종의 위쪽에서의 분무는 경쟁성 종의 부재로 인한 원하는 종의 최대 수량성(yield potential)을 달성하는 능력을 또한 초래한다. 그러나, 이같은 분무 기술을 사용하는 능력은 분무되는 영역에 원하는 초목의 이미다졸리논-저항성 종이 존재하는 것에 좌우된다.
주요 농작물 중에서, 일부 콩과 종 예컨대 대두는 제초제 화합물을 신속하게 대사하는 능력으로 인해 이미다졸리논 제초제에 대해 천연적으로 저항성이다 ([Shaner and Robinson (1985) Weed Sci. 33:469-471]). 옥수수 ([Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100:882886]) 및 벼 ([Barrett et al. (1989) Crop Safeners for Herbicides, Academic Press, New York, pp. 195-220])과 같은 기타 작물은 이미다졸리논 제초제에 대해 다소 감수성이다. 이미다졸리논 제초제에 대한 차별적인 감도는 특정 제초제의 화학적 성질 및 각각의 식물에서의 독성 형태에서 비-독성 형태로의 화합물의 차별적인 대사에 좌우된다 ([Shaner et al. (1984) Plant Physiol. 76:545-546]; [Brown et al., (1987) Pestic. Biochem. Physiol. 27:24-29]). 식물의 또다른 생리학적 차이 예컨대 흡수 및 전위 또한 감도에서 중요한 역할을 한다 ([Shaner and Robinson (1985) Weed Sci. 33:469-471]).
제아 메이스(Zea mays), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 브 라시카 나푸스(Brassica napus) (즉, 캐놀라) 글리시네 막스(Glycine max), 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum), 및 오리자 사티바(Oryza sativa)에서 종자, 소포자, 꽃가루 및 캘러스(callus) 돌연변이유발을 사용하여 이미다졸리논, 술포닐우레아 및 트리아졸로피리미딘에 저항성인 식물이 성공적으로 생산되었다 ([Sebastian et al. (1989) Crop Sci. 29:1403-1408]; [Swanson et al., 1989 Theor. Appl. Genet. 78:525-530]; [Newhouse et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 83:65-70]; [Sathasivan et al. (1991) Plant Physiol. 97:1044-1050]; [Mourand et al. (1993) J. Heredity 84:91-96]; 미국 특허 번호 5,545,822). 모든 경우에, 부분적으로 우성인 단일한 핵 유전자가 저항성을 부여하였다. 트리티쿰 아에스티붐(Triticum aestivum L.)의 피델(Fidel) 재배종의 종자 돌연변이유발 후에 4가지 이미다졸리논 저항성 밀 식물이 또한 기존에 단리되었다 ([Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100:882-886]). 부분적으로 우성인 단일 유전자가 저항성을 부여하였음이 유전 연구에서 확인되었다. 대립유전자 연구를 기초로, 저자들은 4가지의 확인된 계통에서의 돌연변이가 동일한 유전자좌에 위치한 것으로 결론지었다. 피델 재배종 저항성 유전자들 중 하나가 FS-4로 지정되었다 ([Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100:882-886]).
AHAS-억제제 복합체의 3차원 입체형상의 컴퓨터를 기초로 하는 모델링에서, 제안된 억제제 결합 주머니 내의 몇몇 아미노산이 유발 돌연변이가 이미다졸리논에 대한 선택적인 저항성을 부여할 것 같은 부위로 예측되었다 ([Ott et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:359-368]). AHAS 효소의 제안된 결합 부위 내에 약간의 이러한 합리적으로 디자인된 돌연변이들이 있도록 생산된 밀 식물들은 단일 클래스의 제초제에 대한 특이적 저항성을 실제로 나타냈다 ([Ott et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:359-368]).
이미다졸리논 제초제에 대한 식물 저항성이 다수의 특허에서 또한 보고되었다. 미국 특허 번호 4,761,373, 5,331,107, 5,304,732, 6,211,438, 6,211,439 및 6,222,100에는 식물에서 제초제 저항성을 도출하기 위한 변경된 AHAS 유전자의 용도가 일반적으로 기술되어 있고, 특정 이미다졸리논 저항성 옥수수 계통이 특히 기술되어 있다. 미국 특허 번호 5,013,659에는 하나 이상의 보존 영역 내의 적어도 1개의 아미노산에서의 돌연변이로 인해 제초제 저항성을 나타내는 식물이 개시되어 있다. 상기 특허에 기술된 돌연변이는 이미다졸리논 및 술포닐우레아에 대한 교차-저항성 또는 술포닐우레아-특이적 저항성을 코딩하지만, 이미다졸리논-특이적 저항성은 기술되어 있지 않다. 미국 특허 번호 5,731,180 및 미국 특허 번호 5,767,361에는 이미다졸리논-특이적 저항성을 초래하는 야생형 단자엽식물 AHAS 아미노산 서열에서의 단일 아미노산 치환이 있는 단리된 유전자가 논의되어 있다. 또한, 돌연변이 육종에 의해, 그리고 또한 또다른 재배에 의해 생산된 벼 식물들의 풀(pool)로부터의 제초제 저항성 식물의 선별에 의해, AHAS를 방해하는 제초제에 저항성인 벼 식물이 개발되었다. 미국 특허 번호 5,545,822, 5,736,629, 5,773,703, 5,773,704, 5,952,553 및 6,274,796 참조.
식물에서, 시험된 모든 다른 생물에서와 같이, AHAS 효소는 2개의 서브유닛으로 구성된다: 대형 서브유닛 (촉매 역할) 및 소형 서브유닛 (조절 역할) ([Duggleby and Pang (2000) J. Biochem. Mol. Biol. 33:1-36]). AHAS 대형 서브유닛 (본원에서 AHASL로 또한 지칭됨)은 아라비돕시스(Arabidopsis) 및 벼의 경우에서와 같이 단일 유전자에 의해 코딩될 수 있거나, 옥수수, 캐놀라 및 목화에서와 같이 다중 유전자 패밀리 구성원들에 의해 코딩될 수 있다. 대형 서브유닛에서의 특이적인 단일-뉴클레오티드 치환이 하나 이상의 제초제 클래스에 대한 어느 정도의 무감응을 효소에 부여한다 ([Chang and Duggleby (1998) Biochem J. 333:765-777]).
예를 들어, 제빵용 밀인 트리티쿰 아에스티붐은 3개의 상동성 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 유전자를 함유한다. 각각의 유전자는 3개의 유전자 각각에서의 돌연변이체로부터의 제초제 응답 및 생화학적 데이터를 기초로 상당한 발현을 나타낸다 ([Ascenzi et al. (2003) International Society of Plant Molecular Biologists Congress, Barcelona, Spain, Ref. No. S10-17]). 3개의 유전자 모두의 코딩 서열은 뉴클레오티드 수준에서 광범위한 상동성을 공유한다 (WO 03/014357). 트리티쿰 아에스티붐의 여러 품종으로부터의 AHASL 유전자의 서열분석을 통해, 대부분의 IMI-내성 (이미다졸리논-내성) 계통에서의 제초제 내성의 분자적인 기초는 돌연변이 Ser653(At)Asn인 것으로 발견되었고, 이는 아라비돕시스 탈리아나에서의 아미노산 653의 세린과 등가인 위치에서 세린이 아스파라긴으로 치환되는 것을 가리킨다 (WO 03/014357). 이러한 돌연변이는 AHASL 단백질을 코딩하는 DNA 서열에서의 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)으로 인한 것이다.
다중 AHASL 유전자들이 쌍자엽 식물 종에서 발생하는 것으로 또한 공지되어 있다. 최근, [Kolkman et al. (2004) Theor. Appl. Genet. 109:1147-1159]에서 제초제-저항성 및 야생형 유전자형의 해바라기 (헬리안투스 안누스(Helianthus annuus L.))로부터의 3개의 AHASL 유전자 (AHASL1, AHASL2, 및 AHASL3)의 확인, 클로닝 및 서열분석이 보고되었다. Kolkman 등은 제초제-저항성이 AHASL1 단백질에서의 Pro197Leu (아라비돕시스 AHASL 아미노산 위치 명명법 사용) 치환 또는 Ala205Val 치환으로 인한 것이었고, 각각의 이러한 치환이 이미다졸리논 및 술포닐우레안 제초제 양쪽 모두에 대한 저항성을 제공하였음을 보고하였다.
높은 유효성 및 낮은 독성이 제공되어, 이미다졸리논 제초제가 농업 용도에 선호된다. 그러나, 특정 작물 생산 시스템에서 이미다졸리논 제초제를 사용하는 능력은 당해 작물의 이미다졸리논-저항성 품종의 입수가능성에 좌우된다. 사용하는 이미다졸리논 및 술포닐우레안 제초제의 유형 및 비율 면에서 농부에게 더 큰 유연성을 부여하기 위해, 더 강력한 제초제 내성이 종종 요망된다. 또한, 제초제 내성 품종을 개발하는 식물 육종자는 품종을 개발하기 위해 사용하는 배 형질 배경에서의 더 큰 유연성을 허용하는, 더 큰 제초제 내성을 제공하는 돌연변이를 다루기를 원한다. 이같은 이미다졸리논-저항성 품종을 생산하기 위해, 식물 육종자들은 추가적인 육종 계통, 바람직하게는 이미다졸리논-저항성이 증가된 계통을 개발할 필요가 있다. 따라서, 작물 식물의 추가적인 이미다졸리논-저항성 육종 계통 및 품종, 뿐만 아니라 이미다졸리논-저항성 육종 계통 및 품종의 생산 및 사용을 위한 방법 및 조성물이 요구된다.
발명의 개요
본 발명은 야생형 브라시카 식물에 비교했을 때 제초제에 대한 저항성이 증가된 브라시카 식물을 제공한다. 특히, 본 발명의 브라시카 식물은 야생형 브라시카 식물에 비교했을 때 AHAS 효소의 활성을 방해하는 하나 이상의 제초제에 대한 저항성이 증가되었다. 본 발명은 제초제 저항성 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 폴리펩티드를 코딩하는 AHASL 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피를 게놈 내에 포함하고, 이때 AHASL 폴리펩티드는 a) 서열 1의 위치 653, 또는 서열 2의 위치 638, 또는 서열 3의 위치 635에 대응하는 위치에 아스파라긴이 있는 폴리펩티드; b) 서열 1의 위치 122, 또는 서열 4의 위치 107, 또는 서열 5의 위치 104에 대응하는 위치에 트레오닌이 있는 폴리펩티드; 및 c) 서열 1의 위치 574, 또는 서열 6의 위치 557에 대응하는 위치에 류신이 있는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 브라시카 식물을 제공한다.
본 발명은 브라시카 준세아(B. juncea) 식물에서 상이한 게놈들 상의 AHAS 돌연변이들을 조합할 때 달성되는 강화된 제초제-내성을 또한 제공한다. 한 예에서, bR (AHAS1) 돌연변이 (브라시카 준세아의 B 게놈 상에 있음)가 유전자이입된 PM2 (AHAS3) 돌연변이 (브라시카 준세아 내로 유전자이입된 브라시카 나푸스(Brassica napus)의 A 게놈 상에 있음)와 조합된 식물이 제공된다. 생성된 제초제 내성이 상당히 강화되어, PM1이 PM2와 조합된 현재 시판되는 제품에서 관찰되는 것에 비해 놀라운 상승작용성 효과가 있다. 또다른 예에서, PM1 및 PM2 돌연변이가 조합된 식물과 비교하여 상승작용성 수준의 제초제 내성을 또한 제공하는, aR (AHAS1) 돌연변이 (브라시카 준세아의 A 게놈 상에 있음)가 A107T 돌연변이 (브라 시카 준세아의 B 게놈 상에 있음)와 조합된 브라시카 준세아 식물이 제공된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 J05Z-07801로 지정된 브라시카 계통으로부터 유래된 제초제-저항성 이중 돌연변이체 브라시카 식물을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 J04E-0139로 지정된 브라시카 계통으로부터 유래된 제초제-저항성 브라시카 식물을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 J04E-0130으로 지정된 브라시카 계통으로부터 유래된 제초제-저항성 브라시카 식물을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 J04E-0122로 지정된 브라시카 계통으로부터 유래된 제초제-저항성 브라시카 식물을 제공한다.
본 발명의 제초제-저항성 브라시카 식물은 본 발명의 제초제-저항성 AHASL 단백질을 코딩하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 카피를 함유할 수 있다. 본 발명의 제초제-저항성 브라시카 식물은 단일, 이중 또는 그 이상의 돌연변이를 함유하는 제초제-저항성 AHASL 단백질을 코딩하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 본 발명의 브라시카 식물은 본 발명의 제초제-저항성 AHASL 단백질을 코딩하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피를 포함하는 종자 및 자손 식물을 또한 포함한다. 단일, 이중 또는 그 이상의 돌연변이를 함유하는 AHASL 폴리펩티드를 코딩하는 하나의 폴리뉴클레오티드, 또는 AHASL 단일 돌연변이체 폴리펩티드를 코딩하는 2개 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 종자 또는 이로부터 생겨난 자손 식물은 AHAS-억제성 제초제, 예를 들어 이미다졸리논 제초제 또는 술포닐우레안 제초제에 대해 단일 식물 내의 AHASL 단일 돌연변이체 폴리펩티드들로부터 예측되는 것보다 예상외로 더 높은 수준의 내성을 나타낸다. 식물 및 이의 자손은 제초제 내성의 부가적인 효과보다는 상승작용성 효과를 나타냄으로써, 다중 돌연변이를 포함하는 식물 및 이의 자손에서의 제초제 내성의 수준이 AHASL 단일 돌연변이체 단백질을 포함하는 식물의 제초제 내성보다 더 크다.
본 발명은 본 발명의 비-트랜스제닉(non-transgenic) 및 트랜스제닉 제초제-저항성 식물의 부근에 있는 잡초를 제어하는 방법을 제공한다. 이같은 식물에는, 예를 들어, 상기 기술된 제초제-저항성 브라시카 식물 및 본 발명의 제초제-저항성 AHASL 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자로 형질전환된 식물이 포함된다. 형질전환된 식물은 식물 세포에서 유전자 발현을 구동시키는 프로모터를 포함하는 하나 이상의 발현 카세트를 게놈 내에 포함하고, 이때 프로모터는 본 발명의 AHASL 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 상기 방법은 유효량의 제초제를 잡초, 및 야생형 또는 형질전환되지 않은 식물에 비교했을 때 하나 이상의 제초제, 특히 이미다졸리논 또는 술포닐우레안 제초제에 대한 저항성이 증가된 제초제-저항성 식물에 적용하는 단계를 포함한다. 본 발명은 식물에서의 AHAS 활성을 증가시키는 방법, 제초제-저항성 식물을 제조하는 방법, 및 제초제-내성 식물에서 제초제-내성을 강화시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 방법은 식물 세포를 식물 세포에서의 발현을 구동시키는 프로모터에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물로 형질전환시키는 단계 및 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환된 식물을 재생시키는 단계를 포함한다. 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 제초제-저항성 AHASL 단백질을 코딩하는 뉴클레오티 드 서열들로부터 선택된다. 또다른 실시양태에서, 상기 방법은 본 발명의 제초제-저항성 식물과 또다른 식물의 교차 수분을 수반하는 통상적인 식물 육종을 수반하고, 본 발명의 제초제-저항성 식물인 어버이 식물의 제초제-저항성 특성을 포함하는 자손 식물을 선별하는 것을 추가로 수반할 수 있다.
본 발명은 브라시카 AHASL 단백질에 대한 단리된 폴리뉴클레오티드 분자 및 단리된 폴리펩티드를 추가로 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자는 본 발명의 제초제-저항성 AHASL 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명의 제초제-저항성 AHASL 단백질은 a) 서열 13에 기재된 뉴클레오티드 서열; b) 서열 14에 기재된 뉴클레오티드 서열; c) 서열 15에 기재된 뉴클레오티드 서열; d) 서열 13에 기재된 뉴클레오티드 서열에 대한 서열 동일성이 90％ 이상이고, 단백질에 서열 1의 위치 653, 또는 서열 2의 위치 638, 또는 서열 3의 위치 635에 대응하는 위치에 아스파라긴이 있는 뉴클레오티드 서열; e) 서열 14에 기재된 뉴클레오티드 서열에 대한 서열 동일성이 90％ 이상이고, 단백질에 서열 1의 위치 122, 또는 서열 4의 위치 107, 또는 서열 5의 위치 104에 대응하는 위치에 트레오닌이 있는 뉴클레오티드 서열; f) 서열 15에 기재된 뉴클레오티드 서열에 대한 서열 동일성이 90％ 이상이고, 단백질에 서열 1의 위치 122, 또는 서열 4의 위치 107, 또는 서열 5의 위치 104에 대응하는 위치에 트레오닌이 있는 뉴클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 언급된 AHASL 단백질은 a) 서열 1의 위치 653, 또는 서열 2의 위치 638, 또는 서열 3의 위치 635에 대응하는 위치의 아스파라긴; b) 서열 1의 위치 122, 또는 서 열 4의 위치 107, 또는 서열 5의 위치 104에 대응하는 위치의 트레오닌; 및 c) 서열 1의 위치 574, 또는 서열 6의 위치 557에 대응하는 위치의 류신으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다.
하나 이상의 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 카세트, 형질전환 벡터, 형질전환된 비-인간 숙주 세포, 및 형질전환된 식물, 식물의 일부분 및 종자가 또한 제공된다.
도 1은 아라비돕시스 탈리아나로부터의 야생형 AHASL 유전자 (AtAHASL, 서열 11), 계통 J04E-0044로부터의 브라시카 준세아의 제초제-저항성 BjAHASL1B-S653N 유전자 (J04E-0044, 서열 12), 계통 J04E-0139로부터의 브라시카 준세아의 제초제-저항성 BjAHASL1A-S653N 유전자 (J04E-0139, 서열 13), 계통 J04E-0130으로부터의 브라시카 준세아의 제초제-저항성 BjAHASL1B-A122T 유전자 (J04E-0130, 서열 14), 계통 J04E-0122로부터의 브라시카 준세아의 제초제-저항성 BjAHASL1A-A122T 유전자 (BjAHASL1A, 서열 15), PM2 계통으로부터의 브라시카 나푸스의 제초제-저항성 BnAHASL1A-W574L 유전자 (BnAHASL1A, 서열 16), 브라시카 준세아의 야생형 BjAHASL1A 유전자 (BjAHASL1A, 서열 17), 브라시카 준세아의 야생형 BjAHASL1B 유전자 (BjAHASL1B, 서열 18), 브라시카 나푸스의 야생형 BnAHASL1A 유전자 (BnAHASL1A, 서열 19), 브라시카 나푸스의 야생형 BnAHASL1C 유전자 (BnAHASL1C, 서열 20)의 코딩 영역들의 뉴클레오티드 서열의 정렬을 나타낸다. 패스트 알고리즘(Fast Algorithm)을 사용하여 벡터(Vector) NTI 소프트웨어 스위트(suite)에서 분석을 수행하였다 (갭(gap) 오프닝(opening) 15, 갭 확장 6.66 및 갭 분리 8, 매트릭스 swgapdnamt).
도 2는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 야생형 AHASL 유전자 (AtAHASL, 서열 1), 계통 J04E-0044로부터의 브라시카 준세아의 제초제-저항성 BjAHASL1B-S653N 유전자 (J04E-0044, 서열 2), 계통 J04E-0139로부터의 브라시카 준세아의 제초제-저항성 BjAHASL1A-S653N 유전자 (J04E-0139, 서열 3), 계통 J04E-0130으로부터의 브라시카 준세아의 제초제-저항성 BJAHASL1B-A122T 유전자 (J04E-0130, 서열 4), J04E-0122로부터의 브라시카 준세아의 제초제-저항성 BjAHASL1A-A122T 유전자 (J04E-0122, 서열 5), PM2 계통으로부터의 브라시카 나푸스의 제초제-저항성 BnAHASL1A-W574L 유전자 (BnAHASL1A, 서열 6), 브라시카 준세아의 야생형 BjAHASL1A 유전자 (BjAHASL1A, 서열 7), 브라시카 준세아의 야생형 BjAHASL1B 유전자 (BjAHASL1B, 서열 8), 브라시카 나푸스의 야생형 BnAHASL1A 유전자 (BnAHASL1A, 서열 9), 브라시카 나푸스의 야생형 BnAHASL1C 유전자 (BnAHASL1C, 서열 10)의 아미노산 서열들의 정렬을 나타낸다. 벡터 NTI 소프트웨어 스위트에서 분석을 수행하였다 (갭 오프닝 페널티 = 10, 갭 확장 페널티 = 0.05, 갭 분리 페널티 = 8, 블로섬(blosum) 62MT2 매트릭스).
도 3은 브라시카 준세아 식물 계통들에 대한 AHAS 효소 활성 분석법 결과를 나타내는 막대 도표이다.
도 4는 브라시카 준세아 식물 계통들에 대한 온실 분무 분석법 결과를 나타내는 도표이다.
도 5는 상응하는 DNA 또는 단백질 서열에 대한 서열 번호를 나타내는 표이다.
도 6은 100 μM의 이마자목스(Imazamox)에서의 서로, 그리고 브라시카 준세아 내의 유전자이입된 PM2 돌연변이와 스태킹(stacking)된 aR, bR, A107T, 및 A104T 브라시카 준세아 돌연변이의 조합물을 함유하는 동종접합성 브라시카 준세아 계통들로부터 단리된 단백질 추출물에서의 AHAS 효소 활성을 제공한다.
도 7은 35 g ai/ha의 이마자목스를 온실에서 분무하고 나서 2주 후의 상이한 접합성 및 조합의 aR 및 A107T AHAS 돌연변이를 함유하는 브라시카 준세아 F2 계통의 평균 식물 손상 (식물약해(Phytotoxcity))을 제공한다.
도 8은 35 g ai/ha 등가의 이마자목스 (Raptor®)가 분무된지 2주 후의 서로, 그리고 브라시카 준세아 내의 유전자이입된 PM2 돌연변이와 스태킹된 aR, bR, A107T, 및 A104T 브라시카 준세아 돌연변이의 조합물을 함유하는 동종접합성 브라시카 준세아 DH 계통들의 평균 식물 식물약해를 제공한다.
본 발명은 야생형 브라시카 식물에 비교했을 때 제초제에 대한 저항성이 증가된 브라시카 식물에 관한 것이다. 단리된 야생형 (제초제 저항성과 관련하여 야생형) 브라시카 소포자를 돌연변이원에 노출시키고, 소포자를 유효량의 이미다졸리논 제초제의 존재 하에 배양하고, 생존한 배아를 선별함으로써 하기에 상세히 기술된 바와 같이 제초제-저항성 브라시카 식물이 생산되었다. 생존한 배아로부터, 하플로이드(haploid) 브라시카 식물이 생산된 후, 염색체가 배가되어, 야생형 브라시카 식물의 저항성에 비해 이미다졸리논 제초제에 대한 강화된 저항성을 나타내는 배가된 번식성 하플로이드 브라시카 식물이 산출되었다. 한 실시양태에서, 본 발명은 하기에 상세히 기술된 바와 같은 소포자의 돌연변이유발로부터 생산된, 본원에서 J04E-0139로 지칭되는 제초제 저항성 브라시카 계통을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 소포자의 돌연변이유발로부터 생산된, 본원에서 J04E-0130으로 지칭되는 제초제 저항성 브라시카 계통을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 소포자의 돌연변이유발로부터 생산된, 본원에서 J04E-0122로 지칭되는 제초제 저항성 브라시카 계통을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 bR 브라시카 준세아 돌연변이체 계통 (미국 2005/0283858)을 브라시카 나푸스로부터 기원하여 브라시카 준세아 내로 유전자이입된 PM2 돌연변이체 계통 (미국 2004/0142353 및 미국 2004/0171027 참조; [Hattori et al., Mol. Gen. Genet. 246:419-425, 1995]를 또한 참조)과 교배시킴으로써 생산된, 본원에서 J05Z-07801로 지칭되는 제초제 저항성 브라시카 계통을 제공한다.
따라서, 본 발명은 AHAS 억제성 제초제에 대한 저항성이 있는 브라시카 준세아 식물을 제공한다. 하나 이상의 AHASL 폴리뉴클레오티드 내에 단일 돌연변이를 함유하는 브라시카 준세아 계통이 제공되고, 이때 단일 돌연변이는 아라비돕시스 탈리아나 AHASL1 서열의 위치 653의 아미노산에 대응하는 G→A 염기전환(transversion) 및 아라비돕시스 탈리아나 AHASL1 서열의 위치 122의 아미노산에 대응하는 G→A 염기전환의 군으로부터 선택된다.
J04E-0139 제초제-저항성 브라시카 준세아 식물 및 야생형 브라시카 준세아 식물 양쪽 모두로부터, 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 유전자 (AHASL1로 명시됨)의 코딩 영역을 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭에 의해 단리하고, 서열분석하였다. 제초제 저항성 및 야생형 브라시카 식물의 폴리뉴클레오티드 서열을 비교함으로써, 제초제 저항성 브라시카 식물로부터의 AHASL1 폴리뉴클레오티드 서열의 코딩 영역이 브라시카 준세아의 A 게놈 상에 위치하고, 단일 뉴클레오티드 G→A 염기전환에 의해 야생형 식물의 AHASL1 폴리뉴클레오티드 서열과 상이하다는 것이 발견되었다 (도 1). AHASL1 폴리뉴클레오티드 서열에서의 이러한 G→A 염기전환으로 야생형 AHASL1 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 AHASL1 단백질의 예상 아미노산 서열의 보존 영역에서 아미노산 635 (아라비돕시스 탈리아나 AHASL1의 아미노산 653에 대응)에서의 신규 Ser→Asn 치환이 초래된다 (도 2).
J04E-0130 제초제-저항성 브라시카 준세아 식물 및 야생형 브라시카 준세아 식물 양쪽 모두로부터, 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 유전자 (AHASL1로 명시됨)의 코딩 영역을 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭에 의해 단리하고, 서열분석하였다. 제초제 저항성 및 야생형 브라시카 식물의 폴리뉴클레오티드 서열을 비교함으로써, 제초제 저항성 브라시카 식물 계통 J04E-0130으로부터의 AHASL1 폴리뉴클레오티드 서열의 코딩 영역이 브라시카 준세아의 B 게놈 상에 위치하고, 단일 뉴클레오티드 G→A 염기전환에 의해 야생형 식물의 AHASL1 폴리뉴클레오티드 서열과 상이하다는 것이 발견되었다 (도 1). AHASL1 폴리뉴클레오티드 서열에서의 이러한 G→A 염기전환으로 야생형 AHASL1 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 AHASL1 단백질의 예상 아미노산 서열의 보존 영역에서 아미노산 107 (아라비돕시스 탈리아나 AHASL1의 아미노산 122에 대응)에서의 신규 Ala→Thr 치환이 초래된다 (도 2).
J04E-0122 제초제-저항성 브라시카 준세아 식물 및 야생형 브라시카 준세아 식물 양쪽 모두로부터, 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 유전자 (AHASL1로 명시됨)의 코딩 영역을 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭에 의해 단리하고, 서열분석하였다. 제초제 저항성 및 야생형 브라시카 식물의 폴리뉴클레오티드 서열을 비교함으로써, 제초제 저항성 브라시카 식물 계통 J04E-0122로부터의 AHASL1 폴리뉴클레오티드 서열의 코딩 영역이 브라시카 준세아의 A 게놈 상에 위치하고, 단일 뉴클레오티드 G→A 염기전환에 의해 야생형 식물의 AHASL1 폴리뉴클레오티드 서열과 상이하다는 것이 발견되었다 (도 1). AHASL1 폴리뉴클레오티드 서열에서의 이러한 G→A 염기전환으로 야생형 AHASL1 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 AHASL1 단백질의 예상 아미노산 서열의 보존 영역에서 아미노산 104 (아라비돕시스 탈리아나 AHASL1의 아미노산 122에 대응)에서의 신규 Ala→Thr 치환이 초래된다 (도 2).
본 명세서는 2개 이상의 돌연변이된 AHASL 폴리뉴클레오티드를 함유하는 브라시카 준세아 식물을 또한 제공한다. 이같은 식물은 "스태킹된" 돌연변이를 함유하는 식물로 본원에서 또한 지칭된다. 돌연변이들은 브라시카 준세아 식물의 동일한 게놈 또는 상이한 게놈 상에 있을 수 있다. 브라시카 준세아 식물은 임의의 개수의 돌연변이된 AHASL 폴리뉴클레오티드, 및 서열 1의 위치 653, 서열 2의 위치 638, 서열 3의 위치 635, 서열 1의 위치 122, 서열 4의 위치 107, 서열 5의 위치 104, 서열 1의 위치 574, 또는 서열 6의 위치 557에 대응하는 돌연변이를 포함하지만 이에 한정되는 않는 돌연변이들의 임의의 조합을 함유할 수 있다.
하나의 돌연변이된 AHASL 폴리뉴클레오티드는 A 게놈 상에 있고, 제2의 돌연변이된 AHASL 폴리뉴클레오티드는 B 게놈 상에 있는, 상이한 게놈 상의 2개의 돌연변이된 AHASL 폴리뉴클레오티드가 있는 브라시카 준세아 식물이 본원에서 또한 제공된다. 2개의 돌연변이된 AHASL 폴리뉴클레오티드가 있는 이같은 브라시카 준세아 식물은 bR 돌연변이 및 PM2 돌연변이를 함유하는 것을 포함한다. 이같은 식물은 브라시카 준세아 계통 J05Z-07801의 것들, 뿐만 아니라 이의 종자, 및 브라시카 준세아 계통 J05Z-07801과의 교배로부터 수득된 자손 및 후손을 포함한다. 또다른 양상에서, 2개의 돌연변이된 AHASL 돌연변이가 있는 브라시카 준세아 식물은 자손 브라시카 준세아 계통에서 aR 돌연변이 (예를 들어, 계통 J04E-0139로부터의 돌연변이)가 A122T 돌연변이 (예를 들어, 계통 J04E-0130으로부터의 돌연변이)와 조합된 것을 포함한다. 한 양상에서, 2개의 AHASL1 돌연변이가 조합된 이같은 식물은 각각의 개별적인 돌연변이를 함유하는 브라시카 준세아 식물들의 부가적인 제초제 내성 수준과 비교하여 상승작용성 수준의 제초제 내성을 나타낸다.
[Swanson et al. Plant Cell Reports 7:83-87(1989)]에 기술된 바와 같이, 브라시카 나푸스의 소포자 돌연변이유발을 사용하여 PM1 및 PM2 돌연변이가 개발되었다. PM2 돌연변이는 브라시카 나푸스의 A 게놈 ([Rutledge et al. Mol. Gen. Genet. 229:31-40 (1991)]) 상에 있는 것으로 여겨지는 AHAS3 유전자의 3' 말단의 단일 뉴클레오티드 변화 (G→T)를 특징으로 하여, Trp에서 Leu로의 아미노산 변화 Trp556(Bn)Leu를 초래한다 ([Hattori et al., Mol. Gen. Genet. 246:419-425, 1995]). 브라시카 나푸스의 C 게놈 ([Rutledge et al. Mol. Gen. Genet. 229:31-40 (1991)]) 상에 있는 것으로 여겨지는 PM1 돌연변이는 AHAS1 유전자에서의 단일 뉴클레오티드 변화 (G→A)를 특징으로 하여, Ser에서 Asn으로의 아미노산 변화 Ser638(Bn)Asn을 초래한다 ([Sathasivan et al., Plant Physiol. 97:1044-1050, 1991], 및 [Hattori et al., Mol. Gen. Genet. 232:167-173, 1992] 참조; 미국 2004/0142353 및 미국 2004/0171027를 또한 참조). 돌연변이체 PM1 (AHAS1) 및 PM2 (AHAS3) 유전자가 부가적으로 작용하여 이미다졸리논 제초제에 대한 내성을 제공하는 것으로 보고되었다 ([Swanson et al., Theor. Appl. Genet. 78:525-530, 1989]).
PM2가 브라시카 나푸스의 A 게놈 상에 위치하는 것으로 여겨지고, 브라시카 준세아 및 브라시카 라파(Brassica rapa) 양쪽 모두 A 게놈을 함유하기 때문에, 종들을 교배시키고 (유전자이입), 낮은 수준의 제초제 선별 하에 선별함으로써, 나푸스로부터 준세아 또는 라파 내로의 PM2 돌연변이체 유전자의 전달이 달성될 수 있다. PM1은 브라시카 나푸스의 C 게놈 상에 위치하는 것으로 여겨지기 때문에, 브라시카 나푸스로부터 브라시카 준세아 (A,B) 또는 브라시카 라파 (A,A) 내로의 이러한 돌연변이체의 유전자이입은 드문 염색체 전위 이벤트 (브라시카 나푸스의 C 게놈과 브라시카 준세아의 A 또는 B 게놈 사이의 이벤트)가 발생하는 것에 의존하므로 훨씬 더 어렵다. 이같은 염색체 전위 이벤트에는 안정성 결여, 뿐만 아니라 이러한 방법을 사용할 때 종종 발생하는 연관 끌림(drag)을 제거할 수 없음이 종종 부과될 수 있다. 미국 특허 번호 6,613,963에는 이러한 유전자이입 방법을 사용하여 생산된 제초제 내성 PM1/PM2 브라시카 준세아 식물이 개시되어 있다. 브라시카 나푸스에서 PM1 및 PM2에 의해 제공된 부가적인 내성을 기초로, 2개의 돌연변이 PM1 및 PM2의 브라시카 준세아 내로의 유전자이입이 부가적인 제초제 내성을 또한 제공할 것으로 예상될 수 있다.
제초제 내성 소질을 브라시카 나푸스의 C 게놈으로부터 브라시카 라파 및/또는 브라시카 준세아의 A 또는 B 게놈 상으로 전달하는 것과 관련된 문제점을 극복하기 위해, 원하는 게놈에서 직접적으로 돌연변이를 일으키는 것이 유리하다. 미국 특허 출원 2005/0283858에는 제초제 내성 브라시카 준세아 AHAS1 돌연변이인 bR이 개시되어 있고, 이는 B 게놈 상의 AHASL 유전자에서 Ser638Asn (아라비돕시스 AHASL 아미노산 위치 명명법을 사용한 위치 653)의 치환을 야기하는 AHAS1 유전자 상에서의 SNP를 초래하는 직접적인 돌연변이유발에 의해 생산되었다.
본원에서 제공된 2개 이상의 AHASL 돌연변이가 있는 브라시카 준세아 식물은 개별적인 돌연변이들의 부가적인 수준의 저항성에 비해 제초제 저항성의 수준이 증가될 수 있다. 2개 이상의 AHASL 돌연변이가 있는 식물은 개별적인 AHASL 돌연변이들에 의해 제공되는 부가적인 수준의 저항성과 비교하여 저항성의 수준이 10％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 또는 그 이상 더 높을 수 있다.
AHAS 저항성을 결정하기 위한 임의의 방법을 사용하여 저항성에서의 증가를 측정할 수 있다. 예를 들어, AHAS 억제성 제초제로 처리하고 나서 10일, 12일, 14일, 16일, 18일, 20일, 22일, 24일, 26일 또는 28일 또는 그 이상의 기간에 브라시카 준세아에서의 저항성 백분율을 결정함으로써 저항성을 측정할 수 있다. 그후 저항성 백분율을 각각의 개별적인 AHASL 돌연변이를 함유하는 식물들에서의 저항성 백분율을 더함으로써 수득된 수준과 비교할 수 있다. 한 양상에서, 2× 양의 AHAS-억제성 제초제로 처리하고 나서 14일 후에 식물에서 저항성 백분율을 측정함으로써 저항성이 결정된다.
추가로 본 발명은 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자, 및 이같은 AHASL 단백질에 관한 것이다. 본 발명에서 야생형 브라시카 식물의 화학적 돌연변이유발에 의해 생산된 제초제-저항성 브라시카 식물로부터의 제초제-저항성 브라시카 AHASL1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 단리 및 뉴클레오티드 서열이 개시된다. 본 발명의 제초제-저항성 AHASL1 단백질은 A 게놈 상에 위치한 브라시카 준세아 AHASL1 유전자의 위치 635에서의 세린→아스파라긴 치환, 또는 B 게놈 상에 위치한 브라시카 준세아 AHASL1 유전자의 위치 107에서의 알라닌→트레오닌 치환, 또는 A 게놈 상에 위치한 브라시카 준세아 AHASL1 유전자의 위치 104에서의 알라닌→트레오닌 치환을 보유한다. 야생형 브라시카 AHASL1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자의 단리 및 뉴클레오티드 서열이 본 발명에서 추가로 개시된다.
본 발명은 브라시카, 특히 브라시카 준세아로부터의 AHASL1 단백질을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 서열 13에 기재된 뉴클레오티드 서열, 서열 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 AHASL1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 서열 14에 기재된 뉴클레오티드 서열, 서열 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 AHASL1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 서열 15에 기재된 뉴클레오티드 서열, 서열 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 AHASL1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 기능성 AHASL1 단백질을 코딩하는 이같은 뉴클레오티드 서열들의 단편 및 변이체를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다.
본 발명의 단리된 제초제-저항성 AHASL1 폴리뉴클레오티드 분자는 제초제-저항성 AHASL1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이같은 폴리뉴클레오티드 분자는 제초제, 특히 AHAS 활성을 억제하는 것으로 공지된 제초제, 더욱 특히 이미다졸리논 제초제에 대한 식물의 저항성을 강화시키도록 식물, 특히 작물의 형질전환을 위한 폴리뉴클레오티드 구축물에서 사용될 수 있다. 이같은 폴리뉴클레오티드 구축물은 발현 카세트, 발현 벡터, 형질전환 벡터, 플라스미드 등에서 사용될 수 있다. 이같은 폴리뉴클레오티드 구축물로의 형질전환 후에 수득된 트랜스제닉 식물은 AHAS-억제성 제초제, 예를 들어, 이미다졸리논 및 술포닐우레안 제초제에 대해 증가된 저항성을 나타낸다.
본 발명의 조성물은 AHASL1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특히, 본 발명은 서열 3, 4, 또는 5에 제시된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 AHAS 활성을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 이의 단편 및 변이체를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드 분자, 예를 들어 서열 13, 14, 또는 15에 기재된 뉴클레오티드 서열, 및 AHAS 활성을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 이의 단편 및 변이체에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 추가로 제공된다.
본 발명은 본원에 개시된 브라시카 AHASL 단백질의 보존 영역 내의 특정 아미노산 위치에 아미노산 치환이 있는 AHASL 단백질을 제공한다. 본원에서 달리 지시되지 않는 한, 특정 아미노산 위치는 서열 1에 기재된 전장 아라비돕시스 탈리아나 AHASL 아미노산 서열에서의 아미노산의 위치를 지칭한다. 또한, 당업자는 아미노산이 부가되거나 제거되는지, 예를 들어 아미노산 서열의 N-말단 끝부분에 부가되거나 또는 끝부분으로부터 제거되는지 여부에 따라 이같은 아미노산 위치가 변할 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 본 발명은 열거된 위치 또는 등가의 위치 (예를 들어, "아미노산 위치 653 또는 등가의 위치")에서의 아미노 치환을 포함한다. "등가의 위치"는 예시된 아미노산 위치와 동일한 보존 영역 내에 있는 위치를 의미하도록 의도된다. 예를 들어, 서열 1 내의 아미노산 122는 서열 4의 아미노산 107에 대해 등가의 위치이고, 서열 5의 아미노산 104에 대해 등가의 위치이다. 유사하게, 서열 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 아라비돕시스 탈리아나 AHASL 단백질 내의 아미노산 653은 각각 서열 2 및 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 브라시카 AHASL1B 내의 아미노산 638 및 브라시카 AHASL1A 단백질 내의 아미노산 635에 대해 등가의 위치이다.
본 발명은 단리된 또는 실질적으로 정제된 핵산 또는 단백질 조성물을 포함한다. "단리된" 또는 "정제된" 폴리뉴클레오티드 분자 또는 단백질, 또는 이의 생물학적으로 활성인 일부분에는 이의 천연 발생 환경에서 발견되는, 정상적으로는 폴리뉴클레오티드 분자 또는 단백질에 수반되거나 이와 상호작용하는 화합물이 실질적으로 또는 본질적으로 없다. 따라서, 단리된 또는 정제된 폴리뉴클레오티드 분자 또는 단백질에는 재조합 기술에 의해 생산되는 경우 기타 세포성 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구물질 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없다. 바람직하게는, "단리된" 핵산에는 핵산이 유래된 생물의 게놈 DNA 내에서 천연적으로는 핵산에 플랭킹(flanking)된 서열 (즉, 핵산의 5' 및 3' 끝부분에 위치하는 서열) (바람직하게는, 단백질 코딩 서열)이 없다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자는 핵산이 유래된 세포의 게놈 DNA에서 폴리뉴클레오티드 분자에 천연적으로 플랭킹된 뉴클레오티드 서열을 약 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 또는 0.1 kb 미만으로 함유할 수 있다. 세포성 물질이 실질적으로 없는 단백질은 약 30％, 20％, 10％, 5％, 또는 1％ 미만 (건조 중량 기준)의 오염성 단백질이 있는 단백질 제제를 포함한다. 본 발명의 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성인 일부분이 재조합적으로 생산되는 경우, 바람직하게는, 배양 배지는 약 30％, 20％, 10％, 5％, 또는 1％ (건조 중량 기준) 미만의 화학적 전구물질 또는 당해 단백질이 아닌 화학물질을 나타낸다.
본 발명은 AHASL1 단백질을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 단리된 폴리펩티드는 서열 3, 4, 또는 5에 기재된 아미노산 서열, 서열 13, 14, 또는 15에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열, 및 AHAS 활성을 포함하는 AHASL1 폴리펩티드를 코딩하는 상기 아미노산 서열들의 기능성 단편 및 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. "기능성 단편 및 변이체"는 AHAS 활성을 포함하는 예시된 폴리펩티드의 단편 및 변이체를 의미한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 제초제-내성 또는 제초제-저항성 식물의 사용이 방법에 수반된다. "제초제-내성" 또는 "제초제-저항성" 식물은 정상 또는 야생형 식물을 사망시키거나 이의 성장을 억제할 수준의 하나 이상의 제초제에 대해 내성 또는 저항성인 식물을 의미한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 제초제-내성 식물은 제초제-내성 또는 제초제-저항성 AHASL 단백질을 포함한다. "제초제-내성 AHASL 단백질" 또는 "제초제-저항성 AHASL 단백질"은 AHAS 활성을 방해하는 것으로 공지된 하나 이상의 제초제의 존재 하에, 그리고 야생형 AHASL 단백질의 AHAS 활성을 억제하는 것으로 공지된 제초제의 농도 또는 수준에서 이같은 AHASL 단백질이 야생형 AHASL 단백질의 AHAS 활성과 비교하여 더 높은 AHAS 활성을 나타낸다는 것을 의미한다. 또한, 이같은 제초제-내성 또는 제초제-저항성 AHASL 단백질의 AHAS 활성은 본원에서 "제초제-내성" 또는 "제초제-저항성" AHAS 활성으로 지칭될 수 있다.
본 발명을 위해, 용어 "제초제에 대해 내성인" 및 "제초제에 대해 저항성인"은 상호교환가능하게 사용되고, 등가의 의미 및 등가의 범주를 갖는 것으로 의도된다. 유사하게, 용어 "제초제-내성" 및 "제초제-저항성"은 상호교환가능하게 사용되고, 등가의 의미 및 등가의 범주를 갖는 것으로 의도된다. 마찬가지로, 용어 "이미다졸리논에 대해 저항성인" 및 "이미다졸리논-저항성"은 각각 용어 "이미다졸리논에 대해 내성인" 및 "이미다졸리논-내성"과 상호교환가능하게 사용되고, 이와 등가의 의미 및 등가의 범주인 것으로 의도된다.
본 발명은 제초제-저항성 AHASL1 폴리뉴클레오티드 및 제초제-저항성 AHASL1 단백질을 포함한다. "제초제-저항성 AHASL1 폴리뉴클레오티드"는 제초제-저항성 AHAS 활성을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. "제초제-저항성 AHASL1 단백질"은 제초제-저항성 AHAS 활성을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다.
추가로, 식물 또는 이의 원종(ancestor)을 제초제-내성 또는 제초제-저항성 AHASL 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 형질전환시킴으로써 제초제-내성 또는 제초제-저항성 AHASL 단백질을 식물 내로 도입할 수 있는 것으로 인지된다. 이같은 제초제-내성 또는 제초제-저항성 AHASL 단백질은 제초제-내성 또는 제초제-저항성 AHASL 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 별법적으로, 제초제-내성 또는 제초제-저항성 AHASL 단백질은 식물 또는 이의 선조의 게놈 내의 내인성 AHASL 유전자에서의 천연 발생 또는 유발 돌연변이의 결과로서 식물에서 발생할 수 있다.
본 발명은 하나 이상의 제초제, 특히 AHAS 효소의 활성을 방해하는 제초제, 더욱 특히 이미다졸리논 또는 술포닐우레안 제초제에 대한 저항성 또는 내성이 증가 및/또는 강화된 식물, 식물 조직, 식물 세포, 및 숙주 세포를 제공한다. 용어 '강화된'은 예상되는 것을 초과하는 저항성 또는 내성의 양에서의 증가를 지칭한다. 제초제의 바람직한 양 또는 농도는 "유효량" 또는 "유효 농도"이다. "유효량" 및 "유효 농도"는 유사한 야생형의 식물, 식물 조직, 식물 세포, 소포자 또는 숙주 세포를 사망시키거나 이의 성장을 억제하는데 충분하지만 본 발명의 제초제-저항성 식물, 식물 조직, 식물 세포, 소포자 및 숙주 세포를 사망시키거나 이의 성장을 심각하게 억제하지 않는 양 및 농도를 각각 의미한다. 전형적으로, 제초제의 유효량은 당해 잡초를 사망시키기 위해 농업 생산 시스템에서 일상적으로 사용되는 양이다. 이같은 양은 당업자에게 공지되어 있거나, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 쉽게 결정될 수 있다. 또한, 농업 생산 시스템에서의 제초제의 유효량은 식물 배양 시스템, 예를 들어, 소포자 배양 시스템을 위한 제초제의 유효량과 실질적으로 상이할 수 있는 것으로 인지된다.
본 발명의 제초제는 제초제의 존재 하에 AHAS 활성이 감소되도록 AHAS 효소의 활성을 방해하는 것이다. 이같은 제초제는 본원에서 "AHAS-억제성 제초제"로 또는 간단히 "AHAS 억제제"로 또한 지칭될 수 있다. 본원에서 사용된 "AHAS-억제성 제초제" 또는 "AHAS 억제제"는 AHAS 효소의 활성을 방해하는 단일 제초제에 한정되는 것을 의미하지 않는다. 따라서, 달리 언급되거나 문맥적으로 명백하지 않는 한, "AHAS-억제성 제초제" 또는 "AHAS 억제제"는 단일 제초제, 또는 2가지, 3가지, 4가지 또는 그 이상의 제초제 (각각 AHAS 효소의 활성을 방해함)의 혼합물일 수 있다.
"유사한 야생형의 식물, 식물 조직, 식물 세포 또는 숙주 세포"는 본원에 개시된 본 발명의 제초제-저항성 특성 및/또는 특정 폴리뉴클레오티드가 없는 식물, 식물 조직, 식물 세포, 또는 숙주 세포를 각각 의미힌다. 따라서, 용어 "야생형"의 사용은 식물, 식물 조직, 식물 세포, 또는 기타 숙주 세포가 게놈 내에 재조합 DNA가 없고/없거나, 본원에 개시된 것과 상이한 제초제 저항성 특성을 갖지 않는다는 것을 의미하도록 의도되지 않는다.
달리 명확하게 지시되지 않는 한, 본원에서 사용된 용어 "식물"은 임의의 발달 단계의 식물, 뿐만 아니라 전체 무손상 식물에 부착될 수 있거나 이로부터 분리될 수 있는 임의의 일부분 또는 부분들을 의미하도록 의도된다. 이같은 식물의 일부분에는 식물 캘러스, 식물 수풀, 식물 원형질체 및 식물 세포 조직 배양물 (이로부터 식물이 재생될 수 있음)이 포함되는 식물의 기관, 조직 및 세포가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 특정한 식물의 일부분의 예로는 줄기, 잎, 뿌리, 화서, 꽃, 잔꽃, 과실, 작은 꽃자루, 꽃자루, 수꽃술, 꽃밥, 암술머리, 암술대, 씨방, 꽃잎, 꽃받침, 심피, 근단, 근관, 근모, 엽모, 종자모, 화분립, 소포자, 배아, 배주, 떡잎, 배축, 상배축, 물관부, 체관부, 연조직, 배젖, 동반 세포, 공변 세포, 및 식물의 임의의 또다른 공지된 기관, 조직 및 세포가 포함된다. 또한, 종자는 식물인 것으로 인지된다.
본 발명의 식물은 비-트랜스제닉 식물 및 트랜스제닉 식물 양쪽 모두를 포함한다. "비-트랜스제닉 식물"은 게놈 내에 재조합 DNA가 없는 식물을 의미하도록 의도된다. "트랜스제닉 식물"은 게놈 내에 재조합 DNA를 포함하는 식물을 의미하도록 의도된다. 이같은 트랜스제닉 식물은 재조합 DNA를 식물의 게놈 내로 도입함으로써 생산될 수 있다. 이같은 재조합 DNA가 트랜스제닉 식물의 게놈 내로 혼입되는 경우, 식물의 자손 또한 재조합 DNA를 포함할 수 있다. 하나 이상의 선조 트랜스제닉 식물의 재조합 DNA의 적어도 일부분을 포함하는 자손 식물 또한 트랜스제닉 식물이다.
본 발명은 J04E-0122로 본원에서 지칭되는 제초제-저항성 브라시카 계통을 제공한다. 브라시카 계통 J04E-0122로부터의 2500개 이상의 종자가 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC: American Type Culture Collection) (Mansassas, VA 20110 USA)의 특허 기탁소에 2006년 10월 19일에 기탁되었고, ATCC 특허 기탁 번호 PTA-7944가 할당되었다. 본 발명은 J04E-0130으로 본원에서 지칭되는 제초제-저항성 브라시카 계통을 제공한다. 브라시카 계통 J04E-0130으로부터의 2500개 이상의 종자가 2006년 10월 19일에 기탁되었고, ATCC 특허 기탁 번호 PTA-7945가 할당되었다. 본 발명은 J04E-0139로 본원에서 지칭되는 제초제-저항성 브라시카 계통을 제공한다. 브라시카 계통 J04E-0139로부터의 2500개 이상의 종자가 2006년 10월 19일에 기탁되었고, ATCC 특허 기탁 번호 PTA-7946이 할당되었다. 본 발명은 J05Z-07801로 본원에서 지칭되는 제초제-저항성 이중 돌연변이체 브라시카 계통을 제공한다. 브라시카 계통 J05Z-07801로부터의 625개 이상의 종자가 2007년 4월 2일에 기탁되었고, 나머지 1875개의 종자가 2008년 1월 15일에 기탁되었으며, ATCC 특허 기탁 번호 PTA-8305가 할당되었다. 기탁물은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 조항 하에 유지될 것이다. 브라시카 계통 J04E-0122, J04E-0130, J04E-0130, 및 J05Z-07801의 기탁은 30년 이상 및 기탁물 샘플의 공급에 대한 가장 최근의 요청이 ATCC에 접수되고 나서 5년 이상의 조항에 대해 이루어졌다. 추가적으로, 출원인은 샘플의 생육력의 표시를 제공하는 것을 포함하여, 37 C.F.R. § 1.801-1.809의 모든 요건을 충족시켰다.
본 발명의 단일 돌연변이체 제초제-저항성 브라시카 계통 J04E-0122, J04E-0130, 및 J04E-0139는 돌연변이 육종에 의해 생산되었다. 돌연변이원, 특히 화학적 돌연변이원, 더욱 특히 에틸 니트로소-우레아 (ENU)에의 노출에 의해 야생형 브라시카 소포자가 돌연변이되었다. 그러나, 본 발명은 화학적 돌연변이원 ENU을 수반하는 돌연변이유발 방법에 의해 생산된 제초제-저항성 브라시카 식물에 한정되지 않는다. 당업계에 공지된 임의의 돌연변이유발 방법이 본 발명의 제초제-저항성 브라시카 식물을 생산하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이같은 돌연변이유발 방법은 하기의 돌연변이원들 중 임의의 하나 이상을 사용하는 것을 수반할 수 있다: 방사선, 예컨대 X선, 감마선 (예를 들어, 코발트 60 또는 세슘 137), 중성자 (예를 들어, 원자 반응기에서의 우라늄 235에 의한 핵분열의 생성물), 베타 방사선 (예를 들어, 방사성동위원소 예컨대 인 32 또는 탄소 14로부터 방출됨), 및 자외선 조사 (바람직하게는 250 내지 290 nm), 및 화학적 돌연변이원 예컨대 에틸 메탄술포네이트 (EMS), 염기 유사물 (예를 들어, 5-브로모-우라실), 관련된 화합물 (예를 들어, 8-에톡시 카페인), 항생제 (예를 들어, 스트렙토니그린), 알킬화제 (예를 들어, 황 머스타드, 질소 머스타드, 에폭시드, 에틸렌아민, 술페이트, 술포네이트, 술폰, 락톤), 아지드, 히드록실아민, 아질산, 또는 아크리딘. 조직 배양 방법을 사용하여 제초제-저항성 돌연변이를 포함하는 식물 세포를 선별한 후, 이로부터 제초제-저항성 식물을 재생시킴으로써 제초제-저항성 식물이 또한 생산될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,773,702 및 5,859,348 참조 (양쪽 모두 거명에 의해 전체적으로 본원에 포함됨). 돌연변이 육종의 추가적인 상세사항을 ["Principals of Cultivar Development" Fehr, 1993 Macmillan Publishing Company]에서 확인할 수 있고, 이의 개시내용은 거명에 의해 본원에 포함된다.
J04E-0139 계통의 브라시카 식물의 AHASL1 유전자의 분석은 A 게놈 상의 브라시카 준세아 AHASL 유전자의 아미노산 위치 635에서 발견되는 세린이 아스파라긴으로 치환되는 것을 초래하고 제초제에 대한 증가된 저항성을 부여하는 돌연변이를 나타냈다. 따라서, 본 발명은 위치 635 (아라비돕시스 탈리아나 AHASL1의 아미노산 653에 대응함)의 세린을 또다른 아미노산으로 치환하는 것이 브라시카 식물이 제초제, 특히 이미다졸리논 및/또는 술포닐우레안 제초제에 대해 증가된 저항성을 갖도록 야기할 수 있다는 것을 개시한다. 본 발명의 제초제-저항성 브라시카 식물은 아미노산 위치 635 또는 등가의 위치에 아스파라긴을 포함하는 제초제-저항성 AHASL1 단백질을 코딩하는 AHASL1 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피를 게놈 내에 포함하는 브라시카 식물을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
J04E-0130 계통의 브라시카 식물의 AHASL1 유전자의 분석은 B 게놈 상의 브라시카 준세아 AHASL 유전자의 아미노산 위치 107에서 발견되는 알라닌이 트레오닌으로 치환되는 것을 초래하고 제초제에 대한 증가된 저항성을 부여하는 돌연변이를 나타냈다. 따라서, 본 발명은 위치 107 (아라비돕시스 탈리아나 AHASL1의 아미노산 122에 대응함)의 알라닌을 또다른 아미노산으로 치환하는 것이 브라시카 식물이 제초제, 특히 이미다졸리논 및/또는 술포닐우레안 제초제에 대해 증가된 저항성을 갖도록 야기할 수 있다는 것을 개시한다. 본 발명의 제초제-저항성 브라시카 식물은 아미노산 위치 107 또는 등가의 위치에 트레오닌을 포함하는 제초제-저항성 AHASL1 단백질을 코딩하는 AHASL1 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피를 게놈 내에 포함하는 브라시카 식물을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
J04E-0122 계통의 브라시카 식물의 AHASL1 유전자의 분석은 A 게놈 상의 브라시카 준세아 AHASL 유전자의 아미노산 위치 104에서 발견되는 알라닌이 트레오닌으로 치환되는 것을 초래하고 제초제에 대한 증가된 저항성을 부여하는 돌연변이를 나타냈다. 따라서, 본 발명은 위치 104 (아라비돕시스 탈리아나 AHASL1의 아미노산 122에 대응함)의 알라닌을 또다른 아미노산으로 치환하는 것이 브라시카 식물이 제초제, 특히 이미다졸리논 및/또는 술포닐우레안 제초제에 대해 증가된 저항성을 갖도록 야기할 수 있다는 것을 개시한다. 본 발명의 제초제-저항성 브라시카 식물은 아미노산 위치 104 또는 등가의 위치에 트레오닌을 포함하는 제초제-저항성 AHASL1 단백질을 코딩하는 AHASL1 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피를 게놈 내에 포함하는 브라시카 식물을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 브라시카 식물은 야생형 AHASL1 단백질과 비교하여, 아미노산 위치 653 (아라비돕시스 탈리아나 명명법)의 아스파라긴, 아미노산 위치 122 (아라비돕시스 탈리아나 명명법)의 트레오닌 및 야생형 AHASL1 단백질과 비교하여 AHASL1 단백질에서의 하나 이상의 추가적인 아미노산 치환을 포함하는 식물을 추가로 포함하고, 이때 이같은 브라시카 식물은 야생형 브라시카 식물에 비교했을 때 하나 이상의 제초제에 대해 증가된 저항성을 갖는다.
본 발명은 AHAS 제초제에 대한 내성이 증가된 AHAS 제초제 저항성 브라시카 식물을 제조하는 방법 및 식물, 및 이같은 식물의 종자를 제공한다. 따라서, 본원에서 예시된 식물은 추가적인 제초제 저항성 브라시카 준세아 식물, 예컨대 브라시카 준세아의 실용 품종(commercial variety)을 개발하기 위한 육종 프로그램에서 사용될 수 있다. 이같은 방법에 따르면, 제1 브라시카 어버이 식물이 제2 브라시카 어버이 식물과의 교배에 사용될 수 있고, 이때 제1 또는 제2 브라시카 어버이 식물 중 하나 이상이 하나 이상의 AHAS 제초제 저항성 돌연변이를 함유한다. 이러한 과정의 한가지 용도는 F1 하이브리드(hybrid) 식물의 생산에서의 용도이다. 이러한 과정의 또다른 중요한 양상은 과정이 신규 어버이 디하플로이드(dihaploid) 또는 순계의 개발에 사용될 수 있다는 것이다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 브라시카 계통이 임의의 제2 식물에 교배될 수 있고, 생성된 하이브리드 자손 각각이 약 5세대 내지 7세대 또는 그 이상의 세대에 대해 자가 수분 및/또는 형매교배(sibbing)됨으로써, 다수의 독특한 어버이 계통이 제공될 수 있다. 그후, 이러한 어버이 계통들을 다른 계통과 교배시키고, 생성된 하이브리드 자손을 이로운 특성에 대해 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 원하는 특성을 부여하는 신규 계통을 확인할 수 있다. 하플로이드성, 계통 육종, 단일 종자 가계, 변형된 단일 종자 가계, 순환 선별, 및 역교배가 포함되는 다양한 육종 방법이 이러한 방법에서 사용될 수 있다.
천연 또는 기계적 기술에 의해 브라시카 계통이 교배될 수 있다. 암술머리 상에 전달될 수 있는 꽃가루의 유형을 제거함으로써 또는 수동으로 수분시킴으로써 기계적 수분이 실행될 수 있다.
후손 및/또는 자손 브라시카 식물을 돌연변이된 AHASL 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 존재를 결정하기 위한 임의의 방법에 의해 평가할 수 있다. 이같은 방법에는 표현형 평가, 유전자형 평가, 또는 이의 조합이 포함된다. 자손 브라시카 식물을 제초제 저항성, 및 또다른 원하는 소질에 대해 후속 세대에서 평가할 수 있다. 식물을 하나 이상의 적합한 AHAS-억제제 제초제에 노출시키고, 제초제 손상을 평가함으로써 AHAS-억제제 제초제에 대한 저항성을 평가할 수 있다. 일부 소질, 예컨대 도복(lodging) 저항성 및 식물 높이를 식물의 육안 검사를 통해 평가할 수 있는 한편, 조기 성숙을 꼬투리 내의 종자의 육안 검사에 의해 평가할 수 있다 (장각과). 기타 소질, 예컨대 종자의 오일 백분율, 단백질 백분율, 및 총 글루코시놀레이트를 근적외선 분광법 및/또는 액체 크로마토그래피 및/또는 기체 크로마토그래피와 같은 기술을 사용하여 평가할 수 있다.
브라시카 식물의 유전자형 평가는 이소자임 전기영동, 제한 단편 길이 다형성 (RFLP), 무작위로 증폭된 다형성 DNA (RAPD), 임의적으로 프라이밍된 중합효소 연쇄 반응 (AP-PCR), DNA 증폭 핑거프린팅 (DAF), 서열 특성화된 증폭된 영역 (SCAR), 증폭된 단편 길이 다형성 (AFLP), "마이크로새틀라이트(Microsatellite)"로 또한 지칭되는 단순 서열 반복 (SSR)과 같은 기술을 사용하는 것을 포함한다. 본원에서 제공된 브라시카 식물의 유전자형을 분석하기 위한 추가적인 조성물 및 방법에는 미국 공개 번호 2004/0171027, 미국 공개 번호 2005/02080506, 및 미국 공개 번호 2005/0283858에 개시된 방법들이 포함되고, 상기 문서들은 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된다.
평가 및 조작 (하나 이상의 적절한 AHAS-억제제 제초제에의 노출을 통한 평가 및 조작)은 여러 세대에 걸쳐 발생할 수 있다. 대비 품종과 비교하여 객관적인 기준을 사용하여 새로운 계통의 성능을 평가할 수 있다. 소질들의 원하는 조합을 나타내는 계통이 또다른 계통에 교배되거나 자가-수분되어, 종자가 생산된다. 자가-수분은 한 꽃에서 동일한 꽃으로 또는 동일한 식물의 또다른 꽃으로 수분이 전달되는 것을 지칭한다. 다수의 세대에 대해 자가-수분되고 유형에 대해 선별된 식물은 거의 모든 유전자좌에서 동종접합성이 되고, 순수 육종 자손의 균일한 집단을 생산한다.
임의의 육종 방법이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 한 예에서, 하플로이드 방법을 사용하여 본 발명의 제초제-저항성 식물을 육종할 수 있다. 이같은 방법에서, 특성들의 원하는 보충에 대한 유전학적 기초가 있는 어버이들이 단순 또는 복합 교배에서 교배된다. 교배 (또는 교차-수분)은 한 식물로부터 다른 식물로 수분이 전달되는 것을 지칭한다. 교배물의 자손을 성장시키고, 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 소포자 (미성숙 화분립)를 분리 및 여과한다 (예를 들어 [Swanson, E. B. et al., "Efficient isolation of microspores and the production of microspore-derived embryos in Brassica napus, L. Plant Cell Reports, 6: 94-97 (1987)]; 및 [Swanson, E. B., Microspore culture in Brassica, pp. 159-169 in Methods in Molecular Biology, vol. 6, Plant Cell and Tissue Culture, Humana Press, (1990)]).
이러한 소포자들은 유전자들의 분리(segregation)를 나타낸다. 소포자를 적합한 AHAS-억제제 제초제, 예컨대 이마제타피르 (예를 들어 PURSUIT.TM.) 또는 이마자목스 (예를 들어 RAPTOR.TM.) 또는 이마제타피르와 이마자목스의 50/50 혼합물 (예를 들어 ODYSSEY.TM.)의 존재 하에 배양하고, 이들은 제초제에 대한 저항성을 담당하는 돌연변이가 없는 소포자를 사망시킨다. 제초제에 대한 저항성을 담당하는 유전자를 보유하는 소포자는 생존하고, 배아를 생산하며, 배아가 하플로이드 식물을 형성한다. 그후, 염색체가 배가되어, 하플로이드 배가물이 생산된다.
기타 육종 방법이 본 발명에 따라 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 계통 육종이 주로 자가-수분성인 작물 예컨대 브라시카 및 캐놀라의 개선에 사용될 수 있다. 계통 육종은 2개의 유전자형을 교배시키는 것으로 시작되고, 이때 각각의 유전자형은 다른 유전자형에 없는 하나 이상의 원하는 특성을 가질 수 있거나 다른 유전자형을 보완한다. 2개의 원래의 어버이가 원하는 특성 모두를 제공하지 않는 경우, 추가적인 어버이가 교배 계획에 포함될 수 있다.
이러한 어버이들을 단순 또는 복합 방식으로 교배시켜, 단순 또는 복합 F1을 생산할 수 있다. F1 식물 하나 또는 여럿을 자가 교배시킴으로써 또는 2개의 F1을 이종교배 (즉, 형매 짝짓기(sib mating))시킴으로써 F1으로부터 F2 집단이 생산된다. 최상의 개체의 선별은 F2 세대에서 시작될 수 있고, F3에서 시작하여, 최상의 패밀리, 및 최상의 패밀리 내의 최상의 개체들이 선별된다. 유전가능성이 낮은 소질에 대한 선별의 유효성을 개선시키기 위해, 패밀리들의 반복된 테스트가 F4 세대에서 시작될 수 있다. 진전된 동종교배 단계 (즉, F6 및 F7)에서, 최상의 계통 또는 표현형적으로 유사한 계통들의 혼합물을 새로운 재배종으로서의 잠재적인 발매에 대해 테스트할 수 있다. 그러나, 계통 육종 방법은 개선된 AHAS-제초제 저항성 식물을 개발하기 위하여 하플로이드성 방법보다 더욱 시간 소모적인데, 이는 식물이 다중 세대에 대한 분리를 나타내고, 원하는 소질의 회복이 비교적 낮기 때문이다.
단일 종자 가계 (SSD) 절차가 개선된 품종을 육종하는데 또한 사용될 수 있다. 엄격한 의미에서 SSD 절차는 분리 집단을 식재하고, 식물 당 1개의 종자의 샘플을 수확하고, 단일 종자들의 집단을 사용하여 다음 세대를 식재하는 것을 지칭한다. 집단이 F2에서 원하는 수준의 동계교배로 진전되었을 때, 계통이 유래된 식물들은 각각 상이한 F2 개체로 거슬러 올라갈 것이다. 발아하지 못한 일부 종자 또는 하나 이상의 종자를 생산하지 못한 일부 식물로 인해, 집단 내의 식물의 수가 각각의 세대에서 감퇴된다. 그 결과, 본래는 F2 집단 내에 샘플링된 모든 식물이 세대 진행이 완료되었을 때 자손으로 나타나지는 않을 것이다.
다중-종자 절차에서, 캐놀라 육종자는 집단 내의 각각의 식물로부터 하나 이상의 꼬투리를 통상적으로 수확하고, 이들을 함께 타작하여 벌크(bulk)를 형성시킨다. 벌크의 일부분은 다음 세대를 식재하는데 사용하고, 일부분은 예비로 남겨둔다. 이 절차는 변형된 단일 종자 가계 또는 꼬투리-벌크 기술로 지칭되었다. 다중-종자 절차는 수확 시의 노고를 절약하기 위해 사용되었다. 꼬투리를 기계로 타작하는 것은 단일-종자 절차를 위해 손으로 각각으로부터 하나의 종자를 제거하는 것보다 상당히 더 빠르다. 다중-종자 절차는 각각의 동계교배 세대에 대해 집단의 동일한 개수의 종자를 식재하는 것을 또한 가능하게 한다. 충분한 종자가 수확되어, 발아하지 않았거나 종자를 생산하지 않은 식물들을 보상한다.
간단하게 유전되는, 고도로 유전성인 소질에 대한 유전자 또는 유전자들을 공급원 품종 또는 계통 (도너(donor) 어버이)로부터 또다른 바람직한 재배종 또는 순계 (순환 어버이) 내로 전달하는데 역교배 육종이 사용될 수 있다. 최초의 교배 후, 도너 어버이의 표현형을 지니는 개체들을 선별하고, 순환 어버이로 반복적으로 교배시킨다 (역교배시킨다). 역교배가 완료되었을 때, 생성된 식물은 순환 어버이의 속성 및 도너 어버이로부터 전달된 바람직한 소질을 가질 것으로 예상된다.
개선된 품종이 순환 선별을 통해 또한 개발될 수 있다. 이종접합성 개체들의 유전학적으로 가변성인 집단을 확인하거나 또는 여러 상이한 어버이들을 이종교배시킴으로써 생성시킨다. 개별적인 우월성, 우수한 자손, 또는 뛰어난 조합 능력을 기초로 최상의 식물을 선별한다. 선별된 식물을 이종교배시켜, 새로운 집단을 생산하고, 이러한 집단에서 추가적인 선별 사이클이 계속된다.
또다른 양상에서, 본 발명은 (a) AHAS 제초제 저항성 브라시카 식물인 제1 브라시카 계통을 제2 브라시카 계통과 교배시켜 분리 집단을 형성시키는 단계; (b) 증가된 AHAS 제초제 저항성에 대해 집단을 스크리닝하는 단계; 및 (c) 야생형 브라시카 식물에 비해 AHAS 저항성이 증가된 하나 이상의 집단 구성원을 선별하는 단계를 포함하는, AHAS 제초제에 대한 저항성이 있는 브라시카 식물을 생산하는 방법을 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 (a) 적어도 제1 AHAS 제초제 저항성 브라시카 계통을 제2 브라시카 계통과 교배시켜 분리 집단을 형성시키는 단계; (b) 증가된 AHAS 제초제 저항성에 대해 집단을 스크리닝하는 단계; 및 (c) AHAS 제초제 저항성이 증가된 하나 이상의 집단 구성원을 선별하는 단계를 포함하는, AHAS 제초제 저항성 소질을 브라시카 식물 내로 유전자이입시키는 방법을 제공한다.
별법적으로, 본 발명의 또다른 양상에서, 제1 및 제2 어버이 브라시카 식물 양쪽 모두가 본원에 기술된 바와 같은 AHAS 제초제 저항성 브라시카 식물일 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 바와 같은 AHAS 제초제 저항성이 증가된 브라시카 식물을 사용하여 생산된 임의의 브라시카 식물이 본 발명의 일부를 형성한다. 본원에서 사용된 교배는 자가교배, 형매교배, 역교배, 또다른 또는 동일한 어버이 계통에 대한 교배, 집단에 대한 교배 등을 의미할 수 있다.
본 발명은 유성 생식을 수반하는 통상적인 식물 육종을 통해 제초제-저항성 식물, 특히 제초제-저항성 브라시카 식물을 생산하는 방법을 또한 제공한다. 이 방법은 제초제에 대해 저항성인 제1 식물을 제초제에 대해 저항성이지 않은 제2 식물에 교배시키는 것을 포함한다. 제1 식물은 제초제 저항성 AHASL을 코딩하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 하나 이상 포함하는 트랜스제닉 식물 및 J05Z-07801, J04E-0139, J04E-0130, 또는 J04E-0122의 브라시카 식물의 제초제-저항성 특성을 포함하는 비-트랜스제닉 브라시카 식물이 예를 들어 포함되는 임의의 본 발명의 제초제 저항성 식물일 수 있다. 제2 식물은 제1 식물과 교배되었을 때 생육성 자손 식물 (즉, 종자)을 생산할 수 있는 임의의 식물일 수 있다. 전형적으로, 그러나 필수적이지는 않게, 제1 및 제2 식물은 동일한 종이다. 본 발명의 방법은 제1 교배물의 자손 식물을 제1 또는 제2 식물과 동일한 계통 또는 표현형의 식물에 역교배시키는 하나 이상의 세대를 추가로 수반할 수 있다. 별법적으로, 제1 교배물 또는 임의의 후속 교배물의 자손이 제1 또는 제2 식물과 상이한 계통 또는 표현형인 제3 식물에 교배될 수 있다. 본 발명의 방법은 제1 식물의 제초제 저항성 특성을 포함하는 식물을 선별하는 것을 추가적으로 수반할 수 있다.
본 발명은 유성 생식을 수반하는 통상적인 식물 육종을 통해 식물, 특히 제초제-저항성 브라시카 식물의 제초제-저항성을 증가시키는 방법을 또한 제공한다. 이 방법은 제초제에 대해 저항성인 제1 식물을 제초제에 대해 저항성이거나 저항성이지 않을 수 있거나 또는 제1 식물과 상이한 제초제 또는 제초제들에 대해 저항성일 수 있는 제2 식물에 교배시키는 것을 포함한다. 제1 식물은 제초제 저항성 AHASL을 코딩하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 하나 이상 포함하는 트랜스제닉 식물 및 J05Z-07801, J04E-0139, J04E-0130, 또는 J04E-0122의 브라시카 식물의 제초제-저항성 특성을 포함하는 비-트랜스제닉 브라시카 식물이 예를 들어 포함되는 임의의 본 발명의 제초제 저항성 식물일 수 있다. 제2 식물은 제1 식물과 교배되었을 때 생육성 자손 식물 (즉, 종자)을 생산할 수 있는 임의의 식물일 수 있다. 전형적으로, 그러나 필수적이지는 않게, 제1 및 제2 식물은 동일한 종이다; 더욱이, 제1 및 제2 식물은 상이한 종이지만 동일한 속인 식물 (예: 브라시카 준세아 × 브라시카 나푸스, 브라시카 준세아 × 브라시카 라파, 브라시카 준세아 × 브라시카 올레라세아(Brassica oleracea), 브라시카 준세아 × 브라시카 니그라(Brassica nigra) 등)일 수 있고, 또한, 제1 및 제2 식물은 상이한 속의 식물일 수 있다 (예: 브라시카 × 시나피스(Sinapis)). 이러한 본 발명의 방법에 의해 생산된 자손 식물은 제1 또는 제2 식물 중 하나 또는 양쪽 모두에 비교했을 때 제초제에 대한 저항성이 증가되었다. 제1 및 제2 식물이 상이한 제초제들에 대해 저항성인 경우, 자손 식물에는 조합된 제1 및 제2 식물의 제초제 저항성 특성들이 있을 것이다. 본 발명의 방법은 제1 교배물의 자손 식물을 제1 또는 제2 식물과 동일한 계통 또는 표현형의 식물에 역교배시키는 하나 이상의 세대를 추가로 수반할 수 있다. 별법적으로, 제1 교배물 또는 임의의 후속 교배물의 자손이 제1 또는 제2 식물과 상이한 계통 또는 표현형인 제3 식물에 교배될 수 있다. 본 발명의 방법은 제1 식물, 제2 식물, 또는 제1 및 제2 식물 양쪽 모두의 제초제 저항성 특성을 포함하는 식물을 선별하는 것을 추가적으로 수반할 수 있다.
본 발명의 식물은 트랜스제닉 식물 또는 비-트랜스제닉 식물일 수 있다. 이미다졸리논 및/또는 술포닐우레안 제초제에 대한 저항성이 증가된 비-트랜스제닉 브라시카 식물의 예로는 J05Z-07801, J04E-0139, J04E-0130, 또는 J04E-0122의 브라시카 식물; 또는 J05Z-07801, J04E-0139, J04E-0130, 또는 J04E-0122의 식물의 돌연변이체, 재조합체, 또는 유전자 조작된 유도체; 또는 J05Z-07801, J04E-0139, J04E-0130, 또는 J04E-0122의 식물의 임의의 자손; 또는 이러한 식물들 중 임의의 것의 자손인 식물; 또는 J05Z-07801, J04E-0139, J04E-0130, 또는 J04E-0122의 식물의 제초제 저항성 특성을 포함하는 식물이 포함된다.
본 발명은 하나 이상의 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자, 발현 카세트 또는 형질전환 벡터로 형질전환된 식물, 식물 기관, 식물 조직, 식물 세포, 종자, 및 비-인간 숙주 세포를 또한 제공한다. 이같은 형질전환된 식물, 식물 기관, 식물 조직, 식물 세포, 종자, 및 비-인간 숙주 세포는 각각 형질전환되지 않은 식물, 식물 조직, 식물 세포, 또는 비-인간 숙주 세포를 사망시키거나 이의 성장을 억제하는 제초제의 수준에서 하나 이상의 제초제에 대한 내성 또는 저항성이 강화되었다. 바람직하게는, 본 발명의 형질전환된 식물, 식물 조직, 식물 세포 및 종자는 브라시카 및 작물 식물이다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산된 브라시카 식물로부터 수득된 AHAS 제초제 저항성이 있는 브라시카 식물을 생산할 수 있는 브라시카 식물의 종자를 또한 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 제초제 저항성 소질이 있는 종자용으로 성장된 브라시카 식물로부터 수득된 AHAS 제초제 저항성이 있는 브라시카 식물의 종자로부터 성장된 식물, 뿐만 아니라 이같은 식물로부터의 식물의 일부분 및 조직 배양물을 또한 제공한다.
AHAS 제초제 저항성 브라시카 식물을 생산할 수 있는 브라시카 종자의 용기가 본원에서 또한 제공된다. 브라시카 종자의 용기는 임의의 개수, 중량 또는 부피의 종자를 함유할 수 있다. 예를 들어, 용기는 적어도 약 10개, 25개, 50개, 75개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 1500개, 2000개, 2500개, 3000개, 3500개, 4000개, 4500개, 5000개 또는 그 이상, 또는 이보다 많은 종자를 함유할 수 있다. 별법적으로, 용기는 적어도 약 1 온스, 5 온스, 10 온스, 1 파운드, 2 파운드, 3 파운드, 4 파운드, 5 파운드 또는 그 이상, 또는 이보다 많은 종자를 함유할 수 있다.
브라시카 종자의 용기는 당업계에서 입수가능한 임의의 용기일 수 있다. 비-제한적인 예로서, 용기는 상자, 자루, 패킷(packet), 파우치(pouch), 테이프 롤(tape roll), 페일(pail), 호일(foil), 또는 튜브일 수 있다.
또다른 양상에서, 브라시카 종자의 용기 내에 함유된 종자는 처리 종자 또는 미처리 종자일 수 있다. 한 양상에서, 발아를 개선시키도록, 예를 들어, 종자의 프라이밍(priming)에 의해, 또는 종자가 지니는 병원체에 대해 보호하기 위한 소독에 의해, 종자를 처리할 수 있다. 또다른 양상에서, 식재성, 종자 출아, 및 종자가 지니는 병원체에 대한 보호를 예를 들어 개선시키기 위한 임의의 이용가능한 코팅물로 종자를 코팅할 수 있다. 종자 코팅은 펠렛화, 필름 코팅 및 인크러스트먼트(encrustment)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의 형태의 종자 코팅일 수 있다.
본 발명은 본 발명의 AHASL1 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물로 식물을 형질전환시키는 것을 포함하는, 식물에서 AHAS 활성을 증가시키는 방법을 또한 제공한다. 이 방법은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 구축물을 하나 이상의 식물 세포 내로 도입하는 단계 및 이로부터 형질전환된 식물을 재생시키는 단계를 수반한다. 폴리뉴클레오티드 구축물은 하나 이상의, 본 발명의 제초제-저항성 AHASL 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드, 특히 서열 13, 14 또는 15에 기재된 뉴클레오티드 서열, 서열 3, 4 또는 5에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 이의 단편 및 변이체를 포함한다. 이 방법은 식물 세포에서 유전자 발현을 구동시킬 수 있는 프로모터의 사용을 추가로 수반한다. 바람직하게는, 이같은 프로모터는 구성성 프로모터 또는 조직-선호형 프로모터이다. 이러한 방법에 의해 생산된 식물은 형질전환되지 않은 식물에 비교했을 때 증가된 AHAS 활성, 특히 제초제-내성 AHAS 활성을 포함한다. 따라서, 이 방법은 AHAS 효소의 촉매적 활성을 방해하는 하나 이상의 제초제, 특히 이미다졸리논 제초제에 대한 식물의 저항성을 강화 또는 증가시키는 것에서 용도가 발견된다.
본 발명은 식물 세포에서의 발현을 구동시키는 프로모터에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물로 식물 세포를 형질전환시키는 단계 및 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환된 식물을 재생시키는 단계를 포함하는, 제초제-저항성 식물을 생산하는 방법을 제공한다. 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 제초제-저항성 AHASL 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 특히 서열 13, 14 또는 15에 기재된 뉴클레오티드 서열, 서열 3, 4 또는 5에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 이의 단편 및 변이체로부터 선택된다. 이러한 방법에 의해 생산된 제초제-저항성 식물은, 형질전환되지 않은 식물에 비교하여, 하나 이상의 제초제, 특히 AHAS 효소의 활성을 방해하는 제초제, 예컨대 이미다졸리논 제초제 또는 술포닐우레안 제초제에 대해 강화된 저항성을 포함한다.
본 발명은 식물, 식물 세포 및 기타 비-인간 숙주 세포에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자를 발현시키기 위한 발현 카세트를 제공한다. 발현 카세트는 제초제-저항성 AHASL 단백질을 코딩하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 당해 식물, 식물 세포 및 기타 숙주 세포에서 발현가능한 프로모터를 포함한다. 발현을 엽록체에 표적화시키는데 필요하다면, 발현 카세트는 엽록체 운반 펩티드를 코딩하는 작동가능하게 연결된 엽록체-표적화 서열을 또한 포함하여, 발현된 AHASL 단백질을 엽록체로 지시할 수 있다.
본 발명의 발현 카세트는 식물 또는 숙주 세포의 제초제 내성을 강화시키기 위한 방법에서 용도가 발견된다. 이 방법은 식물 또는 숙주 세포를 본 발명의 발현 카세트로 형질전환시키는 것을 수반하고, 이때 발현 카세트는 당해 식물 또는 숙주 세포에서 발현가능한 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터는 본 발명의 제초제-저항성 AHASL1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 이 방법은 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환된 식물을 재생시키는 것을 추가로 포함한다.
본원에서의 용어 "폴리뉴클레오티드 구축물"의 사용은 DNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물에 본 발명을 한정하도록 의도되지 않는다. 당업자는 리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드와 데옥시리보뉴클레오티드의 조합물로 구성된 폴리뉴클레오티드 구축물, 특히 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드가 본원에 개시된 방법에서 또한 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 구축물은 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 및 이들의 조합물로 구성된 것들을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 식물을 형질전환시키기 위하여 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 모든 폴리뉴클레오티드 구축물을 포함한다. 이같은 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드는 천연 발생 분자 및 합성 유사체 양쪽 모두를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 구축물은 단일 가닥 형태, 이중 가닥 형태, 헤어핀(hairpin), 스템-앤-루프(stem-and-loop) 구조 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 모든 형태의 폴리뉴클레오티드 구축물을 또한 포함한다. 또한, 본원에 개시된 각각의 뉴클레오티드 서열은 예시된 뉴클레오티드 서열의 상보물을 또한 포함하는 것으로 당업자에게 이해된다.
또한, 본 발명의 방법이 형질전환된 식물에서 하나 이상의 단백질, 또는 하나 이상의 RNA, 예를 들어, mRNA의 적어도 일부분에 상보적인 안티센스 RNA의 발현을 지시할 수 있는 폴리뉴클레오티드 구축물을 사용할 수 있는 것으로 인지된다. 전형적으로, 이같은 폴리뉴클레오티드 구축물은 5' 및 3' 전사 조절 영역에 작동가능하게 연결된 단백질에 대한 코딩 서열 또는 RNA로 구성된다. 별법적으로, 본 발명의 방법이 형질전환된 식물에서 단백질 또는 RNA의 발현을 지시할 수 없는 폴리뉴클레오티드 구축물을 사용할 수 있는 것으로 또한 인지된다.
또한, 당해 숙주 세포에서의 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해, 전형적으로 폴리뉴클레오티드가 당해 숙주 세포에서 유전자 발현을 구동시킬 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것으로 인지된다. 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 본 발명의 방법은 특정 프로모터에 의존하지 않는다. 당업계에 공지되어 있고 당해 숙주 세포에서 유전자 발현을 구동시킬 수 있는 임의의 프로모터의 사용이 방법에 포함된다.
본 발명은 AHASL1 폴리뉴클레오티드 분자 및 이의 단편 및 변이체를 포함한다. 이러한 뉴클레오티드 서열의 단편인 폴리뉴클레오티드 분자가 본 발명에 또한 포함된다. "단편"은 본 발명의 AHASL1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부분을 의미한다. 본 발명의 AHASL1 뉴클레오티드 서열의 단편은 AHASL1 단백질의 생물학적으로 활성인 부분을 코딩할 수 있거나, 또는 하기에 개시된 방법을 사용하여 혼성화 프로브 또는 PCR 프라이머로 사용될 수 있는 단편일 수 있다. 본 발명의 AHASL1 뉴클레오티드 서열들 중 하나의 일부분을 단리하고, AHASL1 단백질의 코딩된 부분을 발현시키고 (예를 들어, 시험관내 재조합에 의해), AHASL1 단백질의 코딩된 부분의 활성을 평가함으로써 AHASL1 단백질의 생물학적으로 활성인 부분이 제조될 수 있다. AHASL1 뉴클레오티드 서열의 단편인 폴리뉴클레오티드 분자는 의도된 용도에 따라 적어도 약 15개, 20개, 50개, 75개, 100개, 200개, 300개, 350개, 400개, 450개, 500개, 550개, 600개, 650개, 700개, 750개, 800개, 850개, 또는 900개의 뉴클레오티드, 또는 본원에 개시된 전장 뉴클레오티드 서열 내에 존재하는 뉴클레오티드의 개수까지를 포함한다.
본 발명의 AHASL1 단백질의 생물학적으로 활성인 부분을 코딩하는 AHASL1 뉴클레오티드 서열의 단편은 적어도 약 15개, 25개, 30개, 50개, 75개, 100개, 125개, 150개, 175개, 200개, 225개, 또는 250개의 인접 아미노산, 또는 본 발명의 전장 AHASL1 단백질 내에 존재하는 아미노산의 전체 개수까지를 코딩할 것이다. PCR 프라이머용 혼성화 프로브로서 유용한 AHASL1 뉴클레오티드 서열의 단편은 일반적으로 AHASL1 단백질의 생물학적으로 활성인 부분을 코딩할 필요가 없다.
본원에 개시된 뉴클레오티드 서열의 변이체인 폴리뉴클레오티드 분자 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명의 AHASL1 뉴클레오티드 서열의 "변이체"는 본원에 개시된 AHASL1 단백질을 코딩하지만 유전자 코드의 동의성으로 인해 보존적으로 상이한 서열을 포함한다. 주지된 분자 생물학 기술, 예컨대 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 및 혼성화 기술 (하기에 개요됨)을 사용하여 이러한 천연 발생 대립유전자 변이체를 확인할 수 있다. 변이체 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발을 사용함으로써 생성되었지만 하기 논의되는 바와 같이 본 발명에 개시된 AHASL1 단백질을 여전히 코딩하는, 합성에 의해 유래된 뉴클레오티드 서열을 또한 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 뉴클레오티드 서열 변이체는 본원에 개시된 특정 뉴클레오티드 서열에 대한 동일성이 적어도 약 75％, 80％, 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％일 것이다. 변이체 AHASL1 뉴클레오티드 서열은 본원에 개시된 AHASL1 단백질의 아미노산 서열에 대한 동일성이 적어도 약 75％, 80％, 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％인 아미노산 서열을 각각 갖는 AHASL1 단백질을 코딩할 것이다.
또한, 당업자는 본 발명의 뉴클레오티드 서열 내로 돌연변이가 도입됨으로써 AHASL1 단백질의 생물학적 활성을 변경시키지 않으면서 코딩된 AHASL1 단백질의 아미노산 서열이 변화될 수 있음을 추가로 이해할 것이다. 따라서, 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실이 코딩된 단백질 내로 도입되도록 본원에 개시된 상응하는 뉴클레오티드 서열 내로 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실을 도입함으로써 서열 11과 상이한 서열을 갖는 AHASL1 단백질을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자가 생성될 수 있다. 돌연변이는 표준 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있다. 이같은 변이체 뉴클레오티드 서열이 본 발명에 또한 포함된다.
예를 들어, 바람직하게는, 보존적 아미노산 치환이 하나 이상의 예상되는 비-필수 아미노산 잔기에서 이루어질 수 있다. "비-필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성을 변경시키지 않으면서 AHASL1 단백질의 야생형 서열 (예를 들어, 서열 1의 서열)로부터 변경될 수 있는 잔기인 한편, "필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성에 요구된다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄가 있는 아미노산 잔기로 교체되는 치환이다. 유사한 측쇄가 있는 아미노산 잔기들의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 이러한 패밀리에는 염기성 측쇄 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비-극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)가 있는 아미노산이 포함된다. 이같은 치환은 보존된 아미노산 잔기, 또는 보존된 모티프 내에 존재하는 아미노산 잔기들에 대해서는 이루어지지 않을 것이다.
본 발명의 단백질은 아미노산 치환, 결실, 말단절단 및 삽입을 포함하는 다양한 방식으로 변경될 수 있다. 이같은 조작 방법은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, DNA에서의 돌연변이에 의해 AHASL1 단백질의 아미노산 서열 변이체가 제조될 수 있다. 돌연변이유발 및 뉴클레오티드 서열 변경을 위한 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, [Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492]; [Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382]; 미국 특허 번호 4,873,192; [Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York)] 및 이에 인용된 참고문헌 참조. 당해 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적합한 아미노산 치환에 대한 안내를 거명에 의해 본원에 포함된 [Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)]에서 확인할 수 있다. 보존적 치환, 예컨대 한 아미노산을 성질이 유사한 또다른 아미노산을 교환하는 것이 바람직할 수 있다.
별법적으로, AHASL1 코딩 서열의 전체 또는 일부를 따라 무작위로 돌연변이를 도입함으로써, 예컨대 포화 돌연변이유발에 의해 변이체 AHASL1 뉴클레오티드 서열을 제조할 수 있고, 생성된 돌연변이체를 AHAS 활성에 대해 스크리닝하여, AHAS 활성 (제초제-저항성 AHAS 활성 포함)이 유지된 돌연변이체를 확인할 수 있다. 돌연변이유발 후, 코딩된 단백질을 재조합에 의해 발현시킬 수 있고, 단백질의 활성을 표준 분석 기술을 사용하여 결정할 수 있다.
따라서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 본원에 개시된 서열, 뿐만 아니라 이의 단편 및 변이체를 포함한다. 본 발명의 AHASL1 뉴클레오티드 서열, 및 이의 단편 및 변이체를 프로브 및/또는 프라이머로 사용하여, 또다른 식물에서 AHASL 상동체를 확인하고/하거나 클로닝할 수 있다. 이같은 프로브를 사용하여, 동일하거나 일치하는 단백질을 코딩하는 전사물 또는 게놈 서열을 검출할 수 있다.
이러한 방식으로, PCR, 혼성화 등과 같은 방법을 사용하여 본 발명의 서열과 실질적으로 동일한 서열을 확인할 수 있다. 예를 들어, [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY)] 및 [Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY)] 참조. 본원에 기재된 AHASL1 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편 및 변이체에 대한 서열 동일성을 기초로 단리된 AHASL 뉴클레오티드 서열이 본 발명에 포함된다.
혼성화 방법에서, 공지된 AHASL1 뉴클레오티드 서열 전체 또는 이의 일부분을 사용하여 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 이같은 cDNA 및 게놈 라이브러리의 구축 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있고, [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY)]에 개시되어 있다. 소위 혼성화 프로브는 게놈 DNA 단편, cDNA 단편, RNA 단편, 또는 기타 올리고뉴클레오티드일 수 있고, 검출가능한 기 예컨대 32P, 또는 임의의 또다른 검출가능한 마커, 예컨대 기타 방사성동위원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조인자로 표지될 수 있다. 본원에 개시된 공지된 AHASL1 뉴클레오티드 서열을 기초로 하는 합성 올리고뉴클레오티드를 표지함으로써 혼성화용 프로브를 제조할 수 있다. 공지된 AHASL1 뉴클레오티드 서열 또는 코딩된 아미노산 서열 내의 보존된 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 기초로 디자인된 동의성 프라이머가 추가적으로 사용될 수 있다. 프로브는 본 발명의 AHASL1 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편 또는 변이체의 적어도 약 12개, 바람직하게는 약 25개, 더욱 바람직하게는 약 50개, 75개, 100개, 125개, 150개, 175개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 또는 900개의 연속적인 뉴클레오티드에 엄격한 조건 하에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열의 영역을 전형적으로 포함한다. 혼성화용 프로브의 제조는 일반적으로 당업계에 공지되어 있고, 거명에 의해 본원에 포함된 [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)]에 개시되어 있다.
예를 들어, 본원에 개시된 전체 AHASL1 서열, 또는 이의 하나 이상의 일부분이 상응하는 AHASL1 서열 및 메신저 RNA에 특이적으로 혼성화할 수 있는 프로브로서 사용될 수 있다. 혼성화 기술은 플레이팅된 DNA 라이브러리의 혼성화 스크리닝을 포함한다 (플라크 또는 콜로니; 예를 들어, [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)] 참조).
엄격한 조건 하에 이같은 서열의 혼성화가 수행될 수 있다. "엄격한 조건" 또는 "엄격한 혼성화 조건"은 프로브가 다른 서열들에 대한 것보다 검출가능하게 큰 정도 (예를 들어, 배경에 비해 2배 이상)로 자신의 표적 서열에 혼성화할 조건을 의미한다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고, 상이한 환경에서 상이할 것이다.
전형적으로, 엄격한 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 염 농도는 약 1.5 M Na 이온 미만, 전형적으로는 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도 (또는 기타 염)이고, 온도는 짧은 프로브 (예를 들어, 뉴클레오티드 10개 내지 50개)에 대해서는 적어도 약 30℃, 긴 프로브 (예를 들어, 뉴클레오티드 50개 초과)에 대해서는 적어도 약 60℃인 조건일 것이다. 탈안정화제 예컨대 포름아미드의 첨가에 의해 엄격한 조건이 또한 달성될 수 있다. 예시적인 낮은 엄격성 조건은 37℃에서의 30 내지 35％ 포름아미드, 1 M NaCl, 1％ SDS (소듐 도데실 술페이트)의 완충제 용액으로의 혼성화, 및 50 내지 55℃에서의 1× 내지 2× SSC (20× SSC = 3.0 M NaCl/0.3 M 시트르산3나트륨)에서의 세정을 포함한다. 예시적인 중간 정도의 엄격성 조건은 37℃에서의 40 내지 45％ 포름아미드, 1 M NaCl, 1％ SDS에서의 혼성화, 및 55 내지 60℃에서의 0.5× 내지 1× SSC에서의 세정을 포함한다. 예시적인 높은 엄격성 조건은 37℃에서의 50％ 포름아미드, 1 M NaCl, 1％ SDS에서의 혼성화, 및 60 내지 65℃에서의 0.1× SSC에서의 세정을 포함한다. 임의적으로, 세정 완충제는 약 0.1％ 내지 약 1％ SDS를 포함할 수 있다. 혼성화 기간은 일반적으로 약 24시간 미만, 보통 약 4시간 내지 약 12시간이다.
특이성은 전형적으로 혼성화후 세정의 함수이고, 결정적인 인자는 이온 강도 및 최종 세정 용액의 온도이다. DNA-DNA 하이브리드에 대해, [Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284]의 식 Tm = 81.5℃ + 16.6 (log M) + 0.41 (％GC) - 0.61 (％ form) - 500/L [식중, M은 1가 양이온의 몰농도이고, ％GC는 DNA 내의 구아노신 및 사이토신 뉴클레오티드의 백분율이며, ％ form은 혼성화 용액 내의 포름아미드의 백분율이고, L은 염기쌍 내의 하이브리드의 길이이다]으로부터 Tm의 근사값을 구할 수 있다. Tm은 상보적인 표적 가닥의 50％가 완전하게 매칭되는 프로브에 혼성화하는 온도 (규정된 이온 강도 및 pH 하에서의 온도)이다. Tm은 각각 1％의 미스매칭에 대해 약 1℃만큼 감소된다; 따라서, 원하는 동일성의 서열에 혼성화하도록 Tm, 혼성화, 및/또는 세정 조건을 조정할 수 있다. 예를 들어, 동일성이 90％를 초과하는 서열을 탐구하는 경우, Tm이 10℃ 감소될 수 있다. 일반적으로, 규정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열 및 이의 상보물에 대한 열 융점 (Tm)보다 약 5℃ 더 낮도록 엄격한 조건이 선택된다. 그러나, 극도로 엄격한 조건은 열 융점 (Tm)보다 1℃, 2℃, 3℃ 또는 4℃ 더 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세정을 이용할 수 있고, 중등도로 엄격한 조건은 열 융점 (Tm)보다 6℃, 7℃, 8℃, 9℃ 또는 10℃ 더 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세정을 이용할 수 있으며, 낮은 엄격성 조건은 열 융점 (Tm)보다 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃ 또는 20℃ 더 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세정을 이용할 수 있다. 식, 혼성화 및 세정 조성물, 및 원하는 Tm을 사용하여, 당업자는 혼성화 및/또는 세정 용액의 엄격성에서의 변동이 고유하게 기술된다는 것을 이해할 것이다. 원하는 정도의 미스매칭으로 45℃ (수용액) 또는 32℃ (포름아미드 용액) 미만의 Tm이 초래되는 경우, 더 높은 온도가 사용될 수 있도록 SSC 농도를 증가시키는 것이 바람직하다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 안내가 [Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York)]; 및 [Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York)]에서 발견된다. [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)] 참조.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자 및 단백질은 서열 13, 14 및/또는 15의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 3, 4 및/또는 5의 아미노산 서열에 충분하게 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자 및 단백질을 포함하는 것으로 인지된다. 용어 "충분하게 동일한"은 제1 및 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 공통의 구조적 도메인 및/또는 공통의 기능적 활성을 갖도록 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에 대해 충분한 개수의 또는 최소 개수의 동일한 또는 등가 (예를 들어, 유사한 측쇄)의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 함유하는 제1 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 지칭하도록 본원에서 사용된다. 예를 들어, 동일성이 적어도 약 45％, 55％, 또는 65％, 바람직하게는 75％, 더욱 바람직하게는 85％, 95％, 또는 98％인 공통의 구조적 도메인을 함유하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열들이 충분하게 동일한 것으로 본원에서 정의된다.
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산의 서열 동일성을 결정하기 위해, 최적의 비교 목적으로 서열들을 정렬한다. 2개의 서열 간의 백분율 동일성은 서열들이 공유하는 동일한 위치들의 갯수의 함수이다 (즉, 동일성 백분율 = 동일한 위치의 갯수 / 위치 (예를 들어, 중복되는 위치)의 전체 갯수 ×100). 한 실시양태에서, 2개의 서열은 길이가 동일하다. 갭(gap)을 허용하거나 허용하지 않으면서, 하기에 기술된 것들과 유사한 기술을 사용하여 2개의 서열 간의 동일성 백분율을 결정할 수 있다. 동일성 백분율을 계산하는데 있어서, 전형적으로 정확한 매치가 카운팅된다.
수학적 알고리즘을 사용하여 2개의 서열 간의 동일성 백분율의 결정을 달성할 수 있다. 2개의 서열의 비교를 위해 사용된 수학적 알고리즘의 바람직한 비-제한적 예는 [Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]에서와 같이 변형된 [Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264]의 알고리즘이다. 이같은 알고리즘은 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 내로 혼입되었다. NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 워드(word) 길이 = 12로 BLAST 뉴클레오티드 검색을 수행하여, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자와 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 워드 길이 = 3으로 BLAST 단백질 검색을 수행하여, 본 발명의 단백질 분자에 대해 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해, Gapped BLAST가 [Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389]에 기술된 바와 같이 이용될 수 있다. 별법적으로, PSI-Blast를 사용하여, 분자들 간의 거리 관계를 검출하는 반복 검색을 수행할 수 있다. [Altschul et al. (1997) 상기 문헌] 참조. BLAST, Gapped BLAST, 및 PSI-Blast 프로그램을 사용하는 경우, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트(default) 파라메터가 사용될 수 있다. 서열 비교용으로 사용된 수학적 알고리즘의 또다른 바람직한 비-제한적 예는 [Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17]의 알고리즘이다. 이같은 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부분인 ALIGN 프로그램 (버젼 2.0) 내로 혼입되었다. 아미노산 서열들을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 사용하는 경우, PAM120 웨이트(weight) 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용할 수 있다. 검열(inspection)에 의해 수동으로 정렬을 또한 수행할 수 있다.
달리 언급되지 않는 한, 본원에서 제공된 서열 동일성/유사성 값은 본 발명의 전장 서열을 사용하여, 그리고 소프트웨어 패키지 Vector NTI Suite 버젼 9 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 내에 포함된 AlignX 프로그램 (디폴트 파라메터 사용) 또는 임의의 이와 등가인 프로그램을 사용하는 Clustal W 알고리즘 ([Nucleic Acid Research, 22(22):4673-4680, 1994])에 의한 다중 정렬을 사용하여 수득된 값을 지칭한다. "등가의 프로그램"은 임의의 2개의 당해 서열에 대해, 소프트웨어 패키지 Vector NTI Suite 버젼 9 내의 AlignX에 의해 생성된 상응하는 정렬에 비교했을 때, 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 매칭이 동일하고 서열 동일성 백분율이 동일한 정렬을 생성시키는 임의의 서열 비교 프로그램을 의미한다.
본 발명의 AHASL1 뉴클레오티드 서열은 천연 발생 서열, 뿐만 아니라 돌연변이체 형태, 특히 제초제-저항성 AHAS 활성을 포함하는 AHASL1 단백질을 코딩하는 돌연변이체 형태 양쪽 모두를 포함한다. 마찬가지로, 본 발명의 단백질은 천연 발생 단백질, 뿐만 아니라 이의 변종 및 변형된 형태 양쪽 모두를 포함한다. 이같은 변이체는 원하는 AHAS 활성을 계속 가질 수 있다. 명백하게, 변이체를 코딩하는 DNA에서 이루어진 돌연변이는 서열을 리딩 프레임 밖에 놓지 않을 것이고, 바람직하게는 2차 mRNA 구조를 일으킬 수 있는 상보적인 영역을 생성시키지 않을 것이다. EP 특허 출원 공개 번호 75,444 참조.
본원에 포함된 단백질 서열의 결실, 삽입 및 치환은 단백질의 특성에서의 근본적인 변화를 일으킬 것으로 예상되지 않는다. 그러나, 치환, 결실 또는 치환 전에 이의 정확한 효과를 예측하기 어려운 경우, 당업자는 일상적인 스크리닝 분석법에 의해 효과가 평가될 것임을 이해할 것이다. 즉, AHAS 활성 분석법에 의해 활성을 평가할 수 있다. 예를 들어, 거명에 의해 본원에 포함된 [Singh et al. (1988) Anal. Biochem. 171:173-179] 참조.
변이체 뉴클레오티드 서열 및 단백질은 돌연변이유발성 및 재조합유발성 절차 예컨대 DNA 셔플링(shuffling)으로부터 유래된 서열 및 단백질을 또한 포함한다. 이같은 절차로, 원하는 성질을 보유하는 새로운 AHASL 단백질이 생성되도록 하나 이상의 상이한 AHASL 코딩 서열이 조작될 수 있다. 이러한 방식으로, 실질적인 서열 동일성이 있고 시험관내에서 또는 생체내에서 상동 재조합될 수 있는 서열 영역들을 포함하는 관련 서열 폴리뉴클레오티드들의 집단으로부터 재조합 폴리뉴클레오티드들의 라이브러리가 생성된다. 예를 들어, 이러한 접근법을 사용하여, 당해 도메인을 코딩하는 서열 모티프를 본 발명의 AHASL1 유전자와 또다른 공지된 AHASL 유전자 사이에 셔플링하여, 당해 성질이 개선된 단백질, 예컨대 효소의 경우 Km이 증가된 단백질을 코딩하는 새로운 유전자를 수득할 수 있다. 이같은 DNA 셔플링을 위한 전략들이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, [Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751]; [Stemmer (1994) Nature 370:389-391]; [Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438]; [Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347]; [Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509]; [Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291]; 및 미국 특허 번호 5,605,793 및 5,837,458 참조.
본 발명의 뉴클레오티드 서열을 사용하여, 다른 생물, 특히 다른 식물, 더욱 특히 다른 쌍자엽 식물로부터 상응하는 서열을 단리할 수 있다. 이러한 방식으로, PCR, 혼성화 등과 같은 방법을 사용하여, 본원에 기재된 서열들에 대한 서열 상동성을 기초로 이같은 서열들을 확인할 수 있다. 본원에 기재된 전체 AHASL1 서열 또는 이의 단편에 대한 서열 동일성을 기초로 단리된 서열들이 본 발명에 포함된다. 따라서, AHASL 단백질을 코딩하고 엄격한 조건 하에 본원에 개시된 서열 또는 이의 단편에 혼성화하는 단리된 서열이 본 발명에 포함된다.
PCR 접근법에서, 임의의 당해 식물로부터 추출된 게놈 DNA 또는 cDNA로부터 상응하는 DNA 서열을 증폭시키기 위한 PCR 반응에서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드 프라이머가 디자인될 수 있다. PCR 프라이머 디자인 및 PCR 클로닝을 위한 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있고, [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)]에 개시되어 있다. [Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York)]; [Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York)]; 및 [Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York)]를 또한 참조한다. 공지된 PCR 방법에는 쌍을 이룬 프라이머, 네스티드(nested) 프라이머, 단일 특이적 프라이머, 동의성 프라이머, 유전자-특이적 프라이머, 벡터-특이적 프라이머, 부분적으로 미스매칭되는 프라이머 등을 사용하는 방법이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 AHASL1 폴리뉴클레오티드 서열은 당해 식물에서의 발현을 위한 발현 카세트 내에서 제공된다. 카셋트는 본 발명의 AHASL1 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 5' 및 3' 조절 서열을 포함할 것이다. "작동가능하게 연결된"은 프로모터와 제2 서열 간의 기능적인 연결을 의미하고, 이때 프로모터 서열은 제2 서열에 상응하는 DNA 서열의 전사를 개시시키고 매개한다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된은 연결될 핵산 서열들이 연속적이고, 2개의 단백질 코딩 영역을 연결시키는 것이 필요한 경우에는 연속적이고, 동일한 리딩 프레임 내에 있는 것을 의미한다. 카셋트는 생물 내로 공동-형질전환될 하나 이상의 추가적인 유전자를 추가적으로 함유할 수 있다. 별법적으로, 추가적인 유전자(들)이 다중 발현 카세트들 상에서 제공될 수 있다.
이같은 발현 카세트에는 조절 영역의 전사 조절 하에 있도록 AHASL1 폴리뉴클레오티드 서열을 삽입하기 위한 다수의 제한 부위가 제공된다. 발현 카세트는 선별성 마커 유전자를 추가적으로 함유할 수 있다.
발현 카세트는 전사의 5'-3' 방향으로 전사 및 번역 개시 영역 (즉, 프로모터), 본 발명의 AHASL1 폴리뉴클레오티드 서열, 및 식물에서 기능성인 전사 및 번역 종결 영역 (즉, 종결 영역)을 포함할 것이다. 프로모터는 식물 숙주 및/또는 본 발명의 AHASL1 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 천연 또는 유사성, 또는 외인성 또는 이종성일 수 있다. 추가적으로, 프로모터는 천연 서열일 수 있거나, 별법적으로 합성 서열일 수 있다. 프로모터가 식물 숙주에 대해 "외인성" 또는 "이종성"인 경우, 이는 프로모터가 도입되는 천연 식물에서 이러한 프로모터가 발견되지 않는 것을 의미한다. 프로모터가 본 발명의 AHASL1 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 "외인성" 또는 "이종성"인 경우, 이는 프로모터가 작동가능하게 연결된 본 발명의 AHASL1 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 천연 또는 천연 발생 프로모터가 아닌 것을 의미한다. 본원에서 사용된 키메라 유전자는 코딩 서열에 이종성인 전사 개시 영역에 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 포함한다.
이종성 프로모터를 사용하여 본 발명의 AHASL1 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 것이 바람직할 수 있지만, 천연 프로모터 서열이 사용될 수 있다. 이같은 구축물은 식물 또는 식물 세포에서의 AHASL1 단백질의 발현 수준을 변화시킬 것이다. 따라서, 식물 또는 식물 세포의 표현형이 변경된다.
종결 영역은 전사 개시 영역과 천연일 수 있거나, 작동가능하게 연결된 당해 AHASL1 서열과 천연일 수 있거나, 식물 숙주와 천연일 수 있거나, 또는 또다른 공급원으로부터 유래될 수 있다 (즉, 프로모터, 당해 AHASL1 폴리뉴클레오티드 서열, 식물 숙주 또는 이의 임의의 조합에 대해 외인성 또는 이종성). 아그로박테리움 투메파시엔스(A. tumefaciens)의 Ti-플라스미드, 예컨대 옥토핀 신타제 및 노팔린 신타제 종결 영역으로부터 편리한 종결 영역이 입수가능하다. [Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144]; [Proudfoot (1991) Cell 64:671-674]; [Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149]; [Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272]; [Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158]; [Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903]; 및 [Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639]를 또한 참조한다.
적합한 경우, 유전자(들)이 형질전환된 식물에서의 증가된 발현에 대해 최적화될 수 있다. 즉, 개선된 발현을 위해 식물이 선호하는 코돈을 사용하여 유전자들이 합성될 수 있다. 예를 들어, 숙주가 선호하는 코돈 용법의 검토를 위해 [Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11]를 참조한다. 예를 들어, 거명에 의해 본원에 포함된, 미국 특허 번호 5,380,831, 및 5,436,391, 및 [Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498]를 참조한다.
추가적인 서열 변형들이 세포성 숙주에서의 유전자 발현을 강화시키는 것으로 공지되어 있다. 여기에는 위조 폴리아데닐화 신호, 엑손-인트론 스플라이스 부위 신호, 트랜스포존-유사 반복부, 및 유전자 발현에 해로울 수 있는 또다른 잘 특성화된 서열의 제거가 포함된다. 숙주 세포에서 발현되는 공지된 유전자를 참조로 계산된 바와 같이, 소정의 세포성 숙주에 대해 평균인 수준으로 서열의 G-C 함량이 조정될 수 있다. 가능한 경우, 예상되는 헤어핀 2차 mRNA 구조를 피하도록 서열이 변형된다.
유전자 발현을 강화시키기 위한 뉴클레오티드 서열이 식물 발현 벡터에서 또한 사용될 수 있다. 여기에는 옥수수 AdhI, 인트론1 유전자의 인트론 ([Callis et al. Genes and Development 1:1183-1200, 1987]), 및 담배 모자이크 바이러스 (TMV), 옥수수 황화 반점 바이러스 및 알팔파 모자이크 바이러스로부터의 리더 서열 (W-서열) ([Gallie et al. Nucleic Acid Res. 15:8693-8711, 1987] 및 [Skuzeski et al. Plant Mol. Biol. 15:65-79, 1990])이 포함된다. 옥수수의 쉬룬켄트(shrunkent)-1 유전자좌로부터의 제1 인트론이 키메라 유전자 구축물에서 유전자의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 미국 특허 번호 5,424,412 및 5,593,874에는 유전자 발현 구축물에서의 특정 인트론의 사용이 개시되어 있고, [Gallie et al. Plant Physiol. 106:929-939, 1994]에서 인트론이 조직 특이적으로 유전자 발현을 조절하는데 유용한 것으로 또한 나타났다. AHAS 소형 서브유닛 유전자 발현을 추가로 강화시키거나 최적화하기 위해, 본 발명의 식물 발현 벡터가 매트릭스 부착 영역 (MAR)을 함유하는 DNA 서열을 또한 함유할 수 있다. 그러면, 이같은 변형된 발현 시스템으로 형질전환된 식물 세포는 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 과발현 또는 구성적 발현을 나타낼 수 있다.
발현 카세트는 발현 카세트 구축물 내에 5' 리더 서열을 추가로 함유할 수 있다. 이같은 리더 서열은 번역을 강화시키는 작용을 할 수 있다. 번역 리더는 당업계에 공지되어 있고, 피코르나바이러스 리더, 예를 들어, EMCV 리더 (엔세팔로마이오카르디티스 5' 비-코딩 영역) ([Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130]); 포티바이러스 리더, 예를 들어, TEV 리더 (담배 식각 바이러스) ([Gallie et al. (1995) Gene 165(2):233-238]), MDMV 리더 (옥수수 왜소 모자이크 바이러스) ([Virology 154:9-20]), 및 인간 면역글로불린 중쇄 결합 단백질 (BiP) ([Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94]); 알팔파 모자이크 바이러스의 코트 단백질 mRNA (AMV RNA 4)로부터의 비-번역 리더 ([Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625]); 담배 모자이크 바이러스 리더 (TMV) ([Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256]); 및 옥수수 황화 반점 바이러스 리더 (MCMV) ([Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385])가 포함된다. [Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968]를 또한 참조한다. 번역을 강화시키는 것으로 공지된 기타 방법들, 예를 들어, 인트론 등이 또한 사용될 수 있다.
발현 카세트의 제조에서, 알맞은 배향, 그리고 적합하다면 알맞은 리딩 프레임 내의 DNA 서열을 제공하도록 다양한 DNA 단편들이 조작될 수 있다. 이를 위해, 어댑터 또는 링커가 DNA 단편들을 연결하기 위해 사용될 수 있거나, 또는 다른 조작이 편리한 제한 부위, 과잉 DNA의 제거, 제한 부위의 제거 등을 제공하기 위해 수반될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 시험관내 돌연변이유발, 프라이머 복원, 제한, 어닐링(annealing), 재치환, 예를 들어, 염기전위 및 염기전환이 수반될 수 있다.
다수의 프로모터가 본 발명의 실행에서 사용될 수 있다. 원하는 결과를 기초로 프로모터가 선택될 수 있다. 핵산이 구성적 프로모터, 조직-선호형 프로모터 또는 식물에서의 발현을 위한 기타 프로모터와 조합될 수 있다.
이같은 구성적 프로모터에는, 예를 들어, WO 99/43838 및 미국 특허 번호 6,072,050에 개시된 Rsyn7 프로모터 및 기타 구성적 프로모터의 코어(core) 프로모터; 코어 CaMV 35S 프로모터 ([Odell et al. (1985) Nature 313:810-812]); 벼 액틴 ([McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171]); 유비퀴틴 ([Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632] 및 [Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689]); pEMU ([Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588]); MAS ([Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730]); ALS 프로모터 (미국 특허 번호 5,659,026) 등이 포함된다. 기타 구성적 프로모터에는, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142; 및 6,177,611에 기술된 것들이 포함된다.
조직-선호형 프로모터를 사용하여, 강화된 AHASL1 발현을 특정 식물 조직 내로 표적화할 수 있다. 이같은 조직-선호형 프로모터에는 잎-선호형 프로모터, 뿌리-선호형 프로모터, 종자-선호형 프로모터, 및 줄기-선호형 프로모터가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 조직-선호형 프로모터에는 [Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265]; [Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol 38(7):792-803]; [Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343]; [Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168]; [Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341]; [Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535]; [Canevascini et al. (1996) Plant Physiol 112(2):513-524]; [Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol 35(5):773-778]; [Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196]; [Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol 23(6):1129-1138]; [Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590]; 및 [Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505]에 기술된 것들이 포함된다. 필요하다면 약한 발현을 위해 이같은 프로모터들이 변형될 수 있다.
한 실시양태에서, 당해 핵산이 발현을 위해 엽록체에 표적화될 수 있다. 이러한 방식으로, 당해 핵산이 엽록체 내로 직접적으로 삽입되지 않는 경우, 발현 카세트는 당해 유전자 생성물을 엽록체로 지시하는 엽록체 운반 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 엽록체-표적화 서열을 추가적으로 함유할 것이다. 이같은 운반 펩티드는 당업계에 공지되어 있다. 엽록체-표적화 서열과 관련하여, "작동가능하게 연결된"은 2개의 서열이 연속적이고, 동일한 리딩 프레임 내에 있도록, 운반 펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (즉, 엽록체-표적화 서열)이 본 발명의 AHASL 폴리뉴클레오티드에 연결되는 것을 의미힌다. 예를 들어, [Von Heijne et al. (1991) Plant Mol Biol Rep. 9:104-126]; [Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550]; [Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968]; [Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421]; 및 [Shah et al. (1986) Science 233:478-481] 참조. 본 발명의 AHASL1 단백질이 천연 엽록체 운반 펩티드를 포함하는 경우, 엽록체-표적화 서열을 본 발명의 성숙형 AHASL1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5'-말단에 작동가능하게 연결시킴으로써 당업계에 공지된 임의의 엽록체 운반 펩티드가 본 발명의 성숙형 AHASL1 단백질의 아미노산 서열에 융합될 수 있다.
엽록체 표적화 서열은 당업계에 공지되어 있고, 리불로스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제 (Rubisco) ([de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol Biol. 30:769-780]; [Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342]); 5-(에놀피루빌)쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS) ([Archer et al. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810]); 트립토판 신타제 ([Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(11):6081-6087]); 플라스토시아닌 ([Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(33):20357-20363]); 코리스메이트 신타제 ([Schmidt et al. (1993) J. Biol Chem. 268(36):27447-27457]); 및 광-수확(light harvesting) 엽록소 a/b 결합 단백질 (LHBP) ([Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999])의 엽록체 소형 서브유닛이 포함된다. [Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126]; [Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550]; [Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968]; [Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421]; 및 [Shah et al. (1986) Science 233:478-481]을 또한 참조한다.
엽록체의 형질전환 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, [Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530]; [Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917]; [Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606] 참조. 이 방법은 선별성 마커를 함유하는 DNA의 입자 총 전달, 및 상동 재조합을 통한 색소체 게놈으로의 DNA의 표적화에 의존한다. 추가적으로, 핵에 의해 코딩되고 색소체에 지시되는 RNA 중합효소의 조직-선호형 발현에 의한 침묵성 색소체-보유 트랜스진(transgene)의 트랜스활성화(transactivation)에 의해 색소체 형질전환이 달성될 수 있다. 이같은 시스템이 [McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305]에서 보고되었다.
엽록체에 표적화될 당해 핵산은 식물 핵과 이러한 기관 사이의 코돈 용법에서의 차이를 설명하도록 엽록체에서의 발현에 대해 최적화될 수 있다. 이러한 방식으로, 엽록체-선호형 코돈을 사용하여 당해 핵산이 합성될 수 있다. 예를 들어, 거명에 의해 본원에 포함된 미국 특허 번호 5,380,831 참조.
본원에 논의된 바와 같이, 본 발명의 AHASL1 뉴클레오티드 서열은 제초제-내성 AHASL1 단백질을 코딩하는 유전자를 게놈 내에 포함하는 식물의 식물 제초제 내성을 강화시키는 것에서 용도가 발견된다. 이같은 유전자는 내인성 유전자 또는 트랜스진일 수 있다. 추가적으로, 특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산 서열은 원하는 표현형의 식물을 생성시키기 위해 당해 폴리뉴클레오티드 서열들의 임의의 조합과 스태킹될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 구충 및/또는 살충 활성이 있는 폴리펩티드, 예를 들어, 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 독소 단백질 (미국 특허 번호 5,366,892; 5,747,450; 5,737,514; 5,723,756; 5,593,881; 및 [Geiser et al. (1986) Gene 48:109]에 기술됨)을 코딩하는 임의의 또다른 폴리뉴클레오티드와 스태킹될 수 있다. 생성된 조합물은 당해 폴리뉴클레오티드들 중 임의의 하나의 다중 카피를 또한 포함할 수 있다.
이러한 뉴클레오티드 서열들과 함께, AHASL1 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 메신저 RNA (mRNA)의 적어도 일부분에 대해 상보적인 안티센스 구축물이 구축될 수 있는 것으로 인지된다. 안티센스 뉴클레오티드는 상응하는 mRNA와 혼성화하도록 구축된다. 안티센스 서열이 상응하는 mRNA에 혼성화하고 이의 발현을 방해하는 한, 안티센스 서열의 변형이 이루어질 수 있다. 이러한 방식으로, 상응하는 안티센스 서열에 대한 서열 동일성이 70％, 바람직하게는 80％, 더욱 바람직하게는 85％인 안티센스 구축물이 사용될 수 있다. 또한, 안티센스 뉴클레오티드의 일부분이 표적 유전자의 발현을 파괴하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 적어도 뉴클레오티드 50개, 뉴클레오티드 100개, 뉴클레오티드 200개, 또는 그 이상의 서열이 사용될 수 있다.
본 발명의 뉴클레오티드 서열은 식물에서 내인성 유전자의 발현을 억제하도록 센스 배향으로 또한 사용될 수 있다. 센스 배향의 뉴클레오티드 서열을 사용하여 식물에서 유전자 발현을 억제하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이 방법은 내인성 유전자의 전사물에 상응하는 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부분에 작동가능하게 연결된 식물에서의 발현을 구동시키는 프로모터를 포함하는 DNA 구축물로 식물을 형질전환시키는 것을 일반적으로 수반한다. 전형적으로, 이같은 뉴클레오티드 서열은 내인성 유전자의 전사물의 서열에 대해 실질적인 서열 동일성이 있고, 바람직하게는 서열 동일성이 약 65％를 초과하며, 더욱 바람직하게는 서열 동일성이 약 85％를 초과하고, 가장 바람직하게는 서열 동일성이 약 95％를 초과한다. 미국 특허 번호 5,283,184 및 5,034,323 (거명에 의해 본원에 포함됨) 참조.
본 발명의 제초제-저항성 AHASL1 폴리뉴클레오티드에서 식물 형질전환에 대한 선별성 마커 유전자로서의 용도가 발견되는 한편, 본 발명의 발현 카세트는 형질전환된 세포의 선별을 위한 또다른 선별성 마커 유전자를 포함할 수 있다. 본 발명의 것들이 포함되는 선별성 마커 유전자는 형질전환된 세포 또는 조직의 선별용으로 사용된다. 마커 유전자에는 항생제 저항성을 코딩하는 유전자, 예컨대 네오마이신 포스포트랜스페라제 II (NEO) 및 히그로마이신 포스포트랜스페라제 (HPT)를 코딩하는 것들, 뿐만 아니라 제초제 화합물, 예컨대 글루포시네이트 암모늄, 브로목시닐, 이미다졸리논 및 2,4-디클로로페녹시아세테이트 (2,4-D)에 대한 저항성을 부여하는 유전자가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 일반적으로, [Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511]; [Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318]; [Yao et al. (1992) Cell 71:63-72]; [Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422]; [Barkley et al. (1980) The Operon, pp. 177-220]; [Hu et al. (1987) Cell 48:555-566]; [Brown et al. (1987) Cell 49:603-612]; [Figge et al. (1988) Cell 52:713-722]; [Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400-5404]; [Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553]; [Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483]; [Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg]; [Reines et al. (1993) Proc. Natl Acad. Sci. USA 90:1917-1921]; [Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356]; [Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956]; [Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076]; [Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653]; [Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162]; [Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595]; [Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094-1104]; [Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg]; [Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551]; [Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919]; [Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin)]; [Gill et al. (1988) Nature 334:721-724] 참조. 이같은 개시내용들은 거명에 의해 본원에 포함된다.
선별성 마커 유전자들의 상기 목록은 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 임의의 선별성 마커 유전자가 본 발명에서 사용될 수 있다.
본 발명의 AHASL1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자는 생성된 식물의 제초제, 특히 이미다졸리논 제초제에 대한 저항성이 강화되도록 식물을 형질전환시키기 위한 벡터에서 사용될 수 있다. 식물에서 제초제 저항성을 부여하는데 있어서 본 발명의 단리된 AHASL1 폴리뉴클레오티드 분자는 벡터에서 단독으로 또는 AHAS의 소형 서브유닛 (AHASS) 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 조합되어 사용될 수 있다. 거명에 의해 본원에 포함된 미국 특허 번호 6,348,643 참조.
따라서, 본 발명은 본 발명의 선별성 마커 유전자를 포함하는 형질전환 벡터를 제공한다. 선별성 마커 유전자는 본 발명의 제초제-저항성 AHASL 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 숙주 세포에서의 발현을 구동시키는 프로모터를 포함한다. 형질전환 벡터는 숙주 세포에서 발현될 당해 유전자를 추가적으로 포함할 수 있고, 원한다면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 엽록체-표적화 서열을 또한 포함할 수 있다.
본 발명은 당해 유전자로 형질전환된 세포를 선별하기 위해 본 발명의 형질전환 벡터를 사용하는 방법을 추가로 제공한다. 이같은 방법은 숙주 세포를 형질전환 벡터로 형질전환시키는 단계, 형질전환되지 않은 숙주 세포를 사망시키거나 이의 성장을 억제하는 수준의 이미다졸리논 또는 술포닐우레안 제초제에 세포를 노출시키는 단계, 및 형질전환된 숙주 세포를 제초제의 존재 하에 성장하는 능력에 의해 확인하는 단계를 수반한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 숙주 세포는 식물 세포이고, 선별성 마커 유전자는 식물 세포에서의 발현을 구동시키는 프로모터를 포함한다.
본 발명의 형질전환 벡터는 당해 유전자로 형질전환된 식물을 생산하는데 사용될 수 있다. 형질전환 벡터는 본 발명의 선별성 마커 유전자, 및 형질전환된 식물 내로 도입되고, 전형적으로는 이러한 식물에서 발현될 유전자를 포함할 것이다. 이같은 선별성 마커 유전자는 숙주 세포에서의 발현을 구동시키는 프로모터에 작동가능하게 연결된 본 발명의 제초제-저항성 AHASL1 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 식물 및 식물 세포에서의 사용을 위해, 형질전환 벡터는 식물 세포에서의 발현을 구동시키는 프로모터에 작동가능하게 연결된 본 발명의 제초제-저항성 AHASL1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 선별성 마커 유전자를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 식물에서의 발현을 구동시키는 프로모터를 포함하는 식물 발현 벡터에 또한 관련된다. 단리된 폴리뉴클레오티드 분자는 AHASL1 단백질, 특히 서열 2, 3, 4, 5 또는 6에 기재된 아미노 서열을 포함하는 AHASL1 단백질, 또는 이의 기능성 단편 및 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명의 식물 발현 벡터는 프로모터가 식물 세포에서의 유전자 발현을 구동시킬 수 있는 한 특정 프로모터에 좌우되지 않는다. 바람직한 프로모터에는 구성적 프로모터 및 조직-선호형 프로모터가 포함된다.
본 발명의 당해 유전자는 원하는 결과에 따라 변한다. 예를 들어, 식물 내의 지방산 조성을 변형시키는 것, 식물의 아미노산 함량을 변경시키는 것, 식물의 곤충 및/또는 병원체 방어 메커니즘을 변경시키는 것 등을 포함하여 표현형에서의 다양한 변화가 관심 대상일 수 있다. 식물에서의 이종성 생성물의 발현 또는 내인성 생성물의 증가된 발현을 제공함으로써 이러한 결과들이 달성될 수 있다. 별법적으로, 식물에서의 하나 이상의 내인성 생성물, 특히 효소 또는 보조인자의 발현의 감소를 제공함으로써 결과들이 달성될 수 있다. 이러한 변화들은 형질전환된 식물의 표현형에서의 변화를 초래한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 당해 유전자에는 곤충 저항성 유전자, 예를 들어, 바실루스 투린지엔시스 독소 단백질 유전자 (미국 특허 번호 5,366,892; 5,747,450; 5,736,514; 5,723,756; 5,593,881; 및 [Geiser et al. (1986) Gene 48:109])가 포함된다.
본 발명의 AHASL1 단백질 또는 폴리펩티드는 예를 들어 브라시카 식물로부터 정제될 수 있고, 조성물에서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 AHASL1 단백질을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 사용하여, 본 발명의 AHASL1 단백질을 대장균 또는 효모와 같은 미생물에서 발현시킬 수 있다. 발현된 AHASL1 단백질을 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 대장균 또는 효모의 추출물로부터 정제할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 식물에서의 발현을 구동시키는 프로모터를 포함하는 식물 발현 벡터로 식물을 형질전환시키는 것을 포함하는, 제초제에 대해 저항성인 트랜스제닉 식물을 생성시키는 방법에 또한 관련된다. 단리된 폴리뉴클레오티드 분자는 본 발명의 AHASL1 단백질, 특히 서열 2, 3, 4, 5 또는 6에 기재된 아미노산 서열, 서열 12, 13, 14, 15 또는 16에 의해 코딩되는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열들의 기능성 단편 및 변이체를 포함하는 AHASL1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산된 비-트랜스제닉 브라시카 식물, 트랜스제닉 식물, 및 이같은 비-트랜스제닉 및 트랜스제닉 식물의 자손 및 기타 후손에 또한 관련되고, 이러한 식물들은 AHAS 효소를 방해하는 제초제, 특히 이미다졸리논 및 술포닐우레아 제초제에 대해 강화된 또는 증가된 저항성을 나타낸다.
본 발명의 AHASL1 폴리뉴클레오티드, 특히 제초제-저항성 AHASL1 단백질을 코딩하는 것들은 제초제-내성 식물의 저항성을 강화시키는 방법에서 용도가 발견된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제초제-내성 식물은 제초제-내성 또는 제초제 저항성 AHASL 단백질을 포함한다. 제초제-내성 식물에는 제초제-내성 AHASL 뉴클레오티드 서열로 형질전환된 식물 및 제초제-내성 AHASL 단백질을 코딩하는 내인성 유전자를 게놈 내에 포함하는 식물 양쪽 모두가 포함된다. 이같은 제초제-내성 식물은 제초제-내성을 위해 유전자 조작된 제초제-내성 식물 또는 재조합 DNA를 수반하지 않는 수단에 의해 개발된 제초제-내성 식물 예컨대 본 발명의 브라시카 식물일 수 있다. 제초제-내성 AHASL 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 제초제-내성 AHASL 단백질을 코딩하는 내인성 유전자를 포함하는 제초제-내성 식물에는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 식물, 및 당업계에 공지된 것들이 포함된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,013,659, 5,731,180, 5,767,361, 5,545,822, 5,736,629, 5,773,703, 5,773,704, 5,952,553 및 6,274,796 (모두 거명에 의해 본원에 포함됨) 참조. 제초제-내성 식물의 저항성을 강화시키는 이같은 방법은 본 발명의 제초제 저항성 AHASL1 폴리뉴클레오티드, 특히 서열 12, 13, 14, 15, 또는 16에 기재된 제초제-저항성 AHASL1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 서열 2, 3, 4, 5, 또는 6에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 제초제-저항성 AHAS 활성을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드들의 단편 및 변이체에 작동가능하게 연결된 식물 세포에서의 발현을 구동시키는 프로모터를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 구축물로 제초제-내성 식물을 형질전환시키는 것을 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 구축물로의 형질전환 전의 제초제-저항성 식물에 비교했을 때, 이러한 방법에 의해 생산된 식물은 하나 이상의 제초제에 대한 저항성이 강화된다.
수많은 식물 형질전환 벡터 및 식물의 형질전환 방법이 이용가능하다. 예를 들어, [An, G. et al. (1986) Plant Pysiol, 81:301-305]; [Fry, J., et al. (1987) Plant Cell Rep. 6:321-325]; [Block, M. (1988) Theor. Appl Genet. 76:767-774]; [Hinchee, et al. (1990) Stadler. Genet. Symp. 203212.203-212]; [Cousins, et al. (1991) Aust. J. Plant Physiol. 18:481-494]; [Chee, P. P. and Slightom, J. L. (1992) Gene. 118:255-260]; [Christou, et al. (1992) Trends. Biotechnol. 10:239-246]; [D'Halluin, et al. (1992) Bio/Technol. 10:309-314]; [Dhir, et al. (1992) Plant Physiol. 99:81-88]; [Casas et al. (1993) Proc. Nat. Acad Sci. USA 90:11212-11216]; [Christou, P. (1993) In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant; 29P:119-124]; [Davies, et al. (1993) Plant Cell Rep. 12:180-183]; [Dong, J. A. and Mchughen, A. (1993) Plant Sci. 91:139-148]; [Franklin, C. I. and Trieu, T. N. (1993) Plant. Physiol. 102:167]; [Golovkin, et al. (1993) Plant Sci. 90:41-52]; [Guo Chin Sci. Bull. 38:2072-2078]; [Asano, et al. (1994) Plant Cell Rep. 13]; [Ayeres N. M. and Park, W. D. (1994) Crit. Rev. Plant. Sci. 13:219-239]; [Barcelo, et al. (1994) Plant. J. 5:583-592]; [Becker, et al. (1994) Plant. J. 5:299-307]; [Borkowska et al. (1994) Acta. Physiol Plant. 16:225-230]; [Christou, P. (1994) Agro. Food. Ind. Hi Tech. 5: 17-27]; [Eapen et al. (1994) Plant Cell Rep. 13:582-586]; [Hartman, et al. (1994) Bio-Technology 12: 919923]; [Ritala, et al. (1994) Plant. Mol. Biol. 24:317-325]; 및 [Wan, Y. C. and Lemaux, P. G. (1994) Plant Physiol. 104:3748] 참조.
본 발명의 방법은 폴리뉴클레오티드 구축물을 식물 내로 도입하는 것을 수반한다. "도입"은 구축물이 식물의 세포의 내부로 입수되는 방식으로 폴리뉴클레오티드 구축물을 식물에 제시하는 것을 의미한다. 폴리뉴클레오티드 구축물이 식물의 하나 이상의 세포의 내부로 입수되는 한 본 발명의 방법은 폴리뉴클레오티드 구축물을 식물에 도입하는 특정 방법에 좌우되지 않는다. 폴리뉴클레오티드 구축물을 식물 내로 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 안정적인 형질전환 방법, 일시적인 형질전환 방법 및 바이러스-매개 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
"안정적인 형질전환"은 식물 내로 도입된 폴리뉴클레오티드 구축물이 식물의 게놈 내로 통합되고, 이의 자손에 의해 유전될 수 있는 것을 의미한다. "일시적인 형질전환"은 식물 내로 도입된 폴리뉴클레오티드 구축물이 식물의 게놈 내로 통합되지 않는 것을 의미한다.
식물 및 식물 세포의 형질전환을 위해, 식물 및 식물 세포에서의 뉴클레오티드 서열의 발현에 적절한 당업계에 공지된 임의의 벡터 내로 표준 기술을 사용하여 본 발명의 뉴클레오티드 서열이 삽입된다. 벡터의 선택은 바람직한 형질전환 기술 및 형질전환될 표적 식물 종에 좌우된다. 본 발명의 한 실시양태에서, AHASL1 뉴클레오티드 서열이 식물 세포에서의 높은 수준의 발현에 대해 공지된 식물 프로모터에 작동가능하게 연결된 후, 이러한 구축물이 이미다졸리논 제초제에 감수성인 식물 내로 도입되고, 형질전환된 식물이 재생된다. 형질전환된 식물은 형질전환되지 않은 식물을 사망시키거나 실질적으로 손상시킬 수준의 이미다졸리논 제초제에의 노출에 대해 내성이다. 이러한 방법은 임의의 식물 종에 적용될 수 있지만, 작물, 특히 하나 이상의 제초제, 특히 이미다졸리논 제초제의 존재 하에 전형적으로 성장되는 작물에 적용될 때 가장 유익하다.
식물 발현 카세트를 구축하고 외래 핵산을 식물 내로 도입하기 위한 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있고, 기존에 기술되어 있다. 예를 들어, 종양-도입 (Ti) 플라스미드 벡터를 사용하여 외래 DNA를 식물 내로 도입할 수 있다. 아그로박테리움(Agrobacterium)을 기초로 하는 형질전환 기술이 당업계에 주지되어 있다. 아그로박테리움 종 (예를 들어, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes))는 플라스미드 (Ti 또는 Ri 플라스미드), 및 아그로박테리움으로의 감염 후에 식물에 전달되는 T-DNA 요소를 포함한다. T-DNA (전달된 DNA)는 식물 세포의 게놈 내로 통합된다. T-DNA는 Ri- 또는 Ti-플라스미드 상에 위치할 수 있거나, 또는 소위 이원성 벡터 내에 별도로 포함된다. 아그로박테리움-매개 형질전환을 위한 방법이, 예를 들어, [Horsch RB et al. (1985) Science 225:1229f]에 기술되어 있다. 아그로박테리움-매개 형질전환은 쌍자엽 식물 및 단자엽 식물 양쪽 모두에서 사용될 수 있다. 아그로박테리움에 의한 식물의 형질전환이 [White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, S. D. Kung and R. Wu, ed., Academic Press, 1993, pp. 15-38]; [Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, S. D. Kung and R. Wu, ed., Academic Press, pp. 128-143]; [Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225]에 기술되어 있다. 외래 DNA 전달에 사용되는 기타 방법에는 PEG 매개 원형질체 형질전환, 전기천공, 미세주입 위스커(whisker), 및 직접적인 DNA 흡수를 위한 바이오리스틱(biolistics) 또는 미세발사체(microprojectile) 포격의 사용이 수반된다. 이같은 방법들은 당업계에 공지되어 있다 (미국 특허 번호 5,405,765 (Vasil 등); [Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250]; [Scheid et al., (1991) Mol Gen. Genet, 228: 104-112]; [Guerche et al., (1987) Plant Science 52: 111-116]; [Neuhause et al., (1987) Theor. Appl Genet. 75: 30-36]; [Klein et al., (1987) Nature 327: 70-73]; [Howell et al., (1980) Science 208:1265]; [Horsch et al., (1985) Science 227: 1229-1231]; [DeBlock et al., (1989) Plant Physiology 91: 694-701]; [Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press, Inc. (1988)] 및 [Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press, Inc. (1989)]). 형질전환 방법은 형질전환될 식물 세포, 사용된 벡터의 안정성, 유전자 생성물의 발현 수준 및 기타 파라메터에 좌우된다.
뉴클레오티드 서열을 식물 세포 내로 도입하고, 이어서 식물 게놈 내로 삽입하는 또다른 적절한 방법에는 [Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334]의 미세주입, [Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606]에 기술된 전기천공, 미국 특허 번호 5,563,055 (Townsend 등), 미국 특허 번호 5,981,840 (Zhao 등)에 기술된 아그로박테리움-매개 형질전환, [Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722]에 기술된 직접적인 유전자 전달, 및 미국 특허 번호 4,945,050 (Sanford 등); 미국 특허 번호 5,879,918 (Tomes 등); 미국 특허 번호 5,886,244 (Tomes 등); 미국 특허 번호 5,932,782 (Bidney 등); [Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin)]; [McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926]에 예를 들어 기술된 탄도 입자 가속화; 및 Lec1 형질전환 (WO 00/28058)이 포함된다. [Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477]; [Sanford et al. (1987) Paniculate Science and Technology 5:27-37] (양파); [Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674] (대두); [McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926] (대두); [Finer and McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182] (대두); [Singh et al. (1998) Theor. Appl Genet. 96:319-324] (대두); [Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740] (벼); [Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309] (옥수수); [Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563] (옥수수); 미국 특허 번호 5,240,855 (Tomes); 미국 특허 번호 5,322,783 및 5,324,646 (Buising 등); [Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin)] (옥수수); [Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444] (옥수수); [Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839] (옥수수); [Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311:763-764]; 미국 특허 번호 5,736,369 (Bowen 등) (곡류); [Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349] (백합과); [De Wet et al. (1985) The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197-209] (꽃가루); [Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418] 및 [Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566] (위스커-매개 형질전환); [D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505] (전기천공); [Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255] 및 [Christou and Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413] (벼); [Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750] (아그로박테리움 투메파시엔스를 통한 옥수수)를 또한 참조하고, 상기 문헌들 모두는 거명에 의해 본원에 포함된다.
식물을 바이러스 또는 바이러스 핵산과 접촉시킴으로써 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 식물 내로 도입될 수 있다. 일반적으로, 이같은 방법은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 구축물을 바이러스 DNA 또는 RNA 분자 내에 혼입시키는 것을 수반한다. 본 발명의 AHASL1 단백질이 바이러스 다기능단백질(polyprotein)의 일부분으로 먼저 합성될 수 있고, 그후 이러한 다기능단백질이 생체내에서 또는 시험관내에서 단백질분해에 의해 프로세싱되어 원하는 재조합 단백질이 생산될 수 있는 것으로 인지된다. 또한, 본 발명의 프로모터가 바이러스 RNA 중합효소에 의한 전사에 사용되는 프로모터를 또한 포함하는 것으로 인지된다. 바이러스 DNA 또는 RNA 분자를 수반하는, 폴리뉴클레오티드 구축물을 식물 내로 도입하고 구축물 내에 코딩된 단백질을 발현시키는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 거명에 의해 본원에 포함된 미국 특허 번호 5,889,191, 5,889,190, 5,866,785, 5,589,367 및 5,316,931 참조.
형질전환된 세포가 통상적인 방식에 따라 식물로 성장될 수 있다. 예를 들어, [McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84] 참조. 그후, 이러한 식물이 성장될 수 있고, 동일한 형질전환된 계통 또는 상이한 계통과 수분될 수 있으며, 원하는 표현형적 특성의 구성적인 발현이 있는 생성된 하이브리드를 확인할 수 있다. 원하는 표현형적 특성의 발현이 안정적으로 유지되고 유전되는지를 확실히 하기 위해 2 이상의 세대가 성장될 수 있고, 그후 원하는 표현형적 특성의 발현이 달성되었는지를 확실히 하기 위해 종자를 수확할 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 구축물, 예를 들어, 본 발명의 발현 카세트가 게놈 내로 안정적으로 혼입된 형질전환된 종자 ("트랜스제닉 종자"로 또한 지칭됨)를 제공한다.
본 발명은 단자엽식물 및 쌍자엽식물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 식물 종의 형질전환에 사용될 수 있다. 당해 식물 종의 예로는 강냉이 또는 옥수수 (제아 메이스(Zea mays)), 브라시카 종 (예를 들어, 브라시카 나푸스, 브라시카 라파, 브라시카 준세아), 특히 종자유의 공급원으로서 유용한 브라시카 종, 알팔파 (메디카고 사티바(Medicago sativa)), 벼 (오리자 사티바), 호밀 (세칼레 세레알레(Secale cereale)), 사탕수수 (소르검 비콜로르(Sorghum bicolor), 소르검 불가레(Sorghum vulgare)), 기장 (예를 들어, 진주 기장 (페니세툼 글라우쿰(Pennisetum glaucum)), 찰기장 (파니쿰 밀리아세움(Panicum miliaceum)), 조 (세타리아 이탈리카(Setaria italica)), 손가락 기장 (엘레우신 코라카나(Eleusine coracana)), 해바라기 (헬리안투스 아누우스(Helianthus annuus)), 홍화 (카르타무스 틴크토리우스(Carthamus tinctorius)), 밀 (트리티쿰 아에스티붐, 트리티쿰 투르기둠 두룸 아종(T. Turgidum ssp. durum)), 대두 (글리시네 막스), 담배 (니코티아나 타바쿰), 감자 (솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum)), 땅콩 (아라키스 히포가에아(Arachis hypogaea)), 목화 (고시피움 바르바덴스(Gossypium barbadense), 고시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum)), 고구마 (이포모에아 보타투스(Ipomoea batatus)), 카사바 (마니호트 에스쿨렌타(Manihot esculenta)), 커피 (코페아 (Coffea) 아종), 코코넛 (코코스 누시페라(Cocos nucifera)), 파인애플 (아나나스 코모수스(Ananas comosus)), 감귤류 나무 (시트러스(Citrus) 아종), 코코아 (테오브로마 카카오(Theobroma cacao)), 차 (카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)), 바나나 (무사(Musa) 아종), 아보카도 (페르세아 아메리카나(Persea americana)), 무화과 (피쿠스 카시카(Ficus casica)), 구아바 (프시디움 구아자바(Psidium guajava)), 망고 (만기페라 인디카(Mangifera indica)), 올리브 (올레아 에우로파에아(Olea europaea)), 파파야 (카리카 파파야(Carica papaya)), 캐슈 (아나카르디움 옥시덴탈레(Anacardium occidentale)), 마카다미아 (마카다미아 인테그리폴리아(Macadamia integrifolia)), 아몬드 (프루누스 아미가달루스(Prunus amygdalus)), 사탕무 (베타 불가리스(Beta vulgaris)), 사탕수수 (사카룸(Saccharum) 아종), 귀리, 보리, 채소류, 관상식물 및 구과식물이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 식물은 작물 (예를 들어, 해바라기, 브라시카 종, 목화, 사탕무, 대두, 땅콩, 알팔파, 홍화, 담배, 옥수수, 벼, 밀, 호밀, 보리, 라이밀, 사탕수수, 기장 등)이다.
본 발명의 제초제 저항성 식물은 잡초를 제어하는 방법에서 용도가 발견된다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 제초제-저항성 식물 부근의 잡초를 제어하는 방법을 추가로 제공한다. 이 방법은 유효량의 제초제를 잡초 및 제초제-저항성 식물에 적용하는 단계를 포함하고, 이때 상기 식물은 야생형 식물에 비교했을 때 하나 이상의 제초제, 특히 이미다졸리논 또는 술포닐우레안 제초제에 대한 저항성이 증가되어 있다. 잡초를 제어하기 위한 이같은 방법에서, 바람직하게는 본 발명의 제초제-저항성 식물은 해바라기, 알팔파, 브라시카 종, 대두, 목화, 홍화, 땅콩, 담배, 토마토, 밀, 벼, 옥수수, 사탕수수, 보리, 호밀, 기장 및 사탕수수가 포함되지만 이에 한정되지는 않는 작물이다.
제초제, 특히 이미다졸리논 및 술포닐우레안 제초제에 대한 저항성이 증가된 식물을 제공함으로써, 식물 성장을 강화시키고 영양분에 대한 경쟁을 감소시키도록 잡초로부터 식물을 보호하기 위해 광범위한 제형이 사용될 수 있다. 제초제는 본원에 기술된 식물을 둘러싼 영역에서 출아 전, 출아 후, 식재 전 및 식재 시의 잡초 제어를 위해 독자적으로 사용될 수 있거나, 또는 다른 첨자물을 함유하는 이미다졸리논 제초제 제형이 사용될 수 있다. 종자 처리물로서 제초제가 또한 사용될 수 있다. 즉, 유효 농도 또는 유효량의 제초제, 또는 유효 농도 또는 유효량의 제초제를 포함하는 조성물이 파종 전에 또는 파종 동안 종자에 직접적으로 적용될 수 있다. 이미다졸리논 또는 술포닐우레안 제초제 제형 또는 조성물에서 발견되는 첨가물에는 또다른 제초제, 세제, 애쥬번트, 살포제, 점착제, 안정화제 등이 포함된다. 제초제 제형은 습식 또는 건식 제제일 수 있고, 유동성 분말, 유화성 농축물 및 액체 농축물을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 제초제 및 제초제 제형은 통상적인 방법에 따라, 예를 들어, 분무, 관주, 살분, 코팅 등에 의해 적용될 수 있다.
본 발명은 AHAS-억제성 제초제의 사용을 수반하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에서, AHAS-억제성 제초제는 종자 처리, 토양 처리 및 잎 처리를 포함하지만 이에 한정되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 적용될 수 있다.
본 발명은 AHAS 효소의 활성을 방해하는 하나 이상의 제초제에 대한 식물, 식물 조직, 식물 세포, 또는 기타 숙주 세포의 내성 또는 저항성을 강화시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 이같은 AHAS-억제성 제초제는 이미다졸리논 제초제, 술포닐우레안 제초제, 트리아졸로피리미딘 제초제, 피리미디닐옥시벤조에이트 제초제, 술포닐아미노카르보닐트리아졸리논 제초제, 또는 이들의 혼합물이다. 더욱 바람직하게는, 이같은 제초제는 이미다졸리논 제초제, 술포닐우레안 제초제, 또는 이들의 혼합물이다. 본 발명을 위해, 이미다졸리논 제초제에는 PURSUIT® (이마제타피르), CADRE® (이마자픽), RAPTOR® (이마자목스), SCEPTER® (이마자퀸), ASSERT® (이마제타벤즈), ARSENAL® (이마자피르), 상기 언급된 제초제들 중 임의의 것의 유도체, 및 상기 언급된 제초제들 중 둘 이상의 혼합물, 예를 들어, 이마자피르/이마자목스 (ODYSSEY®)가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 더욱 구체적으로, 이미다졸리논 제초제는 2-(4-이소프로필-4-메틸-5-옥소-2-이미디아졸린-2-일)-니코틴산, [2-(4-이소프로필)-4-] [메틸-5-옥소-2-이미다졸린-2-일)-3-퀴놀린카르복실] 산, [5-에틸-2-(4-이소프로필-] 4-메틸-5-옥소-2-이미다졸린-2-일) -니코틴산, 2-(4-이소프로필-4-메틸-5-옥소-2-이미다졸린-2-일)-5-(메톡시메틸)-니코틴산, [2-(4-이소프로필-4-메틸-5-옥소-2-] 이미다졸린-2-일)-5-메틸니코틴산, 및 메틸 [6-(4-이소프로필-4-] 메틸-5-옥소-2-이미다졸린-2-일)-m-톨루에이트와 메틸 [2-(4-이소프로필-4-메틸-5-] 옥소-2-이미다졸린-2-일)-p-톨루에이트의 혼합물에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 5-에틸-2-(4-이소프로필-4-메틸-5-옥소-2-이미다졸린-2-일)-니코틴산 및 [2-(4-이소프로필-4-메틸-5-옥소-2-이미다졸린-2-] 일)-5-(메톡시메틸)-니코틴산의 사용이 바람직하다. [2-(4-이소프로필-4-] 메틸-5-옥소-2-이미다졸린-2-일)-5-(메톡시메틸)-니코틴산의 사용이 특히 바람직하다.
본 발명을 위해, 술포닐우레아 제초제에는 클로르술푸론, 메트술푸론 메틸, 술포메투론 메틸, 클로리무론 에틸, 티펜술푸론 메틸, 트리베누론 메틸, 벤술푸론 메틸, 니코술푸론, 에타메트술푸론 메틸, 림술푸론, 트리플루술푸론 메틸, 트리아술푸론, 프리미술푸론 메틸, 시노술푸론, 아미도술푸론, 플루자술푸론, 이마조술푸론, 피라조술푸론 에틸, 할로술푸론, 아짐술푸론, 시클로술푸론, 에톡시술푸론, 플라자술푸론, 플루피르술푸론 메틸, 포람술푸론, 요오도술푸론, 옥사술푸론, 메소술푸론, 프로술푸론, 술포술푸론, 트리플록시술푸론, 트리토술푸론, 상기 언급된 제초제들 중 임의의 것의 유도체, 및 상기 언급된 제초제들 중 둘 이상의 혼합물이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 트리아졸로피리미딘 제초제에는 클로란술람, 디클로술람, 플로라술람, 플루메트술람, 메토술람, 및 페녹스술람이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 피리미디닐옥시벤조에이트 제초제에는 비스피리박, 피리티오박, 피리미노박, 피리벤족심 및 피리프탈리드가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 술포닐아미노-카르보닐트리아졸리논 제초제에는 플루카르바존 및 프로폭시카르바존이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
피리미디닐옥시벤조에이트 제초제는 피리미디닐티오벤조에이트 제초제와 밀접하게 관련되고, 미국 잡초 학회(Weed Science Society of America)에서 후자의 명칭의 표제 하에 일반화되는 것으로 인지된다. 따라서, 본 발명의 제초제는 피리미디닐티오벤조에이트 제초제를 추가로 포함하고, 이는 상기 기술된 피리미디닐옥시벤조에이트 제초제를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
적용 전에, AHAS-억제성 제초제가 관습적인 제형, 예를 들어 용액, 에멀션, 현탁액, 분진, 분말, 페이스트 및 과립으로 전환될 수 있다. 사용 형태는 의도되는 특정 목적에 좌우된다; 각각의 경우에, 본 발명에 따른 화합물의 미세하고 균일한 분포가 보장되어야 한다.
공지된 방식으로 (예를 들어, 리뷰를 위해 미국 3,060,084, EP-A 707 445 (액체 농축물), [Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering, Dec. 4, 1967, 147-48], [Perry's Chemical Engineer's Handbook, 4th Ed., McGraw-Hill, New York, 1963, pp 8-57] 및 이하 WO 91/13546, 미국 4,172,714, 미국 4,144,050, 미국 3,920,442, 미국 5,180,587, 미국 5,232,701, 미국 5,208,030, GB 2,095,558, 미국 3,299,566, [Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961], [Hance et al., Weed Control Handbook, 8th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989] 및 [Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Germany), 2001], [D. A. Knowles, Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998 (ISBN 0-7514-0443-8)] 참조), 예를 들어, 활성 화합물을 농약 제형에 적절한 보조제, 예컨대 용매 및/또는 담체, 필요한 경우 유화제, 계면활성제 및 분산제, 방부제, 소포제, 동결방지제로 증량시킴으로써, 그리고 종자 처리 제형의 경우에는 또한 임의적으로 착색제 및/또는 결합제 및/또는 젤화제로 증량시킴으로써 제형이 제조된다.
적절한 용매의 예는 물, 방향족 용매 (예를 들어 솔베소(Solvesso) 제품, 자일렌), 파라핀 (예를 들어, 미네랄 오일 분획), 알콜 (예를 들어, 메탄올, 부탄올, 펜탄올, 벤질 알콜), 케톤 (예를 들어, 시클로헥사논, 감마-부티로락톤), 피롤리돈 (NMP, NOP), 아세테이트 (글리콜 디아세테이트), 글리콜, 지방산 디메틸아미드, 지방산 및 지방산 에스테르이다. 원칙적으로, 용매 혼합물이 또한 사용될 수 있다.
적절한 담체의 예는 분쇄된 천연 광물 (예를 들어 카올린, 점토, 탈크, 백악) 및 분쇄된 합성 광물 (예를 들어, 고도로 분산성인 실리카, 실리케이트)이다.
적절한 유화제는 비-이온성 및 음이온성 유화제 (예를 들어 폴리옥시에틸렌 지방 알콜 에테르, 알킬술포네이트 및 아릴술포네이트)이다. 분산제의 예는 리그닌-술파이트 폐액 및 메틸셀룰로스이다.
사용된 적절한 계면활성제는 리그노술폰산, 나프탈렌술폰산, 페놀술폰산, 디부틸나프탈렌술폰산, 알킬아릴술포네이트, 알킬 술페이트, 알킬술포네이트, 지방 알콜 술페이트, 지방산 및 황산화 지방 알콜 글리콜 에테르의 알칼리금속, 알칼리토금속 및 암모늄 염이고, 또한 술폰화 나프탈렌 및 나프탈렌 유도체와 포름알데히드의 축합물, 나프탈렌 또는 나프탈렌술폰산과 페놀 및 포름알데히드의 축합물, 폴리옥시에틸렌 옥틸페놀 에테르, 에톡시화 이소옥틸페놀, 옥틸페놀, 노닐페놀, 알킬페놀 폴리글리콜 에테르, 트리부틸페닐 폴리글리콜 에테르, 트리스테아릴페닐 폴리글리콜 에테르, 알킬아릴 폴리에테르 알콜, 알콜 및 지방 알콜 에틸렌 옥시드 축합물, 에톡시화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 에톡시화 폴리옥시프로필렌, 라우릴 알콜 폴리글리콜 에테르 아세탈, 소르비톨 에스테르, 리그노술파이트 폐액 및 메틸셀룰로스이다.
직접 분무가능한 용액, 에멀션, 페이스트 또는 오일 분산액의 제조에 적절한 물질은 비점이 중등도 내지 고도인 미네랄 오일 분획, 예컨대 등유 또는 디젤 오일이고, 또한 콜타르 오일 및 식물성 또는 동물성 기원의 오일, 지방족, 고리형 및 방향족 탄화수소, 예를 들어 톨루엔, 자일렌, 파라핀, 테트라히드로나프탈렌, 알킬화 나프탈렌 또는 이들의 유도체, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 시클로헥산올, 시클로헥사논, 이소포론, 고도로 극성인 용매, 예를 들어 디메틸 술폭시드, N-메틸피롤리돈 또는 물이다.
또한, 동결방지제 예컨대 글리세린, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 및 살균제가 제형에 첨가될 수 있다.
적합한 소포제는 예를 들어 규소 또는 스테아르산마그네슘을 기초로 하는 소포제이다. 종자 처리 제형은 결합제 및 임의적으로 착색제를 추가로 포함할 수 있다.
처리 후 종자 상에 활성 물질이 부착되는 것을 개선하기 위해 결합제가 첨가될 수 있다. 적절한 결합제는 블록 공중합체 EO/PO 계면활성제, 뿐만 아니라 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리부텐, 폴리이소부틸렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌아민, 폴리에틸렌아미드, 폴리에틸렌이민 (Lupasol®, Polymin®), 폴리에테르, 폴리우레탄, 폴리비닐아세테이트, 타일로스, 및 이러한 중합체들로부터 유도된 공중합체이다.
임의적으로, 착색제가 또한 제형에 포함될 수 있다. 종자 처리 제형을 위한 적절한 착색제 또는 염료는 로다민(Rhodamin) B, C.I. 안료 적색 112, C.I. 솔벤트(Solvent) 적색 1, 청색 안료 15:4, 청색 안료 15:3, 청색 안료 15:2, 청색 안료 15:1, 청색 안료 80, 황색 안료 1, 황색 안료 13, 적색 안료 112, 적색 안료 48:2, 적색 안료 48:1, 적색 안료 57:1, 적색 안료 53:1, 주황색 안료 43, 주황색 안료 34, 주황색 안료 5, 녹색 안료 36, 녹색 안료 7, 백색 안료 6, 갈색 안료 25, 염기성 보라색 10, 염기성 보라색 49, 산성 적색 51, 산성 적색 52, 산성 적색 14, 산성 청색 9, 산성 황색 23, 염기성 적색 10, 염기성 적색 108이다.
적절한 젤화제의 예는 카라기난 (Satiagel®)이다. 활성 물질들을 고체 담체와 혼합함으로써 또는 동시에 분쇄함으로써 분말, 살포용 물질, 및 분진성 제품을 제조할 수 있다.
활성 화합물들을 고체 담체에 결합시킴으로써 과립, 예를 들어 코팅된 과립, 함침된 과립 및 균질성 과립을 제조할 수 있다. 고체 담체의 예는 무기 토류 예컨대 실리카 젤, 실리케이트, 탈크, 카올린, 아타클레이(attaclay), 석회석, 석회, 백악, 교회 점토, 황토, 점토, 백운석, 규조토, 황산칼슘, 황산마그네슘, 산화마그네슘, 분쇄된 합성 물질, 비료, 예를 들어, 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 요소, 및 식물 기원의 제품, 예컨대 곡물 가루, 나무 껍질 가루, 목재 가루 및 견과류 껍질 가루, 셀룰로스 분말 및 기타 고체 담체이다.
일반적으로, 제형은 0.01 내지 95 중량％, 바람직하게는 0.1 내지90 중량％의 AHAS-억제성 제초제를 포함한다. 이러한 경우에, AHAS-억제성 제초제는 90 내지 100 중량％, 바람직하게는 95 내지 100 중량％ (NMR 스펙트럼에 따름)의 순도로 사용된다. 종자 처리 목적을 위해, 각각의 제형이 2-10배 희석되어, 사용 준비가 완료된 제제 내의 활성 화합물의 농도가 0.01 내지 60 중량％, 바람직하게는 0.1 내지 40 중량％에 이를 수 있다.
AHAS-억제성 제초제는 분무, 아토마이징(atomizing), 살분, 살포 또는 살수에 의해 그대로, 제형물 형태로, 또는 이로부터 제조된 사용 형태로, 예를 들어, 직접적으로 분무될 수 있는 용액, 분말, 현탁액 또는 분산액, 에멀션, 오일 분산액, 페이스트, 살분성 제품, 살포용 물질, 또는 과립의 형태로 사용될 수 있다. 사용 형태는 의도된 목적에 전적으로 좌우된다; 이는 각각의 경우에 본 발명에 따른 AHAS-억제성 제초제의 가장 미세한 가능한 분포를 확실히 하도록 의도된다.
물을 첨가함으로써 에멀션 농축물, 페이스트 또는 습윤화가능한 분말 (분무될 수 있는 분말, 오일 분산액)로부터 수성 사용 형태가 제조될 수 있다. 에멀션, 페이스트 또는 오일 분산액을 제조하기 위해, 그대로의 물질 또는 오일 또는 용매에 용해된 물질을 습윤화제, 점착제, 분산제 또는 유화제에 의해 물에서 균질화시킬 수 있다. 그러나, 활성 물질, 습윤화제, 점착제, 분산제 또는 유화제, 그리고 적합한 경우 용매 또는 오일로 구성된 농축물을 제조하는 것이 또한 가능하고, 이같은 농축물은 물로 희석하기에 적절하다
사용 준비가 완료된 제제 내의 활성 화합물 농도는 비교적 넓은 범위 내에서 변할 수 있다. 일반적으로, 이는 0.0001 내지 10 중량％, 바람직하게는 0.01 내지 1 중량％이다.
AHAS-억제성 제초제는 극미량 공정 (ULV: ultra-low-volume)에서 또한 성공적으로 사용될 수 있어서, 95 중량％를 초과하는 활성 화합물을 포함하는 제형을 적용하거나, 심지어 첨가제가 없이 활성 화합물을 적용하는 것이 가능하다.
하기는 제형의 예이다:
1. 잎 적용을 위한 물로 희석되는 제품. 종자 처리 목적을 위해, 이같은 제품이 희석되어 또는 희석되지 않고 종자에 적용될 수 있다.
A) 수용성 농축물 (SL, LS)
10 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 90 중량부의 물 또는 수용성 용매에 용해시킨다. 별법적으로, 습윤화제 또는 다른 보조제를 첨가한다. AHAS-억제성 제초제가 물로의 희석 시 용해됨으로써, 10 ％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제가 있는 제형이 수득된다.
B) 분산성 농축물 (DC)
20 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 70 중량부의 시클로헥사논에 용해시키면서 10 중량부의 분산제, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈을 첨가한다. 물로의 희석으로 분산액이 제공됨으로써, 20％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제가 있는 제형이 수득된다.
C) 유화성 농축물 (EC)
15 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 7 중량부의 자일렌에 용해시키면서 칼슘 도데실벤젠술포네이트 및 피마자유 에톡실레이트 (각각의 경우 5 중량부)를 첨가한다. 물로의 희석으로 에멀션이 제공됨으로써, 15％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제가 있는 제형이 수득된다.
D) 에멀션 (EW, EO, ES)
25 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 35 중량부의 자일렌에 용해시키면서 칼슘 도데실벤젠술포네이트 및 피마자유 에톡실레이트 (각각의 경우 5 중량부)를 첨가한다. 이러한 혼합물을 유화기 (예를 들어 Ultraturrax)에 의해 30 중량부의 물 내로 도입하고, 균질한 에멀션으로 만든다. 물로의 희석으로 에멀션이 제공됨으로써, 25％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제가 있는 제형이 수득된다.
E) 현탁액 (SC, OD, FS)
교반되는 볼 밀(ball mill)에서, 20 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 세분하면서 10 중량부의 분산제, 습윤화제 및 70 중량부의 물 또는 유기 용매를 첨가하여, 미세한 AHAS-억제성 제초제 현탁액을 제공한다. 물로의 희석으로 AHAS-억제성 제초제의 안정적인 현탁액이 제공됨으로써, 20％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제가 있는 제형이 수득된다.
F) 수분산성 과립 및 수용성 과립 (WG, SG)
50 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 미세하게 분쇄하면서 50 중량부의 분산제 및 습윤화제를 첨가하고, 공업용 설비 (예를 들어 압출, 분무탑, 유동층)에 의해 수분산성 또는 수용성 과립으로 만든다. 물로의 희석으로 AHAS-억제성 제초제의 안정적인 분산액 또는 용액이 제공됨으로써, 50％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제가 있는 제형이 수득된다.
G) 수분산성 분말 및 수용성 분말 (WP, SP, SS, WS)
75 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 회전자-고정자 밀(rotor-stator mill)에서 분쇄하면서 25 중량부의 분산제, 습윤화제 및 실리카 젤을 첨가한다. 물로의 희석으로 AHAS-억제성 제초제의 안정적인 분산액 또는 용액이 제공됨으로써, 75％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제가 있는 제형이 수득된다.
I) 젤-제형 (GF)
교반되는 볼 밀에서, 20 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 세분하면서 10 중량부의 분산제, 1 중량부의 젤화제 습윤화제 및 70 중량부의 물 또는 유기 용매를 첨가하여, 미세한 AHAS-억제성 제초제 현탁앨을 제공한다. 물로의 희석으로 AHAS-억제성 제초제의 안정적인 현탁액이 제공됨으로써, 20％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제가 있는 제형이 수득된다. 이러한 젤 제형은 종자 처리물로서 사용하기에 적절하다.
2. 잎 적용을 위한 희석되지 않고 적용되는 제품. 종자 처리 목적을 위해, 이같은 제품은 희석되어 종자에 적용될 수 있다.
A) 살분성 분말 (DP, DS)
5 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 미세하게 분쇄하고, 95 중량부의 미세하게 분쇄된 카올린과 완전히 혼합한다. 이로써 5％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제가 있는 살분성 제품이 제공된다.
B) 과립 (GR, FG, GG, MG)
0.5 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 미세하게 분쇄하고, 95.5 중량부의 담체와 조합함으로써, 0.5％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제가 있는 제형이 수득된다. 현재의 방법은 압출, 분무-건조 또는 유동층이다. 이로써 잎 용도를 위해 희석되지 않고 적용되는 과립이 제공된다.
통상적인 종자 처리 제형에는 유동성 농축물 FS, 용액 LS, 건식 처리용 분말 DS, 슬러리 처리용 수분산성 분말 WS, 수용성 분말 SS 및 에멀션 ES 및 EC, 및 젤 제형 GF가 예를 들어 포함된다. 이러한 제형들은 희석되어 또는 희석되지 않고 종자에 적용될 수 있다. 종자에의 적용은 파종 전에 종자 상에 직접적으로 수행된다.
바람직한 실시양태에서, FS 제형이 종자 처리에 사용된다. 전형적으로, FS 제형은 1-800 g/ℓ의 활성 성분, 1-200 g/ℓ의 계면활성제, 0 내지 200 g/ℓ의 동결방지제, 0 내지 400 g/ℓ의 결합제, 0 내지 200 g/ℓ의 안료 및 1 ℓ까지의 용매, 바람직하게는 물을 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 제초제-저항성 식물의 비-트랜스제닉 및 트랜스제닉 종자를 제공한다. 이같은 종자는, 예를 들어, J05Z-07801, J04E-0139, J04E-0130 또는 J04E-0122의 식물의 제초제-저항성 특성을 포함하는 비-트랜스제닉 브라시카 종자, 및 제초제-저항성 AHASL1 단백질을 코딩하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 트랜스제닉 종자를 포함한다.
종자 처리를 위해, 본 발명에 따른 제초제 저항성 식물의 종자가 제초제, 바람직하게는 AHAS-억제성 제초제 예컨대 아미도술푸론, 아짐술푸론, 벤술푸론, 클로리무론, 클로르술푸론, 시노술푸론, 시클로술파무론, 에타메트술푸론, 에톡시술푸론, 플라자술푸론, 플루피르술푸론, 포람술푸론, 할로술푸론, 이마조술푸론, 요오도술푸론, 메소술푸론, 메트술푸론, 니코술푸론, 옥사술푸론, 프리미술푸론, 프로술푸론, 피라조술푸론, 림술푸론, 술포메투론, 술포술푸론, 티펜술푸론, 트리아술푸론, 트리베누론, 트리플록시술푸론, 트리플루술푸론, 트리토술푸론, 이마자메타벤즈, 이마자목스, 이마자픽, 이마자피르, 이마자퀸, 이마제타피르, 클로란술람, 디클로술람, 플로라술람, 플루메트술람, 메토술람, 페녹스술람, 비스피리박, 피리미노박, 프로폭시카르바존, 플루카르바존, 피리벤족심, 피리프탈리드, 피리티오박 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 제초제로, 또는 AHAS-억제성 제초제를 포함하는 제형으로 처리된다.
종자 처리라는 용어는 당업계에 공지된 모든 적절한 종자 처리 기술, 예컨대 종자 드레싱(dressing), 종자 코팅, 종자 살분, 종자 침지 및 종자 펠렛화(pelleting)를 포함한다.
본 발명의 한 변형에 따르면, 본 발명의 추가적인 대상은 조성물/제형, 예를 들어, 과립 제형으로서의 AHAS-억제성 제초제를 함유하는 과립 제형 (임의적으로 하나 이상의 농업용으로 허용가능한 고체 또는 액체 담체가 있고/있거나 임의적으로 하나 이상의 농업용으로 허용가능한 계면활성제가 있음)을 적용함으로써, 특히 종자 이랑(drill) 내로 적용함으로써 토양을 처리하는 방법이다. 예를 들어, 곡물, 옥수수, 목화 및 해바라기의 모판에서 이러한 방법이 유리하게 사용된다.
본 발명은 아미도술푸론, 아짐술푸론, 벤술푸론, 클로리무론, 클로르술푸론, 시노술푸론, 시클로술파무론, 에타메트술푸론, 에톡시술푸론, 플라자술푸론, 플루피르술푸론, 포람술푸론, 할로술푸론, 이마조술푸론, 요오도술푸론, 메소술푸론, 메트술푸론, 니코술푸론, 옥사술푸론, 프리미술푸론, 프로술푸론, 피라조술푸론, 림술푸론, 술포메투론, 술포술푸론, 티펜술푸론, 트리아술푸론, 트리베누론, 트리플록시술푸론, 트리플루술푸론, 트리토술푸론, 이마자메타벤즈, 이마자목스, 이마자픽, 이마자피르, 이마자퀸, 이마제타피르, 클로란술람, 디클로술람, 플로라술람, 플루메트술람, 메토술람, 페녹스술람, 비스피리박, 피리미노박, 프로폭시카르바존, 플루카르바존, 피리벤족심, 피리프탈리드 및 피리티오박으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 ALS 억제제를 포함하는 종자 처리 제형으로 코팅된 또는 이러한 제형을 함유하는 종자를 또한 포함한다.
종자라는 용어는 진정 종자, 종자 조각, 뿌리순, 구경, 구근, 과실, 덩이줄기, 낟알, 절단물(cutting) 및 절단 묘조(cut shoot) 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는 모든 종류의 종자 및 식물 번식체(propagule)를 포함하고, 바람직한 실시양태에서는 진정 종자를 의미한다.
"~로 코팅되고/되거나 이를 함유하는"이라는 용어는 활성 성분이 적용 시에 대부분 번식 생성물의 표면 상에 있지만, 적용 방법에 따라 얼마간의 성분은 번식 생성물 내로 침투될 수 있다는 것을 일반적으로 의미한다. 상기 번식 생성물이 (재)식재되는 경우, 이는 활성 성분을 흡수할 수 있다.
AHAS-억제성 제초제 또는 AHAS-억제성 제초제를 포함하는 제형으로의 종자 처리 적용은 식물의 파종 전 및 식물의 출아 전에 종자에 분무 또는 살분함으로써 수행된다.
종자의 처리에서, 유효량의 AHAS-억제성 제초제 또는 AHAS-억제성 제초제를 포함하는 제형으로 종자를 처리함으로써 상응하는 제형이 적용된다. 본원에서, 적용률은 종자 100 ㎏ 당 일반적으로 0.1 g 내지 10 kg의 a.i. (또는 a.i.의 혼합물 또는 제형), 바람직하게는 종자 100 ㎏ 당 1 g 내지 5 kg, 특히 종자 100 ㎏ 당 1 g 내지 2.5 kg이다. 양배추와 같은 특정 작물에 대해서, 적용률이 더 높을 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 저항성 식물의 종자를 파종 전 및/또는 사전발아(pregermination) 후에 AHAS-억제성 제초제와 접촉시키는 것을 포함하는, 원치 않는 초목에 대항하거나 잡초를 제어하는 방법을 제공한다. 이 방법은, 예를 들어, 논밭 내의 토양 또는 온실 내의 화분용 배지(potting medium) 내에 종자를 파종하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이 방법은 종자의 바로 옆에서 원치 않는 초목에 대항하는 것 또는 잡초를 제어하는 것에서 특정한 용도가 발견된다.
원치 않는 초목의 제어는 잡초를 사망시키고/시키거나 잡초의 정상적인 성장을 지연시키거나 억제하는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 잡초는, 가장 넓은 의미로, 원치 않는 위치에서 성장하는 모든 식물을 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명의 잡초에는, 예를 들어, 쌍자엽성 및 단자엽성 잡초가 포함된다. 쌍자엽성 잡초에는 하기 속의 잡초가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다: 시나피스(Sinapis), 렙티디움(Lepidium), 갈리움(Galium), 스텔라리아(Stellaria), 마트리카리아(Matricaria), 안테미스(Anthemis), 갈린소가(Galinsoga), 체노포디움(Chenopodium), 우르티카(Urtica), 세네시오(Senecio), 아마란투스(Amaranthus), 포르툴라카(Portulaca), 잔티움(Xanthium), 콘볼불루스(Convolvulus), 이포모에아(Ipomoea), 폴리고눔(Polygonum), 세스바니아(Sesbania), 암브로시아(Ambrosia), 시르시움(Cirsium), 카르두우스(Carduus), 손추스(Sonchus), 솔라눔(Solanum), 로리파(Rorippa), 로탈라(Rotala), 린데르니아(Lindernia), 라미움(Lamium), 베로니카(Veronica), 아부틸론(Abutilon), 에멕스(Emex), 마투라(Datura), 비올라(Viola), 갈레오프시스(Galeopsis), 파파베르(Papaver), 센타우레아(Centaurea), 트리폴리움(Trifolium), 라눈쿨루스(Ranunculus) 및 타락사쿰(Taraxacum). 단자엽성 잡초에는 하기 속의 잡초가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다: 에치노클로아(Echinochloa), 세타리아(Setaria), 파니쿰(Panicum), 디기타리아(Digitaria), 플레움(Phleum), 포아(Poa), 페스투카(Festuca), 엘레우신(Eleusine), 브라키아리아(Brachiaria), 롤리움(Lolium), 브로무스(Bromus), 아베나(Avena), 사이페루스(Cyperus), 소르굼(Sorghum), 아그로피론(Agropyron), 시노돈(Cynodon), 모노초리아(Monochoria), 핌브리스티슬리스(Fimbristyslis), 사기타리아(Sagittaria), 엘레오카리스(Eleocharis), 스키르푸스(Scirpus), 파스팔룸(Paspalum), 이스카에뭄(Ischaemum), 스페노클레아(Sphenoclea), 닥틸로크테니움(Dactyloctenium), 아그로스티스(Agrostis), 알로페쿠루스(Alopecurus) 및 아페라(Apera).
또한, 본 발명의 잡초는, 예를 들어, 원치 않는 위치에서 성장하고 있는 작물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 대두 식물의 밭에서 옥수수 식물을 원치 않는 경우, 대두 식물을 주로 포함하는 밭에 있는 자생식물인 옥수수 식물이 잡초로 간주될 수 있다.
관사 "a" 및 "an"은 1개의 또는 1개를 초과하는 (즉, 적어도 1개의) 관사의 문법적인 대상을 지칭하도록 본원에서 사용된다. 예를 들어, "요소(an element)"는 하나 이상의 요소를 의미한다.
본원에서 사용된 단어 "포함" 또는 변형 예컨대 "포함하다" 또는 "포함하는"는 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군을 포함하는 것을 의미하고, 어떠한 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군을 배제하는 것을 의미하지 않는다.
하기의 예들은 제한하기 위해서가 아니라 설명을 위해 제공된다.
실시예 1 -AHAS 시험관내 효소 분석법
AHAS 효소 분석법은, [Singh et al. Anal. Biochem. 171:173-179, 1988]에 기술된 바와 같이, AHAS 억제제의 존재 하에서의 AHAS 효소의 활성 수준을 측정함으로써 여러 샘플의 내성 수준을 정량하는데 사용되는 신속한 비색 방법이다. 2가지 유형의 테스트가 사용되었다: 하나의 억제제만을 사용하는 기본 테스트 및 2개의 억제제를 사용하는 것을 필요로 하는 집중 테스트. 양쪽 테스트 모두 이미다졸리논 내성의 수준을 가리키고, 집중 테스트는 일부 식물 계통들 사이에서 명백한 근소한 내성 수준 차이를 정확하게 지적할 수 있다. AHAS 분석법 스톡 용액은 0.2 M의 1염기성 인산나트륨 + 0.2 M의 2염기성 인산나트륨 + 50 mM의 1,1 시클로프로판 디카르복실산 (CPCA) + 완전 강도의 무라시게 & 스쿡(Murashige & Skoog) 기초염 + 1 mM 이마자목스 (AC 299,263 공업용 등급) + 5％ H2SO4 + 2 M NaOH + 2.5％ α-나프톨 + 0.25％ 크레아틴을 1 M 포스페이트 완충제 (pH 6.0) 내에 함유하였다.
최종 AHAS 분석 용액에는 3가지 유형의 용액이 포함되었다: 용액 A는 10 mM 포스페이트 완충제 + 10％ M & S 배지 + 500 uM CPCA + 0.5％ L-알라닌 + 50 mM 피루베이트를 함유하였고, 용액 B는 용액 A + 2.5 uM 이마자목스를 함유하였으며, 용액 C는 용액 B + 0.2 uM 클로르술푸론을 함유하였다.
기본 AHAS 테스트: 이마자목스 억제제:
96웰 플레이트에서 테스트를 수행하였다. 각각의 96웰 플레이트는 대조군을 포함하여 19-21개의 샘플에 대한 공간을 함유하였다. 각각의 웰은 100 ㎕의 하기 기술된 바와 같은 AHAS 완충제를 함유하였다. 층류 후드에서, 멸균 AHAS 완충제를 A 및 B로 표시된 2개의 용액 용기 내로 무균적으로 옮겼다. 'B' 용기에, 이마자목스를 2.5 uM의 농도로 균등화된 스톡 용액으로부터 첨가하였다. 100 ㎕의 용액 A를 각각의 플레이트 내의 모든 홀수 번호의 열로 옮기고, 100 ㎕의 용액 B를 모든 짝수 번호의 열로 옮겼다.
단계 1: 샘플링
코르크 천공기를 사용하여 10일령 묘목의 가장 작은 잎의 기부로부터 4개의 화반을 절제하였다. 추대(bolting) 단계 전에 식물을 샘플링하였는데, 이는 이러한 성장 단계 이후에 또다른 AHAS 유전자가 활성화되어 잠재적으로 잘못된 결과를 제공하기 때문이다. 절제 후, 화반을 A 및 B 용액을 함유하는 미량역가 플레이트의 웰 내로 옮겼다.
전체 미량역가 플레이트가 채워지면, 이를 형광 하에 실온에서 14-18시간 동안 인큐베이션하였다. 이러한 시간 후 인큐베이션을 정지시키기 위해, 플레이트를 -80℃ 냉동고에서 동결시켰다.
단계 2: 반응
AHAS 플레이트를 -80℃ 냉동고에서 꺼내어, 실온에서 또는 60℃ 인큐베이터에서 해동시켰다. 25 ㎕의 5％ H2SO4를 각각의 웰에 첨가하였다. 산성화된 플레이트를 모든 화반이 완전히 갈색일 때까지 약 15분 동안 60℃에서 인큐베이션하였다. 이러한 시간 동안, 나프톨 용액을 제조하고, 이어서 150 ㎕의 α-나프톨/크레아틴 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 각각의 플레이트를 60℃에서 15분 동안 인큐베이 션하였다. 인큐베이션 후, 이미다졸리논 샘플과 비-이미다졸리논 샘플 간의 AHAS 활성에서의 차이를 육안으로 비교하였다. AHAS 활성으로부터 초래되는 "적색"의 강도를 미량역가 플레이트 판독기를 사용하여 측정하여, 이미다졸리논 및 비-이미다졸리논 샘플에 대한 정량값을 제공하였다.
각각의 웰의 흡광도를 530 nm에서 판독하였다. 이러한 설정에서, 적색의 강도를 표시하는 값이 제공되었다. 적색의 이러한 강도가 각각의 웰 내의 AHAS 활성의 양으로 번역되었다. 소정의 샘플의 이마자목스 웰의 AHAS 활성으로 대조군의 AHAS 활성을 나누어, "대조군의 AHAS 활성 백분율"이라는 표현으로 비율이 제공되었다.
집중 AHAS 테스트: 이마자목스 및 클로르술푸론 억제제
AHAS 테스트에 클로르술푸론 SU를 통합하는 것은 PM1 및 bR 유전자의 내성 거동을 기초로 한다. PM1 및 bR은 SU에 대해 내성이지 않은 반면, PM2는 SU에 대한 약간의 내성을 나타낸다. SU 활성으로 이마자목스 활성을 나눈 비율이 모든 4가지 내성 수준 (PM1/PM2, PM2, PM1, WT)에 대한 독특한 값이 제공된다.
이마자목스 및 클로르술푸론으로 억제되었을 때 브라시카 준세아에서의 bR, PM2 및 bR/PM2에 대해 결과가 도 3에서 제시된다.
이마자목스의 존재 하에서의 상이한 브라시카 준세아 돌연변이 조합들의 AHAS 효소 활성
상이한 돌연변이 조합 (aR × bR, PM2 × A107T, PM2 × bR, A104T × bR)을 함유하는 동종접합성 이중 하플로이드 (DH) 브라시카 준세아 계통으로부터의 단백 질 추출물에서의 AHAS 효소 활성을 미처리 (0 μM 이마자목스) 샘플의 활성의 백분율로서 측정하였다. 대조군으로서, 3가지 브라시카 나푸스 계통으로부터의 단백질 추출물이 또한 포함되었다: 브라시카 나푸스 PM1, 브라시카 나푸스 PM2 및 브라시카 나푸스 PM1/PM2. 100 μM의 이마자목스에서의 이러한 돌연변이체 조합 및 대비물의 결과가 도 6에서 제시된다.
실시예 2 - 온실에서의 제초제 내성 테스트
제1 실험은 1개의 유전자 (bR 또는 PM2) 및 2개의 유전자 (bR/PM2)를 함유하는 브라시카 준세아 계통과 2개의 유전자 (PM1/PM2)를 함유하는 브라시카 나푸스 계통 간에 이미다졸리논 제초제 내성에서의 차이가 있었는지를 결정하도록 디자인되었다.
각각의 계통으로부터의 6개의 개별적인 식물들에 각각의 분무 처리를 적용하였다. 이미다졸리논 제초제 Odyssey®을 1× (17g ai/에이커), 2× (34g ai/에이커) 및 3× (51 g ai/에이커)로 2-3 잎 단계에 적용하였다. 식재하고 나서 약 14일 후의 2-3 잎 단계에 식물에 분무하였다. 분무 챔버는 40 psi로 설정하였고, 속도는 '80' (34.98 L/ac)으로 설정하였다. Odyssey의 25 ㎖ 스톡 용액을 제조하기 위해 하기의 계산이 이루어졌다: 17*0.025/34.98 = 0.1215 g의 Odyssey 과립. 이는 하기와 수치 가정을 기초로 하였다: 에이커 당 필요한 Odyssey의 양은 17 g이고, 각각의 분무 챔버 패스(pass)에서 8.33 ㎖의 용액이 전달됨. Merge®을 0.5 L / 100 L 또는 0.000125 L 또는 125 ㎕의 비율로 첨가하였다. 분무 후, 식물들을 트레이 내에서 무작위화시켰다. 시각적인 제초제 손상에 대해 하기의 평점에 따라 식물에 점수를 매겼다 (분무하고 나서 7-10일 후):
1. 어떠한 손상도 나타내지 않는 식물
2. 잎 변색 또는 근소한 잎 말림을 나타내는 식물
3. 두드러진 잎 변색 (예를 들어, 황색화 또는 자색화)을 나타낼 뿐만 아니라, 약간의 기저부 분기를 나타내는 식물.
4. 사망 또는 심각한 도짐(set back)을 초래하는 두드러진 손상을 나타내는 식물.
손상이 명백한 후에 식물의 높이 및 생물량 (식물 중량)을 측정하였다. 각각의 품종에 대해 분무 처리와 대조군 간의 비교가 이루어졌다. 결과가 표 1에서 제시된다.
Figure 112009067452928-PCT00001
제2 실험은 온실에서 상이한 비율의 이마자목스로 처리되었을 때 브라시카 준세아 내의 여러 돌연변이들 bR, bR/PM2, PM2, aR, A104T, 및 A107T를 비교하도록 디자인되었다. 이마자목스 분무 테스트 (제2 온실 실험)에 사용된 샘플들이 하기 표 2에서 제시된다.
Figure 112009067452928-PCT00002
계통 당 12개의 개별적인 식물들에 표 3에 설명된 바와 같은 각각의 처리 수준을 적용하였다. 이마자목스 (Raptor®) + 0.5％ v/v Merge®을 7회 처리하였다. 1-2개의 진정한 잎 단계에 식물들을 처리하였다. 결과가 도 4에 제시된다.
Figure 112009067452928-PCT00003
또다른 온실 실험에서, 브라시카 준세아 DH 계통이 A 게놈 AHAS 돌연변이 (aR, A104T, 또는 PM2)를 함유한 브라시카 준세아 계통과 B 게놈 AHAS 돌연변이 (bR, A107T)를 함유한 브라시카 준세아 계통 간의 교배로부터 생산되었다. A 게놈 및 B 게놈 돌연변이 양쪽 모두에 대해 동종접합성인 것으로 확인된 DH 계통들 (예를 들어, aR/bR 또는 A104T/bR 등)을 0, 35, 70 및 100 g ai/ha의 이마자목스 (Raptor® + 0.75％ Merge®)을 사용하는 추후의 온실 제초제 내성 테스트용으로 선별하였다. 0 내지 9의 척도로 식물약해의 점수를 매겼고, 이때 0은 작물 손상 없음과 등가였고, 9는 식물 사망에 이르는 심각한 식물 괴사와 등가였다. 이러한 식물약해 곡선의 결과가 도 8에서 제시된다.
이중 동종접합성 DH 계통이 확인되지 않은 조합에 대해 (예컨대 aR/A107T 돌연변이체 조합의 경우), 분리 F2 집단을 온실에 식재하였다. 각각의 F2 개체를 서열분석하여 돌연변이 및 접합성의 성질을 결정한 후, 35 g ai/ha의 이마자목스를 분무하여 각각의 손상 표현형을 결정하였다. aR 및 A107T 돌연변이에 대한 유전자형 대 작물 손상 표현형 관계의 결과가 도 7에서 제시된다.
실시예 3 - 현장에서의 제초제 내성 테스트
4개의 브라시카 준세아 등록물 및 1개의 브라시카 나푸스 등록물을 제초제 내성 (다양한 처리에 대해 표 4 참조) 및 수율에 대해 노스 다코타(North Dakota) 내의 4곳의 장소에서 무작위화 스플릿 블록(split block) 디자인 시험 (4회 반복)에서 테스트하였다. 구획은 최소 1.5 × 5 m 크기였고, 성숙기에 각각의 구획을 낫질하여 수확하였다. 4개의 브라시카 준세아 등록물 중에서, 1개의 등록물은 브라시카 나푸스로부터의 PM1 및 PM2 돌연변이 양쪽 모두를 통상적인 역교배 기술에 의해 브라시카 준세아 내로 유전자이입한 후, 동종접합성 브라시카 준세아 PM1/PM2가 생산되도록 2세대 자가수분시킴으로써 생산된 PM1/PM2 브라시카 준세아 계통이었다. 나머지 3개의 브라시카 준세아 등록물은 PM2 돌연변이와 스태킹된 B 게놈 bR 돌연변이를 함유하는 상이한 유전자형의 브라시카 준세아였다. 모든 bR/PM2 브라시카 준세아 계통은 양쪽 돌연변이에 대해 동종접합성이었다. 브라시카 나푸스 등록물은 PM1/PM2 돌연변이에 대해 동종접합성인, 시판되는 CLEARFIELD® 대비 품종이었다. 처리하고 나서 5 내지 7일 후 (DAT: days after treatment) 및 18 내지 24 DAT에 작물 손상의 점수 (％ 식물약해)를 매겼다. 4곳의 장소 중 하나로부터의 평균 식물약해 백분율이 표 5에서 제시된다.
Figure 112009067452928-PCT00004
Figure 112009067452928-PCT00005
표 5의 결과는 브라시카 준세아 내의 PM1/PM2 유전자이입 돌연변이에 상업화를 위한 적절한 내성이 없다는 것을 가리켰다. PM1/PM2 브라시카 준세아 계통에 대한 제초제 (Odyssey®) 후의 식물약해 평점은 모든 테스트된 장소 (벨바, 모할(Mohall), 파르고(Fargo), 헤팅저(Hettinger))에 대해 25 내지 50％ 범위인 한편, Odyssey®-처리 PM1/PM2 브라시카 준세아 등록물에 대한 수율은 분무되지 않은 PM1/PM2 브라시카 준세아 등록물에 비해 평균적으로 50％만큼 감소되었다. bR/PM2 브라시카 준세아 등록물 (S006, S007, S008)은 테스트된 어떠한 장소에서도 1× Odyssey® 처리에서 식물약해를 나타내지 않았고, 수율에서 어떠한 유의한 감소도 나타내지 않았다. 또한 bR/PM2 브라시카 준세아 등록물은 모든 장소에서 PM1/PM2 브라시카 나푸스 등록물보다 더 낮은 식물약해 평점을 나타냈다.
유사하게, bR/PM2 스태킹 돌연변이를 함유하는 24개의 상이한 브라시카 준세아 등록물 (유전자형)을, PM2만이 있는 1개의 브라시카 준세아 등록물 (J03Z-16413) 및 PM1/PM2 스태킹 돌연변이를 함유하는 1개의 시판되는 CLEARFIELD® 브라시카 나푸스 대비물과 함께, 3곳의 장소에서 현장 테스트하였다. 2개의 복제물로 구성된 무작위화 완전 블록 디자인 (1회 처리)를 사용하였고, 이때 평균 구획 크기는 1.5 m × 5 m였다. 지역적인 캐놀라 파종량을 사용하였고, 개별적인 구획 파종량을 각각의 등록물의 종자 1000개의 중량을 기초로 각각의 장소에 대해 동일한 파종 밀도로 조정하였다. 이러한 시험에서 모든 등록물에 하기 표 6에 제시된 바와 같이 제초제를 적용하였다.
Figure 112009067452928-PCT00006
Figure 112009067452928-PCT00007
Figure 112009067452928-PCT00008
Figure 112009067452928-PCT00009
bR/PM2 스태킹 돌연변이를 함유하는 2개의 추가적인 상이한 브라시카 준세아 등록물 (유전자형) 및 PM1/PM2 스태킹 돌연변이를 함유하는 1개의 시판되는 CLEARFIELD® 브라시카 나푸스 대비물을 여러 장소에서 연속 2년에 걸쳐 현장 테스트하였다. 지역적인 캐놀라 파종량을 사용하였고, 개별적인 구획 파종량을 각각의 등록물의 종자 1000개의 중량을 기초로 각각의 장소에 대해 동일한 파종 밀도로 조정하였다. 이러한 시험에서 모든 등록물에 하기 표 9에 제시된 바와 같이 제초제 (Beyond®)를 적용하였다.
Figure 112009067452928-PCT00010
Figure 112009067452928-PCT00011
Figure 112009067452928-PCT00012
bR 및 PM2 돌연변이 양쪽 모두를 함유하는 3개의 상이한 계통 (bR/PM2에 대해 동종접합성)으로부터 현장 식물약해 데이터를 또한 수득하여, PM1 및 PM2 돌연변이 양쪽 모두를 함유하는 시판되는 브라시카 나푸스 계통 (PM1/PM2에 대해 동종접합성)의 현장 식물약해와 비교하였다. 이러한 계통들에 1× BEYOND® (35 g ai/ha의 이마자목스)을 분무하고, 처리하고 나서 7 내지 10일 후 (DAT)에 식물약해에 대해 채점하였다. 대조군으로서 브라시카 준세아 야생형 계통 (즉, 어떠한 AHAS 돌연변이도 없음)에 1× BEYOND®를 또한 분무하였다. 결과가 하기 표 10에서 제공된다.
Figure 112009067452928-PCT00013
bR 및 PM2 돌연변이 양쪽 모두를 함유하는 (동종접합성 bR/PM2), 올레산 함량이 중간 정도인 4개의 추가적인 브라시카 준세아 계통에 대해 2× BEYOND™을 분무하여 유사한 셋트의 실험을 수행하였다. 결과가 하기 표 11에서 제시된다.
Figure 112009067452928-PCT00014
각각의 개별적인 돌연변이에 비해 bR 및 PM2 돌연변이를 함께 스태킹시키는 것의 효과를 연구하기 위해, PM2 돌연변이 단독을 함유하는 브라시카 준세아 등록물, bR 돌연변이 단독을 함유하는 등록물, 또는 bR 및 PM2 돌연변이 양쪽 모두를 함유하는 등록물에 대해 제초제 내성 현장 테스트를 수행하였다. 모든 등록물에서 모든 돌연변이는 동종접합성이었다. 3회 반복으로 구성된 무작위화 완전 블록 디자인 (4회 처리)이 1.5 m × 5 m의 평균 구획 크기로 사용되었다. 지역적인 캐놀라 파종량을 사용하였고, 개별적인 구획 파종량을 각각의 등록물의 종자 1000개의 중량을 기초로 각각의 장소에 대해 동일한 파종 밀도로 조정하였다. 이러한 시험에서 모든 등록물에 하기 표 10에 제시된 바와 같이 제초제 (Beyond®; 1× 비율은 35 g ai/ha)를 적용하였다. 단일 소질 또는 조합 소질을 함유하는 브라시카 준세아 계통을 0×, 1×, 2× 또는 4× 수준의 제초제로 처리하였고, 처리하고 나서 10일 후, 12일 후, 14일 후, 또는 28일 후 (DAT)에 점수를 매겼다. 2명의 다른 사람이 각각의 양의 제초제로 처리하고 나서 10일 후, 12일 후, 14일 후 및/또는 28일 후에 식물약해를 채점하였다 (표 10에서 채점자 1 대 채점자 2로 표시됨). 결과가 하기 표 12에 제시된다.
Figure 112009067452928-PCT00015
bR/PM2 스태킹 돌연변이체 계통에서의 내성이 개별적인 돌연변이체 계통 내성들의 합보다 컸다는 것을 더욱 명확하게 설명하기 위해 (작물 손상 또는 식물약해는 표 12에 제시됨), bR/PM2 스태킹 계통의 실제 제초제 내성 백분율을 단일 bR 돌연변이체 계통 + 단일 PM2 돌연변이체 계통의 제초제 내성 백분율의 합 (예상 제초제 내성)과 비교하였다 (표 13). 단일 돌연변이를 공격하거나 제거하는 제초제 수준 (가장 두드러지게는 2× 및 4× 비율)에서, bR/PM2 스태킹 돌연변이체 계통에서 관찰된 제초제 내성의 수준이 2개의 개별적인 bR + PM2 내성을 합했을 때 관찰되는 제초제 내성을 초과하였다. bR/PM2 스태킹 돌연변이체 계통은 부가적인 수준보다는 상승작용성 수준의 제초제 내성을 나타냈다. 이러한 강화된 (상승작용성) 수준의 이미다졸리논 내성이 bR/PM2 스태킹 돌연변이를 함유하는 30가지를 초과하는 여러 유전자형의 브라시카 준세아에서 관찰되었다.
Figure 112009067452928-PCT00016
요약하면, 브라시카 준세아 bR/PM2 계통에서의 상승작용성 또는 강화된 수준의 내성이 브라시카 나푸스 PM1/PM2 스태킹 돌연변이체 계통에서 관찰된 내성의 수준보다 더 크고, 또한 브라시카 준세아 PM1/PM2 스태킹 돌연변이체 계통에서 관찰된 내성 (표 5)보다 훨씬 더 큰 것으로 나타났다. 브라시카 준세아 bR/PM2 계통은 이미다졸리논 제초제로 처리되었을 때 어떠한 수율 페널티도 나타내지 않은 반면, 브라시카 준세아 PM1/PM2 계통은 상업적인 비율의 이미다졸리논 제초제로 처리되었을 때 상당한 수율 페널티를 나타냈다.
명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 분야의 당업자의 수준을 가리킨다. 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별적인 간행물 또는 특허 출원이 거명에 의해 포함되는 것으로 명확하게, 그리고 개별적으로 지시되는 것과 동일한 정도로 거명에 의해 본원에 포함된다.
상기의 발명이 이해를 명확하게 하기 위해 설명 및 예의 방식으로 일부 상세하게 기술되었지만, 첨부된 청구항의 범주 내에서 어느 정도의 변화 및 변형이 실행될 수 있음이 명백할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> BASF SE <120> HERBICIDE-RESISTANT BRASSICA PLANTS AND METHODS OF USE <130> BASFUS.10015WO <140> PCT/US08/059241 <141> 2008-04-03 <150> 60/910,008 <151> 2007-04-04 <160> 20 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 670 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 Met Ala Ala Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Ser Ser Ile Ser Phe 1 5 10 15 Ser Thr Lys Pro Ser Pro Ser Ser Ser Lys Ser Pro Leu Pro Ile Ser 20 25 30 Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser Leu Asn Pro Asn Lys Ser Ser Ser Ser 35 40 45 Ser Arg Arg Arg Gly Ile Lys Ser Ser Ser Pro Ser Ser Ile Ser Ala 50 55 60 Val Leu Asn Thr Thr Thr Asn Val Thr Thr Thr Pro Ser Pro Thr Lys 65 70 75 80 Pro Thr Lys Pro Glu Thr Phe Ile Ser Arg Phe Ala Pro Asp Gln Pro 85 90 95 Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gln Gly Val 100 105 110 Glu Thr Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln 115 120 125 Ala Leu Thr Arg Ser Ser Ser Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His Glu 130 135 140 Gln Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Lys 145 150 155 160 Pro Gly Ile Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val 165 170 175 Ser Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala Ile 180 185 190 Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu 195 200 205 Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu 210 215 220 Val Met Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Ile Ile Glu Glu Ala Phe Phe 225 230 235 240 Leu Ala Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro Lys 245 250 255 Asp Ile Gln Gln Gln Leu Ala Ile Pro Asn Trp Glu Gln Ala Met Arg 260 265 270 Leu Pro Gly Tyr Met Ser Arg Met Pro Lys Pro Pro Glu Asp Ser His 275 280 285 Leu Glu Gln Ile Val Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu 290 295 300 Tyr Val Gly Gly Gly Cys Leu Asn Ser Ser Asp Glu Leu Gly Arg Phe 305 310 315 320 Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly 325 330 335 Ser Tyr Pro Cys Asp Asp Glu Leu Ser Leu His Met Leu Gly Met His 340 345 350 Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu Leu 355 360 365 Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala 370 375 380 Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu 385 390 395 400 Ile Gly Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val Lys 405 410 415 Leu Ala Leu Gln Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu Glu 420 425 430 Leu Lys Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Asn Glu Leu Asn Val Gln Lys 435 440 445 Gln Lys Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro Pro 450 455 460 Gln Tyr Ala Ile Lys Val Leu Asp Glu Leu Thr Asp Gly Lys Ala Ile 465 470 475 480 Ile Ser Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Tyr 485 490 495 Asn Tyr Lys Lys Pro Arg Gln Trp Leu Ser Ser Gly Gly Leu Gly Ala 500 505 510 Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro 515 520 525 Asp Ala Ile Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn 530 535 540 Val Gln Glu Leu Ala Thr Ile Arg Val Glu Gln Leu Pro Val Lys Ile 545 550 555 560 Leu Leu Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Met Gln Trp Glu Asp 565 570 575 Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Phe Leu Gly Asp Pro Ala 580 585 590 Gln Glu Asp Glu Ile Phe Pro Asn Met Leu Leu Phe Ala Ala Ala Cys 595 600 605 Gly Ile Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Ala Asp Leu Arg Glu Ala 610 615 620 Ile Gln Thr Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile 625 630 635 640 Cys Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Gly Gly Thr 645 650 655 Phe Asn Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg Ile Lys Tyr 660 665 670 <210> 2 <211> 655 <212> PRT <213> Brassica juncea <400> 2 Met Ala Ala Ala Thr Ser Ser Ser Pro Ile Ser Phe Thr Ala Lys Pro 1 5 10 15 Ser Ser Lys Ser Leu Leu Pro Ile Ser Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser 20 25 30 Leu Ile Pro Gln Lys Pro Ser Ser Leu Arg His Ser Pro Leu Ser Ile 35 40 45 Ser Ala Val Leu Asn Thr Pro Val Asn Val Ala Pro Pro Ser Pro Glu 50 55 60 Lys Ile Glu Lys Asn Lys Thr Phe Ile Ser Arg Tyr Ala Pro Asp Glu 65 70 75 80 Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gln Gly 85 90 95 Val Glu Thr Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His 100 105 110 Gln Ala Leu Thr Arg Ser Ser Thr Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His 115 120 125 Glu Gln Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly 130 135 140 Lys Pro Gly Ile Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu 145 150 155 160 Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala Met Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala 165 170 175 Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln 180 185 190 Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr 195 200 205 Leu Val Met Asp Val Asp Asp Ile Pro Arg Ile Val Gln Glu Ala Phe 210 215 220 Phe Leu Ala Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro 225 230 235 240 Lys Asp Ile Gln Gln Gln Leu Ala Ile Pro Asn Trp Asp Gln Pro Met 245 250 255 Arg Leu Pro Gly Tyr Met Ser Arg Leu Pro Gln Pro Pro Glu Val Ser 260 265 270 Gln Leu Gly Gln Ile Val Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Arg Pro Val 275 280 285 Leu Tyr Val Gly Gly Gly Ser Leu Asn Ser Ser Asp Glu Leu Gly Arg 290 295 300 Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu 305 310 315 320 Gly Ser Tyr Pro Cys Asn Asp Glu Leu Ser Leu Gln Met Leu Gly Met 325 330 335 His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu 340 345 350 Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu 355 360 365 Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala 370 375 380 Glu Ile Gly Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val 385 390 395 400 Lys Leu Ala Leu Gln Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu 405 410 415 Glu Leu Lys Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Ser Glu Leu Ser Glu Gln 420 425 430 Lys Gln Lys Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro 435 440 445 Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu Thr Asp Gly Lys Ala 450 455 460 Ile Ile Ser Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe 465 470 475 480 Tyr Lys Tyr Arg Lys Pro Arg Gln Trp Leu Ser Ser Ser Gly Leu Gly 485 490 495 Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ser Val Ala Asn 500 505 510 Pro Asp Ala Ile Val Val 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<400> 13 cacgttcaca aactcattca tcatctctct ctcatttctc tctctctcat ctaaccatgg 60 cggcggcaac atcgtcttct ccgatctcct taaccgctaa accttcttcc aaatcccctc 120 tacccatttc cagattctcc cttcccttct ccttaacccc acagaaaccc tcctcccgtc 180 tccaccgtcc tctcgccatc tccgccgttc tcaactcacc cgtcaatgtc gcacctgaaa 240 aaaccgacaa gatcaagact ttcatctccc gctacgctcc cgacgagccc cgcaagggtg 300 ctgatatcct cgtggaagcc ctcgagcgtc aaggcgtcga aaccgtcttc gcttatcccg 360 gaggtgcctc catggagatc caccaagcct tgactcgctc ctccaccatc cgtaacgtcc 420 tcccccgtca cgaacaagga ggagtcttcg ccgccgaggg ttacgctcgt tcctccggca 480 aaccgggaat ctgcattgcc acttcgggtc ccggagctac caacctcgtc agcgggttag 540 ccgacgcgat gcttgacagt gttcctctcg tcgccattac aggacaggtc cctcgccgga 600 tgatcggtac tgacgccttc caagagacgc caatcgttga ggtaacgagg tctattacga 660 aacataacta tctggtgatg gatgttgatg acatacctag gatcgttcaa gaagctttct 720 ttctagctac ttccggtaga cccggaccgg ttttggttga cgttcctaag gatattcagc 780 agcagcttgc gattcctaac tgggatcaac ctatgcgctt gcctggctac atgtctaggc 840 tgcctcagcc 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aaacaaccag catcttggga tggtcatgca atgggaagat cggttctaca 1740 aagctaacag agctcacact tatctcgggg acccggcaag ggagaacgag atcttcccta 1800 acatgctgca gtttgcagga gcttgcggga ttccagctgc gagagtgacg aagaaagaag 1860 aactccgaga agctattcag acaatgctgg atacacctgg accgtacctg ttggatgtca 1920 tctgtccgca ccaagaacat gtgttaccga tgatcccaaa tggtggcact ttcaaagatg 1980 taataaccga aggggatggt cgcactaagt actga 2015 <210> 14 <211> 2024 <212> DNA <213> Brassica juncea <400> 14 cacgttcaca aactcattca tcatctctcg ctcatttctc tccctctcct ctaaccatgg 60 cggcggcaac atcgtcttct ccaatctcct tcaccgctaa accttcttcc aaatcccttt 120 tacccatttc cagattctcc cttcccttct ccttaatccc gcagaaaccc tcctcccttc 180 gccacagtcc tctctccatc tcagccgttc tcaacacacc cgtcaatgtc gcacctcctt 240 cccctgaaaa aattgaaaag aacaagactt tcatctcccg ctacgctccc gacgagcccc 300 gcaagggcgc cgatatcctc gtcgaagccc tcgagcgtca aggcgtcgaa accgtcttcg 360 cttacccggg aggtacttcc atggagatcc accaagcctt aactcgatcc tctaccatcc 420 gtaacgtcct cccccgtcac gaacaaggag gagtctttgc cgccgagggt 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tcggagtttg gaggagtgaa ttgagcgagc agaaacaaaa gttcccgttg agttttaaaa 1380 cgtttggaga agctattcct ccacagtacg cgattcaggt cctcgacgag ctaaccgatg 1440 ggaaggcaat catcagtact ggtgttgggc aacatcagat gtgggcggcg cagttttaca 1500 agtacaggaa gccgaggcag tggttgtcat catcaggcct tggagctatg ggttttggac 1560 ttcctgctgc cattggagcg tctgtggcga accctgatgc gattgttgtg gacattgacg 1620 gtgacggaag cttcatcatg aatgttcaag agctggccac aatccgtgta gagaatcttc 1680 ctgtgaaggt actcttgtta aacaaccagc atcttggcat ggttatgcaa tgggaagatc 1740 ggttctacaa agctaacaga gctcacactt atctcgggga tccggcaaag gagaacgaga 1800 tcttcccaaa catgctgcag tttgcaggag cctgtgggat tccagctgcg agggtgacga 1860 agaaagaaga actccgagat gctattcaga caatgctgga tacaccagga ccatacctgt 1920 tggatgtgat ctgtccgcac caagagcatg tgttaccgat gatcccaagt ggtggtactt 1980 tcaaagatgt cataacagaa ggggatggtc gcactaagta ctga 2024 <210> 15 <211> 2015 <212> DNA <213> Brassica juncea <400> 15 cacgttcaca aactcattca tcatctctct ctcatttctc tctctctcat ctaaccatgg 60 cggcggcaac atcgtcttct ccgatctcct taaccgctaa accttcttcc aaatcccctc 120 tacccatttc cagattctcc cttcccttct ccttaacccc acagaaaccc tcctcccgtc 180 tccaccgtcc tctcgccatc tccgccgttc tcaactcacc cgtcaatgtc gcacctgaaa 240 aaaccgacaa gatcaagact ttcatctccc gctacgctcc cgacgagccc cgcaagggtg 300 ctgatatcct cgtggaagcc ctcgagcgtc aaggcgtcga aaccgtcttc gcttatcccg 360 gaggtacctc catggagatc caccaagcct tgactcgctc ctccaccatc cgtaacgtcc 420 tcccccgtca cgaacaagga ggagtcttcg ccgccgaggg ttacgctcgt tcctccggca 480 aaccgggaat ctgcattgcc acttcgggtc ccggagctac caacctcgtc agcgggttag 540 ccgacgcgat gcttgacagt gttcctctcg tcgccattac aggacaggtc cctcgccgga 600 tgatcggtac tgacgccttc caagagacgc caatcgttga ggtaacgagg tctattacga 660 aacataacta tctggtgatg gatgttgatg acatacctag gatcgttcaa gaagctttct 720 ttctagctac ttccggtaga cccggaccgg ttttggttga cgttcctaag gatattcagc 780 agcagcttgc gattcctaac tgggatcaac ctatgcgctt gcctggctac atgtctaggc 840 tgcctcagcc accggaagtt tctcagttag gtcagatcgt taggttgatc tcggagtcta 900 agaggcctgt tttgtacgtt ggtggtggaa gcttgaactc gagtgaagaa ctggggagat 960 ttgtcgagct tactgggatc cctgttgcga gtacgttgat ggggcttggc tcttatcctt 1020 gtaacgatga gttgtccctg cagatgcttg gcatgcacgg gactgtgtat gctaactacg 1080 ctgtggagca tagtgatttg ttgctggcgt ttggtgttag gtttgatgac cgtgtcacgg 1140 gaaagctcga ggcgtttgcg agcagggcta agattgtgca catagacatt gattctgctg 1200 agattgggaa gaataagaca cctcacgtgt ctgtgtgtgg tgatgtaaag ctggctttgc 1260 aagggatgaa caaggttctt gagaaccggg cggaggagct caagcttgat ttcggtgttt 1320 ggaggagtga gttgagcgag cagaaacaga agttcccgtt gagcttcaaa acgtttggag 1380 aagccattcc tccgcagtac gcgattcagg tcctagacga gctaacccaa gggaaggcaa 1440 ttatcagtac tggtgttgga cagcatcaga tgtgggcggc gcagttttac aagtacagga 1500 agccgaggca gtggctgtcg tcctcaggac tcggagctat gggtttcgga cttcctgctg 1560 cgattggagc gtctgtggcg aaccctgatg cgattgttgt ggacattgac ggtgatggaa 1620 gcttcataat gaacgttcaa gagctggcca caatccgtgt agagaatctt cctgtgaaga 1680 tactcttgtt aaacaaccag catcttggga tggtcatgca atgggaagat cggttctaca 1740 aagctaacag agctcacact tatctcgggg acccggcaag ggagaacgag atcttcccta 1800 acatgctgca gtttgcagga gcttgcggga ttccagctgc gagagtgacg aagaaagaag 1860 aactccgaga agctattcag acaatgctgg atacacctgg accgtacctg ttggatgtca 1920 tctgtccgca ccaagaacat gtgttaccga tgatcccaag tggtggcact ttcaaagatg 1980 taataaccga aggggatggt cgcactaagt actga 2015 <210> 16 <211> 1959 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 16 atggcggcgg caacatcgtc ttctccgatc tccttaaccg ctaaaccttc ttccaaatcc 60 cctctaccca tttccagatt ctcccttccc ttctccttaa ccccacagaa accctcctcc 120 cgtctccacc gtccactcgc catctccgcc gttctcaact cacccgtcaa tgtcgcacct 180 gaaaaaaccg acaagatcaa gactttcatc tcccgctacg ctcccgacga gccccgcaag 240 ggtgctgata tcctcgtgga agccctcgag cgtcaaggcg tcgaaaccgt cttcgcttat 300 cccggaggtg cctccatgga gatccaccaa gccttgactc gctcctccac catccgtaac 360 gtcctccccc gtcacgaaca aggaggagtc ttcgccgccg agggttacgc tcgttcctcc 420 ggcaaaccgg gaatctgcat agccacttcg ggtcccggag ctaccaacct cgtcagcggg 480 ttagccgacg cgatgcttga cagtgttcct ctcgtcgcca tcacaggaca ggtccctcgc 540 cggatgatcg gtactgacgc gttccaagag acgccaatcg ttgaggtaac gaggtctatt 600 acgaaacata actatctggt gatggatgtt gatgacatac ctaggatcgt tcaagaagca 660 ttctttctag ctacttccgg tagacccgga ccggttttgg ttgatgttcc taaggatatt 720 cagcagcagc ttgcgattcc taactgggat caacctatgc gcttgcctgg ctacatgtct 780 aggctgcctc agccaccgga agtttctcag ttaggccaga tcgttaggtt gatctcggag 840 tctaagaggc ctgttttgta cgttggtggt ggaagcttga actcgagtga agaactgggg 900 agatttgtcg agcttactgg gatccctgtt gcgagtacgt tgatggggct tggctcttat 960 ccttgtaacg atgagttgtc cctgcagatg cttggcatgc acgggactgt gtatgctaac 1020 tacgctgtgg agcatagtga tttgttgctg gcgtttggtg ttaggtttga tgaccgtgtc 1080 acgggaaagc tcgaggcgtt tgcgagcagg gctaagattg tgcacataga cattgattct 1140 gctgagattg ggaagaataa gacacctcac gtgtctgtgt gtggtgatgt aaagctggct 1200 ttgcaaggga tgaacaaggt tcttgagaac cgggcggagg agctcaagct tgatttcggt 1260 gtttggagga gtgagttgag cgagcagaaa cagaagttcc cgttgagctt caaaacgttt 1320 ggagaagcca ttcctccgca gtacgcgatt caggtcctag acgagctaac ccaagggaag 1380 gcaattatca gtactggtgt tggacagcat cagatgtggg cggcgcagtt ttacaagtac 1440 aggaagccga ggcagtggct gtcgtcctca ggactcggag ctatgggttt cggacttcct 1500 gctgcgattg gagcgtctgt ggcgaaccct gatgcgattg ttgtggacat tgacggtgat 1560 ggaagcttca taatgaacgt tcaagagctg gccacaatcc gtgtagagaa tcttcctgtg 1620 aagatactct tgttaaacaa ccagcatctt gggatggtca tgcaattgga agatcggttc 1680 tacaaagcta acagagctca cacttatctc ggggacccgg caagggagaa cgagatcttc 1740 cctaacatgc tgcagtttgc aggagcttgc gggattccag ctgcgagagt gacgaagaaa 1800 gaagaactcc gagaagctat tcagacaatg ctggatacac ctggaccgta cctgttggat 1860 gtcatctgtc cgcaccaaga acatgtgtta ccgatgatcc caagtggtgg cactttcaaa 1920 gatgtaataa ccgaagggga tggtcgcact aagtactga 1959 <210> 17 <211> 2015 <212> DNA <213> Brassica juncea <400> 17 cacgttcaca aactcattca tcatctctct ctcatttctc tctctctcat ctaaccatgg 60 cggcggcaac atcgtcttct ccgatctcct taaccgctaa accttcttcc aaatcccctc 120 tacccatttc cagattctcc cttcccttct ccttaacccc acagaaaccc tcctcccgtc 180 tccaccgtcc tctcgccatc tccgccgttc tcaactcacc cgtcaatgtc gcacctgaaa 240 aaaccgacaa gatcaagact ttcatctccc gctacgctcc cgacgagccc cgcaagggtg 300 ctgatatcct cgtggaagcc ctcgagcgtc aaggcgtcga aaccgtcttc gcttatcccg 360 gaggtgcctc catggagatc caccaagcct tgactcgctc ctccaccatc cgtaacgtcc 420 tcccccgtca cgaacaagga ggagtcttcg ccgccgaggg ttacgctcgt tcctccggca 480 aaccgggaat ctgcattgcc acttcgggtc ccggagctac caacctcgtc agcgggttag 540 ccgacgcgat gcttgacagt gttcctctcg tcgccattac aggacaggtc cctcgccgga 600 tgatcggtac tgacgccttc caagagacgc caatcgttga ggtaacgagg tctattacga 660 aacataacta tctggtgatg gatgttgatg acatacctag gatcgttcaa gaagctttct 720 ttctagctac ttccggtaga cccggaccgg ttttggttga cgttcctaag gatattcagc 780 agcagcttgc gattcctaac tgggatcaac ctatgcgctt gcctggctac atgtctaggc 840 tgcctcagcc accggaagtt tctcagttag gtcagatcgt taggttgatc tcggagtcta 900 agaggcctgt tttgtacgtt ggtggtggaa gcttgaactc gagtgaagaa ctggggagat 960 ttgtcgagct tactgggatc cctgttgcga gtacgttgat ggggcttggc tcttatcctt 1020 gtaacgatga gttgtccctg cagatgcttg gcatgcacgg gactgtgtat gctaactacg 1080 ctgtggagca tagtgatttg ttgctggcgt ttggtgttag gtttgatgac cgtgtcacgg 1140 gaaagctcga ggcgtttgcg agcagggcta agattgtgca catagacatt gattctgctg 1200 agattgggaa gaataagaca cctcacgtgt ctgtgtgtgg tgatgtaaag ctggctttgc 1260 aagggatgaa caaggttctt gagaaccggg cggaggagct caagcttgat ttcggtgttt 1320 ggaggagtga gttgagcgag cagaaacaga agttcccgtt gagcttcaaa acgtttggag 1380 aagccattcc tccgcagtac gcgattcagg tcctagacga gctaacccaa gggaaggcaa 1440 ttatcagtac tggtgttgga cagcatcaga tgtgggcggc gcagttttac aagtacagga 1500 agccgaggca gtggctgtcg tcctcaggac tcggagctat gggtttcgga cttcctgctg 1560 cgattggagc gtctgtggcg aaccctgatg cgattgttgt ggacattgac ggtgatggaa 1620 gcttcataat gaacgttcaa gagctggcca caatccgtgt agagaatctt cctgtgaaga 1680 tactcttgtt aaacaaccag catcttggga tggtcatgca atgggaagat cggttctaca 1740 aagctaacag agctcacact tatctcgggg acccggcaag ggagaacgag atcttcccta 1800 acatgctgca gtttgcagga gcttgcggga ttccagctgc gagagtgacg aagaaagaag 1860 aactccgaga agctattcag acaatgctgg atacacctgg accgtacctg ttggatgtca 1920 tctgtccgca ccaagaacat gtgttaccga tgatcccaag tggtggcact ttcaaagatg 1980 taataaccga aggggatggt cgcactaagt actga 2015 <210> 18 <211> 2024 <212> DNA <213> Brassica juncea <400> 18 cacgttcaca aactcattca tcatctctcg ctcatttctc tccctctcct ctaaccatgg 60 cggcggcaac atcgtcttct ccaatctcct tcaccgctaa accttcttcc aaatcccttt 120 tacccatttc cagattctcc cttcccttct ccttaatccc gcagaaaccc tcctcccttc 180 gccacagtcc tctctccatc tcagccgttc tcaacacacc cgtcaatgtc gcacctcctt 240 cccctgaaaa aattgaaaag aacaagactt tcatctcccg ctacgctccc gacgagcccc 300 gcaagggcgc cgatatcctc gtcgaagccc tcgagcgtca aggcgtcgaa accgtcttcg 360 cttacccggg aggtgcttcc atggagatcc accaagcctt aactcgatcc tctaccatcc 420 gtaacgtcct cccccgtcac gaacaaggag gagtctttgc cgccgagggt tacgctcgtt 480 cctctggtaa accgggaatc tgcatagcca cgtcaggtcc cggagccacc aacctcgtta 540 gcggtttagc cgacgcgatg ctcgacagtg tccctctcgt cgctattaca ggacaggtcc 600 ctcgtcggat gattggtact gacgcgttcc aggagacgcc aatcgttgag gtaacgaggt 660 ctattacgaa acataactat ctggtcatgg atgttgatga catacctagg atcgtgcaag 720 aggctttctt tctagctact tccggtagac ccggaccggt tttagttgat gttcctaagg 780 atattcagca gcagcttgcg attcctaact gggatcagcc tatgcgctta cctggttaca 840 tgtctaggct gcctcagcct ccggaagttt ctcagttagg gcagatcgtt aggttgatct 900 ctgaatctaa gaggcctgtt ttgtatgttg gtggtggaag cttgaactcg agtgatgaac 960 tggggaggtt tgtggagctt actgggatcc ctgtcgcgag tactttgatg gggcttggtt 1020 cttatccttg taacgatgag ttgtctctgc agatgcttgg tatgcacggg actgtgtacg 1080 ctaattacgc tgtggagcat agtgatttgt tgctggcgtt tggtgttagg tttgatgacc 1140 gtgtcactgg aaagctcgag gcttttgcga gcagggctaa gattgtgcac attgacattg 1200 attctgctga gattgggaag aacaagacgc ctcatgtgtc tgtgtgtggt gatgttaagc 1260 tggctttgca agggatgaac aaggttcttg agaaccgagc agaggagctc aagcttgact 1320 tcggagtttg gaggagtgaa ttgagcgagc agaaacaaaa gttcccgttg agttttaaaa 1380 cgtttggaga agctattcct ccacagtacg cgattcaggt cctcgacgag ctaaccgatg 1440 ggaaggcaat catcagtact ggtgttgggc aacatcagat gtgggcggcg cagttttaca 1500 agtacaggaa gccgaggcag tggttgtcat catcaggcct tggagctatg ggttttggac 1560 ttcctgctgc cattggagcg tctgtggcga accctgatgc gattgttgtg gacattgacg 1620 gtgacggaag cttcatcatg aatgttcaag agctggccac aatccgtgta gagaatcttc 1680 ctgtgaaggt actcttgtta aacaaccagc atcttggcat ggttatgcaa tgggaagatc 1740 ggttctacaa agctaacaga gctcacactt atctcgggga tccggcaaag gagaacgaga 1800 tcttcccaaa catgctgcag tttgcaggag cctgtgggat tccagctgcg agggtgacga 1860 agaaagaaga actccgagat gctattcaga caatgctgga tacaccagga ccatacctgt 1920 tggatgtgat ctgtccgcac caagagcatg tgttaccgat gatcccaagt ggtggtactt 1980 tcaaagatgt cataacagaa ggggatggtc gcactaagta ctga 2024 <210> 19 <211> 2017 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 19 cacgttcaca aactcattca tcatctctct ctcatttctc tctctctctc atctaaccat 60 ggcggcggca acatcgtctt ctccgatctc cttaaccgct aaaccttctt ccaaatcccc 120 tctacccatt tccagattct cccttccctt ctccttaacc ccacagaaac cctcctcccg 180 tctccaccgt ccactcgcca tctccgccgt tctcaactca cccgtcaatg tcgcacctga 240 aaaaaccgac aagatcaaga ctttcatctc ccgctacgct cccgacgagc cccgcaaggg 300 tgctgatatc ctcgtggaag ccctcgagcg tcaaggcgtc gaaaccgtct tcgcttatcc 360 cggaggtgcc tccatggaga tccaccaagc cttgactcgc tcctccacca tccgtaacgt 420 cctcccccgt cacgaacaag gaggagtctt cgccgccgag ggttacgctc gttcctccgg 480 caaaccggga atctgcatag ccacttcggg tcccggagct accaacctcg tcagcgggtt 540 agccgacgcg atgcttgaca gtgttcctct cgtcgccatc acaggacagg tccctcgccg 600 gatgatcggt actgacgcgt tccaagagac gccaatcgtt gaggtaacga ggtctattac 660 gaaacataac tatctggtga tggatgttga tgacatacct aggatcgttc aagaagcatt 720 ctttctagct acttccggta gacccggacc ggttttggtt gatgttccta aggatattca 780 gcagcagctt gcgattccta actgggatca acctatgcgc ttgcctggct acatgtctag 840 gctgcctcag ccaccggaag tttctcagtt aggccagatc gttaggttga tctcggagtc 900 taagaggcct gttttgtacg ttggtggtgg aagcttgaac tcgagtgaag aactggggag 960 atttgtcgag cttactggga tccctgttgc gagtacgttg atggggcttg gctcttatcc 1020 ttgtaacgat gagttgtccc tgcagatgct tggcatgcac gggactgtgt atgctaacta 1080 cgctgtggag catagtgatt tgttgctggc gtttggtgtt aggtttgatg accgtgtcac 1140 gggaaagctc gaggcgtttg cgagcagggc taagattgtg cacatagaca ttgattctgc 1200 tgagattggg aagaataaga cacctcacgt gtctgtgtgt ggtgatgtaa agctggcttt 1260 gcaagggatg aacaaggttc ttgagaaccg ggcggaggag ctcaagcttg atttcggtgt 1320 ttggaggagt gagttgagcg agcagaaaca gaagttcccg ttgagcttca aaacgtttgg 1380 agaagccatt cctccgcagt acgcgattca ggtcctagac gagctaaccc aagggaaggc 1440 aattatcagt actggtgttg gacagcatca gatgtgggcg gcgcagtttt acaagtacag 1500 gaagccgagg cagtggctgt cgtcctcagg actcggagct atgggtttcg gacttcctgc 1560 tgcgattgga gcgtctgtgg cgaaccctga tgcgattgtt gtggacattg acggtgatgg 1620 aagcttcata atgaacgttc aagagctggc cacaatccgt gtagagaatc ttcctgtgaa 1680 gatactcttg ttaaacaacc agcatcttgg gatggtcatg caatgggaag atcggttcta 1740 caaagctaac agagctcaca cttatctcgg ggacccggca agggagaacg agatcttccc 1800 taacatgctg cagtttgcag gagcttgcgg gattccagct gcgagagtga cgaagaaaga 1860 agaactccga gaagctattc agacaatgct ggatacacct ggaccgtacc tgttggatgt 1920 catctgtccg caccaagaac atgtgttacc gatgatccca agtggtggca ctttcaaaga 1980 tgtaataacc gaaggggatg gtcgcactaa gtactga 2017 <210> 20 <211> 2009 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 20 cacgttcaca aactcattca tcatctctct ctcctctaac catggcggcg gcaacatcgt 60 cttctccgat ctccttaacc gctaaacctt cttccaaatc ccctctaccc atttccagat 120 tctcccttcc cttctcctta accccacaga aagactcctc ccgtctccac cgtcctctcg 180 ccatctccgc cgttctcaac tcacccgtca atgtcgcacc tccttcccct gaaaaaaccg 240 acaagaacaa gactttcgtc tcccgctacg ctcccgacga gccccgcaag ggtgctgata 300 tcctcgtcga agccctcgag cgtcaaggcg tcgaaaccgt ctttgcttat cccggaggtg 360 cttccatgga gatccaccaa gccttgactc gctcctccac catccgtaac gtccttcccc 420 gtcacgaaca aggaggagtc ttcgccgccg agggttacgc tcgttcctcc ggcaaaccgg 480 gaatctgcat agccacttcg ggtcccggag ctaccaacct cgtcagcggg ttagcagacg 540 cgatgcttga cagtgttcct cttgtcgcca ttacaggaca ggtccctcgc cggatgatcg 600 gtactgacgc cttccaagag acaccaatcg ttgaggtaac gaggtctatt acgaaacata 660 actatttggt gatggatgtt gatgacatac ctaggatcgt tcaagaagct ttctttctag 720 ctacttccgg tagacccgga ccggttttgg ttgatgttcc taaggatatt cagcagcagc 780 ttgcgattcc taactgggat caacctatgc gcttacctgg ctacatgtct aggttgcctc 840 agcctccgga agtttctcag ttaggtcaga tcgttaggtt gatctcggag tctaagaggc 900 ctgttttgta cgttggtggt ggaagcttga actcgagtga agaactgggg agatttgtcg 960 agcttactgg gatccccgtt gcgagtactt tgatggggct tggctcttat ccttgtaacg 1020 atgagttgtc cctgcagatg cttggcatgc acgggactgt gtatgctaac tacgctgtgg 1080 agcatagtga tttgttgctg gcgtttggtg ttaggtttga tgaccgtgtc acgggaaagc 1140 tcgaggcttt cgctagcagg gctaaaattg tgcacataga cattgattct gctgagattg 1200 ggaagaataa gacacctcac gtgtctgtgt gtggtgatgt aaagctggct ttgcaaggga 1260 tgaacaaggt tcttgagaac cgggcggagg agctcaagct tgatttcggt gtttggagga 1320 gtgagttgag cgagcagaaa cagaagttcc ctttgagctt caaaacgttt ggagaagcca 1380 ttcctccgca gtacgcgatt cagatcctcg acgagctaac cgaagggaag gcaattatca 1440 gtactggtgt tggacagcat cagatgtggg cggcgcagtt ttacaagtac aggaagccga 1500 gacagtggct gtcgtcatca ggcctcggag ctatgggttt tggacttcct gctgcgattg 1560 gagcgtctgt ggcgaaccct gatgcgattg ttgtggatat tgacggtgat ggaagcttca 1620 taatgaacgt tcaagagctg gccacaatcc gtgtagagaa tcttcctgtg aagatactct 1680 tgttaaacaa ccagcatctt gggatggtca tgcaatggga agatcggttc tacaaagcta 1740 acagagctca cacttatctc ggggacccgg caagggagaa cgagatcttc cctaacatgc 1800 tgcagtttgc aggagcttgc gggattccag ctgcgagagt gacgaagaaa gaagaactcc 1860 gagaagctat tcagacaatg ctggatacac caggaccata cctgttggat gtgatatgtc 1920 cgcaccaaga acatgtgtta ccgatgatcc caagtggtgg cactttcaaa gatgtaataa 1980 cagaagggga tggtcgcact aagtactga 2009

Claims (61)

  1. 제초제 저항성 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 폴리펩티드를 코딩하는 AHASL 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피를 게놈 내에 포함하고, 이때 AHASL 폴리펩티드는
    a) 서열 1의 위치 653, 또는 서열 2의 위치 638, 또는 서열 3의 위치 635에 대응하는 위치에 아스파라긴이 있는 폴리펩티드;
    b) 서열 1의 위치 122, 또는 서열 4의 위치 107, 또는 서열 5의 위치 104에 대응하는 위치에 트레오닌이 있는 폴리펩티드; 및
    c) 서열 1의 위치 574, 또는 서열 6의 위치 557에 대응하는 위치에 류신이 있는 폴리펩티드
    로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 브라시카(Brassica) 식물.
  2. 제1항에 있어서, 브라시카 준세아(B. juncea), 브라시카 나푸스(B. napus), 브라시카 라파(B. rapa), 브라시카 카리나타(B. carinata), 브라시카 올레라세아(B. oleracea) 및 브라시카 니그라(B. nigra)로 구성된 군으로부터 선택되는 브라시카 식물.
  3. 제1항에 있어서, 제초제 저항성 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 폴리펩티드를 코딩하는 AHASL 폴리뉴클레오티드의 2개 이상의 카피를 포함 하고, 이때 AHASL 폴리펩티드는
    a) 서열 1의 위치 653, 또는 서열 2의 위치 638, 또는 서열 3의 위치 635에 대응하는 위치에 아스파라긴이 있는 폴리펩티드;
    b) 서열 1의 위치 122, 또는 서열 4의 위치 107, 또는 서열 5의 위치 104에 대응하는 위치에 트레오닌이 있는 폴리펩티드; 및
    c) 서열 1의 위치 574, 또는 서열 6의 위치 557에 대응하는 위치에 류신이 있는 폴리펩티드
    로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 브라시카 식물.
  4. 제3항에 있어서, 서열 1의 위치 653, 또는 서열 2의 위치 638, 또는 서열 3의 위치 635에 대응하는 위치에 아스파라긴이 있는 폴리펩티드 및 서열 1의 위치 574, 또는 서열 6의 위치 557에 대응하는 위치에 류신이 있는 폴리펩티드를 포함하는 브라시카 식물.
  5. 제4항에 있어서, 브라시카 준세아, 브라시카 나푸스, 브라시카 라파, 브라시카 카리나타, 브라시카 올레라세아 및 브라시카 니그라로 구성된 군으로부터 선택되는 브라시카 식물.
  6. 제5항에 있어서, 브라시카 준세아인 브라시카 식물.
  7. 제6항에 있어서,
    a) J05Z-07801로 지정된 식물 계통;
    b) J05Z-07801로 지정된 식물 계통의 자손;
    c) a) 및 b)의 식물 중 하나의 돌연변이체, 재조합체, 또는 유전자 조작된 유도체; 또는
    d) a) 내지 c)의 식물 중 하나 이상의 자손인 식물
    인 브라시카 식물.
  8. 게놈 내에 AHASL 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피를 포함하는, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 브라시카 식물의 종자.
  9. 제1항에 있어서, 제초제가 이미다졸리논, 술포닐우레아, 트리아졸로피리미딘 및 피리미디닐옥시벤조에이트로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 브라시카 식물.
  10. 제9항에 있어서, 제초제가 이미다졸리논인 브라시카 식물.
  11. 유효량의 이미다졸리논 제초제, 술포닐우레아 제초제, 트리아졸로피리미딘 제초제, 피리미디닐옥시벤조에이트 제초제 또는 이들의 혼합물을 잡초 및 브라시카 식물에 적용하는 단계를 포함하고, 이때 브라시카 식물은 제초제 저항성 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 폴리펩티드를 코딩하는 AHASL 코딩 폴리뉴 클레오티드의 하나 이상의 카피를 게놈 내에 포함하며, AHASL 폴리펩티드는
    a) 서열 1의 위치 653, 또는 서열 2의 위치 638, 또는 서열 3의 위치 635에 대응하는 위치에 아스파라긴이 있는 폴리펩티드;
    b) 서열 1의 위치 122, 또는 서열 4의 위치 107, 또는 서열 5의 위치 104에 대응하는 위치에 트레오닌이 있는 폴리펩티드; 및
    c) 서열 1의 위치 574, 또는 서열 6의 위치 557에 대응하는 위치에 류신이 있는 폴리펩티드
    로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 브라시카 식물 부근에 있는 잡초를 제어하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 식물이 서열 1의 위치 653, 또는 서열 2의 위치 638, 또는 서열 3의 위치 635에 대응하는 위치에 아스파라긴이 있는 폴리펩티드 및 서열 1의 위치 574, 또는 서열 6의 위치 557에 대응하는 위치에 류신이 있는 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 브라시카 식물이 브라시카 준세아, 브라시카 나푸스, 브라시카 라파, 브라시카 카리나타, 브라시카 올레라세아 및 브라시카 니그라로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 식물이 브라시카 준세아인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 브라시카 식물이
    a) J05Z-07801로 지정된 식물 계통;
    b) J05Z-07801로 지정된 식물 계통의 자손;
    c) a) 및 b)의 식물 중 하나의 돌연변이체, 재조합체, 또는 유전자 조작된 유도체; 또는
    d) a) 내지 c)의 식물 중 하나 이상의 자손인 식물
    인 방법.
  16. 제11항에 있어서, 제초제가 이미다졸리논, 술포닐우레아, 트리아졸로피리미딘 및 피리미디닐옥시벤조에이트로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  17. a) 서열 3에 기재된 뉴클레오티드 서열;
    b) 서열 4에 기재된 뉴클레오티드 서열;
    c) 서열 5에 기재된 뉴클레오티드 서열;
    d) 서열 3에 기재된 뉴클레오티드 서열에 대한 서열 동일성이 90％ 이상이고, 단백질에 서열 1의 위치 653, 또는 서열 2의 위치 638, 또는 서열 3의 위치 635에 대응하는 위치에 아스파라긴이 있는 뉴클레오티드 서열;
    e) 서열 4에 기재된 뉴클레오티드 서열에 대한 서열 동일성이 90％ 이상이고, 단백질에 서열 1의 위치 122, 또는 서열 4의 위치 107, 또는 서열 5의 위치 104에 대응하는 위치에 트레오닌이 있는 뉴클레오티드 서열;
    f) 서열 5에 기재된 뉴클레오티드 서열에 대한 서열 동일성이 90％ 이상이고, 단백질에 서열 1의 위치 122, 또는 서열 4의 위치 107, 또는 서열 5의 위치 104에 대응하는 위치에 트레오닌이 있는 뉴클레오티드 서열;
    g) 엄격한 조건 하에 a)-f)에 기재된 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열; 및
    h) a)-g)에 기재된 뉴클레오티드 서열들로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열에 완전하게 상보적인 뉴클레오티드 서열
    로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 AHASL 코딩 폴리뉴클레오티드 분자.
  18. 제17항에 있어서, 코딩된 AHASL 단백질이
    a) 서열 1의 위치 653, 또는 서열 2의 위치 638, 또는 서열 3의 위치 635에 대응하는 위치의 아스파라긴;
    b) 서열 1의 위치 122, 또는 서열 4의 위치 107, 또는 서열 5의 위치 104에 대응하는 위치의 트레오닌; 및
    c) 서열 1의 위치 574, 또는 서열 6의 위치 557에 대응하는 위치의 류신
    으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  19. 제17항 또는 제18항의 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터.
  20. 제19항의 발현 벡터로 형질전환된 형질전환 식물.
  21. 제20항에 있어서, 이미다졸리논, 술포닐우레아, 트리아졸로피리미딘 및 피리미디닐옥시벤조에이트로 구성된 군으로부터 선택된 제초제에 대한 저항성이 증가된 식물.
  22. 제21항에 있어서, 브라시카 준세아, 브라시카 나푸스, 브라시카 라파, 브라시카 카리나타, 브라시카 올레라세아 및 브라시카 니그라로 구성된 군으로부터 선택되는 식물.
  23. a) 식물 세포를 제19항의 발현 벡터로 형질전환시키는 단계; 및
    b) 식물 세포로부터 AHASL 폴리펩티드를 발현하는 트랜스제닉(transgenic) 식물을 생성시키는 단계
    를 포함하는, 트랜스제닉 식물을 생산하는 방법.
  24. a) 선별 마커로 사용되는 AHASL 돌연변이체 폴리펩티드를 코딩하는 제17항 또는 제18항의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 추가적인 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있는 형질전환된 식물 세포, 식물 조직, 식물 또는 이의 일부분을 제공하는 단계;
    b) 형질전환된 식물 세포, 식물 조직, 식물 또는 이의 일부분을 하나 이상의 AHAS 억제제 또는 AHAS 억제 화합물과 접촉시키는 단계;
    c) 식물 세포, 식물 조직, 식물 또는 이의 일부분이 억제제 또는 억제 화합물의 영향을 받는지 여부를 결정하는 단계; 및
    d) 형질전환된 식물 세포, 식물 조직, 식물 또는 이의 일부분을 확인 또는 선별하는 단계
    를 포함하는, 형질전환된 식물 세포, 식물 조직, 식물 또는 이의 일부분을 확인 또는 선별하는 방법.
  25. 제초제에 대해 저항성인 제1 식물을 제초제에 대해 저항성이지 않은 제2 식물에 교배시키는 단계를 포함하고, 이때 제1 식물은 제1항 내지 제7항, 제9항, 제10항 및 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항의 식물인, 제초제-저항성 식물을 생산하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 제초제에 대해 저항성인 자손 식물을 선별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  27. 제25항 또는 제26항의 방법에 의해 생산된 제초제-저항성 식물.
  28. 제1 식물의 제초제 저항성 특성을 포함하는, 제27항의 식물의 종자.
  29. 제1 식물을 제2 식물에 교배시키는 단계를 포함하고, 이때 제1 식물은 제1항 내지 제7항, 제9항, 제10항, 제20항 내지 제22항 및 제27항 중 어느 한 항의 식물인, 식물의 제초제-저항성을 증가시키는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 제2 식물의 제초제 저항성에 비교했을 때 증가된 제초제 저항성을 포함하는 자손 식물을 선별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  31. 제29항 또는 제30항의 방법에 의해 생산된 식물.
  32. 증가된 제초제 저항성을 포함하는, 제31항의 식물의 종자.
  33. 유효량의 이미다졸리논 제초제, 술포닐우레아 제초제, 트리아졸로피리미딘 제초제, 피리미디닐옥시벤조에이트 제초제 또는 이들의 혼합물을 잡초 및 브라시카 식물에 적용하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제7항, 제9항, 제10항, 제20항 내지 제22항, 제27항 및 제31항 중 어느 한 항의 브라시카 식물의 부근에 있는 잡초를 제어하는 방법.
  34. A 게놈 및 B 게놈, 및 A 게놈 상의 제1 제초제 저항성 AHASL 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 B 게놈 상의 제2 제초제 저항성 AHASL 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물을 생산할 수 있고, 이때 제2 폴리뉴클레오티드는 bR 돌연변이를 코딩하고, 제1 및 제2 제초제 저항성 AHASL 폴리펩티드는 AHAS-억제성 제초제에 대한 상승작용성 수준의 저항성을 제공하는 것인, 브라시카 준세아 식물의 종자.
  35. 제34항에 있어서, 식물의 저항성이 제1 폴리뉴클레오티드를 함유하는 식물 및 제2 폴리뉴클레오티드를 함유하는 식물에서의 부가적인 수준의 저항성과 비교하여 약 10％ 이상 더 높은 종자.
  36. 제35항에 있어서, 식물의 저항성이 제1 폴리뉴클레오티드를 함유하는 식물 및 제2 폴리뉴클레오티드를 함유하는 식물에서의 부가적인 수준의 저항성과 비교하여 약 20％ 이상 더 높은 종자.
  37. 제36항에 있어서, 식물의 저항성이 제1 폴리뉴클레오티드를 함유하는 식물 및 제2 폴리뉴클레오티드를 함유하는 식물에서의 부가적인 수준의 저항성과 비교하여 약 30％ 이상 더 높은 종자.
  38. 제34항에 있어서, 식물이
    a) J05Z-07801로 지정된 식물 계통;
    b) J05Z-07801로 지정된 식물 계통의 자손;
    c) a) 및 b)의 식물 중 하나의 돌연변이체, 재조합체, 또는 유전자 조작된 유도체; 또는
    d) a) 내지 c)의 식물 중 하나 이상의 자손인 식물
    인 종자.
  39. 제1 브라시카 준세아 계통을 제2 브라시카 준세아 계통과 교배시키고, 이때 제1 브라시카 준세아 계통은 제1 제초제 저항성 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 폴리펩티드를 코딩하는 제1 AHASL 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피를 게놈 내에 포함하고, 제1 AHASL 폴리펩티드는
    a) 서열 1의 위치 653, 또는 서열 2의 위치 638, 또는 서열 3의 위치 635에 대응하는 위치에 아스파라긴이 있는 폴리펩티드;
    b) 서열 1의 위치 122, 또는 서열 4의 위치 107, 또는 서열 5의 위치 104에 대응하는 위치에 트레오닌이 있는 폴리펩티드; 및
    c) 서열 1의 위치 574, 또는 서열 6의 위치 557에 대응하는 위치에 류신이 있는 폴리펩티드
    로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
    종자를 수득하는 단계
    를 포함하는, 브라시카 준세아 종자를 생산하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 제2 브라시카 준세아 계통이 제2 제초제 저항성 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 폴리펩티드를 코딩하는 제2 AHASL 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피를 게놈 내에 포함하고, 제2 AHASL 폴리펩티드가
    a) 서열 1의 위치 653, 또는 서열 2의 위치 638, 또는 서열 3의 위치 635에 대응하는 위치에 아스파라긴이 있는 폴리펩티드;
    b) 서열 1의 위치 122, 또는 서열 4의 위치 107, 또는 서열 5의 위치 104에 대응하는 위치에 트레오닌이 있는 폴리펩티드; 및
    c) 서열 1의 위치 574, 또는 서열 6의 위치 557에 대응하는 위치에 류신이 있는 폴리펩티드
    로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 제1 및 제2 AHASL 폴리뉴클레오티드가 상이한 게놈 상에 위치하는 것인 방법.
  42. 제39항에 있어서, 제1 브라시카 준세아 계통이
    a) J05Z-07801로 지정된 식물 계통;
    b) J05Z-07801로 지정된 식물 계통의 자손;
    c) a) 및 b)의 식물 중 하나의 돌연변이체, 재조합체, 또는 유전자 조작된 유도체; 또는
    d) a) 내지 c)의 식물 중 하나 이상의 자손인 식물
    인 방법.
  43. 종자의 샘플이 ATCC 기탁 번호 PTA-8305 하에 기탁되어 있는, J05Z-07801로 지정된 브라시카 준세아 식물 계통의 종자.
  44. 제43항의 종자로부터 성장된 식물.
  45. 제44항의 식물로부터의 식물의 일부분.
  46. 제45항에 있어서, 꽃가루, 원형질체, 배주 및 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 식물의 일부분.
  47. 제1 계통을 제2 브라시카 준세아 계통과 교배시키고, 이때 제1 브라시카 준세아 계통은 종자의 샘플이 ATCC 접속 번호 PTA-8305 하에 기탁되어 있는 돌연변이체 계통 J05Z-07801의 종자를 성장시킴으로써 수득된 브라시카 준세아 식물인 단계; 및
    종자를 수득하는 단계
    를 포함하는, 브라시카 준세아 식물의 육종 방법.
  48. 제47항에 있어서, 종자를 AHAS 제초제 저항성에 대해 평가하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 하나 이상의 AHAS 제초제에 대해 저항성을 나타내는 종자를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  50. 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) AHASL1 폴리펩티드의 아미노산 위치 122에 대응하는 A 게놈 상의 AHASL 폴리펩티드 내의 위치에 트레오닌이 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비-천연 브라시카 준세아 식물.
  51. 제50항에 있어서,
    a) J04E-0122로 지정된 식물 계통;
    b) J04E-0122로 지정된 식물 계통의 자손;
    c) a) 및 b)의 식물 중 하나의 돌연변이체, 재조합체, 또는 유전자 조작된 유도체; 또는
    d) a) 내지 c)의 식물 중 하나 이상의 자손인 식물
    인 비-천연 브라시카 준세아 식물.
  52. 아라비돕시스 탈리아나 AHASL1 폴리펩티드의 아미노산 위치 122에 대응하는 B 게놈 상의 AHASL 폴리펩티드 내의 위치에 트레오닌이 있는 폴리펩티드를 코딩하 는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비-천연 브라시카 준세아 식물.
  53. 제52항에 있어서,
    a) J04E-0130으로 지정된 식물 계통;
    b) J04E-0130으로 지정된 식물 계통의 자손;
    c) a) 및 b)의 식물 중 하나의 돌연변이체, 재조합체, 또는 유전자 조작된 유도체; 또는
    d) a) 내지 c)의 식물 중 하나 이상의 자손인 식물
    인 비-천연 브라시카 준세아 식물.
  54. 아라비돕시스 탈리아나 AHASL1 폴리펩티드의 아미노산 위치 653에 대응하는 A 게놈 상의 AHASL 폴리펩티드 내의 위치에 아스파라긴이 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비-천연 브라시카 준세아 식물.
  55. 제54항에 있어서,
    a) J04E-0139로 지정된 식물 계통;
    b) J04E-0139로 지정된 식물 계통의 자손;
    c) a) 및 b)의 식물 중 하나의 돌연변이체, 재조합체, 또는 유전자 조작된 유도체; 또는
    d) a) 내지 c)의 식물 중 하나 이상의 자손인 식물
    인 비-천연 브라시카 준세아 식물.
  56. A 게놈 및 B 게놈, 및 A 게놈 상의 제1 제초제 저항성 AHASL 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 B 게놈 상의 제2 제초제 저항성 AHASL 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물을 생산할 수 있고, 이때 제1 폴리뉴클레오티드는 aR 돌연변이를 코딩하고, 제1 및 제2 제초제 저항성 AHASL 폴리펩티드는 AHAS-억제성 제초제에 대한 상승작용성 수준의 저항성을 제공하는 것인, 브라시카 준세아 식물의 종자.
  57. 제56항에 있어서, 제2 제초제 저항성 AHASL 폴리펩티드가 아라비돕시스 탈리아나 AHASL1 폴리펩티드의 아미노산 위치 122에 대응하는 B 게놈 상의 AHASL 폴리펩티드 내의 위치에 트레오닌을 갖는 것인 종자.
  58. 제56항에 있어서, 식물의 저항성이 제1 폴리뉴클레오티드를 함유하는 식물 및 제2 폴리뉴클레오티드를 함유하는 식물에서의 부가적인 수준의 저항성과 비교하여 약 10％ 이상 더 높은 종자.
  59. 제58항에 있어서, 식물의 저항성이 제1 폴리뉴클레오티드를 함유하는 식물 및 제2 폴리뉴클레오티드를 함유하는 식물에서의 부가적인 수준의 저항성과 비교하여 약 20％ 이상 더 높은 종자.
  60. 제59항에 있어서, 식물의 저항성이 제1 폴리뉴클레오티드를 함유하는 식물 및 제2 폴리뉴클레오티드를 함유하는 식물에서의 부가적인 수준의 저항성과 비교하여 약 30％ 이상 더 높은 종자.
  61. 유효량의 이미다졸리논 제초제, 술포닐우레아 제초제, 트리아졸로피리미딘 제초제, 피리미디닐옥시벤조에이트 제초제, 또는 이들의 혼합물을 잡초 및 브라시카 준세아 식물에 적용하는 단계를 포함하는, 제43항, 제50항, 제52항, 제54항 및 제56항 중 어느 한 항의 브라시카 준세아 식물의 부근에 있는 잡초를 제어하는 방법.
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