BRPI0822358B1 - métodos para controle de ervas daninhas em proximidade a uma brassica, para tratar uma semente de brassica, e para seleção de uma brassica - Google Patents

Abstract

MÉTODOS DE CONTROLE DE ERVAS DANINHAS EM PROXIMIDADE A UMA BRASSICA, MÉTODO DE TRATAR UMA SEMENTE DE BRASSICA, BEM COMO DE SELECIONAR UMA BRASSICA, FORMULAÇÃO DE TRATAMENTO DE SEMENTE, MOLÉCULAS DE POLINUCLEOTÍDEOS E PRODUTO DE UMA BRASSICA. A presente invenção fornece plantas transgênicas ou não-transgênicas com níveis melhorados de tolerância aos herbicidas inibidores de AHAS. A invenção também fornece ácidos nucleicos codificando mutantes da subunidade grande de acetoidroxiácido sintase (AHAS), vetores de expressão, plantas compreendendo os polinucleotídeos codificando as subunidades AHASL contendo mutações individuais, duplas ou múltiplas compreendendo um, dois ou mais polipeptídeo mutantes individuais de subunidade AHASL, métodos para fazer e usar os mesmos e métodos de controle de ervas daninhas.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se às plantas Brassicaresistentes a herbicida e a novas sequências de polinucleotídeos que codificam proteínas da subunidade grande do acetoidroxiácido sintase de Brassicaresistentes à imidazolinona e do tipo selvagem, sementes e métodos usando tais plantas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Acetoidroxiácido sintase (AHAS; EC 4.1.3.18, também conhecida como acetolactato sintase ou ALS) é a primeira enzima que catalisa a síntese bioquímica dos aminoácidos da cadeia ramificada valina, leucina e isoleucina (Singh (1999) "Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine", em Plant Amino Acid, Singh, B.K., ed., Marcel Dekker Inc. Nova Iorque, Nova Iorque, pp. 227-247). AHAS é o sítio de ação de cinco famílias de herbicidas estruturalmente diversas incluindo as sulfonilureias (Tan et al. (2005) PestManag. Sci. 61: 246-57; Mallory-Smith e Retzinger (2003) Weed Technology 17:620-626; XaRossa e Falco (1984) Trends Biotechnol. 2: 158-161), the imidazolinones (Shaner et al. (1984) Plant Physiol. 76:545-546), the triazolopyrimidines (Subramanian e Gerwick (1989) "Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines", em Biocatalysis in Agricultural Biotechnology, Whitaker, J.R. e Sonnet, P. E.. eds., ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington, D.C., pp. 277-288), Tan et al. (2005) PestManag. Sci. 61: 246-57; Mallory-Smith e Retzinger (2003) Weed Technology 17: 620-626, the sulfonylamino-carbonyltriazolinones (Tan et al. (2005) PestManag.Sci. 61: 246-57; Mallory-Smith e Retzinger (2003) Weed Segue-se folha 1a

Technology 17:620-626). Herbicidas de imidazoliπona e sulfonilureia são amplamente utilizados na agricultura moderna devido às suas eficácias em taxas de aplicação muito baixas e relativa-

AHAS, essas famílias de herbicidas evitam o crescimento adicional e desenvolvimento de plantas suscetíveis, incluindo muitas espécies de ervas daninhas. Vários exemplos de herbicidas de imidazolinona comercialmente disponíveis são PURSUIT® (imazetapir), SCEPTER® (imazaquin) e ARSENAL® (imazapir). Exemplos de herbicidas de sulfonilureia são clorsulfuron, metsulfuron metila, sulfometuron metila, clorimuron etila, tifensulfuron metila, tribenuron metila, bensulfuron metila, nicossulfuron, etametsulfuron metila, rimsulfuron, triflussulfuron metila, triassulfuron, primissulfuron metila, cinossulfuron, amidossulfiuon, fluzassulfuron, imazossulfuron, pirazossulfuron etila e halossulfuron.

Devido às suas altas eficácias e baixas toxicidades,herbicidas de imidazolinona são favorecidos para aplicação por pulverização na parte de cima de uma ampla área de vegetação. A capacidade de borrifar um herbicida na parte de cima de uma ampla área de vegetação diminui os custos associados com o estabelecimento e manutenção de plantação, e reduz a necessidade de preparo do sítio antes do uso de tais substâncias químicas. A pulverização pelo topo de uma espécie tolerante desejável também resulta na capacidade de conseguir o rendimento máximo potencial das espécies desejadas devido à ausência de espécies competitivas. Entretanto, a capacidade de usar tais técnicas de pulverização é dependente da presença de espécies resistentes à imidazolinona da vegetação desejada na área a ser pulverizada por cima.

Dentre as safras de agricultura principais, algumas espécies de leguminosa tais como soja são naturalmente resistentes aos herbicidas de imidazolinona devido às suas capacidades de metabolizar rapidamente os compostos herbicidas (Shaner e Robinson (1985) Weed Sci. 33: 469-471). Outras safras, tais como a de milho (Newhouse et al (1992) Plant Physiol. 100:882886) e arroz (Barrett et al. (1989) Crop Safeners for Herbicides, Academic Press, Nova Iorque, pp. 195-220) são suscetíveis de alguma forma aos herbicidas de imidazolinona. A sensibilidade diferencial aos herbicidas imidazolinona é dependente da natureza química do herbicida particular e do metabolismo diferencial do composto de uma forma tóxica para uma forma não-tóxica em cada planta (Shaner et al. (1984) Plant Physiol. 76:545546; Brown et al, (1987) Pestic. Biochem. Physiol. 27:24-29). Outras diferenças fisiológicas vegetais tais como absorção e translocação também desempenham um papel importante na sensibilidade (Shaner e Robinson (1985) Weed Sci. 33: 469-471).

Plantas resistentes às imidazolinonas, sulfonilureias e triazolopirimidinas foram produzidas com sucesso usando mutagênese em sementes, microesporos pólen e calos em Zea mays, Arabidopsis thaliana, Brassica napus (isto é, canola) Glycine max, Nicotiana tabacum, e Oryza sativa(Sebastian et al. (1989) Crop Sci. 29: 1403-1408; Swanson et al., 1989 Theor. Appl. Genet.78: 525-530; Newhouse et al. (1991) Theor. Appl. Genet.83:6570; Sathasivan et al (1991) Plant Physiol.97:1044-1050; Mourand et al. (1993) J. Heredity84:91-96; Patente U.S. Ne 5.545.822). Em todos os casos, um gene nuclear parcialmente dominante único conferiu resistência. Quatro trigos resistentes à imidazolinona também foram previamente isolados após a mutagênese das sementes de Triticum aestivum L. cv. Fidel (Newhouse et al. (1992) Plant Physiol.100: 882-886). Estudos de hereditariedade confirmaram que um único gene parcialmente dominante conferiu resistência. Baseando-se em estudos de alelos, os autores concluíram que as mutações nas quatro linhagens identificadas estavam localizadas no mesmo local. Um dos genes de resistência de cultivar Fidel foi designado FS-4 (Newhouse et al. (1992) Plant Physiol.100: 882-886).

Modelagem computadorizada da conformação tridimensional do complexo inibidor AHAS prevê vários aminoácidos na bolsa de ligação do inibidor proposto como sítios onde as mutações induzidas poderiam conferir provavelmente resistência seletiva às imidazolinonas (Ott et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:359-368). Trigos produzidos com algumas dessas mutações racionalmente projetadas nos sítios de ligação propostos da enzima AHAS exibiram de fato resistência específica a uma única classe de herbicidas (Ott et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:359-368).

Resistência vegetal aos herbicidas de imidazolinona também foram reportadas em várias patentes. As Patentes Americanas Nes 4.761.373, 5.331.107, 5.304.732, 6.211.438, 6.211.439 e 6.222.100 geralmente descrevem o uso e um gene AHAS alterado para eliciar a resistência a herbicida em plantas, e especificamente descrevem certas linhagens de milho resistentes à imidazolinona. A Patente U.S. N5.013.659 descreve plantas exibindo resistência a herbicida devido às mutações em pelo menos um aminoácido em uma ou mais regiões conservadas. As mutações ali descritas codificam ou resistência cruzada às imidazolinonas e sulfonilureias ou resistência específica para sulfonilureia, porém resistência específica para imidazolinona não é descrita. A Patente U.S. Ns 5.731.180 e a Patente U.S. N5.767.361 discutem um gene isolado com uma substituição de aminoácidos individual em uma sequência de aminoácidos AHAS de monocotiledônea do tipo selvagem que resulta em resistência específica para imidazolinona. Além disso, plantas de arroz que são resistentes a herbicidas que interferem com AHAS foram desenvolvidas por geração por mutação e também pela seleção de plantas resistentes a herbicidas de um grupo de plantas de arroz produzidas por outra cultura. Ver as Patentes Americanas N-s 5.545.822, 5.736.629, 5.773.703, 5.773.704, 5.952.553 e 6.274.796.

Em plantas, como em outros organismos examinados, a enzima AHAS é compreendida de duas subunidades: uma subunidade grande (função catalítica) e uma subunidade pequena (função regulatória) (Duggleby e Pang (2000) J. Biochem. Mol. Biol. 33:1-36). A subunidade grande AHAS (também referida aqui como AHASL) pode ser codificada por um gene único como no caso de Arabidopsis e arroz ou por membros de família de gene múltiplo, como no milho, canola e algodão. Substituições de nucleotídeo úni-cas específicas na subunidade grande conferem á enzima um grau de insensibilidade a uma ou mais classes de herbicidas (Chang e Duggleby (1998) Biochem J. 333:765-777).

Por exemplo, trigo de pão, Triticum aestivum L., contém três genes da subunidade grande de acetoidroxiácido sintase homólogos. Cada um dos genes exibe expressão significativa baseando-se na resposta do herbicida e em dados bioquímicos de mutantes em cada um dos três genes (Ascenzi et al. (2003) International Society of Plant Molecular Biologists Congress, Barcelona, Espanha, NRef. S10-17). As sequências codificadoras de todos os três genes compartilham extensa homologia no nivel do nucleotídeo (WO 03/014357). Através do sequenciamento, os genes AHASL de várias variedades de Triticum aestivum, descobriu-se que base molecular da tolerância ao herbicida na maioria das linhagens tolerantes ao IMI (tolerantes à imidazolinona) era a mutação Ser653(At)Asn, indicando uma substituição de asparagina por serina em uma posição equivalente à serina no aminoácido 653 em Arabidopsis thaliana (WO 03/014357). Esta mutação é devido a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) na sequência de DNA codificando a proteína AHASL.

Também vários genes AHASL são conhecidos por ocorrer em espécies de plantas dicotiledôneas. Recentemente, Kolkman et al. ((2004) Theor. Appl. Genet. 109: 1147-1159) reportaram a identificação, clonagem e sequenciamnto para três genes AHASL (AHASLI, AHASL2, e AHASL3) dos genótipos resistntes a herbicida e do tipo selvagem do girassol (Helianthus annuus L.). Kolkman et al. reportaram que a resistência ao herbicida ocorreu devido ou à substituição Pro197Leu (usando a nomenclatura de posição de aminoácido AHASL de Arabidopsis) o a substituição Ala205Val na proteína AHASL1 e que cada uma dessas substituições forneceu resistência aos herbicidas de imdazolinona e de sulfonilureia.

Dado às suas altas eficácias e baixa toxicidade, herbicidas de imidazolinona são favorecidos para uso na agricultura. Entretanto, a capacidade de usar herbicidas de imidazolinona em um sistema de produção de safra particular depende da disponibilidade de variedades resistentes a imidazolinona da planta da safra de interesse. Para permitir aos fazendeiros maior flexibilidade nos tipos e taxas de herbicidas de imidazolinona e sulfonilureia que eles usam uma tolerância a herbicida mais forte é geralmente desejada. Também os criadores de plantas os quais desenvolvem variedades tolerantes a herbicidas desejam lidar com mutações que forneçam maior tolerância a herbicida, permitindo uma maior flexibilidade na prática do germoplasma que eles usam para desenvolver as suas variedades. Para produ-zir tais variedades resistentes a imidazolinona, os criadores de plantas precisam desenvolver outras linhagens de criação, preferivelmente com resistência à imidazolinona aumentada. Deste modo linhagens de criação resistentes à imidazolinona adicionais e variedades de plantas de safra, assim como métodos e composições para a produção e uso de linhagens de criação resistentes à imidaolinona e variedades são necessárias.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece plantas Brassicacom resistência aumentada aos herbicidas em comparação com uma planta Brassicado tipo selvagem. Particularmente, as plantas Brassicada invenção têm resistência aumentada a pelo menos um herbicida que interfere com a atividade da enzima AHAS em comparação com uma planta Brassicado tipo selvagem. Uma planta Brassicacompreendendo em seu genoma pelo menos uma cópia de um polinucleotídeo de subunidade grande de acetoidroxiácido sintase (AHASL) que codifica um polipeptídeo AHASL resistente a herbicida, em que o polipeptídeo AHASL é selecionado do grupo consistindo em: a) um polipeptídeo com uma asparagina em uma posição correspondendo à posição 653 da SEQ ID NO: 1, ou posição 638 da SEQ ID NO: 2, ou posição 653 da SEQ ID NO: 3, b) um polipeptídeo com uma treonina em uma posição cor-respondendo à posição 122 da SEQ ID NO: 1, ou posição 107 da SEQ ID NO: 4, ou posição 104 da SEQ ID NO: 5, e c) um polipeptídeo com uma leucina em uma posição correspondendo à posição 574 da SEQ ID NO: 1, ou posição 557 da SEQ ID NO: 6.

A presente invenção também fornece uma tolerância à herbicida aumentada a qual é alcançada mediante a combinação de mutações AHAS em diferentes genomas em uma planta B. juncea. Em um exemplo, plantas combinando a mutação BR (AHAS1) (no genoma B de Brassica Juncea) com a mutação PM2 infiltradas (AHAS3) (no genoma A de Brassica napus infiltrado em Brassica juncea). A tolerância a herbicida resultante é significativamente aumentada, com um efeito sinergístico surpreendente, sobre o qual se observa no produto comercial atual que combina PM1 com PM2. Em outro exemplo, plantas B. juncea combinando as mutações aR (AHAS1) (no genoma A de B. juncea) com a mutação A107T (no genoma B de B. juncea) são fornecidas que também proporcionam níveis sinergísticos de tolerância a herbicida em comparação com plantas combinando as mutações PM1 e PM2.

Em uma modalidade, a presente invenção fornece plantas Brassicamutantes duplamente resistentes a herbicidas que são da linhagem Brassicaque foram designadas como J05Z-07801. Em outra modalidade, a presente invenção fornece plantas Brassicaresistentes a herbicida que são da linhagem Brassicaque foi designada como J04E-0139. Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece plantas Brassicaresistentes a herbicida que são da linhagem Brassicaque foi designada como J04E-0130. Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece plantas Brassica resistentes a herbicida que são da linhagem Brassicaque foi designada como J04E-0122.

Uma planta Brassicaresistente a herbicida da invenção pode conter uma, duas, três, quatro ou mais cópias de um gene ou polinucleotídeo codificando uma proteína AHAS resistente a herbicida da invenção. Uma planta Brassicaresistente a herbicida da invenção pode conter um gene ou polinucleotídeo codificando uma proteína AHASL resistente a herbicida contendo mutações individuais, duplas ou outras. As plantas Brassicada invenção também incluem sementes e plantas da progenia que compreendem pelo menos uma cópia de um gene ou polinucleotídeo codificando uma proteína AHASL resistente a herbicida da invenção. Sementes ou plantas de progenia que surgem daí as quais compreendem um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo AHASL contendo mutações individuais, duplas ou outras, ou dois ou mais polinucleotídeos codificando plantas com polipeptídeos mutantes individuais AHASL apresentam um nível inesperadamente maior de tolerância a um herbicida inibidor AHAS, por exemplo, um herbicida de imidazolinona ou herbicida de sulfonilureia, que é previsto dos polipeptídeos mutantes individuais AHASL em uma planta única. As plantas e suas progenies apresentam um efeito sinergístico ao invés de um efeito aditivo de tolerância a herbicida, por meio do qual o nível de tolerância a herbicida nas plantas e na sua progenia compreendendo várias mutações é maior do que a tolerância a herbicida de uma planta compreendendo proteína mutante individual AHASL.

A presente invenção fornece um método para controlar ervas daninhas na vizinhança das plantas resistentes a herbicida não-transgênicas e transgênicas da invenção. Tais plantas incluem, por exemplo, as plantas Brassicaresistentes a herbicida descritas acima e plantas transformadas com uma molécula de polinucleotídeo codificando uma proteína AHASL resistente a herbicida da invenção. As plantas transformadas compreendem em seus genomas pelo menos um cassete de expressão compreendendo um promotor que direciona a expressão gênica em uma célula vegetal, em que o promotor é operativamente ligado a um polinucleotídeo AHASL da invenção. O método compreende a aplicação de uma quantidade eficaz de um herbicida às ervas daninhas e à planta resistente a herbicida, em que a planta resistente a herbicida tem maior resistência a pelo menos um herbicida, particularmente a um herbicida de imidazolinona ou de sulfonilureia, em comparação com uma planta do tipo selvagem ou não-transformada. A presente invenção fornece métodos para aumentar a atividade AHAS em uma planta, para produzir uma planta resistente a herbicida, e para aumentar a tolerância ao herbicida em uma planta tolerante a herbicida. Em algumas modalidades da invenção, os métodos compreendem a transformação de uma célula vegetal com um constructo de polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotideos operativamente ligada a um promotor que direciona a expressão em uma célula vegetal e a regeneração de uma planta transformada da célula vegetal transformada. A sequência de nucleotideos é selecionada daquelas sequências de nucleotideos que codificam as proteínas AHASI resistentes a herbicida da invenção. Em outras modalidades, os métodos envolvem a criação de plantas convencionais envolvendo polinização cruzada de uma planta resistente a herbicida da invenção com outra planta e pode ainda envolver a seleção de plantas da progenia que compreendem características de resistência a herbicida da planta de origem que é a planta resistente a herbicida da invenção.

A presente invenção ainda fornece moléculas de polinucleotídeo isoladas e polipeptídeos isolados para proteínas AHASL de Brassica.As moléculas de polinucleotídeo da invenção compreendem sequências de nucleotídeo que codificam proteínas AHASL resistentes a herbicida da invenção. As proteínas AHASL resistentes a herbicida da invenção compreendem um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo a) da sequência de nucleotídeos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 13, b) da sequência de nucleotídeos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 14, c) sequência de nucleotídeos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 15, d) uma sequência de nucleotídeos com uma sequência de pelo menos 90% de identidade com a sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 13, em que a proteína tem uma asparagina em uma posição correspondendo à posição 653 da SEQ ID NO: 1, ou posição 638 da SEQ ID NO: 2, ou posição 635 da SEQ ID NO: 3; e) uma sequência de nucleotídeos com uma sequência de pelo menos 90% de identidade com a sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 14, em que a proteína tem uma treonina em uma posição correspondendo à posição 122 da SEQ ID NO: 1, ou posição 107 da SEQ ID NO: 4, ou posição 104 da SEQ ID NO: 5; f) uma sequência de nucleotídeos com uma sequência de pelo menos 90% de identidade com a sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 15, em que a proteína tem uma treonina em uma posição correspondendo à posição 122 da SEQ ID NO: 1, ou posição 107 da SEQ ID NO: 4, ou posição 104 da SEQ ID NO: 5. A proteína AHASL anteriormente mencionada ainda compreende pelo menos uma mutação selecionada do grupo consistindo em a) uma asparagina em uma posição correspondendo à posição 653 da SEQ ID NO: 1, ou posição 638 da SEQ ID NO: 2, ou posição 635 da SEQ ID NO: 3; b) uma treonina em uma posição correspondendo à posição 122 da SEQ ID NO: 1, ou posição 107 da SEQ ID NO: 4, ou posição 104 da SEQ ID NO: 5; e c) uma leucina em uma posição correspondendo à posição 574 da SEQ ID NO: 1, ou posição 557 da SEQ ID NO: 6.

São também fornecidos cassetes de expressão, vetores de transformação, células hospedeiras humanas não-transformadas e plantas transformadas, partes de plantas e sementes que compreendem uma ou mais moléculas de polinucleotídeo da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 demonstra um alinhamento das sequências de nucleotídeos das regiões codificadoras do gene AHASL do tipo selvagem de Arabidopsis thaliana (AtAHASL, SEQ ID NO: 11), gene BjAHASLI B-S653N resistente à herbicida de Brassica juncea da linhagem J04E-0044 (J04E-0044, SEQ ID NO: 12), gene BjAHASLIA-S653N resistente a herbicida de Brassica juncea da linhagem J04E-0139 (J04E-0139, SEQ ID NO:13), gene BjAHASLIB-A122T resistente a herbicida de Brassica juncea da linhagem J04E-0130 (J04E-0130, SEQ ID NO:14), gene BjAHASLIA-AI22T resistente a herbicida de Brassci juncea da linhagem J04E-0122 (BjAHASLIA, SEQ ID NO: 15), gene BnAHASLIA-W574L resistente a herbicida de Brassica napus da linhagem PM2 (BnAHASLIA, SEQ ID NO: 16), gene BjAHASLIA do tipo selvagem de Brassica juncea (BjAHASLIA, SEQ ID NO: 17), gene BjAHASLIB do tipo selvagem de Brassica juncea (BjAHASLIB, SEQ ID NO: 18), gene BnAHASLIA do tipo selvagem de Brassica napus (BnAHASLIA, SEQ ID NO: 19), gene BnAHASLIC do tipo selvagem de Brassica napus (BnAHASLIC, SEQ ID NO: 20). A análise foi efetuada no pacote de softwares Vector NTI usando o algoritmo Fast (abertura de intervalo 15, extensão de intervalo 6,66 e separação de intervalo 8, a matriz é swgapdnamt).

Figura 2 demonstra um alinhamento das sequências de aminoácidos do gene AHASL do tipo selvagem de Arabidopsis thaliana (AtAHASL, SEQ ID NO: 1), gene BjAHASLI B-S653N resistente a herbicida de Brassica juncea da linhagem J04E-0044 (J04E-0044, SEQ ID NO: 2), gene BjAHASLIA-S653N resistente a herbicida de Brassica juncea da linhagem J04E-0139 (J04E-0139, SEQ ID NO:3), gene BJAHASL1B-A122T resistente a herbicida de Brassica juncea da linhagem J04E-0130 (J04E-0130, SEQ ID NO:4), gene BjAHASLIA-A122T resistente a herbicida de Brassci juncea da linhagem J04E-0122 (J04E-0122, SEQ ID NO:5), gene BnAHASLIA-W574L resistente a herbicida de Brassica napus da linhagem PM2 (BnAHASLIA, SEQ ID NO: 6), gene BjAHASLIA do tipo selvagem de Brassica juncea (BjAHASLIA, SEQ ID NO: 7), gene BjAHASLIB do tipo selvagem de Brassica juncea (BjAHASLIB, SEQ ID NO: 8), gene BnAHASLIA do tipo selvagem de Brassica napus (BnAHASLIA, SEQ ID NO: 9), gene BnAHASLI C do tipo selvagem de Brassica napus (BnAHASLIC, SEQ ID NO: 10). A análise foi efetuada no pacote de softwares Vector NTI (penalidade de abertura de intervalo 10, penalidade de extensão de intervalo 0,05 e penalidade de separação de intervalo 8, a matriz é blosum 62MT2).

Figura 3 é um gráfico de barras mostrando os resultados do ensaio de atividade da enzima AHAS para as linhagens vegetais de B. juncea.

Figura 4 é um gráfico mostrando os resultados do ensaio de pulverização em estufa para as linhagens de planta B. juncea.

Figura 5 é uma tabela mostrando a SEQ ID NO do DNA ou sequência de proteína correspondente.

Figura 6 fornece a atvidade enzimática AHAS em extratos de proteína isolado de linhagens B. juncea homozigóticas contendo combinações de mutações aR, bR, A107T, e A104T isoladas ente si e com a mutação PM2 introduzida em B. juncea em 100 pM de Imazamox.

Figura 7 fornece a injúria vegetal média (fitotoxicidade) de linhagens F2 de B. juncea contendo diferentes zigosidades e combinações das mutações AHAS ar e A107T 2 semanas após a pulverização na estufa com 35 g de ai/ha de Imazamox.

Figura 8 fornece a fitotoxicidade vegetal média das linhagens DH de B. juncea homozigóticas contendo combinações de mutações aR, bR, A107T, e A104T de B. juncea empilhadas ente si e com a mutação PM2 infiltrada em B. juncea duas semanas após a pulverização com 35 g de ai/ha de Imazamox (Raptor®).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se às plantas Brassicacom resistência aumentada aos herbicidas em comparação com uma planta Brassicado tipo selvagem. Plantas Brassicaresistentes a herbicida foram produzidas conforme descrito em detalhes abaixo através da exposição de microesporos de Brassicado tipo selvagem (em relação á resistência ao herbicida) isolados a um mutágeno, do cultivo dos microesporos na presença de uma quantidade eficaz de um herbicida imidazolinona e da seleção dos embriões sobreviventes. A partir dos embriões sobreviventes, plantas Brassicahaploides foram produzidas e então os cromossomos foram duplicados para produzir plantas Brassicacom haploides duplos férteis que apresentam resistência aumentada a um herbicida imidazolinona, em relação à resistência de uma planta Brassicatipo selvagem. Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma linhagem Brassicaresistente a herbicida referida aqui como J04E-0139 que foi produzida a partir da mutagênese dos microesporos conforme descrito detalhadamente abaixo. Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma linhagem de Brassicaresistente a herbicida referida aqui como J04E-0130 que foi produzida a partir da mutagênese do microesporos. Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece uma linhagem de Brassicaresistente a herbicida referida aqui como J04E-0122 que foi produzida a partir da mutagênese dos microesporos. Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece uma linhagem de Brassicaresistente a herbicida referida aqui como J05Z-07801 que foi produzida pelo cruzamento da linhagem mutante BR B. juncea (US 2005/0283858) com a linhagem mutante PM2 (ver US2004/0142353 e US2004/0171027; ver também Hattori et al, Mol. Gen. Genet. 246:419-425, 1995) o qual foi originalmente infiltrado em Brassica juncea a partir de Brassica napus.

Deste modo, a presente invenção fornece plantas Brassica juncea com resistência aos herbicidas inibidores de AHAS. Linhagens de B, juncea são fornecidas que contêm uma única mutação em pelo menos um polinucleotídeo AHASL, no qual a mutação única é selecionada do grupo de transversão G para A que corresponde a um aminoácido na posição 653 da sequência AHASL1 de Arabidopis thaliana e de uma transversão G para A que corresponde a um aminoácido na posição 122 da sequência AHASL1 de A. thaliana.

A partir de ambas das plantas Brassica juncea resistentes ao herbicida J04E-0139 e Brassica juncea do tipo selvagem, a região codificadora do gene da subunidade grande de acetoidroxiácido sintase (designada como AHASL1) foi isolada pela amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciada. Através da comparação das sequências de polinucleotídeo das plantas Brassicaresistentes ao herbicida e do tipo selva-gem, foi descoberto que a região codificadora da sequência de polinucleotídeos AHAS1 da planta Brassicaresistente ao herbicida é localizada no genoma A de Brassica juncea que difere da sequência de polinucleotídeos AHASL1 da planta tipo selvagem por um único nucleotídeo, uma transversão G para A (Figura 1). Esta transversão G para A na sequência do polinucleotídeo AHASL1 resulta em uma nova substituição Ser para Asn no aminoácido 635 (correspondendo ao aminoácido 653 de AHAS1 de A. thaliana) em uma região conservada da sequência de aminoácidos prevista da proteína AHASL1, em relação à sequência de aminoácidos da proteína AHASL1 do tipo selvagem (Figura 2).

A partir de ambas as plantas Brassica juncea resistentes a herbicidaJ04E-0130 e plantas Brassica juncea tipo selvagem, a região codificadora de um gene da subunidade grande de acetoidroxiácido sintase (designado como AHASL1) foi isolada pela amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciada. Através da comparação das sequências de polinucleotídeo das plantas Brassicaresistentes a herbicida e do tipo selvagem, foi descoberto que a região codificadora da sequência de polinucleotídeos AHAS1 da linhagem de planta Brassicaresistente ao herbicida J04E0130 está localizada no genoma B de Brassica juncea e difere da sequência de polinucleotídeo AHASL1 da planta tipo selvagem por um único nucleotídeo, uma transversão G para A (Figura 1). Esta transversão G para A na sequência de polinucleotídeos AHASL1 resulta em uma nova substituição Ala para Thr no aminoácido 107 (correspondendo ao aminoácido 122 de AHASL1 de A. thaliana) em uma região conservada da sequência de aminoácidos prevista da proteína AHASL1, em relação à sequência de aminoácidos conservada da proteína AHASL1 do tipo selvagem (Figura 2).

A partir de ambas as plantas Brassica juncea resistentes a herbicida J04E-0122 e plantas Brassica juncea tipo selvagem, a região codificadora de um gene de subunidade grande de acetoidroxiácido sintase (designado como AHASL1) foi isolada pela amplificação pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciada. Através da comparação das sequências de polinucleotídeo das plantas Brassicaresistentes a herbicida e do tipo selvagem, foi descoberto que a região codificadora da sequência de polinucleotideos AHASL1 da linhagem vegetal Brassicaresistente a herbicida J04E0122 está localizada no genoma de Brassica juncea e difere da sequência de polinucleotideos AHASL1 da planta tipo selvagem por um único nucleotídeo, uma transversão G para A (Figura 1). Esta transversão G para A na sequência de polinucleotídeo AHASL1 resulta em uma nova substituição Ala para Thr no aminoácido 104 (correspondendo ao aminoácido 122 de AHASL1 de A. thaliana) em uma região conservada da sequência de aminoácido prevista da proteína AHASL1, em relação à sequência de aminoácidos da proteína AHASL1 do tipo selvagem (Figura 2).

A presente descoberta também fornece plantas B. juncea que contêm pelo menos dois polinucleotideos AHASL modificados. Tais plantas também são referidas aqui como plantas contendo mutações "empilhadas". As mutações podem estar em genomas iguais ou diferentes da planta B. juncea. As plantas B. juncea podem conter qualquer quantidade de polinucleotideos AHASL modificados e qualquer combinação de mutações incluindo, porém sem se limitar, às mutações correspondendo à posição 653 da SEQ ID NO: 1, posição 638 da SEQ ID NO: 2, posição 635 da SEQ ID NO: 3, posição 122 da SEQ ID NO: 1, posição 107 da SEQ ID NO: 4, posição 104 da SEQ ID NO: 5, posição 574 da SEQ ID NO: 1 ou posição 557 da SEQ ID NO: 6.

São também fornecidos aqui as plantas B. juncea com dois polinucleotideos AHASL modificados em diferentes genomas, um polinucleotídeo AHAS modificado no genoma A e o segundo polinucleotídeo AHASL modificado no genoma B. Tais plantas de B. juncea com dois polinucleotideos AHASL modificados incluem aquelas contendo a mutação BR e a mutação PM2. Tais plantas incluem aquelas da linhagem de B. juncea J05Z07801, assim como suas sementes, e a progenia e descendentes obtidos dos cruzamentos com a linhagem B. juncea L05Z-07801. Em outro aspecto, as plantas B. juncea com duas mutações AHASL modificadas incluem aquelas que combinam a mutação aR (por exemplo, da linhagem J04E-0139) com a mutação A122T (por exemplo, da linhagem J04E-0130) em uma progenia da linhagem B. juncea. Em um aspecto, tais plantas combinando duas mutações AHASL1 exibem um nível sinergístico de tolerância a herbicida em comparação com os níveis de tolerância a herbicida aditivos de plantas B. juncea contendo as respectivas mutações individuais.

As mutações PM1 e PM2 foram desenvolvidas usando mutagênese de microesporo de Brassica napus, conforme descrito por Swanson et al. (Plant Cell Reports 7: 83-87(1989)). A mutação PM2 é caracterizada por uma alteração de nucleotídeo simples (G para T) da extremidade 3’ do gene AHAS3 que se acredita estar no genoma A de Brassica napus(Rutledge et al. Mol. Gen. Genet. 229: 31-40 (1991)), resultando na alteração de aminoácido de Trp para Leu, Trp556(Bn)Leu (Hattori et al., Mol. Gen. Genet. 246: 419-425, 1995). A mutação PM1, que se acredita estar no genoma C de Brassica napus (Rutledge et al. Mol. Gen. Genet. 229: 31-40 (1991)), é caracterizada por uma única alteração de nucleotídeo no gene AHAS1 (G para A) resultando em uma alteração de aminoácido de Ser para Asn, Ser638(Bn)Asn (Ver Sathasivan et al., Plant Physiol. 97: 1044-1050, 1991 e Hattori et al., Mol. Gen. Genet. 232: 167-173, 1992; ver também US2004/0142353 e US2004/0171027). Foi reportado que os genes PM1 mutantes (AHAS1) e PM2 (AHAS3) atuam aditivamente para fornecer tolerância aos herbicidas de imidazolinona (Swanson et al., Theor. Appl. Genet. 78: 525-530, 1989).

Devido ao fato de se acreditar que PM2 esteja localizado no genoma A de Brassica napus, e tanto Brassica juncea quanto Brassica rapa contém o genoma A, a transferência do gene mutante PM2 de napus em juncea ou em rapa pode ser conseguida através do cruzamento das espécies (infiltração) e seleção sob níveis baixos de seleção de herbicida. Devido ao fato de se acreditar que PM1 esteja localizado no genoma C de Brassica napus, a infiltração deste mutante de B. napus em Brassica juncea (A, B) ou Brassica rapa (A, A) é muito mais difícil, uma vez que se baseia em um evento de ocorrência de translocação cromossomal raro (entre o genoma C de Brassica napus e os genomas A ou B de Brassica juncea). Tal evento de translocação cromossomal pode geralmente ser oprimido por uma falta de estabilidade assim como pela falta de capacidade de eliminar a obstrução que geralmente ocorre ao usar este método. A Patente U.S. Ns 6.613.963 descreve plantas Brassica juncea PM1/PM2 tolerantes a herbicida produzidas usando este método de infiltração. Baseando-se na tolerância aditiva fornecida por PM1 e PM2 em B. napus, pode se esperar que a infiltração das duas mutações, PM1 e PM2, em Brassica juncea também forneça tolerância a herbicida aditiva.

Para superar as questões associadas com a transferência de uma característica de tolerância a herbicida do genoma C de Brassica napus nos genomas A e B de Brassica rapa e/ou Brassica juncea, é vantajoso produzir diretamente a mutação no genoma desejado. O Pedido de Patente U.S. 2005/0283858 descreve uma mutação AHAS1 de Brassica juncea tolerante a herbicida, BR, a qual foi produzida por mutagênese direta resultando em um SNP do gene AHAS1 causando uma substituição de Ser638Asn (posição 653 usando a nomenclatura de posição de aminoácido AHASL de Arabidopsis) no gene AHASL do genoma B.

As plantas B. juncea com duas ou mais mutações AHASL fornecidas aqui podem ter níveis aumentados de resistência a herbicida em comparação com os níveis aditivos de resistência às mutações individuais. Plantas com duas ou mais mutações AHASL podem ter níveis de resistência que sejam 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, ou maiores em comparação com os níveis aditivos de resistência fornecidos pelas mutações AHASL individuais.

Os aumentos na resistência podem ser medidos usando qualquer método para determinar a resistência AHAS. Por exemplo, a resistência pode ser medida pela determinação da resistência porcentual em B. juncea em um período de tempo que seja de 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, ou 28 dias ou mais depois do tratamento com um herbicida inibidor de AHAS. A resistência porcentual pode ser então comparada com os níveis obtidos pela adição da resistência porcentual em plantas contendo as mutações AHASL individuais respectivas. Em um aspecto, a resistência é determinada pela medição da resistência porcentual em plantas 14 dias depois do tratamento com uma quantidade 2x de um herbicida inibidor de AHAS.

A invenção ainda se refere às moléculas de polinucleotídeo isoladas compreendendo sequências de nucleotídeo que codifiquem as proteínas da subunidade grande de acetoidroxiácido sintase (AHASL) e tais proteínas AHASL. A invenção descreve o isolamento e sequência de nucleotideos de um polinucleotídeo que codifica uma proteína AHASL1 de Brassicaresistente a herbicida de uma planta Brassicaresistente a herbicida que foi produzida por mutagênese química de plantas Brassicatipo selvagem. As proteínas AHASL1 resistentes a herbicida da invenção possuem uma substituição serina para asparagina na posição 635 do gene AHASL1 de B. juncea localizado no genoma A, ou uma substituição alanina para treonina na posição 107 do gene AHASL1 de B. juncea localizado no genoma B, ou uma substituição alanina para treonina na posição 104 do gene AHASL1 de B. juncea localizado no genoma A. A invenção ainda descreve o isolamento de uma sequência de nucleotideos de uma molécula de polinucleotideos codificando uma proteína AHASL1 Brassicado tipo selvagem.

A presente invenção fornece moléculas de polinucleotídeo isoladas que codificam proteínas AHASL1 de Brassica,particularmente de Brassica juncea.Especificamente, a invenção fornece moléculas de polinucleotídeo isoladas compreendendo: a sequência de nucleotideos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 13, as sequências de nucleotídeo codificando a proteína AHASL1 compreendendo a sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 3, a sequência de nucleotideos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 14, as sequências de nucleotideos codificando a proteína AHASL1 compreendendo a sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 4, a sequência de nucleotideos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 15, as sequências de nucleotideos codificando a proteína AHASL1 compreendendo a sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 5, e fragmentos e variantes de tais sequências de nucleotideos que codifica proteínas AHASL1 funcionais.

As moléculas de polinucleotídeo AHASL1 resistentes a herbicida isoladas da invenção compreendem sequências de nucloeotídeos que codificam proteínas AHAS1 resistentes a herbicida. Tais moléculas de polinucleotídeos podem ser usadas em constructos de polinucleotídeo para a transformação de plantas, particularmente de plantas de safra, para aumentar a resistência das plantas a herbicidas, particularmente herbicidas que sejam conhecidos por inibir a atividade de AHAS, mais particularmente herbicidas de imidazolinona. Tais constructos de polinucleotídeo podem ser usados em cassetes de expressão, vetores de expressão, vetores de transformação, plasmídeos e semelhantes. As plantas transgênicas obtidas após a transformação com tais constructos de polinucleotídeo apresentam resistência aumentada aos herbicidas inibidores de AHAS tais como, por exemplo, herbicidas de imidazolinona e sulfonilureia.

Composições da invenção incluem sequências de nucleotídeos que codificam proteínas AHAS1. Particularmente, a presente invenção fornece moléculas de polinucleotídeo isoladas compreendendo sequências de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID NOS: 3, 4 ou 5, e fragmentos e variantes suas que codificam polipeptídeos compreendendo atividade AHAS. são também fornecidos polipeptídeos com uma sequência de aminoácidos codificada por uma molécula de polinucleo-tídeo aqui descrita, por exemplo, a sequência de nucleotídeos estabelecida nas SEQ ID NOS: 13, 14 ou 15, e fragmentos e variantes suas que codificam polipeptídeos compreendendo atividade AHAS.

A presente invenção fornece proteínas AHASL com substituições de aminoácidos em posições de aminoácidos particulares em regiões conservadas das proteínas AHASL de Brassicaaqui descrevedas. A não ser que seja indicado aqui de outra forma, posições de aminoácidos particulares se referem à posição daquele aminoácido nas sequências de aminoácidos AHASL de A. thaliana de comprimento total estabelecida na SEQ ID NO: 1. Além disso, as pessoas normalmente versadas irão reconhecer que tais po-sições de aminoácidos podem variar dependendo se aminoácidos são adicionados a ou removidos, por exemplo, da extremidade N-terminal de uma sequência de aminoácidos. Deste modo, a invenção engloba as substituições amino na posição citada ou posição equivalente (por exemplo, "posição de aminoácido 653 ou posição equivalente"). Por "posição equivalente" se tenciona significar uma posição que esteja dentro da mesma região conser-vada que a posição de aminoácido exemplificada. Por exemplo, o aminoácido 122 da SEQ ID NO: 1 é a posição equivalente ao aminoácido 107 da SEQ ID NO: 4 e à posição equivalente do aminoácido 104 da SEQ ID NO: 5. Semelhantemente, o aminoácido 653 na proteína AHASL de Arabidopsis thaliana com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1 é a posição equivalente ao aminoácido 638 em AHASL1B de Brassicae ao aminoácido 635 nas proteínas AHASL1A de Brassicacom a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2 e 3, respectivamente.

A invenção engloba composições de ácido nucléico ou proteína isoladas ou substancialmente purificadas. Uma molécula ou proteína de polinucleotídeo "isolada" ou "purificada", ou porção biologicamente ativa sua, é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham ou interagem com a molécula de polinucleotídeo ou proteína conforme encontrada em seu ambiente de ocorrência natural. Deste modo, uma molécula ou proteína de polinucleotídeo isolada ou purificada é subs-tancialmente livre de outros materiais celulares, ou meio de cultura quando produzida por técnicas recombinantes, ou substancialmente livres de precursores químicos ou outras substâncias químicas quando quimicamente sintetizados. Preferivelmente, um ácido nucléico "isolado" é livre de sequências (preferivelmente sequências codificadoras de proteína) que flanqueiam naturalmente o aminoácido (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5’ e 3’ do ácido nucléico) no DNA genômico do organismo a partir do qual o ácido nucléico é derivado. Por exemplo, em várias modalidades, a molécula de polinucleotídeo isolada pode conter menos do que cerca de 5 Kb, 4 Kb, 3 Kb, 2 Kb, 1 Kb, 0.5 Kb ou 0,1 Kb de sequências de nucleotídeos que flanqueiam a molécula polinucleotídica no DNA genômico da célula a partir da qual o ácido nucléico é derivado. Uma proteína que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteína com menos do que cerca de 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (em peso seco) de proteína contaminante.

Quando a proteína da invenção ou porção biologicamente ativa sua é recombinantemente produzida, o meio de cultura representa preferivelmente menos do que cerca de 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (em peso seco) de precursores químicos ou substâncias químicas não-proteicas de interesse. A presente invenção fornece polipeptídeos isolados compreendendo proteínas AHASL1. Os polipeptídeos isolados compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo da sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID Nos: 3, 4 ou 5, a sequência de aminoácidos codificada pelas sequências de nucleotideos estabelecida na SEQ ID NO: 13, 14 ou 15, e fragmentos funcionais e variantes das referidas sequências de aminoácidos que codificam um polipeptídeo AHASL1 compreendendo atividade AHAS. Por "fragmentos funcionais e variantes" se entende fragmentos e variantes dos polipeptídeos exemplificados que compreendem atividade AHAS.

Em certas modalidades da invenção, os métodos envolvem o uso de plantas tolerantes a herbicida ou resistentes a herbicida. Por uma planta "tolerante a herbicida" ou "resistente a herbicida" se entende que uma planta é tolerante ou resistente a pelo menos um herbicida em nível que poderia normalmente matar ou inibir o crescimento de uma planta normal ou tipo selvagem. Em uma modalidade da invenção, as plantas tolerantes a herbicida da invenção compreendem uma proteína AHASL tolerante a herbicida o resistente a herbicida. Por "proteína AHASL tolerante a herbicida" ou "proteína AHASL resistente a herbicida" se entende que tal proteína AHASL exibe atividade AHAS maior, em relação à atividade AHAS de uma proteína AHASL do tipo selvagem, na presença de pelo menos um herbicida que seja conhecido por interferir com a atividade AHAS e em uma concentração ou nível do herbicida que seja conhecido por inibir a atividade AHAS da proteína AHASL tipo selvagem. Além disso, a atividade AHAS de tal proteína AHASL tolerante a herbicida ou resistente a herbicida pode ser aqui referida como atividade AHAS "tolerante a herbicida" ou "resistente a herbicida".

Para a presente invenção, os termos "tolerante a herbicida" e "resistente a herbicida" são usados intercambiavelmente e são tencionados a ter um significado equivalente e um escopo equivalente. Semelhantemente, os termos "tolerante a herbicida" e "resistente a herbicida" são usados intercambiavelmente e são tencionados a ter um significado equivalente e um escopo equivalente. Da mesma forma, os termos "resistente a imidazolinona" e "resistência a imidazolinona" são usados intercambiavelmente e são tencionados a serem de um significado equivalente e de um escopo equivalente aos termos "tolerante à imidazolinona" e "tolerância à imidazolinona", respectivamente.

A invenção engloba polinucleotídeos AHAS1 resistentes a herbicida e proteínas AHASL1 resistentes a herbicida. Por "polinucleotídeo AHASL1 resistente a herbicida" é tencionado um polinucleotídeo que codifica uma proteína compreendendo atividade AHAS resistente a herbicida. Por "proteína AHASL1 resistente a herbicida" é tencionada uma proteína ou polipeptídeo que compreenda atividade AHAS resistente a herbicida.

Além disso, é reconhecido que uma proteína AHASL tolerante a herbicida ou resistente a herbicida possa ser introduzida em uma planta pela transformação de uma planta ou ancestral sua com uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína AHASL tolerante a herbicida ou resistente a herbicida. Tais proteínas tolerantes a herbicida ou resistentes a herbicida são codificadas pelos polinucleotídeos AHASL tolerantes a herbicida ou resistentes a herbicida. Alternativamente, uma proteína tolerante a herbicida ou resistente a herbicida pode ocorrer em uma planta como resultado de uma ocorrência natural ou mutação induzida em um gene AHASLendógeno no genoma de uma planta ou progenitora sua.

A presente invenção fornece plantas, tecidos vegetais, células vegetais e células hospedeiras com resistência aumentada e/ou intensificada ou tolerância a pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida que interfere com a atividade da enzima AHAS, mais particularmente um herbicida imidazolinona ou sulfonilureia. O termo "intensificado" se refere a um aumento na quantidade de resistência ou tolerância acima a qual será esperada. A quantidade ou concentração preferida do herbicida é uma "quantidade eficaz" ou "concentração eficaz". Por "quantidade eficaz" ou "concentração eficaz" se entende uma quantidade e concentração, respectivamente, que seja suficiente para matar ou inibir o crescimento de tipo selvagem, planta, tecido vegetal, célula vegetal, micrósporo ou célula hospedeira similar, porém a referida quantidade não mata ou inibe de modo tão severo o crescimento das plantas resistentes a herbicida, tecidos vegetais, micrósporos e células hospedeiras da presente invenção. Tipicamente, a quantidade eficaz de um herbicida é uma quantidade que é rotineiramente usada em sistemas de produção agrícola para matar ervas daninhas de interesse. Tal quantidade é conhecida pelas pessoas normalmente versadas na técnica, ou pode ser facilmente determinada usando métodos conhecidos na técnica. Além disso, é reconhecido que a quantidade eficaz de um herbicida no sistema de produção agrícola deve ser substancialmente diferente da quantidade eficaz de um herbicida para um sistema de cultivo vegetal tal como, por exemplo, o sistema de cultivo de microsporos.

Os herbicidas da presente invenção são aqueles que interferem com a atividade da enzima AHAS de modo que a atividade AHAS seja reduzida na presença do herbicida. Tais herbicidas também são referidos aqui como "herbicidas inibidores de AHAS" ou simplesmente "inibidores AHAS". Conforme aqui utilizado, "herbicida inibidor de AHAS" ou "inibidor AHAS" não são tencionados a serem limitativos de herbicidas simples que interferem com a atividade da enzima AHAS. Deste modo a não ser que seja estabelecido de oura forma ou evidenciado a partir do contexto, um "herbicida inibidor de AHAS" ou "inibidor AHAS" podem ser um herbicida ou uma mistura de dois, três, quatro ou mais herbicidas, cada um dos quais interferindo coma atividade da enzima AHAS.

Por "semelhante, tipo selvagem, planta, tecido vegetal, célula vegetal ou célula hospedeira" se entende uma planta, tecido vegetal, célula vegetal, célula hospedeira, respectivamente, que não tem as características de resistência à herbicida e/ou polinucleotídeos particulares da invenção que são descrevedos aqui. O uso do termo "tipo selvagem" não é, consequentemente, tencionado a implicar que uma planta, tecido vegetal, célula vegetal ou célula hospedeira não tem DNA recombinante em seu genoma, e/ou não possui características de resistência a herbicida que são diferentes daquelas aqui descrevedas.

Conforme aqui usado, a não ser que seja claramente definido de outra forma, o termo "planta" é tencionado a significar uma planta em qualquer estágio de desenvolvimento, assim como qualquer parte ou partes de uma planta que possam ser ligadas a ou separadas de uma planta intacta inteira. Tais partes vegetais incluem, porém não estão limitadas, a órgãos, tecidos e células de uma planta, incluindo caules vegetais, moitas, protoplastos vegetais e culturas de tecidos celulares vegetais a partir das quais plantas podem ser regeneradas. Exemplos de partes vegetais particulares incluem um tronco, uma folha, uma raiz, uma inflorescência, uma flor, uma florzinha, uma fruta, um pedículo, um pedúnculo, um estame, uma antera, um estigma, um estilo, um ovário, uma sépala, um carpelo, uma ponta de raiz, um topo de raiz, um pêlo de raiz, um pêlo de folha, um pêlo de semente, um grão de pólen, um micrósporo, um embrião, um óvulo, um cotilédone, um hipocotil, um epicotil, zilema, floema, parênquima, endosperma, uma célula companheira, uma célula guarda e quaisquer outros órgãos, tecidos e células de uma planta conhecidos. Além disso, é reconhecido que uma semente é uma planta.

As plantas da presente invenção incluem tanto plantas nãotransgênicas quanto plantas não-transgênicas. Por "planta não-transgênica" é tencionado significar uma planta sem DNA recombinante em seu genoma. Por "planta transgênica" é tencionado significar uma planta compreendendo DNA recombinante em seu genoma. Tal planta transgênica pode ser produzida pela introdução de DNA recombinante no genoma da planta. Quando tal DNA recombinante é incorporado no genoma da planta transgênica, a progenia da planta pode também compreender o DNA recombinante. Uma planta de progenia que compreende pelo menos uma porção do DNA recombinante de pelo menos uma planta transgênica progenitora também é uma planta transgênica.

A presente invenção fornece a linhagem Brassicaresistente a herbicida que é referida aqui como J04E-0122. Um depósito de pelo menos 2500 sementes da linhagem BrassicaJ04E-0122 com o Depositário de Patentes da American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA 20110 EUA foi feito no dia 19 de outubro de 2006, e atribuído o número de depósito de patente ATCC PTA-7944. A presente invenção fornece a linhagem Brassicaresistente a herbicida que é aqui referida como J04E-0130. Um depósito de pelo menos 2500 sementes da linhagem BrassicaJ04E-0130 foi feito no dia 19 de outubro de 2006, e atribuído o número de depósito de patente ATCC PTA-7945. A presente invenção fornece a linhagem Brassicaresistente a herbicida que é aqui referida como J04E-0139. Um depósito de pelo menos 2500 sementes da linhagem BrassicaJ04E-0139 foi feito no dia 19 de outubro de 2006, e atribuído o número de depósito de patente ATCC PTA-7946. A presente invenção fornece a linhagem Brassicaduplamente mutante resistente a herbicida que é aqui referida como J05Z-07801. Um depósito de pelo menos 625 sementes da linhagem BrassicaJ05Z-07801 foi feito no dia 2 de abril de 2007, as 1875 sementes remanescentes foram depositadas no dia 15 de janeiro de 2008, e atribuído o número de depósito de patente ATCC PTA-8305. O depósito será mantido sob os termos do Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional de Depósito e Microorganismos para Finas de Procedimentos de Patente. O depósito das linhagens BrassicaJ04E-0122, J04E-0130, J04E-0130 e J05Z-07801 foi por um período de pelo menos 30 anos e pelo menos 5 anos após a solicitação mais recente para o fornecimento de uma amostra do depósito ser recebida pelo ATCC. Adicionalmente, os requerentes satisfizeram todas as exigências de 37 C.F.R. §§ 1,801-1,809, incluindo o fornecimento de uma indicação a viabilidade da amostra.

As linhagens de Brassicaresistentes a herbicida mutantes individuais J04E-0122, J04E-0130 e J04E-0139 da presente invenção foram produzidas por geração de mutações, micrósporos de Brassicatipo selvagem foram modificadas por exposição a um mutágeno, particularmente a um mutágeno químico, mais particularmente etilnitrosureia (ENU). Entretanto, a presente invenção não está limitada às plantas Brassicaresistentes a herbicida que são produzidas por um método de mutagênese envolvendo o mutágeno químico ENU. Qualquer método de mutagênese conhecido na técnica pode ser usado para produzir as plantas Brassicaresistentes a herbicida da presente invenção. Tais métodos de mutagênese podem envolver, por exemplo, o uso de qualquer um ou mais dos seguintes mutágenos: radiação, tais como raios-X, raios-gama (por exemplo, cobalto 60 ou césio 137), nêutrons (por exemplo, produto de fissão nuclear por urânio 235 em um reator atômico), radiação beta (por exemplo, emitida de radioisótopos tais como fósforo 32 ou carbono 14) e radiação ultravioleta (preferivelmente de 250 a 290 nm) e mutágenos químicos tais como metanossulfonato de etila (EMS), análogos de base (por exemplo, 5-bromouracila), compostos relacionados (por exemplo, 8-etoxicafeína), antibióticos (por exemplo, estreptonigrina), agentes alquilantes (por exemplo, mostardas com enxofre, mostardas nitrogenadas, epóxidos, etilenaminas, sulfatos, sulfonatos, sulfonas, lactonas), azida, hidroxilamina, ácido nitroso ou acridinas. Plantas resistentes a herbicida podem também ser produzidas pelo uso dos métodos de cultivo para selecionar células vegetais compreendendo mutações de resistência a herbicida e a seguir a regeneração de plantas resistentes a herbicidas deste ponto. Ver, por exemplo, as patentes Americanas N2S 5.773.702 e 5.859.348, ambas sendo aqui incorporadas por referência nas suas totalidades. Outros detalhes de geração de mutação podem ser encontrados em "Principals of Cultivar Development" Fehr, 1993 Macmillan Publishing Company, a qual é aqui incorporada por referência.

A análise do gene AHAS1 da planta Brassicada linhagem J04E-0139 revelou que uma mutação que resulta na substituição de uma asparagina para serina encontrada na posição de aminoácido 635 do gene AHASL de B. juncea no genoma A e confere resistência aumentada a um herbicida. Deste modo, a presente invenção descreve que a substituição de outro aminoácido para a serina na posição 635 (correspondente ao aminoácido 653 da AHASL1 de A. thaliana) pode fazer com que uma planta Brassicatenha resistência aumentada a um herbicida, particularmente um herbicida de imidazolinona e/ou sulfonilureia. As plantas Brassicaresistentes a herbicida da invenção incluem, porém não estão limitadas, àquelas plantas Brassicaas quais compreendem em seus genomas pelo menos uma cópia de um polinucleotídeo AHASL1 que codifica uma proteína AHASL1 resistente a herbicida, que compreende uma asparagina na posição de aminoácido 635 ou posição equivalente.

A análise do gene AHASL1 da planta Brassicada linhagem J04E-0130 revelou uma mutação que resulta na substituição de uma treonina por alanina encontrada na posição e aminoácido 107 do gene AHASL de B. juncea no genoma B e confere resistência aumentada a um herbicida. Deste modo, a presente invenção descreve que a substituição de outro aminoácido da alanina na posição 107 (correspondente ao aminoácido 122 da AHASL1 de A. thaliana) pode fazer com que uma planta Brassicatenha maior resistência a um herbicida, particularmente um herbicida imidazolinona e/ou sulfonilureia. As plantas Brassicaresistentes ao herbicida da invenção incluem, porém não estão limitadas, àquelas plantas Brassicaas quais compreendem em seus genomas pelo menos uma cópia de um polinucleotídeo AHASL1 que codifica uma proteína AHASL1 resistente a herbicida que com-preende uma treonina na posição do aminoácido 107 ou posição equivalente.

A análise do gene AHASL1 da planta Brassicada linhagem J04E-0122 revelou uma modificação que resulta na substituição de uma treonina por uma alanina encontrada na posição do aminoácido 104 do gene AHASL de B. juncea no genoma A e confere maior resistência a um herbicida. Deste modo, a presente invenção descreve que a substituição de outro aminoácido pela alanina na posição 104 (correspondente ao aminoácido 122 da AHASL1 de A. thaliana) pode fazer com que uma planta Brassicatenha maior resistência a um herbicida, particularmente a um herbicida imidazolinona e/ou sulfonilureia. As plantas Brassicaresistentes a herbicida da invenção incluem, porém não estão limitadas, àquelas plantas Brassicaas quais compreendem em seus genomas pelo menos uma cópia de um polinucleotídeo AHASL1 que codifica uma proteína AHASL1 resistente a herbicida que compreende uma treonina na posição de aminoácido 104 ou posição equivalente.

As plantas Brassicada invenção ainda incluem plantas que compreendem, em relação à proteína AHASL1 do tipo selvagem, uma asparagina na posição de aminoácido 653 (nomenclatura de A. thaliana), uma treonina na posição de aminoácido 122 (nomenclatura de A. thaliana), e uma ou mais substituições de aminoácidos adicionais na proteína AHASL1 em relação à proteína AHASL1 tipo selvagem, em que tal planta Brassicatem maior resistência a pelo menos um herbicida em comparação com uma planta Brassicatipo selvagem.

A presente invenção fornece plantas e métodos de preparo de plantas Brassicaresistentes ao herbicida AHAS, plantas Brassicacom maior tolerância aos herbicidas AHAS, e sementes de tais plantas. Deste modo, as plantas aqui exemplificadas podem ser usadas em programas de geração para desenvolver plantas B. juncea resistentes a herbicida adicionais, tais como variedades comerciais de B. juncea. De acordo com tais métodos, uma primeira planta de origem Brassicapode ser usada em cruzamentos com uma segunda planta de origem Brassica,onde pelo menos uma dentre as plantas Brassicaprimeira ou segunda contém pelo menos uma mutação de resistência ao herbicida AHAS. Uma aplicação do processo está na produção de plantas Fi híbridas. Outro aspecto importante deste processo é que o processo pode ser usado para o desenvolvimento de linhagens de origem novas, diaploides ou congênitas. Por exemplo, uma linhagem Brassicaconforme aqui descrito poderia ser cruzada com qualquer segunda planta, e cada progenia híbrida resultante própria e/ou irmã por cerca de 5 a 7 ou mais gerações, fornecendo deste modo uma maior quantidade de linhagens de origem distintas. Essas linhagens de origem poderiam ser então cruzadas com outras linhagens e a progenia híbrida resultante analisada em relação às características benéficas. Deste modo, novas linhagens conferindo características desejáveis poderiam ser identificadas. Vários métodos de geração podem ser usados nos métodos, incluindo haploidia, geração pedigree, linhagem de uma única semente, linhagem de uma única semente modificada, seleção recorrente e cruzamento reverso.

Linhagens Brassicapodem ser cruzadas por técnicas ou naturais ou mecânicas. A polinização mecânica pode ser efetuada ou através do controle de tipos de pólen que pode ser transferido no estigma ou por polinização manual.

Plantas Brassicade linhagem e/ou progenia podem ser avaliadas por qualquer método para determinar a presença de um polinucleotídeo ou polipeptídeo AHASL modificado. Tais métodos incluem avaliações fenotípicas, avaliações genotípicas ou combinações desses. As plantas Brassica de progenia podem ser avaliadas em gerações subsequentes em relação à resistência a herbicida, e outras características desejáveis. A resistência aos herbicidas inibidores de AHAS pode ser avaliada pela exposição de plantas a um ou mais herbicidas inibidores de AHAS apropriados e pela avaliação da injúria do herbicida. Algumas características, tais como resistência ao alojamento e altura da planta, podem ser avaliadas através de inspeção visual das plantas, enquanto que a precocidade da maturidade pode ser avaliada por inspeção visual das sementes nas vagens (síliquas). Outras características, tais como porcentagem de óleo, porcentagem de proteína e glicosinolatos totais das sementes podem ser avaliadas usando técnicas tais como Espectroscopia no Infravermelho próximo e/ou cromatografía líquida e/ou cromatografia a gás.

A avaliação genotípica das plantas Brassicainclui o uso de técnicas tais como eletroforese de isozima, polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLPs), DNAs polimórficos aleatoriamente amplificados (RAPDs), reação em cadeia da polimerase arbitrariamente iniciada (AP-PCR), Impressão Digital da Amplificação do DNA (DAF), Regiões Amplificadas Caracterizadas por Sequência (SCARs), Polimorfismos de Compri-mento de Fragmento Amplificado (AFLPs), Repetições de Sequência Simples (SSRs) as quais também são referidas com "Microssatélites". Composições adicionais e métodos para analisar o genótipo das plantas Brassica aqui fornecidos incluem aqueles métodos descrevedos na Publicação Americana Ne 2004/0171027, Publicação Americana Ne 2005/02080506 e Publicação Americana N2 2005/0283858, as totalidades das quais sendo por meio deste documento incorporadas por referência.

A avaliação e manipulação (através da exposição de um ou mais herbicidas inibidores e AHAS apropriados) pode ocorrer por várias gerações.

O desempenho de novas linhagens pode ser avaliado usando critérios objetivos em comparação para averiguar as variedades. As linhagens mostrando as combinações desejadas de características são ou cruzadas com outra linhagem ou auto-polinizadas para produzir sementes. A auto-polinização se refere à transferência de pólen de uma flor para a mesma flor ou outra flor da mesma planta. Plantas que tenham sido auto-polinizadas e selecionadas em relação ao tipo por muitas gerações se tornam homozigóticas em quase to-dos os locais de genes e produzem uma população uniforme de progenia de geração verdadeira.

Qualquer método de geração pode ser usado nos métodos da presente invenção. Em um exemplo, as plantas resistentes a herbicida da presente invenção podem ser produzidas usando um método haploide. Em tais métodos, origens com a base genética para o complemento desejado de características são cruzadas em um cruzamento simples ou complexo. O cruzamento (ou polinização cruzada) se refere a transferência de pólen de uma planta para outra diferente. A progenia do cruzamento cresce e os microsporos (grãos de pólen imaturo) são separados e filtrados, usando técnicas conhecidas pelas pessoas versadas na técnica [(por exemplo, Swanson, E. B. et al., "Efficient isolation of microspores and the production of microspore-derived embryos in Brassica napus, L. Plant Cell Reports, 6: 94-97 (1987); e Swanson, E. B., Microspore culture in Brassica, pp. 159-169 em Methods in Molecular Biology, vol. 6, Plant Cell and Tissue Culture, Humana Press, (1990)].

Estes micrósporos apresentam segregação os genes. Os micrósporos são cultivados na presença de um herbicida inibidor de AHAS apropriado, tal como imazetafir (por exemplo, PURSUIT.TM) ou imazamox (por exemplo, RAPTOR.TM.) ou uma mistura 50/50 de imazetapir e imazamox (por exemplo, ODYSSEY.TM), o qual mata os microsporos sem as mutações responsáveis pela resistência ao herbicida. Os micrósporos contendo os genes responsáveis pela resistência ao herbicida sobrevivem e produzem embriões, os quais formam plantas haploides. Esses cromossomos são a seguir duplicados para produzir haploides duplicados.

Outros métodos de geração também podem ser usados de acordo com a presente invenção. Por exemplo, a geração de pedigree pode ser usada para a melhoria de safras altamente auto-polinizadoras, tais como Brassicae canola. A geração de pedigree começa com o cruzamento de dois genótipos, cada um dos quais podendo ter uma ou mais características desejáveis que estejam faltando na outra ou a qual complemente a outra. Se os dois genitores originais não fornecerem todas as características desejadas, genitores adicionais podem ser incluídos no plano de cruzamento.

Esses genitores podem ser cruzados de modo simples ou complexo para produzir um Fi simples ou complexo. Uma população de F2 é prodeuzida a partir de Fi através de da própria uma ou várias plantas Fi, ou pelo intercruzamento de dois F-iS (isto é, emparelhamento irmão). A seleção dos melhores indivíduos pode começar com a geração F2, e as melhores famílias podem começar em F3, e os melhores indivíduos nas melhores famílias são selecionados. A testagem replicada das famílias pode começar na geração F4 para melhorar a eficácia de seleção de características com baixa hereditabilidade. Em um estágio avançado de procriação (isto é, Fθ e F7), as melhores linhagens ou misturas de linhagens fenotipicamente similares podem ser testadas para a liberação potencial como novos cultivares. Entretanto, o método pedigree gasta mais tempo do que o método de haploidia para desenvolver plantas resistentes ao herbicida AHAS, uma vez que as plantas exibem segregação para várias gerações, e a recuperação das características desejáveis é relativamente baixa.

O procedimento de linhagem de semente individual (SSD) pode também ser usado para gerar variedades melhoradas. O procedimento SSD no senso estrito se refere ao plantio de uma população segregada, coleta de uma amostra de uma semente por planta e uso da população de sementes individuais para plantar a próxima geração. Quando a população progrediu do F2 para o nível desejado de procriação, as plantas de cujas linhagens são derivadas irão cada uma determinar indivíduos F2. A quantidade de plantas em uma população declina a cada geração devido à falha de algumas sementes em germinar ou em algumas plantas de produzir pelo menos uma semente. Como resultado, nem todas as plantas originalmente amostradas na população F2 irão ser representadas por uma progenia quando terminado o melhoramento da geração.

Em um procedimento com várias sementes, os criadores de canola comumente coletam uma ou mais vagens de cada planta em uma população e debulham-nas para formar uma massa. Parte da massa é usada para plantar a próxima geração e parte é reservada. O procedimento foi referido como linhagem de semente individual modificada ou técnica de vagemmassa. O procedimento de várias sementes é usado para economizar trabalho na colheita. É consideravelmente mais rápido debulhar vagens com uma máquina do que removê-las uma semente de cada vez com as mãos para o procedimento com uma única semente. O procedimento com várias sementes também torna possível plantar a mesma quantidade de sementes de uma população a cada geração de procriação. Sementes suficientes são coletadas para compor aquelas plantas que não germinam ou produzem sementes.

A procriação cruzada reversa pode ser usada para transferir um gene ou genes para uma característica simplesmente herdada e altamente transmissível de uma variedade ou linhagem fonte (o genitor doador) em outro cultivar desejável ou linhagem de procriação (o genitor recorrente). Após o cruzamento inicial, indivíduos com o fenótipo do genitor doador são selecionados e são repetidamente cruzados (cruzados de modo reverso) ao genitor recorrente. Quando 0 cruzamento reverso é completado, espera-se que a planta resultante tenha os atributos do genitor recorrente e a característica desejável transferida do genitor doador.

Variedades melhoradas também podem ser desenvolvidas através da seleção recorrente. Uma população geneticamente variável de indivíduos heterozigóticos é ou identificada ou criada através do intercruzamento de vários genitores diferentes. As melhores plantas são selecionadas baseando-se na superioridade individual, na excelente progenia ou na excelente capacidade de combinação. As plantas selecionadas são entrecruzadas para produzir uma nova população na qual outros ciclos de seleção continuam.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de produção de uma planta Brassicacom resistência aos herbicidas AHAS compreendendo: (a) o cruzamento de uma primeira linhagem Brassicacom uma segunda linhagem Brassicapara formar uma população segregada, onde a primeira linhagem Brassicaé uma planta Brassicaresistente ao herbicida AHAS; (b) a varredura da população em relação à resistência ao herbicida AHAS aumentada; e (c) a seleção de um ou mais membros da população com resistência AHAS aumentada em relação a uma planta Brassica tipo selvagem.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de infiltração de uma característica de resistência ao herbicida AHAS em uma planta Brassicacompreendendo: (a) o cruzamento de pelo menos uma primeira linhagem de Brassicaresistente ao herbicida AHAS com uma segunda linhagem Brassicapara formar uma população segregada; (b) a varredura da população em relação à resistência ao herbicida AHAS aumentada; e (c) a seleção de pelo menos um membro da população com resistência ao herbicida AHAS aumentada.

Alternativamente, em outro aspecto da invenção, tanto a primeira quanto a segunda planta Brassicapodem ser uma planta Brassicaresistente ao herbicida AHAS conforme aqui descrito. Deste modo, qualquer planta Brassicaproduzida usando uma planta Brassicacom resistência herbicida AHAS aumentada conforme aqui descrito forma uma parte da invenção. Conforme aqui utilizado, o cruzamento pode significar auto cruzamento, cruzamento entre irmãs, cruzamento reverso, cruzamento com outra unidade da mesma linhagem genitora, cruzamento com populações e semelhantes.

A presente invenção também fornece métodos para produzir uma planta resistente a herbicida, particularmente uma planta Brassicaresistente a herbicida, através de reprodução sexual envolvendo a procriação de plantas convencionais. Os métodos compreendem o cruzamento de uma primeira planta que é resistente a um herbicida com uma segunda planta que não é resistente ao herbicida. A primeira planta pode ser qualquer uma das plantas resistentes ao herbicida da presente invenção incluindo, por exemplo, plantas transgênicas compreendendo pelo menos um dos polinucleotídeos da presente invenção que codificam AHASL resistente a herbicida e plantas Brassicanão-transgênicas que compreendem as características de resistência ao herbicida da planta Brassica de J05Z-07801, J04E-0139, J04E-0130 ou J04E-0122. A segunda planta pode ser qualquer planta capaz de produzir plantas de progenia viável (isto é, sementes) quando cruzada com a primeira planta. Tipicamente, porém não necessariamente, a primeira e a segunda planta são da mesma espécie. Os métodos da invenção podem ainda envolver uma ou mais gerações de cruzamento reverso das plantas da progenia do primeiro cruzamento com uma planta da mesma linhagem ou genótipo ou como a primeira ou a segunda planta. Alternativamente, a progenia do primeiro cruzamento pode ser cruzada com uma terceira planta que é de uma linhagem ou genótipo diferente do que a primeira ou segunda planta. Os métodos da invenção podem ainda envolver a seleção de plantas que compreendem as características de resistência a herbicida da primeira planta.

A presente invenção ainda fornece métodos para aumentar a resistência a herbicida de uma planta, particularmente uma planta Brassica resistente a herbicida, através da procriação de plantas convencional envolvendo reprodução sexual. Os métodos compreendem o cruzamento de uma primeira planta que é resistente a um herbicida com uma segunda planta que pode ou não ser resistente ao herbicida ou pode ser resistente a diferente herbicida ou herbicidas do que a primeira planta. A primeira planta pode ser qualquer uma das plantas resistentes a herbicida a presente invenção incluindo, por exemplo, plantas transgênicas compreendendo pelo menos um dos polinucleotídeos da presente invenção que codificam uma AHASL resistente a herbicida e plantas Brassicanão-transgênicas que compreendem as características de resistência a herbicida da planta Brassicade J05Z-07801, J04E-0139, J04E-0130 ou J04E-0122. A segunda planta pode ser qualquer planta que seja capaz de produzir plantas de progenia viáveis (isto é, sementes) quando cruzada com a primeira planta. Tipicamente, porém não necessariamente, a primeira e a segunda planta são da mesma espécie; da mesma forma, a primeira e a segunda planta podem ser de espécies diferentes, porém do mesmo gênero (exemplo: Brassica Juncea x Brassica napus, Brassica juncea x Brassica rapa, Brassica juncea x Brassica oleracea, Brassica juncea x Brassica nigra,etc.), e também a primeira e segunda plantas são de gêneros diferentes (exemplo: Brassica x Sinapsis). As plantas de progenia produzidas por este método da presente invenção têm resistência maior a um herbicida em comparação com a primeira ou a segunda planta ou ambas. Quando a primeira ou a segunda planta são resistentes a diferentes herbicidas,as plantas da progenia apresentarão as características de resistência ao herbicida da primeira e da segunda planta. Os métodos da invenção podem ainda envolver uma ou mais gerações de cruzamento reverso das plantas da progenia do primeiro cruzamento para uma planta da mesma linhagem ou genótipo como ou a primeira ou segunda planta. Alternativamente, a progenia do primeiro cruzamento ou qualquer cruzamento subsequente pode ser cruzada com uma terceira planta que é de uma linhagem ou genótipo diferente do que a primeira ou a segunda planta. Os métodos da invenção podem ainda envolver a seleção de plantas que compreendem as características de resistência ao herbicida da primeira planta, a segunda planta ou tanto a primeira como a segunda planta.

As plantas da presente invenção podem ser transgênica ou nãotransgênicas. Um exemplo de uma planta Brassicanão-transgênica com resistência aumentada aos herbicidas de imidazolinona e/ou sulfonilureia inclui a planta Brassica de J05Z-07801, J04E-0139, J04E-0130 ou J04E-0122; ou uma mutante, uma recombinante ou um derivado geneticamente modificado da planta de J05Z-07801, J04E-0139, J04E-0130 ou J04E-0122; ou de qualquer progenia da planta de J05Z-07801, J04E-0139, J04E-0130 ou J04E-0122; ou uma planta que é uma progenia de qualquer uma dessas plantas; ou uma planta que compreende as características de resistência ao herbicida da planta de J05Z-07801, J04E-0139, J04E-0130 ou J04E-0122.

A presente invenção também fornece plantas, órgãos vegetais, tecidos vegetais, células vegetais, sementes e células hospedeiras não-humanas que são transformadas com pelo menos uma molécula de polinucleotídeo, cassete de expressão ou vetor de transformação da invenção. Tais plantas, órgãos vegetais, tecidos vegetais, células vegetais, sementes e células hospedeiras não-humanas transformadas apresentam tolerância ou resistência intensificados a pelo menos um herbicida, em níveis de herbicida que matam ou inibem o crescimento de uma planta, órgão vegetal, tecido vegetal, célula vegetal ou célula hospedeira não-humana, respectivamente. Preferivelmente, as plantas, tecidos vegetais, células vegetais e sementes transformadas da invenção são Brassicae plantas de safra.

A presente invenção também fornece uma semente de uma planta Brassicacapaz de produzir uma planta Brassicacom resistência ao herbicida AHAS obtido de plantas Brassicaproduzidas pelos métodos da presente invenção.

Em outro aspecto, a presente invenção também proporciona o crescimento de uma planta a partir da semente de Brassicacom resistência herbicida AHAS obtida de plantas Brassicacrescidas para a semente com a característica de resistência ao herbicida, assim como partes vegetais e culturas de tecidos de tais plantas.

É também aqui fornecido um recipiente de sementes Brassica, onde as sementes são capazes de produzir uma planta Brassicaresistente ao herbicida AHAS. O recipiente das sementes Brassicapodem conter pelo menos, ou mais do que cerca de 10, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 ou mais sementes. Alternativamente, o recipiente pode conter pelo menos,ou mais do que cerca de 28,3 g, (1 onça), 141,7 g (5 onças), 283,5 g (10 onças), 453,6 kg (1 libra), 907,2 kg (2 libras), 1,4 kg (3 libras), 1,8 kg (4 libras), 2,3 kg (5 libras) ou mais de sementes.

Recipientes de sementes de Brassicapodem ser qualquer recipiente disponível na técnica. A título de exemplo não-limitativo, um recipiente pode ser uma caixa, uma bolsa, um pacote, uma algibeira, um rolo de fita, um balde, uma chapa ou um tubo.

Em outro aspecto, as sementes contidas nos recipientes de sementes Brassicapodem ser sementes tratadas ou não-tratadas. Em um aspecto, as sementes podem ser tratadas para melhorar a germinação, por exemplo, pela iniciação das sementes, ou pela desinfecção para proteger contra patógenos presentes em sementes. Em outro aspecto, as sementes podem ser revestidas com qualquer revestimento disponível para melhorar, por exemplo, a capacidade de plantio, a emergência de sementes e a proteção contra patógenos presentes em sementes. O revestimento de sementes pode ser qualquer forma de revestimento de semente incluindo, porém sem se limitar, à peletização, revestimento de filme e incrustações.

A presente invenção também fornece métodos para aumentar a atividade AHAS em uma planta compreendendo a transformação de uma planta com um constructo de polinucleotídeo compreendendo um promotor operativamente ligado a uma sequência de nucleotídeos AHASL1 da invenção. Os métodos envolvem a introdução de um constructo de polinucleotídeo da invenção em pelo menos uma célula vegetal e regenerando uma planta transformada dali. O constructo de polinucleotídeo compreende pelo menos um nucleotídeo que codifica uma proteína AHASL resistente a herbicida da invenção, particularmente a sequência de nucleotídeo estabelecida nas SEQ ID Nos: 13, 14 ou 15, sequências de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID Nos: 3, 4 ou 5, e fragmentos e variantes suas. Os métodos ainda envolvem o uso de um promotor que é capaz de direcionar a expressão gênica em uma célula vegetal. Uma planta produzida por este método compreende a atividade AHAS aumentada, particularmente a atividade AHAS tolerante ao herbicida, em comparação com uma planta não-transformada. Deste modo, os métodos encontram uso na intensificação ou aumento da resistência de uma planta a pelo menos um herbicida que interfere com a atividade catalítica da enzima AHAS, particu-larmente um herbicida de imidazolinona.

A presente invenção fornece um método para produzir uma planta resistente a herbicida compreendendo a transformação de uma célula vegetal com um constructo de polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos operativamente ligada a um promotor que direciona a expressão em um célula vegetal e a regeneração de uma planta transformada da referida célula vegetal transformada. A sequência de nucleotídeo é sele-cionada daquelas sequências de nucleotídeos que codificam as proteínas AHASL resistentes a herbicida da invenção, particularmente a sequência de nucleotídeos estabelecida nas SEQ ID Nos: 13, 14 ou 15, sequências de nucleotídeos que codificam a sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID Nos: 3, 4 ou 5, e fragmentos e variantes suas. Uma planta resistente a herbicida produzida por este método compreende resistência aumentada, em comparação com uma planta não-transformada, a pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida que interfere com a atividade da enzima AHAS tal como, por exemplo, um herbicida de imidazolinona ou um herbicida de sulfonilureia.

A presente invenção fornece cassetes de expressão para expressar as moléculas de polinucleotídeo da invenção em plantas, células vegetais e outras células não-humanas. Os cassetes de expressão compreendem um promotor que se pode expressar na planta, célula vegetal ou outras células hospedeiras de interesse operativamente ligadas a uma molécula de polinucleotídeo da invenção que codifica uma proteína AHAS resistente a herbicida. Caso seja necessário para alvejar a expressão para o cloroplasto, o cassete de expressão também pode compreender uma sequência de alvejamento de cloroplasto operativamente ligada a uma sequência que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto para direcionar uma proteína AHASL expressa para o cloroplasto.

Os cassetes de expressão da invenção encontram uso em um método para aumentar a tolerância a herbicida de uma planta ou célula hospedeira. O método envolve a transformação da planta ou célula hospedeira com um cassete de expressão da invenção, em que o cassete de expressão compreende um promotor que pode ser expresso na planta ou célula hospedeira de interesse e o promotor é operativamente ligado a um polinucleotídeo da invenção que compreende uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína AHASL1 resistente a herbicida da invenção. O método ainda compreende a regeneração de uma planta transformada da célula vegetal transformada.

O uso do termo "constructos de polinucleotídeo" aqui não é tencionado a limitar a presente invenção aos constructos de polinucleotídeo compreendendo DNA. As pessoas normalmente versadas na técnica irão reconhecer que constructos de polinucleotídeo, particularmente polinucleotideos e oligonucleotídeos, compreendidos de ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos também podem ser empregados nos métodos aqui descrevedos. Deste modo, os constructos de polinucleotídeo da presente invenção englobam todos os constructos de polinucleotídeo que podem ser empregados nos métodos da presente invenção para transformar plantas incluindo, porém sem se limitar, àqueles compreendidos de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e combinações suas. Tais desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluem tanto moléculas de ocorrência natural quanto análogos sintéticos. Os constructos de polinucleotídeo da invenção também englobam todas as formas de constructos de po-linucleotídeo incluindo, porém sem se limitar, a formas de fita simples, de fita dupla, grampos, estruturas de haste e alça e semelhantes. Além disso, se entende pelas pessoas versadas na técnica que cada sequência de nucleotídeo aqui descreveda também engloba o complemento daquela sequência de nucleotídeo exemplificada.

Além disso, reconhece-se que os métodos da invenção podem empregar um constructo de polinucleotídeo que seja capaz de direcionar, em uma planta transformada, a expressão de pelo menos uma proteína, ou de pelo menos um RNA, tal como, por exemplo, um RNA antissenso que seja complementar a pelo menos uma porção de um RNAm. Tipicamente, tal constructo de polinucleotídeo é compreendido de uma sequência codificadora para uma proteína ou um RNA operativamente ligado às regiões regulatórias de transcrição 5’ e 3’. Alternativa mente, também é reconhecido que os métodos da invenção podem empregar um constructo de polinucleotídeo que seja capaz de direcionar, em uma planta transformada, a expressão de uma proteína ou de um RNA.

Além disso, reconhece-se que, para a expressão de polinucleotideos da invenção em uma célula hospedeira de interesse, o polinucleotídeo é tipicamente operativamente ligado a um promotor que é capaz de direcionar a expressão gênica na célula hospedeira de interesse. Os métodos da invenção para expressar os polinucleotídeos em células hospedeiras não dependem de um promotor particular. Os métodos englobam o uso de qualquer promotor que seja conhecido na técnica e que seja capaz de direcionar a expressão gênica na célula hospedeira de interesse.

A presente invenção engloba moléculas do polinucleotídeo AHASL1 e fragmentos e variantes suas. Moléculas de polinucleotídeo que são fragmentos dessas sequências de nucleotídeos também são englobadas pela presente invenção. Por "fragmento" se entende uma porção da sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína AHASL 1 da invenção. Um fragmento de uma sequência de nucleotídeos AHASL1 da invenção pode codificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína AHASL1, ou ela pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridização ou iniciador de PCR usando os métodos descrevedos abaixo. Uma porção biologicamente ativa de uma proteína AHAS1 pode ser preparada pelo isolamento de uma poção de uma das sequências de nucleotídeo AHASL1 da invenção, expressando a porção codificada da proteína AHASL1 (por exemplo, pela expressão recombinante in vitro)e avaliando a atividade da porção codificada da proteína AHASL1. Moléculas de polinucleotídeo que são fragmentos de uma sequência de nucleotídeo AHASL1 compreendem pelo menos cerca de 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, ou 900, ou até a quantidade de nucleotídeos presente em uma sequência de nucleotídeos completa aqui descreveda dependendo do uso tencionado.

Um fragmento de uma sequência de nucleotídeo AHASL1 que codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína AHASL1 da invenção irá codificar pelo menos cerca de 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225 ou 250 aminoácidos contíguos, ou até a quantidade total de aminoácidos presente em uma proteína AHASL1 de comprimento total da invenção. Fragmentos de uma sequência de nucleotídeos AHASL1 que são úteis como sondas de hibridização para iniciadores PCR geralmente não precisam codificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína AHASH.

Moléculas de polinucleotídeo que são variantes das sequências de nucleotídeos descrevedas aqui também são englobadas pela presente invenção. "Variantes" das sequências de nucleotídeo AHASL1 da invenção incluem aquelas sequências que codificam as proteínas AHASL1 descrevedas aqui, porém que diferem de modo conservative devido à degeneração do código genético. Essas variantes alélicas de ocorrência natural podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular bem-conhecidas, tais como reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridização conforme esboçado abaixo. Sequências de nucleotídeos variantes também incluem sequências de nucleotídeos sinteticamente derivadas que foram geradas, por exemplo, pelo uso de mutagênese direcionada a sítio porém que ainda codificam a proteína AHASL1 descreveda na presente in-venção conforme discutido abaixo. Geralmente, variantes de sequência de nucleotídeos da invenção terão pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma sequência de nucleotídeo particular aqui descreveda. Uma sequência de nucleotídeos AHASL1 variante irá codificar uma proteína AHASL1, respectivamente, que tenha uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de uma proteína AHASL1 aqui descreveda.

Além disso, o profissional versado na técnica irá ainda perceber que alterações podem ser introduzidas por mutação nas sequências de nucleotídeos da invenção, levando deste modo às alterações na sequência de aminoácidos das proteínas AHASL1 codificadas sem alterar a atividade biológica das proteínas AHASL1. Deste modo, uma molécula de polipeptídeo isolada codificando uma proteína AHASL1 com uma sequência que difere daquela da SEQ ID NO: 11 pode ser criada pela introdução de uma ou mais substituições, adições ou eliminações de nucleotídeos na sequência de nucleotídeos correspondente aqui descreveda, de modo que uma ou mais substituições, adições ou eliminações de nucleotídeos sejam introduzidas na proteína codificada. Mutações podem ser introduzidas por técnicas padrão, tais como mutagênese direcionada a sítio e mutagênese mediada por PCR. Tais sequências de nucleotideos variantes também são englobados pela presente invenção.

Por exemplo, preferivelmente, substituições de aminoácidos conservativas podem ser feitas em um ou mais resíduos de aminoácidos previstos, não-essenciais. Um resíduo de aminoácido "não-essencial" é um resíduo que pode ser alterado a partir da sequência tipo selvagem de uma proteína AHASL1 (por exemplo, a sequência da SEQ ID NO: 1) sem alterar a atividade biológica, enquanto que um aminoácido "essencial" é necessário para a atividade biológica. Uma "substituição de aminoácido conservative"é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais similares foram identificadas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares descarregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não-polares, (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Tais substituições não poderiam ser feitas para resíduos de aminoácidos conservados, ou para resíduos de aminoácidos localizados em uma porção conservada.

As proteínas da invenção podem ser alteradas de várias formas, incluindo substituições, eliminações, mutilações e inserções de aminoácidos. Métodos para tais manipulações são geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, variantes de uma sequência de aminoácidos das proteínas AHASL1 podem ser preparadas por mutações no DNA. Métodos para a mutagênese e alterações de sequência de nucleotideos são bem-conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; Patente U.S. N4.873.192; Walker e Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nova Iorque) e as referências citadas nestes documentos. Diretrizes para atribuir substituições de aminoácidos que não afetem a atividade biológica da proteína de interesse podem ser encontradas no modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C), aqui incorporado por referência. Substituições conservatives, tal como a troca de um aminoácido por outro com propriedades semelhantes podem ser preferidas.

Alternativamente, sequências de nucleotídeos AHASL1 variantes podem ser feitas pela introdução de mutações aleatoriamente ao longo de toda ou parte da sequência codificadora de AHASL1, tal como por mutagênese de saturação, e as mutações resultantes podem ser varridas para atividade AHAS para identificar os mutantes que retêm atividade AHAS, incluindo atividade AHAS resistente a herbicida. Após a mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa de modo recombinante, e a atividade da proteína pode ser determinada usando técnicas de ensaio padrão.

Deste modo, as sequência de nucleotídeos da invenção incluem as sequências descrevedas aqui, assim como os fragmentos e variantes suas. As sequências de nucleotídeos AHASL1 da invenção, e fragmentos e variantes suas, podem ser usadas como sondas e/ou iniciadores para identificar e/ou clonar homólogos de AHASL em outras plantas. Tais sondas podem ser usadas para detectar transcritos ou sequências genômicas codificando proteínas iguais ou idênticas.

Deste modo, métodos como PCR, hibridização e semelhantes podem ser usados para identificar tais sequências com identidade substancial com as sequências da invenção. Ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) e Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY). Sequências de nucleotídeos AHASL isoladas baseando-se nas suas identidades de sequência em relação a sequências de nucleotídeos AHASL1 aqui estabelecidas ou aos fragmentos e variantes suas são englobadas pela presente invenção.

Em um método de hibridização, toda ou parte de uma sequência de nucleotídeos AHASL1 conhecida pode ser usada para varrer DNAcs o bibliotecas genômicas. Métodos para a construção de tal DNAc e bibliotecas genômicas são geralmente conhecidos na técnica e são descrevedos em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY). As chamadas sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de DNAc, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos, e podem ser marcadas com um grupo detectável tal como 32P, ou qualquer outro marcador detectável, tais como outros radioisótopos, um composto fluorescente, uma enzima ou um co-fator enzimático. Sondas para hibridização podem ser feitas pela marcação de oligoucleotídeos sintéticos baseando-se na sequência de nucleotídeos AHASL1 aqui descreveda. Degenerar iniciadores projetados com base nos resíduos de nucleotídeos ou aminoácidos conservados em uma sequência de nucleotídeos AHAS1 ou sequência de aminoácidos codificada pode ser adicionalmente usado. A sonda tipicamente compreende uma região de sequência de nucleotídeos que hibridiza sob condições estringentes até pelo menos cerca de 12, preferivelmente cerca de 25, mais preferivelmente cerca de 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, ou 900 nucleotídeos consecutivos de uma sequência de nucleotídeos AHASL1 da invenção ou um fragmento ou variante sua. A preparação de sondas para hibridização é geralmente conhecida na técnica e é descreveda em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nova Iorque), aqui incorporado por referência.

Por exemplo, toda a sequência AHASL1 aqui descreveda, ou uma ou mais porções suas, pode ser usada como uma sonda capaz de hibridizar especificamente com as sequências AHASL1 correspondentes e RNAs mensageiros. Técnicas de hibridização incluem a varredura de hibridização de bibliotecas de DNA plaqueadas (ou placas ou colônias; ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nova Iorque).

A hibridização de tais sequências pode ser efetuada sob condições estringentes. Por "condições estringentes" ou "condições de hibridização estringentes" se entende condições sob as quais uma sonda irá hibridizar para a sua sequência alvo até um grau detectavelmente maior do que as outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes em relação ao fundo). Condições estringentes são dependentes de sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes.

Tipicamente, condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração salina é menor do que cerca de 1,5 M de ions Na, tipicamente de cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de ions Na (ou outro sais) em pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, de 10 a 50 nucleotideos) e de pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, maior do que 50 nucleotideos). Condições estringentes também podem ser conseguidas pela adição de agentes de desestabilização tais como formamida. Condições de baixa estringência exemplares incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, NaCI 1 M, SDS 1 % (dodecilsulfato de sódio) a 37°C e uma lavagem em 1x a 2x SSC (20x SSC = NaCI 3,0 M/citrato trissódico 0,3 M) de 50 a 55°C. Condições de estringência moderadas exemplares incluem hibridização de 40 a 45% de formamida, NaCI 1,0 M, SDS 1 % a 37°C e uma lavagem em 0,5x a 1x SSC de 55 a 60°C. Condições de estringência elevadas exemplares incluem hibridização em 50% de formamida, NaCI 1%, SDS 1% a 37°C e uma lavagem em 0,1X SSC de 60 a 65°C. Opcionalmente, tam-pões de lavagem podem compreender de cerca de 0,1% até cerca de 1% de SDS. A duração da hibridização é geralmente menor do que cerca de 24 horas, geralmente de cerca de 4 a 12 horas.

Especificidade é tipicamente a função das lavagens póhibridização, os fatores críticos sendo a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final. Para os híbridos de DNA-DNA, a Tm pode ser aproximada a partir da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284: Tm = 81,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) 0,61 (% form) 500/L; onde M é a molaridade de cátions monovalentes, %GC é a porcentagem de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % form é a porcentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido em pares de base. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% de uma sequência alvo complementar hibridiza até uma sonda perfeitamente emparelhada. Tm é reduzida em cerca de 1°C para cada 1% de mau-emparelhamento; deste modo, Tm, hibridização e/ou condições de lavagem podem ser ajustadas para hibridizar em sequências de identidade desejada. Por exemplo, se as sequências com > de 90% de identidade foram procuradas, a Tm pode reduzir em 10°C. Geralmente, condições estringentes são selecionadas como sendo cerca de 5°C mais baixas do que o ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência específica e seu complemento em uma força iônica e pH definidos. Entretanto, condições severamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1,2, 3 ou 4°C mais baixa do que o ponto de fusão térmico (Tm); moderadamente, condições estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10°C mais baixa do que o ponto de fusão térmico (Tm); condições de baixa estringência podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15 ou 20°C mais baixa do que o ponto e fusão térmico (Tm). Ao usar a equação, a hibridização e as composições de lavagem, e a Tm desejada, as pessoas versadas na técnica irão entender que variações na estringência de hibridização e/ou soluções de lavagem são inerentemente descritas. Se o grau desejado de mau emparelhamento resultar em uma Tm menor do que 45°C (solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida), é preferível aumentar a concen-tração de SSC de modo que uma temperatura mais alta possa ser usada. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology — Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nova Iorque); e Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing e Wiley-lnterscience, Nova Iorque). Ver Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2aed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nova Iorque).

É reconhecido que as moléculas de polinucleotídeo e proteínas da invenção englobam moléculas de polinucleotídeo e proteínas compreendendo um nucleotídeo ou uma sequência de aminoácidos que seja suficientemente idêntica à sequência de nucleotídeos das SEQ ID Nos: 13, 14 e/ou 15, ou à sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 3, 4 e/ou 5. O termo "suficientemente idêntico" é aqui usado para se referir a um primeiro aminoácido ou sequência de nucleotídeo que contém uma quantidade suficiente ou mínima de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos idênticos ou equivalentes (por exemplo, comuma cadeia lateral similar) em relação a uma segunda sequência de aminoácidos ou nucleotídeos de modo que a primeira e a segunda sequência de aminoácidos ou nucleotídeos tenham um domínio estrutural comum e/ou atividade funcional comum. Por exemplo, sequências de aminoácidos ou nucleotídeos que contêm um domínio estrutural comum com pelo menos cerca de 45%, 55% ou 65% de identidade, preferivelmente 75% de identidade, mais preferivelmente 85%, 95% ou 98% de identidade são aqui definido como sendo suficientemente idênticas.

Para determinar a identidade porcentual de duas sequências de aminoácidos ou de dois ácidos nucléico, as sequências são alinhadas para propósitos de comparação ótimos. A identidade porcentual entre as duas sequências é uma função da quantidade de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, identidade porcentual = quantidade de posições idênticas/quantidade total de posições (por exemplo, posições sobrepostas) x 100). Em uma modalidade, as duas sequências têm o mesmo comprimento. A identidade porcentual entre as duas sequências pode ser determinada usando técnicas semelhantes àquelas descritas abaixo, com ou sem permitir intervalos. Ao calcular a identidade porcentual, tipicamente emparelhamentos exatos são contados.

A determinação da identidade porcentual entre duas sequências pode ser conseguida usando um algoritmo matemático. Um exemplo nãolimitativo preferido de um algoritmo matemático usado para a comparação das duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877. Tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Buscas de nucleotideos BLAST podem ser efetuadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12, para obter sequências de nucleotideos homólogas às moléculas de polinucleotídeo da invenção. Buscas de proteína BLAST podem ser efetuadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3, para obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteína da invenção. Para obter alinhamentos intervalados para fins de comparação, BLAST intervalado pode ser utilizado conforme descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, PSI-Blast pode ser usado para efetuar uma busca repetida que detecta relações diretas entre as moléculas. Ver Altschul et al. (1997), acima. Ao utilizar os programas BLAST, BLAST intervalado e PSI-Blast, os parâmetros predefinidos dos programas respectivos (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Outro exemplo não-limitativo preferido de um algoritmo matemático utilizado para a comparação das sequências é o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), o qual faz parte do pacote de softwares de alinhamento de sequências GCG. Ao utilizar o programa ALIGN para comparar sequências de aminoácidos, uma tabela de resíduos de peso PAM120, penalidade de comprimento de intervalo de 12 e penalidade de 4 podem ser usados, o alinhamento também pode ser efetuado manualmente por inspeção.

A não ser que seja estabelecido de outra forma, valores de identidade/similaridade de sequência aqui fornecidos se referem ao valor obtido usando as sequências de comprimento total da invenção e usando alinhamento múltiplo através do algoritmo Clustal W (Nucleic Acid Research, 22(22):46734680, 1994) usando o programa AlignX incluído no pacote de softwares Vector NTI Suite Versão 9 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) usando os parâmetros predefinidos; ou qualquer programa equivalente seu. Por "programa equivalente" se entende qualquer programa de comparação de sequência que, para qualquer uma das duas sequências em questão, gera um alinhamento com emparelhamentos de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos idêntico e na identidade de sequência porcentual idêntica em comparação com o alinhamento correspondente gerado por AlignX no pacote de softwares Vector NTI Suite Versão 9.

As sequências de nucleotídeos AHASL1 da invenção incluem tanto as sequências de ocorrência natural quanto as formas mutantes, particularmente formas mutantes que codificam as proteínas AHASL1 compreendendo atividade AHAS resistente a herbicida. Da mesma forma, as proteínas da invenção englobam proteínas de ocorrência natural, assim como variações e formas modificadas suas. Tais variantes continuarão a possuir a atividade AHAS desejada. Obviamente, as mutações que serão feitas no DNA codificando a variante não devem colocar a sequência fora da estrutura de leitura e preferivelmente não criarão regiões complementares que poderiam produzir estrutura de RNAm secundária. Ver a Publicação do Pedido de Patente EP Ns 75.444.

As eliminações, inserções e substituições das sequências proteicas englobadas aqui não são esperadas para produzir alterações radicais nas características da proteína. Entretanto, quando é difícil predizer o efeito exato da substituição, eliminação ou inserção antecipadamente ao fazer isso, uma pessoa versada na técnica irá perceber que o efeito será avaliado por ensaios de varredura rotineiros. Isto é, a atividade pode ser avaliada por ensaios de atividade AHAS. Ver, por exemplo, Singh et al. (1988) Anal. BÍochem. 171 :173-179, aqui incorporada por referência.

Proteínas e sequências de nucleotídeos variantes também englobam sequências e proteínas derivadas de um procedimento mutagênico e recombinogênico tal como embaralhamento de DNA. Com tal procedimento, uma ou mais sequências codificadoras de AHASL diferentes pode ser manipulada para criar uma nova proteína AHASL possuindo as propriedades desejadas. Deste modo, bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de polinucleotídeo de sequências relacionadas compreendendo regiões de sequência que têm identidade de sequência substancial e podem ser homologamente recombinadas in vivo ou in vitro.Por exemplo, usando esta abordagem, porções de sequência que codificam um domínio de interesse podem ser embaralhadas entre o gene AHASL1 da invenção e outros genes AHASL conhecidos para obter um novo gene codificando uma proteína com uma propriedade melhorada de interesse, tal com Km aumentado no caso de uma enzima. Estratégias para tal embaralhamento de DNA são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370: 389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15: 436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272: 336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391: 288-291; e Patentes Americanas N-s 5.605.793 e 5.837.458.

As sequências de nucleotídeos da invenção podem ser usadas para isolar as sequências correspondentes de outros organismos, particularmente outras plantas, mais particularmente outras dicotiledôneas. Deste modo, métodos tais como PCR, hibridização e semelhantes podem ser usados para identificar tais sequências baseando-se nas suas homologias de sequência em relação às sequências estabelecidas aqui. Sequências isoladas baseando-se nas suas identidades de sequência em relação às sequências AHASL1 totais estabelecidas aqui ou aos seus fragmentos são englobadas pela presente invenção. Deste modo, sequências isoladas que codificam uma proteína AHASL e as quais hibridizam sob condições estringentes com a sequência aqui descreveda, ou com os seus fragmentos, são englobadas pela presente invenção.

Em uma abordagem de PCR, iniciadores de oligonucleotídeos podem ser projetados para serem usados em reações de PCR para amplificar as sequências de DNA correspondentes de DNAc ou DNA genômico extraído de qualquer planta de interesse. Métodos para projetar iniciadores de PCR e clonagem de PCR são conhecidos na técnica de modo geral e são descrevedos em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nova Iorque). Ver também Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nova Iorque); Innis e Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nova Iorque); e Innis e Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nova Iorque). Métodos conhecidos de PCR incluem, porém não estão limitados, aos métodos usando iniciadores emparelhados, iniciadores aninhados, iniciadores específicos únicos, iniciadores degenerados, iniciadores gene-específicos, iniciadores vetor-específicos, iniciadores parcialmente mal-emparelhados e semelhantes.

As sequências de polinucleotídeo AHASL1 da invenção são fornecidas em cassetes de expressão para a expressão na planta de interesse. O cassete irá incluir sequências regulatórias 5’ e 3’ operativamente ligadas com uma sequência de polinucleotídeo AHASL1 da invenção. Por "operativamente ligado" se entende uma ligação funcional entre uma sequência promotora e outra segunda, em que a sequência promotora inicia e medeia a transcrição da sequência de DNA correspondendo à segunda sequência. Geralmente, operativamente ligado significa que as sequências de ácido nucleico sendo ligadas são contíguas e, onde necessário, unem duas regiões codificadoras de proteína, contíguas e na mesma estrutura de leitura. O cassete pode conter adicionalmente pelo menos um gene adicional a ser cotransformado no organismo. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(is) pode(m) ser fornecidos em cassetes de expressão múltipla.

Tal cassete de expressão é fornecido com uma variedade de sítios de restrição para a inserção da sequência de polinucleotídeo AHASL1 a ocorrer sob a regulação de transcrição das regiões regulatórias. O cassete de expressão pode adicionalmente conter genes marcadores selecionáveis.

O cassete de expressão irá incluir na direção 5’-3’ da transcrição uma região de iniciação de transcrição e tradução (isto é, um promotor), uma sequência de polinucleotídeo AHASL1 da invenção e uma região de término de transcrição e tradução (isto é, região terminadora) funcional em plantas. O promotor pode ser natural ou análogo, ou estrangeiro ou heterólogo, ao hospedeiro vegetal e/ou à sequência de polinucleotídeo AHASL1 da invenção. Adicionalmente, o promotor pode ser a sequência natural ou alternativamente uma sequência sintética. Onde o promotor é "estrangeiro" ou "heterólogo", ao hospedeiro vegetal, é tencionado que o promotor não seja encontrado na planta natural na qual o promotor é introduzido. Onde o promotor é "estrangeiro" ou "heterólogo" à sequência de polinucleotídeos AHASL1 da invenção, entende-se que o promotor não é o promotor natural ou de ocorrência natural para a sequência de polinucleotídeo AHASL1 operativamente ligada da invenção. Conforme aqui utilizado, um agente quimérico compreende uma sequência codificadora operativamente ligada a uma região de iniciação de transcrição que é heteróloga à sequência codificadora.

Enquanto pode ser preferível expressar os polinucleotídeos AHASL1 da invenção usando promotores heterólogos, as sequências de promotor naturais podem ser usadas. Tais constructos poderiam alterar os níveis de expressão da proteína AHASL1 na planta ou célula vegetal. Deste modo, o fenótipo da planta ou célula vegetal é alterado.

A região de terminação pode ser natural com a região de iniciação de transcrição, pode ser natural com a sequência AHASL1 operativamente ligada de interesse, pode ser natural com o hospedeiro vegetal ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estrangeira ou heteróloga ao promotor, a sequência de polinucleotídeo AHASL1 de interesse, o hospedeiro vegetal ou qualquer combinação desses). Regiões de terminação convenientes são disponíveis do plasmídeo Ti de A. tumefaciens,tais como as regiões de terminação octopina sintase e nopalina sintase. Ver também Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891-7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639.

Onde apropriado, o(s) gene(s) pode(m) ser otimizado(s) para a expressão aumentada na planta transformada. Isto é, os genes podem ser sintetizados usando códons preferidos vegetais para melhor expressão. Ver, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para uma discussão sobre o uso do códon preferido pelo hospedeiro. Métodos são disponíveis na técnica para sintetizar genes preferidos vegetais. Ver, por exemplo, as Patentes Americanas N°s 5.380.831 e 5.436.391 e Murray et al. (1989)

Nucleic Acids Res. 17: 477-498, aqui incorporados por referência.

Modificações de sequências adicionas são conhecidas por aumentar a expressão gênica em um hospedeiro celular. Estas incluem a eliminação das sequências que codificam sinais de poliadenilação falsos, repetições tipo transposon e outras tais sequências bem caracterizadas que podem ser prejudiciais para a expressão gênica. O conteúdo de G-C da sequência pode ser ajustado até níveis médios para um dado hospedeiro celular, conforme calculado por referência para os genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Quando possível, a sequência é modificada para evitar estruturas de RNAm secundárias de grampo previstas.

Sequências de nucleotídeos para aumentar a expressão gênica podem também ser usadas nos vetores de expressão vegetais. Estas incluem os introns do milho Adhl, o gene intronl (Callis et al. Genes and Development 1: 1183-1200, 1987), e sequências líderes (W-sequência) do vírus mosaico do tabaco (TMV), Vírus da Mancha Clorótica do Milho e Vírus Mosaico da Alfafa (Gallie et al. Nucleic Acid Res. 15: 8693-8711, 1987 e Skuzeski et al. Plant Mol. Biol. 15: 65-79, 1990). Foi demonstrado que o primeiro intron do local shrunkent-1 do milho aumenta a expressão dos genes em constructos de genes quiméricos. Patentes Americanas N-s 5.424.412 e 5.593.874 descrevem o uso de introns específicos em constructos de expressão gênica, e Gallie et al. (Plant Physiol. 106:929-939, 1994) também demonstraram que os introns são úteis para regular a expressão gênica em uma base tecido-especifica. Para aumentar ainda mais ou otimizar a expressão do gene da subunidade pequena AHAS, os vetores de expressão vegetais da invenção também podem conter sequências de DNA contendo regiões de ligação da matriz (MARs). As células vegetais transformadas com tais sistemas de expressão modificados podem então exibir a superexpressão ou expressão constitutiva de uma sequência nucleotídica da invenção.

Os cassetes de expressão podem adicionalmente conter sequências líderes 5’ no constructo do cassete de expressão. Tais sequências líderes podem atuar para intensificar a tradução. Líderes de tradução são conhecido na técnica e incluem: líderes de picornavírus, por exemplo, líder

EMCV (região não-codificadora 5’ de encefalomiocardite) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6126-6130); líderes potyvirus, por exemplo, líder TEV (Virus Etch do Tabaco) (GaMe et al. (1995) Gene 165(2):233-238), líder MDMV (Vírus Mosaico Comum do Milho) (Virology 154: 9-20), e a proteína de ligação da cadeia pesada de imunoglobulina hu-mana (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353: 90-94); líder não-traduzido do RNAm de proteína de revestimento do vírus mosaico da alfafa (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325: 622-625); líder do vírus mosaico do tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) em Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, Nova Iorque), pp. 237-256); e líder do vírus da mancha clorótica do milho (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81: 382-385). Ver também DellaCioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968. Outros métodos conhecidos por intensificar a tradução podem também ser utilizados, por exemplo, introns e semelhantes.

Ao preparar o cassete de expressão os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados, de modo a fornecer sequências de DNA na orientação adequada e, conforme apropriado, na estrutura de leitura própria. Para este ponto adaptadores ou ligantes podem ser empregados para unir os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem estar envolvidas para fornecer sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição ou semelhantes. Para este propósito, mutagênese in vitro,reparo iniciador, restrição, anelamento, ressubstituições, por exemplo, transições e transversões podem estar envolvidas.

Uma variedade de promotores pode ser usada na prática da invenção. Os promotores podem ser selecionados baseando-se no resultado desejado. Os ácidos nucleicos podem ser combinados com promotores constitutivos, tecido-preferidos ou outros para a expressão em vegetais.

Tais promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor central do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos descrevedos em WO 99/43838, e a Patente U.S. N6.072.050; o promotor CaMV 35S central (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812); actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant

Mol. Biol. 12: 619-632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3: 2723-2730); promotor ALS (Patente U.S. No. 5.659.026) e semelhantes. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, as Patentes Americanas N-s 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; e 6.177.611.

Promotores tecido-específicos podem ser utilizados para almejar a expressão de AHASL1 intensificada em um tecido vegetal particular. Tais promotores tecido-específicos incluem, porém não estão limitados, aos promotores preferidos de folha, promotores preferidos de raiz, promotores preferidos de semente e promotores preferidos de caule. Promotores preferidos de tecido incluem Yamamoto et al (1997) Plant J. 12(2): 255-265; Kawamata et al (1997) Plant Cell Physiol 38(7): 792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3): 337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3): 1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2): 525-535; Canevascini et al (1996) Plant Physiol 112(2): 513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol 35(5): 773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181196; Orozco et al (1993) Plant Mol Biol 23(6): 1129-1138; Matsuoka et al (1993) Proc Natl. Acad. Sci USA 90(20): 9586-9590; e Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3): 495-505. Tais promotores podem ser modificados, caso seja necessário, para uma expressão fraca.

Em uma modalidade, os ácidos nucleicos de interesse são alvejados ao cloroplasto para expressão. Deste modo, onde o ácido nucléico de interesse não é diretamente inserido no cloroplasto, o cassete de expressão irá adicionalmente conter uma sequência de alvejamento de cloroplasto compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto para direcionar o produto gênico de interesse aos cloroplastos. Tais peptídeos de trânsito são conhecidos na técnica. Em relação às sequências de alvejamento de cloroplasto, "operativamente ligado" significa que a sequência de ácido nucléico codificando um peptídeo de trânsito (isto é, a sequência de alvejamento de cloroplasto) é ligada ao polinucleotídeo AHASL da invenção de modo que as duas sequências sejam contíguas e estejam na mesma estrutura de leitura. Ver, por exemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol Biol Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968; Romer et al (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233: 478-481. Enquanto as proteínas AHASL1 da invenção incluem um peptídeo de trânsito de cloroplasto natural, qualquer peptídeo de trânsito de cloroplasto conhecido na técnica pode ser fundido à sequência de aminoácidos de uma proteína AHAS1 madura da invenção pela ligação de modo operável a uma sequência de alvejamento de cloroplasto a uma extremidade 5’ de uma sequência de nucleotídeo codificando uma proteína AHASL1 madura da invenção.

Sequências de alvejamento e cloroplasto são conhecidas na técnica e incluem a subunidade pequena de cloroplasto da ribulose-1,5bisfosfato carboxilase (Rubisco) (de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol Biol. 30: 769-780; Schnell et al (1991) J. Biol. Chem. 266(5): 3335-3342); 5(enolpyruvyl)shikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) (Archer et al. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6): 789-810); tryptophan synthase (Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(11): 6081-6087); plastocyanin (Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(33): 20357-20363); chorismate synthase (Schmidt et al. (1993) J. Biol Chem. 268(36): 27447-27457); e a proteína de ligação à clorofila que captura luz a/b (LHBP) (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 14996-14999). Ver também Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; DellaCioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233: 478-481.

Métodos para a transformação de cloroplastos são bemconhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci USA 87: 8526-8530; Svab e Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 913-917; Svab e Maliga (1993) EMBO J. 12: 601-606. O método se baseia na distribuição de DNA por arma de partícula contendo um marcador selecionável e no alvejamento do DNA no genoma de plastídeo através da recombinação homóloga. Adicionalmente, a transformação de plastídeo pode ser conseguida pela transativação de um transgene em plastídeo silencioso por expressão preferida em tecido de uma RNA polimerase direcionada a plastídeo e codificada nuclearmente. Tal sistema foi reportado em McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305.

Os ácidos nucleicos de interesse a serem alvejados ao cloroplasto podem ser otimizados para a expressão no cloroplasto para responder pelas diferenças no uso de códons entre o núcleo da planta e esta organela. Deste modo, os ácidos nucleicos de interesse podem ser sintetizados usando códons preferidos por cloroplasto. Ver, por exemplo, a Patente U.S. N2 5.380.831, aqui incorporada por referência.

Conforme aqui descrevedo, as sequências de nucleotideos AHASL1 da invenção encontram uso na intensificação da tolerância a herbicida de plantas que compreende em seus genomas um gene codificando uma proteína AHAS1 tolerante a herbicida. Tal gene pode ser um gene endógeno ou um transgene. Adicionalmente, em certas modalidades, as sequências de ácido nucléico da presente invenção podem ser empilhadas com qualquer combinação de sequências de polinucleotídeo de interesse para criar plantas com um fenótipo desejado. Por exemplo, os polinucleotideos codificando polipeptídeos com atividade pesticida e/ou inseticida, tal como, por exemplo, as proteínas da toxina de Bacillus thuringiensis (descrita nas Patentes Americanas N2S 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881; e Geiser et al. (1986) Gene 48:109). As combinações geradas também podem incluir várias cópias de qualquer um dos polinucleotideos de interesse.

É reconhecido que com essas sequências de nucleotideos, construções antissenso, complementares a pelo menos uma porção do RNA mensageiro (RNAm) para as sequências de polinucleotídeo AHASL1 podem ser construídas. Nucleotídeo antissenso são construídos para hibridizar com o RNAm correspondente. Modificações das sequências antissenso podem ser feitas, contanto que as sequências hibridizem para e interfiram com a expressão do RNAm correspondente. Deste modo, as construções antissenso com 70%, preferivelmente 80%, mais preferivelmente 85% de identidade de sequência com as sequências antissenso correspondentes podem ser usadas. Além disso as porções dos nucleotídeos antissenso podem ser usadas para romper a expressão do gene alvo. Geralmente, sequências de pelo menos 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos ou mais podem ser usadas.

As sequências de nucleotídeos da presente invenção também podem ser usadas na orientação de senso para suprimir a expressão dos genes endógenos nas plantas. Métodos para suprimir a expressão gênica nas plantas usando sequências de nucleotídeos na orientação de senso são conhecidos na técnica. Os métodos geralmente envolvem plantas transformadas com um constructo de DNA compreendendo um promotor que direciona a expressão em uma planta operativamente ligada a pelo menos uma porção de uma sequência de nucleotídeo que corresponda ao transcrito do gene endógeno. Tipicamente, tal sequência de nucleotídeo tem identidade de sequência substancial com a sequência do transcrito do gene endógeno, preferivelmente de mais de 65% de identidade de sequência, mais preferivelmente de mais de cerca de 85% de identidade de sequência, mais prefe-rivelmente de mais de cerca de 95% de identidade de sequência. Ver as Patentes Americanas N-s 5.283.184 e 5.034.323; aqui incorporadas por referência.

Uma vez que os polinucleotídeo AHASL1 resistentes a herbicida da invenção encontram uso como genes marcadores selecionáveis para transformação vegetal, os cassetes de expressão da invenção podem incluir outro gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas. Genes marcadores selecionáveis, incluindo aqueles da presente invenção, são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Genes marcadores incluem, porém não estão limitados, aos genes que codificam resistência a antibiótico, tais como aqueles codificando neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), assim como genes que conferem resistência aos compostos herbicidas, tais como glufosinato de amónio, bromoxinila, imidazolinonas e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Ver de modo geral Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3: 506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71: 63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6: 2419-2422; Barkley et al. (1980) em The Operon, pp. 177220; Hu et al. (1987) Cell 48: 555-566; Brown et al (1987) Cell 49: 603-612; Figge et al (1988) Cell 52: 713-722; Deuschle et al (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 5400-5404; Fuerst et al (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2549-2553; Deuschle et al (1990) Science 248: 480-483; Gossen (1993) Tese de PhD, Universidade de Heidelberg; Reines et al (1993) Proc. Natl Acad. Sci. USA 90: 1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3952-3956; Bairn et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10: 143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27: 1094-1104; Bonin (1993) Tese de Ph.D., Universidade de Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36: 913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al. (1988) Nature 334:721-724. Tais descobertas são aqui incorporadas por referência.

A lista acima de genes marcadores selecionáveis não é tencionada a ser limitante. Qualquer gene marcador selecionável pode ser usado na presente invenção.

As moléculas de polinucleotídeo isoladas compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica as proteínas AHASL1 da invenção podem ser usadas em vetores para transformar plantas de modo que as plantas criadas apresentem resistência aumentada aos herbicidas, particularmente herbicidas de imidazolinona. As moléculas de polinucleotídeo AHAS1 isoladas da invenção podem ser usadas em vetores sozinhas ou em combinação com uma sequência de nucleotídeo codificando a subunidade pequena da enzima AHAS (AHASS) para conferir resistência a herbicida em plantas. Ver a Patente U.S. N6.348.643; a qual é aqui incorporada por referência.

Deste modo, a presente invenção fornece vetores de transformação compreendendo um gene marcador selecionável da invenção. O gene marcador selecionável compreende um promotor que direciona a expressão em uma célula hospedeira operativamente ligada a um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifique uma proteína AHASL resistente a herbicida da invenção. O vetor de transformação pode ainda compreender um gene de interesse a ser expresso na célula hospedeira e também pode, caso seja desejado, incluir uma sequência de alvejamento e cloroplasto que seja operativamente ligada ao polinucleotídeo da invenção.

A presente invenção ainda oferece métodos para usar os vetores de transformação da invenção para selecionar células transformadas com o gene de interesse. Tais métodos envolvem a transformação de uma célula hospedeira com o vetor de transformação, expondo a célula a um nível de herbicida de imidazolinona ou sulfonilureia que poderia matar ou inibir o crescimento de uma célula hospedeira não-transformada, e a identificação da célula hospedeira transformada por sua capacidade de crescer na presença do herbicida. Em uma modalidade da invenção, a célula hospedeira é uma célula vegetal e o gene do marcador selecionável compreende um promotor que direciona a expressão em uma célula vegetal.

Os vetores de transformação da invenção podem ser usados para produzir plantas transformadas com um gene de interesse. O vetor de transformação irá compreender um gene marcador selecionável da invenção e um gene de interesse a ser introduzido e tipicamente expresso na planta transformada. Tal gene marcador selecionável compreende um polinucleotídeo AHASL1 resistente a herbicida da invenção operativamente ligado a um promotor que direciona a expressão em uma célula hospedeira. Para uso em plantas e células vegetais, o vetor de transformação compreende um gene marcador selecionável compreendendo um polinucleotídeo AHASL1 resistente a herbicida da invenção operativamente ligado a um promotor que direciona a expressão em uma célula vegetal.

A invenção também se refere a um vetor de expressão vegetal compreendendo um promotor que direciona a expresso em uma planta operativamente ligada a uma molécula de polinucleotídeo isolada da invenção. A molécula de polinucleotídeo isolada compreende uma sequência de nucleotídeo codificando uma proteína AHASL1, particularmente uma proteína AHAS1 compreendendo uma sequência de aminoácidos que é estabelecida nas SEQ ID Nos: 2, 3, 4, 5 ou 6, ou um fragmento funcional e variante sua. O vetor de expressão vegetal da invenção não depende de um promotor particular, simplesmente pelo fato de que tal promotor é capaz de direcionar a expressão gênica em uma célula vegetal. Promotores preferidos incluem promotores constitutivos e promotores tecido-específicos.

Os genes de interesse da invenção variam dependendo do resultado desejado. Por exemplo, várias alterações no fenótipo podem ser interessantes, incluindo a modificação da composição de ácido graxo em uma planta, a alteração do conteúdo de aminoácido de uma planta, a alteração de mecanismos de defesa contra insetos e/ou patógenos de uma planta e semelhantes. Esses resultados podem ser alcançado pelo fornecimento da expressão dos produtos heterólogos de expressão aumentada dos produtos endógenos nas plantas. Alternativamente, os resultados podem ser conseguidos através do fornecimento para uma redução da expressão de um ou mais produtos endógenos, particularmente enzimas ou co-fatores na planta. Essas alterações resultam em uma mudança no fenótipo da planta transformada.

Em uma modalidade da invenção, os genes de interesse incluem genes de resistência a inseto tais como, por exemplo, gene da proteína de toxina de Bacillus thuringiensis (Patentes Americanas N2S 5.366.892; 5.747.450; 5.736.514; 5.723.756; 5.593.881; e Geiser et al. (1986) Gene 48:109).

As proteínas ou polipeptídeos AHASL1 da invenção podem ser purificadas, por exemplo, de plantas Brassicae podem ser usadas nas composições. Também uma molécula de polinucleotídeo isolada codificando uma proteína AHASL1 da invenção pode ser usada para expressar uma proteína AHALS1 da invenção em um micróbio, tal como E. coli ou levedura. A proteína AHASL1 expressa pode ser purificada a partir dos extratos de E. coli ou levedura por qualquer método conhecido pelas pessoas normalmente versadas na técnica.

A invenção também se refere a um método para criar uma planta transgênica que é resistente a herbicidas, compreendendo a transformação de uma planta com um vetor de expressão vegetal compreendendo um promotor que direciona a expressão em uma planta operativamente ligada a uma molécula de polinucleotídeo da invenção. A molécula de polinucleotídeo isolada compreende uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína AHASL1 da invenção, particularmente uma proteína AHASL1 compreendendo: a sequência de aminoácidos que é estabelecida nas SEQ ID Nos: 2, 3, 4, 5 ou 6, a sequência de aminoácidos codificada pelas SEQ ID Nos: 12, 13, 14, 15 ou 16 ou um fragmento funcional e variante das referidas sequências de aminoácidos.

A invenção também se refere às plantas Brassicanão-transgênicas produzidas pelos métodos da invenção, e a progenia e outros descendentes de tais plantas não-transgênicas e transgênicas, cujas plantas exibem resistência intensificada ou aumentada aos herbicidas que interferem com a enzima AHAS, particularmente herbicidas de imidazolinona e sulfonilureia.

Os polinucleotídeos AHASL1 da invenção, particularmente aqueles codificando proteínas AHASL1 resistentes a herbicida, encontram uso em métodos para aumentar a resistência de plantas tolerantes a herbicidas. Em uma modalidade da invenção, as plantas tolerantes a herbicida compreendem uma proteína AHASL resistente a herbicida ou tolerante a herbicida. As plantas tolerantes a herbicida incluem tanto plantas transformadas com sequências de nucleotídeos AHASL tolerantes a herbicida quanto plantas que compreendem em seus genomas um gene endógeno que codifica uma proteína AHASL tolerante a herbicida. Tal planta tolerante a herbicida pode ser uma planta tolerante a herbicida que tenha sido geneticamente modificada em relação à tolerância a herbicida ou uma planta tolerante a herbicida que tenha se desenvolvido através de meios que não envolvam DNA recombinante tais como, por exemplo, as plantas Brassicada presente invenção. Sequências de nucleotideos que codificam proteínas AHASL tolerantes a herbicida e plantas tolerantes a herbicida compreendendo um gene endógeno que codifique uma proteína AHASL tolerante a herbicida incluem os polinucleotideos e plantas da presente invenção e aqueles que são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, as Patentes Americanas N2S 5.013.659, 5.731.180, 5.767.361, 5.545.822, 5.736.629, 5.773.703, 5.773.704, 5.952.553 e 6.274.796; todas as quais sendo aqui incorporadas por referência. Tais métodos para aumentar a resistência de plantas tolerantes a herbicida compreendem a transformação de uma planta tolerante a herbicida com pelo menos um constructo de polinucleotídeo compreendendo um promotor que direciona a expressão em uma célula vegetal que é operativamente ligada a um polinucleotídeo AHASL1 resistente a herbicida da invenção, particularmente o polinucleotídeo codificando uma proteína AHASL1 resistente a herbicida estabelecida nas SEQ ID Nos: 12,13, 14, 15 ou 16, polinucleotideos codificando a sequência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID Nos: 2, 3, 4, 5 ou 6 e fragmentos e variantes dos referidos polinucleotideos que codificam polipeptídeos compreendendo atividade AHAS resistente a herbicida. Uma planta produzida por este método tem resistência aumentada a pelo menos um herbicida, em comparação com a planta resistente a herbicida antes da transformação com o constructo de polinucleotídeo da invenção.

Vários vetores de transformação vegetais e métodos para transformar plantas são disponíveis. Ver, por exemplo, An, G. et al. (1986) Plant Physiol, 81: 301-305; Fry, J., et al. (1987) Plant Cell Rep. 6: 321-325; Block, M. (1988) Theor. Appl Genet. 16: 161774; Hinchee, et al. (1990) Stadler. Genet. Symp. 203212.203-212; Cousins, et al. (1991) Aust. J. Plant Physiol. 18: 481-494; Chee, P. P. e Slightom, J. L. (1992) Gene.118: 255-260; Christou, et al. (1992) Trends. Biotechnol. 10: 239-246; D'Halluin, et al. (1992) Bio/Technol. 10: 309-314; Dhir, et al. (1992) Plant Physiol. 99: 81-88; Casas et al. (1993) Proc. Nat. Acad Sci.. USA 90: 11212-11216; Christou, P. (1993) In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant; 29P: 119-124; Davies, et al. (1993) Plant Cell Rep. 12: 180-183; Dong, J. A. e Mchughen, A. (1993) Plant Sci. 91: 139-148; Franklin, C. I. e Trieu, T. N. (1993) Plant. Physiol. 102: 167; Golovkin, et al. (1993) Plant Sci. 90: 41-52; Guo Chin Sci. Bull. 38: 2072-2078; Asano, et al. (1994) Plant Cell Rep. 13; Ayeres N. M. e Park, W. D. (1994) Crit. Rev. Plant. Sci. 13: 219-239; Barcelo, et al. (1994) Plant. J. 5: 583-592; Becker, et al. (1994) Plant. J. 5: 299-307; Borkowska et al. (1994) Acta. Physiol Plant. 16: 225-230; Christou, P. (1994) Agro. Food. Ind. Hi Tech. 5: 17-27; Eapen et al. (1994) Plant Cell Rep. 13: 582-586; Hartman, et al (1994) Bio-Technology 12: 919923; Ritala, et al. (1994) Plant. Mol. Biol. 24: 317-325; e Wan, Y. C. e Lemaux, P. G. (1994) Plant Physiol. 104: 3748.

Os métodos da invenção envolvem a introdução de um constructo de polinucleotídeo em uma planta. Por "introdução" tenciona-se apresentar à planta o constructo de polinucleotídeo de tal forma que o constructo ganhe acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos da invenção não dependem de um método particular para introduzir um constructo de polinucleotídeo em uma planta, somente pelo fato de que o constructo de poliucleotídeo ganha aceso ao interior de pelo menos uma célula vegetal. Métodos para introduzir constructos de polinucleotídeo em plantas são conhecidos na técnica incluindo, porém sem se limitar, aos métodos de transformação estáveis, métodos de transformação transientes e métodos mediados por vírus.

Por "transformação estável" se entende que o constructo de polinucleotídeo introduzido em uma planta integra no genoma da planta e é capaz de ser herdado por sua progenia. Por "transformação transiente"se entende que um constructo de polinucleotídeo introduzido em uma planta não integra no genoma da planta.

Para a transformação de plantas e células vegetais, as sequências de nucleotídeos da invenção são inseridas usando técnicas-padrão em qualquer vetor conhecido na técnica que seja adequado para a expressão das sequências de nucleotídeo em uma planta ou célula vegetal. A seleção do vetor depende da técnica de transformação preferida e das espécies de planta alvo a serem transformadas. Em uma modalidade da invenção, uma sequência de nucleotídeo AHASL1 é operativamente ligada a um promotor vegetal que é conhecido pelo alto nível de expressão em uma célula vegetal, e este constructo é então introduzido em uma planta que é suscetível a um herbicida imidazolinona e uma planta transformada é regenerada. A planta transformada é tolerante à exposição até um nível de um herbicida de imidazolinona que poderia matar ou prejudicar significativamente uma planta nãotransformada. Este método pode ser aplicado a qualquer espécie vegetal; entretanto, é mais benéfico quando aplicado em espécies de safra, particularmente plantas de safra que crescem tipicamente na presença de pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida de imidazolinona.

Metodologias para construir cassetes de expressão vegetais e introduzir ácidos nucleicos estrangeiros nas plantas são geralmente conhecidos na técnica e foram anteriormente descritos. Por exemplo, DNA estrangeiro pode ser introduzido nas plantas, usando vetores de plasmídeo (Ti) indutores de tumor. Técnicas de transformação à base de Agrobacterium são bem-conhecidas na técnica. A cepa de Agrobacterium(por exemplo, Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes) compreende um plasmídeo (plasmídeo Ti ou Ri) e um elemento de T-DNA o qual é transferido para a planta após a injeção com Agrobacterium.O T-DNA (DNA transferido) é integrado no genoma da célula vegetal. O T-DNA pode ser localizado no plasmídeo Ri ou Ti ou está separadamente compreendido em um chamado vetor binário. Métodos para a transformação mediada por Agrobacterium são descritos, por exemplo, em Horsch RB et al. (1985) Science 225:1229f. A transformação mediada por Agrobacteriumpode ser usada tanto em plantas dicotiledôneas quanto em plantas monocotiledôneas. A transformação de plantas por agrobactérias é descrita em White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; em Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editado por S. D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38; Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, em: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editado por S. D. Kung e R. Wu, Academic Press, pp. 128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42: 205-225. Outros métodos utilizados para a distribuição de

DNA estrangeiro envolvem o uso de transformação, de protoplasto mediada por PEG, eletroporação, microinjeção de whiskerse bombardeamento com microprojétil ou biolístico para a absorção direta de DNA. Tais métodos são conhecidos na técnica (Patente U.S. N2 5.405.765 para Vasil et al; Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al, (1991) Mol Gen. Genet, 228: 104-112; Guerche et al, (1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause et al, (1987) Theor. Appl Genet. 75: 30-36; Klein et al, (1987) Nature 327: 70-73; Howell et al, (1980) Science 208:1265; Horsch et al, (1985) Science 227: 1229-1231; DeBlock et al, (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach e Weissbach, eds.) Academic Press, Inc. (1988) e Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press, Inc. (1989). O método de transformação depende da célula vegetal a ser transformada, da estabilidade dos vetores usados, do nivel de expressão dos produtos de gene e de outros parâmetros.

Outros métodos adequados de introdução de sequências de nucleotideos em células vegetais e a subsequente inserção no genoma vegetal incluem microinjeção como Crossway et al (1986) Biotechniques 4:320-334, eletroporação conforme descrito por Riggs et al (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606, Transformação mediada por Agrobacteriumconforme descrito por Townsend et al, Patente U.S. N2 5.563.055, Zhao et al, Patente U.S. N2 5.981.840, transferência de gene direto conforme descrito por Paszkowski et al (1984) EMBO J. 3: 2717-2722, e aceleração de partícula balística conforme descrito, por exemplo, em Sanford et al, Patente U.S. N2 4.945.050; Tomes et al, Patente U.S. N2 5.879.918; Tomes et al, Patente U.S. N2 5.886.244; Bidney et al, Patente U.S. N2 5.932.782; Tomes et al (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bom-bardment", em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al (1988) Biotechnology 6:923-926); e transformação de Led (WO 00/28058). Também ver Weissinger et al (1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421-477; Sanford et al (1987) Paniculate Science and Technology 5:27-37 (cebola); Christou et al (1988) Plant Physiol. 87: 671-674 (soja); McCabe et al (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer e McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (soja); Singh et al (1998) Theor. Appl Genet. 96:319-324 (soja); Datta et al (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309 (milho); Klein et al (1988) Biotechnology 6: 559-563 (milho); Tomes, Patente U.S. Ns 5.240.855; Buising et al, Patentes Americanas N-s 5.322.783 e 5.324.646; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (SpringerVerlag, Berlin) (milho); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91: 440444 (milho); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8: 833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (Londres) 311: 763-764; Bowen et al, Patente U.S. Ns 5.736.369 (cereais); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, Nova Iorque), pp. 197-209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 e Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84: 560-566 (transformação mediada por whisker); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505 (eletroporação); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12: 250-255 e Christou e Ford (1995) Annals of Botany 75: 407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750 (milho através de Agrobacteηum tumefaciens);todos os quais sendo aqui incorporados por referência.

Os polinucleotídeos da invenção podem ser introduzido nas plantas através do contado das plantas com um vírus ou ácidos nucleicos virais. Geralmente, tais métodos envolvem a incorporação de um constructo de polinucleotídeo da invenção em uma molécula de DNA ou RNA virai. É reconhecido que a proteína AHASL 1 da invenção pode ser inicialmente sintetizada como parte de uma poliproteína viral, a qual pode ser posteriormente processada por proteólise in vivo ou in vitropara produzir a proteína recombinante desejada. Além disso, é reconhecido que os promotores da invenção também englobam promotores utilizados para a transcrição por RNA polimerases virais. Métodos para introduzir constructos de polinucleotídeo em plantas e expressão e uma proteína ali codificada envolvendo moléculas de DNA ou RNA viral são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, as Patentes Americanas Nss 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367 e 5.316.931; aqui incorporadas por referência.

As células que foram transformadas podem crescer em plantas de acordo com vias convencionais. Ver, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Essas plantas podem então crescer, e polinizar com cepas transformadas iguais ou com cepas diferentes, o híbrido resultante apresentando a expressão constitutiva da característica fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem crescer para assegurar que a expressão da característica fenotípica desejada seja mantida de modo estável e herdada e a seguir as sementes colhidas para assegurar que a expressão da característica fenotípica desejada tenha sido alcançada. Deste modo, a presente invenção fornece sementes transformadas (também referidas como "sementes transgênicas") com um constructo de polinucleotídeo da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, estavelmente incorporado nos seus genomas.

A presente invenção pode ser usada para a transformação de qualquer espécie vegetal incluindo, porém sem se limitar, às monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos de espécies de plantas de interesse incluem, porém não estão limitadas, às plantas produtoras de milho ou milho amarelo, Brassicasp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquelas espécies de Brassicaúteis como fontes de óleo de semente, alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale),sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare),painço (por exemplo, painço granulado (Pennisetum glaucum), painço proso (Panicum miliaceum), painço rabode-raposa (Setaria italica), painço de dedo (Eleusine coracana)), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum, T. Turgidum ssp. durum),soja (Glycine max),tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solatium tuberosum),amendoim (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata-doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), árvores cítricas (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao),chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.),abacate (Persea americana), figo (Ficus casica),goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), azeitona (Olea europaea),mamão (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia),amêndoa (Prunus amygdalus),beterraba (Beta vulgaris),cana-de-açúcar (Saccharum spp.),aveias, cevadas, vegetais, plantas ornamentais e coníferas. Preferivelmente, plantas da presente invenção são plantas de safra (por exemplo, plantas de girassol, Brassica sp., algodão, cana-de-açúcar, beterraba, soja, amendoim, alfafa, cártamo, tabaco, milho, arroz, trigo, centeio, cevada, triticale, sorgo, pinço, etc.).

As plantas resistentes a herbicida da invenção encontram uso em métodos para controle de ervas daninhas. Deste modo, a presente invenção ainda fornece um método para o controle de ervas daninhas na vizinhança de uma planta resistente a herbicida da invenção. O método compreende a aplicação de uma quantidade eficaz de um herbicida às ervas da-ninhas e à planta resistente a herbicida, em que a planta tem resistência aumentada a pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida de imidazolinona ou sulfonilureia, em comparação com uma planta tipo selvagem. Em tal método de controle de ervas daninhas, as plantas resistentes a herbicida da invenção são preferivelmente plantas de safra incluindo, porém sem se limitar, às plantas de girassol alfafa, Brassica sp., soja, algodão, cártamo, amendoim, tabaco, tomate, batata, trigo arroz, milho, sorgo, cevada, centeio, painço e sorgo.

Ao fornecer plantas com resistência aumentada aos herbicidas, particularmente herbicidas de imidazolinona e sulfonilureia, uma ampla variedade de formulações pode ser empregada para proteger plantas de ervas daninhas, de modo a intensificar o crescimento vegetal e reduzir a competição por nutrientes. Um herbicida pode ser usado por si só em situações préemergência, pós-emergência, pré-plantio e no controle do plantio de ervas daninhas em áreas ao redor das plantas aqui descritas ou uma formulação herbicida de imidazolinona pode ser usada que contenha outros aditivos. O herbicida também pode ser usado como um tratamento para sementes. Esta é uma concentração eficaz do herbicida, ou uma composição compreendendo uma concentração eficaz de uma quantidade eficaz do herbicida pode ser aplicada diretamente nas sementes antes de ou durante a semeadura das sementes. Aditivos encontrados em uma formulação ou composição herbicida de imidazolinona ou sulfonilureia incluem outros herbicidas, detergentes, adjuvantes, agentes de espalhamento, agentes de fixação, agentes estabilizantes ou semelhantes. A formulação herbicida pode ser uma preparação seca ou úmida e pode incluir, porém não está limitada, aos pós com capacidade de fluxo, concentrados emulsificáveis e concentrados líquidos. Os her-bicidas e as formulações herbicidas podem ser aplicadas de acordo com métodos convencionais, por exemplo, por pulverização, irrigação, polvilhamento, revestimento e semelhantes.

A presente invenção fornece métodos que envolvem o uso de um herbicida inibidor de AHAS. Nestes métodos, o herbicida inibidor de AHAS pode ser aplicado por qualquer método conhecido na técnica incluindo, porém sem se limitar, ao tratamento de sementes, tratamento do solo e tratamento foliar.

A presente invenção fornece métodos para aumentar a tolerância ou resistência de uma planta, tecido vegetal, célula vegetal ou outra célula hospedeira a pelo menos um herbicida que interfira com a atividade da enzima AHAS. Preferivelmente, tal herbicida inibidor de AHAS é um herbicida de imidazolinona, um herbicida de sulfonilureia, um herbicida de triazolopirimidina, um herbicida de pirimidiniloxibenzoato, um herbicida de sulfonilaminocarboniltriazolinona ou uma mistura desses. Mais preferivelmente, tal herbicida é um herbicida de imidazolinona, um herbicida de sulfonilureia ou uma mistura desses. Para a presente invenção, os herbicidas de imidazolinona incluem, porém não estão limitados, a PURSUIT® (imazetapir), CADRE® (imazapic), RAPTOR® (imazamox), SCEPTER® (imazaquin), ASSERT® (imazetabenz), ARSENAL® (imazapir), um derivado de qualquer um dos herbicidas anteriormente mencionados e uma mistura de dois ou mais dos herbicidas anteriormente mencionados, por exemplo, imazapir/imazamox (ODYSEY®). Mais especificamente, o herbicida de imidazolinona pode ser selecionado de, porém não está limitado, ao ácido 2-(4-isopropil-4-metila-5-oxo-2-imidiazolin-2-il)-nicotínico, ácido [2-(4-isopropil)-4-][metila-5-oxo-2-imidazolin-2-il)3-quinolinocarboxílico], ácido [5-etil-2-(4-isopropil-]4-metila-5-oxo-2-imidazolin -2-il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metila-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)-nicotínico, ácido [2-(4-isopropil-4-metila-5-oxo-2-]imidazolin-2-il)-5metilnicotínico e uma mistura de [6-(4-isopropil-4-]metila-5-oxo-2-imidazolin2-il)-m-toluato de metila e [2-(4-isopropil-4-metila-5-]oxo-2-imidazolin-2-il)-ptoluato de metila. O uso de ácido 5-etil-2-(4-isopropil-4-metila-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico e ácido [2-(4-isopropil-4-metila-5-oxo-2-imidazolin-2-]il)5-(metoximetil)-nicotínico é preferido. O uso de ácido [2-(4-isopropil-4-]metila -5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)-nicotínico é particularmente preferido.

Para a presente invenção, os herbicidas de sulfonilureia incluem, porém não estão limitados, a clorsulfuron, metsulfuron metila, sulfometuron metila, clorimuron etila, tifensulfuron metila, tribenuron metila, bensulfuron metila, nicossulfuron, etametsulfuron metila, rimsulfuron, triflussulfuron metila, triassulfuron, primissulfuron metila, cinossulfuron, amidossulfuron, fluzassulfuron, imazossulfuron, pirazossulfuron etila, halossulfuron, azimsulfuron, ciclossulfuron, etoxissulfuron, flazassulfuron, flupirsulfuron metila, foramsulfuron, iodossulfuron, oxassulfuron, mesossulfuron, prossulfuron, sulfossulfuron, trifloxissulfuron, tritossulfuron, um derivado de qualquer um dos herbicidas anteriormente mencionados e uma mistura de dois ou mais dos herbicidas anteriormente mencionados. Os herbicidas de triazolopirimidina da invenção incluem, porém não estão limitados, a cloransulam, diclossulam, florassulam, flumetsulam, metossulam e penoxsulam. Os herbicidas de pirimidiniloxibenzoato da invenção incluem, porém não estão limitados, a bispiribac, piritiobac, piriminobac, piribenzoxim e piriftalid. Os herbicidas de sulfonaminocarboniltriazolinona incluem, porém não estão limitados, a flucarbazona e propoxicarbazona.

Sabe-se que os herbicidas de pirimidiniloxibenzoato estão intimamante relacionados com os herbicidas de pirimidiniltiobenzoato e são generalizados pelo título do último nome pela Weed Science Society of America. Concordantemente, os herbicidas da presente invenção ainda incluem herbicidas de pirimidiniltiobenzoato incluindo, porém sem se limitar, aos herbicidas de pirimidiniloxitiobenzoato descritos acima.

Antes da aplicação, o herbicida inibidor de AHAS pode ser convertido nas formulações habituais, por exemplo, soluções, emulsões, suspensões, poeiras, pós, pastas e grânulos. A forma de uso depende do propósito tencionado particular; em cada caso, ele deve assegurar uma fina e homogênea distribuição do composto de acordo com a invenção.

As formulações são preparadas de modo conhecido (ver, por exemplo, por revisão US 3.060.084, EP-A 707 445 (para concentrados líquidos), Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering, 4 de dezembro de 1967, 147-48, Perry's Chemical Engineer's Handbook, 4aEd., McGraw-Hill, Nova Iorque, 1963, páginas 8-57 e em seq. WO 91/13546, US 4.172.714, US 4.144.050, US 3.920.442, US 5.180.587, US 5.232.701, US 5.208.030, GB 2.095.558, US 3.299.566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., Nova Iorque, 1961, Hance et al, Weed Control Handbook, 8a Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989 e Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Alemanha), 2001, 2. D. A. Knowles, Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998 (ISBN 0-75140443-8), por exemplo, pela adição do composto ativo com adjuvantes ade-quados para a formulação dos agroquímicos, tais como solventes e/ou veículos, emulsificantes caso seja desejado, tensoativos e dispersantes, conservantes, agentes antiespumantes, agentes anticongelantes para formulações de tratamento de sementes e também opcionalmente corantes e/ou ligantes e/ou agentes gelificantes.

Exemplos de solventes adequados são água, solventes aromáticos (por exemplo produtos Solvesso, xileno), parafinas (por exemplo, frações de óleo mineral), alcoóis (por exemplo, metanol, butanol, pentanol, álcool benzílico), cetonas (por exemplo, ciclo-hexanona, gama-butirolactona), pirrolidonas (NMP, NOP), acetatos (glicol diacetato), glicóis, dimetilamidas do ácido graxo, ácidos graxos e ésteres de ácido graxo. A princípio, misturas de solventes também podem ser usadas.

Exemplos de veículos aequados são minerais naturais moídos (por exemplo caulins, argilas, talco, giz) e minerais sintéticos moídos (por exemplo sílica altamente dispersa, silicatos).

Emulsificantes adequados são emulsificantes não-iônicos e aniônicos (por exemplo, éteres de álcool graxo de polioxietileno, alquilsulfonatos e arilsulfonatos). Exemplos de dispersantes são líquidos de rejeito de lignina-sulfito e metilcelulose.

Tensoativos adequados usados são metal alcalino, metal alcalino-terroso e sais de amónio do ácido ligninossulfônico, ácido naftalenossulfônico, ácido fenolsulfônico, ácido dibutilnaftalenossulfônico, alquilarilsulfonatos, alquilsulfatos, alquilsulfonatos, sulfatos de ácido graxo, ácidos graxos e éteres do álcool glicólico graxo sulfatado, além disso condensates de naftaleno sulfonado e derivados de naftaleno com formaldeído, condensados de naftaleno ou de ácido naftalenossulfônico com fenol e formaldeído, éter de polioxietileno-octilfenol, iso-octilfenoletoxilado, octilfenol, nonilfenol, éteres de alquilfenolpoliglicol, éter de tributilfenilpoliglicol, éter de triestearilfenilpoliglicol, alcoóis alquilarilpoliéter, álcool e condensados de óxido de etileno e álcool graxo, óleo de rícino etoxilado, éteres de polioxietilenoalquila, polioxipropileno de etoxilado, acetal de poliglicoléter de álcool laurílico, ésteres de sorbitol, líquidos de rejeito de lignossulfito e metilcelulose.

Substâncias as quais são adequadas para o preparo de soluções diretamente pulverizáveis, emulsões, pastas ou dispersões em óleo são frações de óleo mineral de ponto de ebulição médio a alto, tais como querosene ou óleo diesel, além disso óleos de alcatrão de hulha e óleos de origem vegetal ou animal, hid rocarbonetos alifáticos, cíclicos e aromáticos, por exemplo tolueno, xileno, parafina, tetra-hidronaftaleno, naftalenos alquilados ou seus derivados, metanol, etanol, propanol, butanol, ciclo-hexanol, ciclo-hexanona, isoforona, solventes altamente polares, por exemplo dimetilsulfóxido, N-metilpirrolidona ou água.

Agentes anticongelantes tais como glicerina, etilenoglicol, propilenoglicol e bactericidas como tais podem ser adicionados à formulação. Agentes antiespumantes adequados são, por exemplo, agentes antiespumantes à base de silício ou estearato de magnésio. Formulações de tratamento de sementes podem compreender adicionalmente ligantes e opcionalmente corantes.

Ligantes podem ser adicionados para melhorar a adesão dos materiais ativos nas sementes depois do tratamento. Ligantes adequados são tensoativos EO/PO de copolímeros em bloco, mas também são alcoóis polivinílicos, polivinilpirolidonas, poliacrilatos, polimetacrilatos, polibutenos, poli-isobutilenos, poliestireno, polietilenaminas, polietilenamidas, polietileniminas (Lupasol®, Polymin®), poliéteres, poliuretanos, acetato de polivinila, tilose e copolímeros derivados desses polímeros.

Opcionalmente, todos os corantes podem ser incluídos na formulação. Corantes ou tinturas adequadas para formulações de tratamento de semente são Rodamina B, Pigmento Vermelho 112 C.I., Solvente Vermelho 1 C.I., pigmento azul 15:4, pigmento azul 15:3, pigmento azul 15:2, pigmento azul 15:1, pigmento azul 80, pigmento amarelo 1, pigmento amarelo 13, pigmento vermelho 112, pigmento vermelho 48:2, pigmento vermelho 48:1, pigmento vermelho 57:1, pigmento vermelho 53:1, pigmento laranja 43, pigmento laranja 34, pigmento laranja 5, pigmento verde 36, pigmento verde 7, pigmento branco 6, pigmento marrom 25, violeta básico 10, violeta básico 49, vermelho ácido 51, vermelho ácido 52, vermelho ácido 14, azul ácido 9, amarelo ácido 23, vermelho básico 10, vermelho básico 108.

Um exemplo de um agente gelificante adequado é carragena (Satiagel®). Pós, materiais para espalhamento e produtos polvilháveis podem ser preparados pela mistura ou moagem concomitante das substâncias ativas com um veículo sólido.

Grânulos, por exemplo grânulos revestidos, grânulos impregnados e grânulos homogêneos podem ser preparados pela ligação dos compostos ativos nos veículos sólidos. Exemplos de veículos sólido são terras minerais tais como sílica-géis, silicates, talco, caulim, terra fuler, calcário, cal, giz, argila friável, loesse, argila, dolomita, terra diatomácea, sulfato de cálcio, sulfato de magnésio, óxido de magnésio, materiais sintéticos moídos, fertilizantes, tais como por exemplo, sulfato de amónio, fosfato de amónio, nitrato de amónio, ureias e produtos de origem vegetal, tais como farinha de cereal, farinha de casca de árvore, farinha de madeira e farinha de casca de noz, pós de celulose e outros veículos sólidos.

Em geral, as formulações compreendem de 0,01 a 95% em peso, preferivelmente de 0,1 a 90% em peso do herbicida inibidor de AHAS. Neste caso, os herbicidas inibidores de AHAS são empregados com uma pureza de 90% a 100% em peso, preferivelmente de 95% a 100% em peso (de acordo com o espectro de RMN). Para fins de tratamento de semente, as respectivas formulações podem ser diluídas de 2 a 10 vezes levando às concentrações nas preparações prontas para uso de 0,01 a 60% em peso de composto ativo por peso, preferivelmente de 0,1 a 40% em peso.

O herbicida inibidor de AHAS pode ser usado como tal, na forma de suas formulações ou nas formas de uso preparadas a partir daí, por exemplo, na forma de soluções diretamente pulverizáveis, pós, suspensões ou dispersões, emulsões, dispersões oleosas, pastas, produtos polvilháveis, materiais para espalhamento ou grânulos, através de pulverização, atomização, polvilhamento, espalhamento ou despejamento. As formas de uso dependem totalmente dos propósitos tencionados; elas são tencionadas a assegurar em cada caso a distribuição mais fina possível do herbicida inibidor de AHAS de acordo com a invenção.

Formas de uso aquosas podem ser preparadas a partir de concentrados de emulsão, pastas ou pós umedecíveis (pós pulverizáveis, dispersões oleosas) pela adição de água. Para preparar emulsões, pastas ou dispersões oleosas, as substâncias, como tais ou dissolvidas em um óleo ou solvente, podem ser homogeneizadas em água através de um umidificante, aderente, dispersante ou emulsificante. Entretanto, também é possível preparar concentrados compostos de substância ativa, umidificante, aderente, dispersante ou emulsificante e, caso apropriado, solvente ou óleo, e tais concentrados são adequados para diluição com água.

As concentrações de composto ativo nas preparações prontas para uso podem variar dento de faixas relativamente amplas. Em geral, elas variam de 0,0001 a 10%, preferivelmente de 0,01 a 1% em peso.

O herbicida inibidor de AHAS pode também ser usado com sucesso no processo de volume ultrabaixo (ULV), sendo possível aplicar formulações compreendendo mais de 95% em peso de composto ativo, ou mesmo aplicar o composto ativo sem aditivos.

A seguir estão exemplificados exemplos de formulações: 1. Produtos para diluição com água para aplicações foliares. Para fins de tratamento de sementes, tais produtos podem ser aplicados à semente diluída ou não-diluída. A) Concentrados solúveis em água (SL, LS) Dez partes em peso de herbicida inibidor de AHAS são dissolvidas em 90 partes em peso de água ou um solvente solúvel em água. Como alternativa, umidificantes ou outros adjuvantes são adicionados. O herbicida inibidor de AHAS se dissolve na diluição com água, por meio do que uma formulação com 10% (p/p) de herbicida inibidor de AHAS é obtida. B) Concentrados dispersáveis (DC) Vinte partes em peso de herbicida inibidor de AHAS são dissolvidas em 70 partes em peso de ciclo-hexanona com adição de 10 partes em peso de um dispersante, por exemplo, polivinilpirrolidona. A diluição com água produz uma dispersão, por meio da qual uma formulação com 20% (p/p) de herbicida inibidor de AHAS é obtida. C) Concentrados Emulsificávéis (EC) Quinze partes em peso de herbicida inibidor de AHAS são dissolvidas em 7 partes em peso de xileno com adição de dodecilbenzenossulfonato de cálcio e etoxilato de óleo de rícino (em cada caso 5 partes em peso). A diluição com água produz uma emulsão, por meio da qual uma formulação com 15% (p/p) de herbicida inibidor de AHAS é obtida. D) Emulsões (EW, EO, ES) Vinte e cinco partes em peso de herbicida inibidor de AHAS são dissolvidas em 35 partes em peso de xileno com adição de dodecilbenzenossulfonato de cálcio e etoxilato de óleo de rícino (em cada caso 5 partes em peso). Essa mistura é introduzida em 30 partes em peso de água através de um emulsificador (por exemplo, Ultraturrax) e composta em uma emulsão homogênea. A diluição com água produz uma emulsão, por meio da qual uma formulação com 25% (p/p) de herbicida inibidor de AHAS é obtida. E) Suspensões (SC, OD, FS) Em um moinho de bolas agitado, 20 partes em peso de herbicida inibidor de AHAS são cominuídas com a adição de 10 partes em peso de dispersantes, umidificantes e 70 partes em peso de água ou de um solvente orgânico para produzir uma suspensão herbicida inibidora de AHAS fina. A diluição com água produz uma suspensão estável de herbicida inibidor de AHAS, por meio do que uma formulação com 20% (p/p) de herbicida inibidor de AHAS é obtida. F) Grânulos dispersáveis em água e grânulos solúveis em água (WG, SG) Cinquenta partes em peso de herbicida inibidor de AHAS são moídas finamente com a adição de 50 partes em peso de dispersantes e umidificantes e feitas como grânulos dispersáveis em água ou solúveis em água através de dispositivos técnicos (por exemplo extrusâo, torre de pulverização, leito fluidizado). A diluição com água produz uma dispersão ou solução estável do herbicida inibidor de AHAS, por meio do que uma formulação com 50% (p/p) de herbicida inibidor de AHAS é obtida. G) Pós dispersáveis em água e pós solúveis em água (WP, SP, SS, WS) Setenta e sete partes em peso do herbicida inibidor de AHAS são moídas em um moinho rotor-estator com a adição de 25 partes em peso de dispersantes, umidificantes e sílica-gel. A diluição com água produz uma dispersão ou solução estável do herbicida inibidor de AHAS, por meio do que uma formulação com 75% (p/p) de herbicida inibidor de AHAS é obtida. I) Formulação em Gel (GF) Em um moinho de bolas agitado, 20 partes em peso de herbicida inibidor de AHAS são cominuídas com a adição de 10 partes em peso de dispersantes, 1 parte em peso de um umidificante de agente gelificante e 70 partes em peso de água ou de um solvente orgânico para produzir uma suspensão herbicida inibidora de AHAS. A diluição com água produz uma suspensão estável do herbicida inibidor de AHAS, por meio do que uma formulação com 20% (p/p) de herbicida inibidor de AHAS é obtida. Esta formulação em gel é adequada para uso como tratamento de semente. 2. Produtos a serem aplicados não-diluídos para aplicações foliares. Para fins de tratamento de semente, tais produtos podem ser aplicados à semente diluída. A) Pós polvilháveis (DP, DS) Cinco partes em peso do herbicida inibidor de AHAS são finamente moídas e misturadas intimamente com 95 partes em peso de caulim finamente dividido. Isto produz um pó polvilhável com 5% (p/p) de herbicida inibidor de AHAS. B) Grânulos (GR, FG, GG, MG)

Meia parte em peso do herbicida inibidor de AHAS é finamente moída e associada com 95,5 partes em peso de veículos, por meio do que uma formulação com 0,5% (p/p) de herbicida inibidor de AHAS é obtida. Os métodos atuais são extrusão, atomização ou leito fluidizado. Isto produz grânulos a serem aplicados de modo não-diluído para uso foliar.

Formulações de tratamento de semente convencionais incluem, por exemplo, concentrados fluíveis FS, soluções LS, pós para tratamento DS, pó dispersáveis em água para tratamento em pasta WS, pós solúveis em água SS e emulsão ES e EC e formulação em gel GF. Essas formulações podem ser aplicadas â semente diluída ou não-diluída. A aplicação às sementes é efetuada antes da semeadura, ou diretamente nas sementes.

Em uma modalidade preferida, uma formulação FS é usada para tratamento de semente. Tipicamente, uma formulação FS pode compreender de 1 a 800 g/L de ingrediente ativo, de 1 a 200 g/L de tensoativo, de 0 a 200 g/L de agente anticongelante, de 0 a 400 g/L de ligante, de 0 a 200 g/L de um pigmento e até 1 litro de solvente, preferivelmente água.

A presente invenção fornece sementes não-transgênicas e transgênicas das plantas resistentes a herbicidas da presente invenção. Tais sementes incluem, por exemplo, sementes Brassicanão-transgênicas compreendendo as características resistentes a herbicida da planta de J05Z-07801, J04E-0139, J04E-0130 ou J04E-0122, e sementes transgênicas compreendendo uma molécula de polinucleotídeo da invenção que codifica uma proteína AHASL1 resistente a herbicida.

Para tratamento de sementes, as sementes das plantas resistentes a herbicida de acordo com a presente invenção são tratadas com herbicidas, preferivelmente herbicidas selecionados do grupo consistindo em herbicidas inibidores de AHAS tais como amidossulfuron, azimsulfuron, bensulfuron, clorimuron, clorsulfuron, cinossulfuron, ciclossulfamuron, etametsulfuron, etoxissulfuron, flazassulfuron, flupirsulfuron, foramsulfuron, halossulfuron, imazossulfuron, iodossulfiiron, mesossulfuron, metsulfuron, nicossulfuron, oxassulfuron, primissulfuron, prossulfuron, pirazossulfuron, rimsulfuron, sulfometuron, sulfossulfuron, tifensulfluron, triassulfuron, tribenuron, trifloxissulfuron, triflussulfuron, tritossulfuron, imazametabenz, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin, imazetapir, cloransulam, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam, penoxsulam, bispiribac, piriminobac, propoxicarbazona, flucarbazona, piribenzoxim, piriftalid, piritiobac e misturas suas, ou com uma formulação compreendendo um herbicida inibidor AHAS.

O termo tratamento de semente compreende todas as técnicas de tratamento de semente adequadas conhecidas na técnica, tal como adubação de semente, revestimento de semente, polvilhamento de semente, molhadura de semente e peletização de semente.

De acordo com uma variante da presente invenção, um outro assunto da invenção é um método de tratamento de solo pela aplicação, particularmente na semeadeira de semente: qualquer um dentre uma formulação granular contendo o herbicida inibidor de AHAS como uma composição/formulação, por exemplo, uma formulação granular, com opcionalmente um ou mais dentre veículos agricolamente aceitáveis sólidos ou líquidos, e/ou opcionalmente com um ou mais tensoativos agricolamente aceitáveis. Este método é vantajosamente empregado, por exemplo, em leitos de sementes de cereais, milho, algodão e girassol.

A presente invenção também engloba sementes revestidas com ou contendo uma formulação de tratamento de semente compreendendo pelo menos um inibidor ALS selecionado do grupo consistindo em amidossulfuron, azimsulfuron, bensulfuron, clorimuron, clorsulfuron, cinossulfuron, ciclossulfamuron, etametsulfuron, etoxissulfuron, flazassulfuron, flupirsulfuron, foramsulfuron, halossulfuron, imazossulfuron, iodossulfuron, mesossulfuron, metsulfuron, nicossulfuron, oxassulfuron, primissulfuron, prossulfuron, pirazossulfuron, rimsulfuron, sulfometuron, sulfossulfuron, tifensulfluron, triassulfuron, tribenuron, trifloxissulfuron, triflussulfuron, tritossulfuron, imazametabenz, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin, imazetapir, cloransulam, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam, penoxsulam, bispiribac, piriminobac, propoxicarbazona, flucarbazona, piribenzoxim, piriftalid, piritiobac.

O termo semente engloba sementes e botões de plantas de todos os tipos incluindo, porém sem se limitar, Às sementes verdadeiras, peças de sementes, brotos, caules subterrâneos, bulbos, frutas, túberos, grãos, cortes, brotos de corte e semelhantes e meios em uma modalidade preferida de sementes verdadeiras.

O termo "revestido com e/ou contendo" geralmente significa que o ingrediente ativo está, para a maior parte, na superfície do produto de propagação no momento da aplicação, embora uma parte maior ou menor de ingrediente possa penetrar no produto de propagação, dependendo do método de aplicação. Quando o referido produto de propagação é (re)plantado, ele pode absorver o ingrediente ativo.

A aplicação de tratamento de semente com o herbicida inibidor de AHAS ou com uma formulação compreendendo o herbicida inibidor de AHAS é efetuado por pulverização ou polvilhamento das sementes antes de semear as plantas e antes da emergência das plantas.

No tratamento de sementes, as formulações correspondentes são aplicadas pelo tratamento das sementes com uma quantidade eficaz de herbicida inibidor de AHAS ou uma formulação compreendendo o herbicida inibidor de AHAS. Aqui, as taxas de aplicação variam geralmente de 0,1 g a 10 Kg de a.i. (ou da mistura de a.i. ou da formulação) por 100 Kg de semente, preferivelmente de 1 g a 5 Kg por 100 Kg de semente, particularmente de 1 g a 2,5 Kg por 100 Kg de semente. Para safras específicas tais como alface, a taxa pode ser ainda maior.

A presente invenção fornece um método para combater vegetação indesejável ou ervas daninhas compreendendo o contato das sementes das plantas resistentes de acordo com a presente invenção antes de semear e/ou após pré-germinar com um herbicida inibidor de AHAS. O método pode ainda compreender a semeadura das sementes, por exemplo, em solo em um campo ou em um meio de plantio em vasos em estufa. O método encontra uso particular no combate da vegetação indesejada ou no controle de ervas daninhas na vizinhança imediata da semente.

O controle da vegetação indesejável é entendido como significando a morte das ervas daninhas e/ou, de outro modo, o retardo ou inibição do crescimento normal das ervas daninhas. Ervas daninhas, no senso mais amplo, são entendidas como significando todas aquelas plantas que crescem em locais onde elas são indesejáveis.

As ervas daninhas da presente invenção incluem, por exemplo, ervas daninhas dicotiledôneas e monocotiledôneas. Ervas daninhas dicotiledôneas incluem, porém não estão limitadas, às ervas daninhas do gênero: Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus, e Taraxacum. Ervas daninhas monocotiledôneas incluem, porém não estão limitadas, às ervas daninhas dos gêneros: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus e Apera.

Além disso, as ervas daninhas da presente invenção podem incluir, por exemplo, plantas de safra que crescem em um local indesejável. Por exemplo, uma planta de milho voluntária que está em um campo que predominantemente compreende plantas de soja pode ser considerada uma erva daninha, caso a planta de milho seja indesejável no campo das plantas de soja.

Os artigos "um" e "uma" são usado aqui para se referir a um ou mais de um (isto é, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, "um elemento" significa um ou mais elementos.

Conforme aqui utilizada, a palavra "compreendendo" ou variações tais como "compreende" ou "compreendendo" serão entendidas como implicando na inclusão de um elemento, o todo ou passo estabelecido, ou grupo de elementos, todos ou passos, porém não a exclusão de qualquer outro elemento, todo ou passo, ou grupo de elementos, todos ou passos.

Os exemplos a seguir são fornecidos a título de ilustração e não a título de limitação.

Exemplo 1 Ensaio de enzima in vitro de AHAS

O ensaio de enzima AHAS é um método colorimétrico rápido que é usado para quantificar os níveis de tolerância das amostras diferentes pela medição do nível de atividade da enzima AHAS na presença dos inibidores AHAS, conforme descrito por Singh et al. (Anal. Biochem. 171 :173179, 1988). Dois tipos de testes foram usados: um teste básico usando so-mente um inibidor e um teste intensivo que requer o uso de dois inibidores. Ambos os testes indicam níveis de tolerância à imidazolinona com o teste intensivo sendo capaz de detectar leves diferenças nos níveis de tolerância evidentes entre algumas linhagens vegetais. A Solução Estoque do Ensaio AHAS contém: 0,2 M de fosfato de sódio monobásico + 0,2 M de fosfato de sódio dibásico + 50 mM de ácido 1,1-ciclopropanodicarboxílico (CPCA) + sais de base Murashige & Skoogs de força total + 1 mM de Imazamox (AC 299.263 grau técnico) + N2SO4 5% + NaOH 2 M + 2,5% de a-naftol + 0,25% de creatina em 1 M de tampão fosfato pH 6,0.

Soluções de Ensaio AHAS finais incluem três tipos de soluções: A solução A contém: 10 mM de tampão fosfato + 10% de meio M & S + 500 uM de CPCA + 0,5% de L-alanina + 50 mM de piruvato. A solução B contém: Solução A + Imazamox. A Solução C contém: Solução B + clorssulfuron 0,2 uM.

Teste AHAS Básico: Inibidor de Imazamox:

O teste foi efetuado em placas com 96 poços. Cada placa com 96 poços continha espaço para 19-21 amostras incluindo os controles. Cada poço continha 100 uL de tampão AHAS conforme descrito abaixo. Em uma capela de fluxo laminar, o tampão AHAS estéril foi assepticamente transferido para duas bacias de solução rotuladas como A e B. Na bacia "B", imazamox foi adicionado a partir de uma solução estoque que se igualou até uma concentração de 2,5 uM. 100 uL de solução A foram transferidos para todas as fileiras com números ímpares em cada placa, e 100 uL de solução B foram transferidos para todas as fileiras com números pares.

Fase 1: Amostragem

Quatro discos foram cortados do fundo da menor folha de mudas com dez dias de idade usando uma broca. As plantas foram amostradas antes do estágio de separação, uma vez que outro gene AHAS é ativado depois desse estágio de crescimento, e deste modo fornecendo potencialmente falsos resultados. Após a excisão, os discos foram transferidos para os poços da placa de microtitulação contendo as soluções A e B.

Uma vez completa toda a placa de microtitulação, ela foi incubada sob luz fluorescente em temperatura ambiente por 14-18 horas. Para interromper a incubação depois deste período, as placas foram congeladas em um freezer a -80°C.

Fase 2: Reação

As placas AHAS foram removidas do freezer a -80°C e descongeladas em temperatura ambiente ou em uma incubadora a 60°C. Vinte e cinco microlitros de H2SO4 5% foram adicionados em cada poço. As placas acidificadas foram incubadas a 60°C até que todos os discos ficassem completamente amarronzados, em cerca de 15 minutos. Durante este tempo, a solução de naftol foi preparada e subsequentemente 150 uL de solução de a-naftol/creatina foram adicionados em cada poço. Cada placa foi incubada a 60°C por 15 minutos. Depois da incubação, a diferença na atividade de AHAS foi comparada visualmente entre amostras de imidazolinona e diferentes de imidazolinona. A intensidade da cor "vermelha" resultante da atvidade

AHAS foi medida usando um Leitor de Placas de Microtitulação para fornecer o valor da quantidade para as amostras de imidazolinona e diferentes de imidazolinona.

A absorvância de cada poço foi lida a 530 nm. Sob este ajuste, um valo foi dado que foi representativo da intensidade do vermelho. Esta intensidade do vermelho foi convertida na quantidade de atividade AHAS em cada poço. Quando a atividade de AHAS do poço de imazamox em uma dada amostra foi dividida na atividade AHAS do controle, uma proporção foi dada em termos de "atividade AHAS porcentual do controle".

Teste AHAS Intensivo: Inibidores de Imazamox e Clorsulfuron

A integração de clorsulfuron, SU, no teste de AHAS é baseada no comportamento de tolerância dos genes PM1 e bR. PM1 e bR não são tolerantes a SU, enquanto que PM2 não mostra alguma tolerância ao SU. Uma proporção de atividade SU dividida na atividade de imazamox produziu um valor único para todos os quatro níveis de tolerância (PM1/PM2, PM2, PM1, WT).

Os resultados estão mostrados na Figura 3 para bR, PM2 e bR/PM2 em B. juncea quando inibido com imazamox e clorsulfuron.

Atividade da Enzima AHAS de Diferentes Combinações de Mutações de B. juncea na Presença de Imazamox

A atividade da enzima AHAS nos extratos de proteína das linhagens de B. juncea haploides duplas homozigóticas (DH) contendo diferentes combinações de mutação (aR, bR, PM2 c A107T, PM2 x bR, A104T x bR) foi medida como uma porcentagem da atividade da amostra não-tratada (0 pM de imazamox). Como controle, extratos de proteína de três linhagens de B. napus também foram incluídas: B. napus PM1, B. napus PM2 e B. napus PM1/PM2. Os resultados dessas combinações de mutantes e verificações a 100 pM de imazamox estão mostrados na Figura 6.

Exemplo 2 TESTES DE TOLERÂNCIA A HERBICIDA NA ESTUFA

O primeiro experimento foi projetado para determinar se havia uma diferença na tolerância ao herbicida imidazolinona entre as linhagens de B. juncea contendo um gene (bR ou PM2) e dois genes (bR/PM2) versus a linhagem B. napuscontendo os dois genes (PM1/PM2).

Seis plantas individuais de cada linhagem foram submetidas a cada tratamento com pulverização. O herbicida imidazolinona Odysey® foi aplicado 1 x (17 g ai/acre), 2 x (34 g acre) e 3 x (51 g ai/acre) no estágio de folha 2-3. As plantas foram pulverizadas no estágio de folha 2-3 aproximadamente 14 dias após o plantio. A câmara de pulverização foi ajustada a 275,8 KPa (40 psi) e a velocidade foi ajustada a ‘80’ (34,98 L/AC). O cálculo a seguir foi feito para preparar 25 mL de uma solução estoque de Odyssey: 17*0,025/34,98 = 0,1215 g de grânulos de Odyssey. Isto foi baseado nas seguintes considerações de valores: a quantidade de Odyssey necessária por acre foi de 17 g; e 8,33 mL de solução foi distribuído em cada passo da câmara de pulverização. Merge® foi adicionado em uma taxa de 0,5 L/100 L ou de 0,000125 L ou 125 pL. Depois da pulverização, as plantas foram distribuídas aleatoriamente pelas bandejas. As plantas foram classificadas em relação aos danos do herbicida visuais (7 a 10 dias depois da pulverização) de acordo com a seguinte classificação: 1. Plantas que não apresentam qualquer danos 2. Plantas que demonstram descoloração de folhas ou leve enrolamento das folhas. 3. Plantas apresentando descoloração de folhas maior (por exemplo, folhas amareladas ou roxas) assim como demonstrando certa ramificação basal. 4. Plantas demonstrando danos maiores resultando em morte ou contrariedades severas. A altura da planta e a biomassa (peso da planta) foram medidas depois do dano ficar aparente. Comparações foram feitas entre os tratamentos por pulverização e controles para cada variedade. Os resultados estão mostrados na Tabela 1.

O segundo experimento foi projetado para comparar as diferentes mutações, bR, bR/PM2, PM2, aR, Al 04T e Al 07T em B. juncea quando tratada com diferentes taxas de imazamox em estufa. As amostras usadas para o Teste de Pulverização com Imazamox (Segundo Experimento de Es5 tufa) estão mostradas na tabela 2 abaixo. Tabela 2: Linhagens de mutação de B. juncea usadas no segundo experimento de estufa

Doze plantas distntas por linhagem foram submetidas a cada nível de tratamento, conforme ilustrado na Tabela 3. Houve 7 tratamentos 10 com Imazamox (Raptor®) + Merge® 0,5% v/v. As plantas foram tratadas no estágio de folha verdadeiro 1-2. Os resultado estão mostrados na Figura 4. Tabela 3. Níveis de tratamento

Em outro experimento de estufa, linhagens de B. juncea DH foram produzidas a partir dos cruzamentos entre as linhagens de B. juncea as 15 quais continham uma mutação AHAS no genoma A (aR, A104T ou PM2) e linhagens de B. juncea as quais continham uma mutação AHAS no genoma B (bR, A107T). Aquelas linhagens DH foram confirmadas como sendo homozigóticas para mutações tanto no genoma A quanto no genoma B (por exemplo, aR/bR ou A104T/bR, etc.) foram selecionadas para testagem de tolerância ao herbicida em estufa subsequente com 0, 35, 70 e 100 g ai/ha de imazamox (Raptor® + Merge® 0,75%). A fitotoxicidade foi classificada em uma escala de 0 a 9, onde 0 foi equivalente a ausência de injúria na safra e 9 foi equivalente a necrose da planta severa levando à morte da planta. Os resultados dessas curvas de fitotoxicidade estão mostrados na Figura 8.

Para aquelas combinações onde nenhuma linhagem DH homozigótica dupla foi identificada (tal como no caso para a combinação mutante de aR/A107T), uma população F2 segregada foi plantada na estufa. Cada F2 individual foi sequenciado para determinar a natureza da mutação e zigosidade, e a seguir pulverizado com 35 g de ai/ha de imazamox para determinar o respectivo fenótipo de injúria. Os resultados da relação do genótipo em relação ao fenótipo de injúria da safra para as mutações aR e A107T estão mostrados na Figura 7.

Exemplo 3 TESTES DE TOLERÂNCIA A HERBICIDA NO CAMPO Quatro entradas de B. juncea e uma entrada de B. napus foram testadas em testes de design de bloco dividido aleatórios (4 repetições) por 4 locais em Dacota do Norte em relação à tolerância ao herbicida (referência à Tabela 4 para os vários tratamentos) e rendimento. Os canteiros tinham tamanho mínimo de 1,5 x 5 m e os canteiros individualmente foram dispostos em fileira e colhidos quando maduros. Das quatro entradas de B. juncea, uma entrada foi de uma linhagem de B. juncea PM1/PM2 que foi produzida pela infiltração das mutações tanto de PM1 quanto de PM2 de Brassica napus em Brassica juncea por técnicas de cruzamento reverso convencionais, seguido por duas gerações de cruzamento entre elas próprias para produzir PM1/PM2 de B. juncea homozigótico. As outras três entradas de B. juncea foram genótipos diferentes de B. juncea contendo mutação bR do genoma B arranjadas juntamente com a mutação PM2. Todas as linhagens de B. juncea bR/PM2 foram homozigóticas para ambas as mutações. A entrada de B. napus foi uma variedade de verificação comercial CLEARFIELD® homozigótica para as mutações PM1/PM2. As taxas de injúria de safra (% de fitotoxicidade) foram tomadas de 5 a 7 dias após o tratamento (DAT) e 18 a 24 DAT. A fitotoxicidade porcentual média de um dos quatro locais está mostra5 da na Tabela 5. Tabela 4: Tratamento com Herbicida

©CLEARFIELD e o símbolo CLEARFIELD único são marcas comerciais registradas da BASF Tabela 5: A Fitotoxicidade Porcentual Média e o Rendimento Médio de PM1/PM2 de B. juncea e as entradas bR/PM2 de B. juncea após uma aplicação de herbicida 1x de Odyssey em um local em Velva, Dacota do Norte.

Os resultados na Tabela 5 indicaram que as mutações infiltradas em B. Juncea não têm tolerância adequada para a comercialização. As taxas de fitotoxicidade pós-herbicida (Odyssey®) para a linhagem B. juncea PM1/PM2 estavam na faixa de 25 a 50% para todos os locais de teste (Velva, Mohall, fargo, Hettinger) enquanto que o rendimento da entrada de B. juncea PM1/PM2 tratada com Odyssey® foi reduzida, em media, em 50% contra a entrada de B. juncea PM1/PM2 não-pulverizada. As entradas de B. juncea bR/PM2 (S006, S007 e S008) não demonstraram fitotoxicidade em um tratamento de 1 x Odyssey® para qualquer um dos locais de teste e não demonstrou qualquer decréscimo significativo no rendimento. As entradas de B. juncea também demonstraram taxas de fitotoxicidade mais baixas do que a entrada de B. napus PM1/PM2 em todos os locais.

Semelhantemente, vinte e oito entradas de B. juncea diferentes (genótipos) contendo a mutação empilhada bR/PM2, juntamente com uma entrada única de B. juncea PM2 (J03Z-16413) e um controle de B. napus CLEARFIELD® comercial contendo as mutações empilhadas PM1/P2 foram testados em campo em três locais. Um design em bloco completamente aleatorizado (1 tratamento) consistindo em 2 replicatas foi usado onde o tamanho da canteiro médio foi de 1,5 x 5 m. As taxas de mudas de canola regionais foram usadas e as taxas de mudas de canteiros individuais foram ajustadas para a mesma densidade de mudas para cada local, baseando-se em cada peso de 1000 sementes de entrada. Herbicida foi aplicado em todas as entradas neste ensaio, conforme demonstrado na Tabela 6 abaixo. Tabela 6: Tratamento com Herbicida

©CLEARFIELD e o símbolo CLEARFIELD único são marcas comerciais registradas da BASF Tabela 7: Classificações agrícolas

Tabela 8: Resultados do teste de campo

Tabela 8: -continua

Tabela8: -continua

Duas entradas de B. Juncea diferentes adicionais (genótipos) contendo a mutação empilhada de bR/PM2 e um controle de B. napusCLEARFIELD® contendo as mutações empilhadas PM1/PM2 foram testados em campo em vários locais durante dois anos sucessivos. Taxas de semeadura 5 de canola regionais foram usadas e as taxas de semeadura de canteiros individuais foram ajustadas para a mesma densidade de semeadura para cada local, baseando-se em cada peso de 1000 sementes de entrada. O herbicida (Beyond®) foi aplicado em todas as entradas neste teste, conforme mostrado na Tabela 9 abaixo. Tabela 9:

Dados da fitotoxicidade em campo também foram obtidos a partir de 3 linhagens diferentes contendo tanto as mutações bR quanto as mutações PM2 (homozigóticos para bR/PM2), e comparados com a fitotoxicidade de campo de uma linhagem de B. napus comercial contendo as mutações 5 tanto PM1 quanto PM2 (homozigótico para PM1/PM2). Essas linhagens foram pulverizadas com 1x BEYOND® (35 g de ai/ha de imazamox) e classifi-cadas em relação à fitotoxicidade de 7 a 10 dias após o tratamento (DAT). Uma linhagem tipo selvagem de B. juncea (isto é, sem mutações AHAS) também foi pulverizada com 1x BEYOND® como controle. Os resultado são 10 fornecidos na Tabela 10 abaixo. Tabela 10:

Um grupo semelhante de experimentos foi efetuado em quatro linhagens de B juncea semi-oleico adicionais contento ambas as mutações bR e PM2 (homozigótico bR/PM2) pulverizado com 2x BEYOND™. Os resul15 tados estão apresentados na Tabela 11 abaixo. Tabela 11:

Para estudar o efeito do empilhamento das mutações bR e PM2 juntamente versusas mutações individuais respectivas, os testes de campo de tolerância a herbicida foram efetuados em entradas de B. juncea contendo ou a mutação PM2 sozinha, ou a mutação bR sozinha ou as entradas contendo tanto mutações bR quanto PM2. Todas as mutações foram homozigóticas em todas as entradas. Um modelo em bloco completo aleatorizado (4 tratamentos) consistindo em 3 replicatas foi usado com um tamanho de canteiro médio de 1,5 m x 5 m. As taxas de semeadura de canola regionais foram usadas e taxas de semeadura de canteiro individuais foram ajustadas até a mesma densidade de semeadura para cada local, baseando-se em cada peso de 1000 sementes de entrada. Herbicida (Beyond®, onde uma dose de 1x foi de 35 g ai/ha) foi aplicado em todas as entradas neste teste, conforme demonstrado na tabela 10 abaixo. As linhagens de B. juncea contendo as características individuais ou combinadas foram tratadas com 0x, 1x, 2x, ou 4x os níveis de herbicida e avaliadas 10 dias, 12 dias, 14 dias ou 28 dias depois do tratamento (DAT). Duas pessoas diferentes classificaram a fitotoxicidade em 10, 12, 14 e/ou 28 dias depois do tratamento com as quantidades respectivas de herbicida (conforme mostrado na Tabela 10: Contador 1 x Contador 2). Os resultados estão apresentados na Tabela 12 abaixo. Tabela 12:

Para demonstrar mais claramente que a tolerância na linhagem mutante empilhada ÕR/PM2 foi maior do que a soma das tolerâncias de linhagem mutantes individuais (injúria de safra ou fitotoxicidade é mostrada 5 na Tabela 12), a tolerância do herbicida porcentual efetiva do aglomerado bR/PM2 foi comparada com a soma das tolerâncias do herbicida porcentuais da linhagem mutante bR individual mais a linhagem mutante PM2 individual (tolerância ao herbicida prevista) (Tabela 13). em níveis de herbicida os quais desafiam ou subjugam as mutações individuais (de modo mais notório 10 em taxas de 2x e 4x), o nível de tolerância ao herbicida observado na linhagem mutante empilhada bR/PM2 excede a tolerância ao herbicida observada ao adicionar as duas tolerâncias bR + PM2 individuais juntas. A linhagem mutante empilhada bR/PM2 exibe um nível sinergístico de tolerância ao herbicida ao invés de um nível aditivo. Este nível (sinergístico) intensificado de 15 tolerância à imidazolinona foi observado em mais de 30 genótipos diferentes de B. Juncea contendo as mutações empilhadas bR/PM2. Tabela 13:

Em resumo, o nível sinergístico ou melhorado de tolerância em linhagens bR/PM2 de B. juncea demonstrou ser maior do que o nível de tolerância observado nas linhagens mutantes empilhadas PM1/PM2 de B. napus 5 e também muito maior do que a tolerância observada nas linhagens mutan tes empilhadas de B. juncea PM1/PM2 (Tabela 5). As linhagens bR/PM2 de B. juncea não demonstraram qualquer penalidade de rendimento com os herbicidas de imidazolinona, enquanto que a linhagem B. juncea PM1/PM2 demonstrou penalidades de rendimento significativas quando tratada com 10 taxas comerciais de herbicida imidazolinona. Todas as publicações e pedidos de patente mencionados no relatório descritivo são indicativos do nível das pessoas versadas na técnica a quem esta invenção pertence. Todas as publicações e pedidos de patente são aqui incorporados por referência na mesma extensão que se cada publi15 cação individual ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

Claims (21)

1. Método para controle de ervas daninhas em proximidade a uma Brassica,caracterizado pelo fato de que compreende aplicar uma quantidade eficaz de um herbicida às ervas daninhas e à Brassica, sendo que a Brassicacompreende um genoma A compreendendo um primeiro polinucleotídeo da subunidade grande de acetohidroxiácido sintase (AHASL) que codifica um primeiro polipeptídeo AHASL tolerante ao herbicida apresentando uma substituição de leucina na posição correspondente à posição 574 de SEQ ID NO: 1 ou posição 556 de SEQ ID NO: 6, e um genoma B, compreendendo um segundo polinucleotídeo AHASL que codifica um segundo polipeptídeo AHASL tolerante ao herbicida apresentando uma substituição de asparagina na posição correspondente à posição 653 de SEQ ID NO: 1 ou posição 638 de SEQ ID NO: 2, e sendo que o primeiro e segundo polipeptídeos AHASL tolerantes ao herbicida, juntos, fornecem à referida Brassica,um nível sinérgico de tolerância a um herbicida inibidor de AHAS, e ainda em que a Brassicaé um derivado ou progénie de uma planta de linhagem J05Z-07801, uma amostra representativa de semente da linhagem depositada sob o número de depósito ATCC NPTA-8305, ou uma progénie da mesma.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro polinucleotídeo AHASL é um gene AHASL do genoma A.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o segundo polinucleotídeo AHASL é um gene AHASL do genoma B.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a Brassicaé B. juncea.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a Brassicatem pelo menos ou cerca de 10% a mais de tolerância em comparação com o nível aditivo de tolerância em uma Brassicacontendo o primeiro polinucleotídeo e uma Brassica contendo o segundo polinucleotídeo.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a Brassicatem pelo menos cerca de 20% a mais de tolerância em comparação com o nível aditivo de tolerância em uma Brassicacontendo o primeiro polinucleotídeo e uma Brassicacontendo o segundo polinucleotídeo.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a Brassicatem pelo menos cerca de 30% a mais de tolerância em comparação com o nível aditivo de tolerância em uma Brassicacontendo o primeiro polinucleotídeo e uma Brassicacontendo o segundo polinucleotídeo.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de o herbicida compreende um ou mais de um herbicida de imidazolinona, um herbicida de sulfonilureia, um herbicida de tiazolopirimidina e um herbicida de pirimidiniloxibenzoato.

9. Método para tratar uma semente de Brassica,caracterizado pelo fato de que compreende aplicar uma quantidade eficaz de uma formulação de tratamento de semente à semente, em que a Brassicacompreende um genoma A compreendendo um primeiro polinucleotídeo da subunidade grande de acetohidroxiácido sintase (AHASL) que codifica um primeiro polipeptídeo AHASL tolerante ao herbicida apresentando uma substituição de leucina na posição correspondente à posição 574 de SEQ ID NO: 1 ou posição 556 de SEQ ID NO: 6, e um genoma B, compreendendo um segundo polinucleotídeo AHASL que codifica um segundo polipeptídeo AHASL tolerante ao herbicida apresentando uma substituição de asparagina na posição correspondente à posição 653 de SEQ ID NO: 1 ou posição 638 de SEQ ID NO: 2, e em que o primeiro e segundo polipeptídeos AHASL tolerantes ao herbicida, juntos, fornecem à referida Brassica,um nível sinérgico de tolerância a um herbicida inibidor de AHAS, e ainda em que a Brassicaé um derivado ou progénie de uma planta de linhagem J05Z-07801, uma amostra representativa de semente da linhagem depositada sob o número de depósito ATCC N2 PTA-8305, ou uma progénie da mesma.

10. Método, de acordo a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a formulação de tratamento de semente compreende um ou mais de um herbicida de imidazolinona, um herbicida de sulfonilureia, um herbicida de tiazolopirimidina e um herbicida de pirimidiniloxibenzoato.

11. Método, de acordo a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o tratamento é um dentre: pulverização de semente, adubação de semente, revestimento de semente, polvilhamento de semente, molhadura de semente, peletização de semente ou combinação dos mesmos.

12. Método, de acordo a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o tratamento é realizado antes de semear a semente.

13. Método, de acordo a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o tratamento é realizado antes da emergência da planta.

14. Método de seleção de uma Brassica,caracterizado pelo fato de que compreende: expor a referida Brassicaa uma quantidade eficaz de um herbicida; e identificar a referida Brassicapor sua habilidade de crescer na presença do referido herbicida; sendo que a referida Brassica:compreende um genoma A com-preendendo um primeiro polinucleotídeo da subunidade grande de acetohidroxiácido sintase (AHASL) que codifica um primeiro polipeptídeo AHASL tolerante ao herbicida apresentando uma substituição de leucina na posição correspondente à posição 574 de SEQ ID NO: 1 ou posição 556 de SEQ ID NO: 6, e um genoma B, compreendendo um segundo polinucleotídeo AHASL que codifica um segundo polipeptídeo AHASL tolerante ao herbicida apresentando uma substituição de asparagina na posição correspondente à posição 653 de SEQ ID NO: 1 ou posição 638 de SEQ ID NO: 2, e sendo que o primeiro e segundo polipeptídeos AHASL tolerantes ao herbicida, juntos, fornecem à referida Brassica,um nível sinérgico de tolerância a um herbicida inibidor de AHAS, e ainda em que a Brassicaé um derivado ou progénie de uma planta de linhagem J05Z-07801, uma amostra representativa de semente da linhagem depositada sob o número de depósito ATCC N2 PTA-8305, ou uma progénie da mesma.

15. Método, de acordo a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o herbicida compreende um ou mais de um herbicida de imidazolinona, um herbicida de sulfonilureia, um herbicida de tiazolopirimidina e um herbicida de pirimidiniloxibenzoato.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o herbicida compreende um herbicida de imidazolinona.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o herbicida de imidazolinona compreende um ou mais de imazetapir, imazapic, imazamox, imazaquin, e imazapir.

18. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a formulação de tratamento de semente compreende um herbicida de imidazolinona.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o herbicida de imidazolinona compreende um ou mais de imazetapir, imazapic, imazamox, imazaquin, e imazapir.

20. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o herbicida compreende um herbicida de imidazolinona.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o herbicida de imidazolinona compreende um ou mais de imazetapir, imazapic, imazamox, imazaquin, e imazapir.

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