JP2015512640A - 突然変異アセトヒドロキシ酸合成酵素タンパク質のラージサブユニットをコードする突然変異ポリヌクレオチドを有し、除草剤耐性が増大したソルガム植物 - Google Patents

突然変異アセトヒドロキシ酸合成酵素タンパク質のラージサブユニットをコードする突然変異ポリヌクレオチドを有し、除草剤耐性が増大したソルガム植物 Download PDF

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Abstract

ソルガムＡＨＡＳタンパク質ラージサブユニットの位置９３にアラニンからトレオニンへの置換を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをゲノム中に含むソルガム種子。この植物は、野生型ソルガム植物と比較して、例えば、イミダゾリノン群に由来する１つまたは複数の除草剤に対する増大した耐性を有する。ソルガム植物は、そのゲノム中に、本発明のソルガムＡＨＡＳの突然変異ラージサブユニットまたはソルガムＡＨＡＳポリペプチドをコードする１、２、３コピー以上のポリヌクレオチドを含んでもよい。この文脈において、ソルガム植物は、ＡＨＡＳ酵素活性を阻害することができる任意の除草剤に対して寛容性であってもよい。例えば、ソルガム植物は、イマゼタピル、イマザピル、およびイマザピックなどのイミダゾリノン型の除草剤またはスルホニルウレア群の除草剤に対して寛容性であってもよい。

Description

ソルガム（ソルガム種）は、約２０種の草を含む植物の属である。それは東アフリカの熱帯および亜熱帯地域を原産とし、ヒトおよび動物による消費のための穀物用に、大陸のどこででも育てられており、飼料として、およびアルコール飲料の製造のためにも用いられている。それはグルテンを含まないため、ソルガムはセリアック病に罹患する個体にとって好適である。
ソルガムは、多くの穀類よりも干ばつおよび過剰の土壌水分含量に対して寛容性である。それは様々な土壌および気象条件下で適切に生長することができる。同様に、それは灌漑に対して好ましく応答し、その生活環の間に必要とするのは最小で２５０ｍｍであり、最適な灌漑範囲は４００〜５５０ｍｍである。
迅速で均一な発芽およびそれにより良好な作物の移植を達成するためには、土壌は植付けの時点で適切な水分含量を有さなければならない。水の最大の要求は発芽後３０日で開始し、穀物が満たされるまで続き、最も重要な段階は円錐花序形成および開花のものであり、それはこの時点での水の欠乏は収量の低下をもたらすからである。
さらに、ソルガムは、干ばつ期には休眠したままになる能力を有し、好ましい期間の下で生長を再開するが、これらのストレス状況は性能に影響し得る。
ソルガムは、正常な発達のために高い温度を必要とし、結果として、他の作物よりも低温に対する感受性が高い。発芽には少なくとも１８℃の土壌温度が必要である；植物の実際の活発な生長は、１５℃の温度に達するまで達成されず、最適温度は約３２℃である。
アセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ）は、分枝アミノ酸であるバリン、ロイシンおよびイソロイシンの合成を触媒する第１の酵素である。ＡＨＡＳは、スルホニルウレア、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジンおよびピリミジルオキシ安息香酸などのいくつかの除草剤の標的である。前者２つの除草剤ファミリーは、その低い毒性および雑草に対する高い有効性のため現代の農業において広く用いられている。
イミダゾリノンファミリーの除草剤は、イマゼタピル、イマザキン、およびイマザピルを含む。
市場に存在するいくつかのスルホニルウレアは、メツルフロン−メチル、クロロスルフロン、ニコスルフロン、シノスルフロン、イミダスルフロン、ハロスルフロン、リムスルフロン、トリスルフロン−メチル、およびトリベヌロン−メチルである。
しかしながら、イミダゾリノンおよび／またはスルホニルウレアファミリーの除草剤に耐性である植物；例えば、Ｚｅａ ｍａｙｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、およびＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａなどの種がある（Ｓｅｂａｓｔｉａｎら（１９８９）Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．，２９：１４０３〜１４０８頁；Ｓｗａｎｓｏｎら、１９８９ Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７８：５２５〜５３０頁；Ｎｅｗｈｏｕｓｅら（１９９１）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，８３：６５〜７０頁；Ｓａｔｈａｓｉｖａｎら（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９７：１０４４〜１０５０頁；Ｍｏｕｒａｎｄら（１９９３）Ｊ．Ｈｅｒｅｄｉｔｙ ８４：９１〜９６頁；米国特許第５，５４５，８２２号）。イミダゾリノン型の除草剤に対する耐性を付与するＡＨＡＳのラージサブユニットにおける点突然変異がヒマワリにおいて記載されている（ＷＯ２００７／０１１８９２０）。
イミダゾリノンまたはスルホニルウレア型の除草剤に対して耐性である植物も検出されている。これらの植物は、自然に耐性を獲得し、作物育種のために用いられており、除草剤耐性品種をもたらしている。耐性植物の分析から、アミノ酸ＡｌａのＶａｌによる置換をもたらすヒマワリのＡＨＡＳタンパク質において点突然変異が決定された（Ｗｈｉｔｅら（２００３）Ｗｅｅｄ Ｓｃｉ．，５１：８４５〜８５３頁）。
さらに、米国特許第４，７６１，３７３号；第５，３３１，１０７号；第５，３０４，７３２号；第６，２１１，４３８号；第６，２１１，４３９号；および第６，２２２，１００号は、イミダゾリノン除草剤に対して耐性である植物を開示している。これらの植物は全て、一般に、植物における除草剤耐性を惹起するための変化したＡＨＡＳ遺伝子の使用を記載し、ある特定のイミダゾリノン耐性トウモロコシ系を特に開示している。米国特許第５，７３１，１８０号および米国特許第５，７６７，３６１号は、イミダゾリノン特異的耐性をもたらす野生型単子葉植物ＡＨＡＳアミノ酸配列における単一のアミノ酸置換を有する単離された遺伝子を考察している。
特許文献ＷＯ２００６／００７３７３およびＷＯ２００６／０６０６３４は、コムギ植物においてイミダゾリノン型の除草剤に対して耐性を付与する突然変異を開示している。
刊行物「タバコアセトヒドロキシ酸合成酵素における除草剤耐性を付与するアミノ酸」は、除草剤耐性を付与するＡＨＡＳにおける様々な点突然変異を記載している（ＧＭ Ｃｒｏｐｓ １：２、６２〜６７頁；２０１０年２月１６日）。
特許文献ＵＳ２０１００１１５６６３は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子を変化させることにより達成される除草剤耐性ソルガム植物に関する。また、除草剤ジニトロアニリンに対して耐性であるソルガム植物（ＵＳ２０１００２０５６８６）および除草剤アセト乳酸合成酵素に対して耐性であるソルガム植物（ＷＯ２００８／０７３８００）も開示されている。
本発明のソルガム植物は、野生型ソルガム植物と比較して、除草剤、例えば、ＡＨＡＳ酵素を標的とする除草剤、特に、イミダゾリノンおよびスルホニルウレアに対する改善された耐性を示す。特に、本発明のソルガム植物（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）は、そのゲノム中に、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。前記ポリヌクレオチドは、ソルガムＡＨＡＳのラージサブユニットの位置９３または等価な位置にアラニンからトレオニンへの置換を有するＡＨＡＳのラージサブユニットをコードし、前記植物は野生型ソルガム植物と比較して、イミダゾリノン群から選択される除草剤などの１つまたは複数の除草剤に対する耐性が増大している。ソルガム植物は、そのゲノム中に、ソルガムＡＨＡＳの突然変異ラージサブユニットまたは本発明のソルガムＡＨＡＳポリペプチドをコードする、１、２、３コピー以上のポリヌクレオチドを含んでもよい。この文脈において、ソルガム植物は、ＡＨＡＳ酵素活性を阻害することができる任意の除草剤に対して寛容性であってもよい、すなわち、ソルガム植物は、限定されるものではないが、イマゼタピル、イマザピル、およびイマザピックなどのイミダゾリノン型の除草剤または限定されるものではないが、クロロスルフロン、メツルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、チオフェンスルフロンメチル、トリベヌロンメチル、ベンスルフロンメチル、ニコスルフロン、エタメツルフロンメチル、リムスルフロン、トリフルスルフロンメチル、トリアスルフロン、プリミスルフロンメチル、シノスルフロン、アミドスルフロン、フルザスルフロン、イマゾスルフロン、ピラゾスルフロンエチル、およびハロスルフロンなどのスルホニルウレア群の除草剤に対して寛容性であってもよい。
好ましい実施形態においては、イミダゾリノンまたはスルホニルウレアの群に属する除草剤に対して耐性である本発明のソルガム植物は、ＶＴ１１−１１３３１−ＢＫと命名されたソルガム系であり、その種子はブダペスト条約の下で２０１１年１０月１２日に受託番号ＮＣＩＭＢ４１８７０の下でＮＣＩＭＢコレクションに寄託されたものである。突然変異ＶＴ１１−１１３３１−ＢＫ植物、その部分およびその種子は、そのゲノム中に、配列番号２に記載の配列を有するＡＨＡＳラージサブユニットのポリペプチドをコードする配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む突然変異ＡＨＡＳ遺伝子を含む。ＡＨＡＳのラージサブユニットに対応する配列番号２のアミノ酸配列は、ソルガムＡＨＡＳのラージサブユニットの野生型アミノ酸配列（配列番号３）と１個のアミノ酸が異なり、前記相違はソルガムＡＨＡＳのラージサブユニットの位置９３、または等価な位置にアラニンからトレオニンへの置換を含む。
本発明の除草剤寛容性ソルガム植物遺伝資源は、他のソルガム品種への遺伝子移入による寛容性形質の導入にとって有用である。本発明のソルガム植物は、ＡＨＡＳラージサブユニットをコードし、ソルガムＡＨＡＳの前記ラージサブユニットの位置９３または等価な位置にアラニンからトレオニンへの置換を有するポリヌクレオチドを含む植物の子孫および種子を含み、前記植物は野生型ソルガム植物と比較して、１つまたは複数のイミダゾリノンおよび／またはスルホニルウレア除草剤に対する耐性の増大を示す。
好ましい実施形態においては、除草剤耐性ソルガム植物は、ＮＣＩＭＢ４１８７０の耐性形質を含み、ＮＣＩＭＢ４１８７０に記載の植物、ＮＣＩＭＢ４１８７０植物の子孫、ＮＣＩＭＢ４１８７０植物の突然変異体、およびＮＣＩＭＢ４１８７０突然変異体の子孫であってもよい。前記植物は、トランスジェニックまたは非トランスジェニックであってもよく、農業使用、または観葉植物などの他の使用にとって好適な任意の植物種に属してもよい。
ソルガムＡＨＡＳタンパク質ラージサブユニットの位置９３にアラニンからトレオニンへの置換を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをそのゲノム中に含むソルガム種子がさらに提供される。この種子は、野生型ソルガム植物と比較して、イミダゾリノン群の１つまたは複数の除草剤に対する耐性が増大した植物を発芽、生成する。好ましい実施形態においては、前記種子は、ＮＣＩＭＢ４１８７０として寄託された種子である。
イミダゾリノンまたはスルホニルウレアの群中の除草剤に対して耐性である植物を同定するための方法であって、
ａ）ソルガム植物に由来する核酸試料を供給するステップと、
ｂ）前記核酸試料中に存在するソルガム植物からＡＨＡＳ遺伝子に対応する領域を増幅するステップと、
ｃ）イミダゾリノン除草剤に対する耐性を付与する前記増幅された核酸試料中の少なくとも１つの突然変異の存在に基づいて、イミダゾリノン群の除草剤に対して耐性であるソルガム植物を同定するステップと
を含む、上記方法がさらに提供される。好ましい実施形態においては、ＮＣＩＭＢ４１８７０中の突然変異などのＡＨＡＳ中に少なくとも１つの突然変異を含む植物が選択され、ＡＨＡＳ遺伝子中の前記少なくとも１つの突然変異は野生型ソルガムＡＨＡＳアミノ酸配列と比較して、Ａｌａ９３Ｔｈｒ置換を含むＡＨＡＳのポリペプチドまたはラージサブユニットをコードする。前記植物は単子葉植物または双子葉植物であってもよい。好ましくは、前記植物は、ソルガム、コメ、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、オートムギ、オオムギ、ライムギ、アマ、ワタ、サトウキビ、ヒマワリなどの農業の対象となる植物である。同定の方法は、特異的点突然変異ＳＮＰマーカーを用いてもよい。
本発明は、農業用植物、例えば、ソルガム植物の近くにある雑草を防除するための方法であって、前記ソルガム植物がイミダゾリノンおよび／またはスルホニルウレアの群中の由来する除草剤などの除草剤に対して耐性である、前記方法を提供する。好ましい実施形態においては、除草剤はイミダゾリノンである。イミダゾリノン除草剤は、イマゼタピル、イマザピック、またはイマザピルであってもよい。前記植物は、ＮＣＩＭＢ４１８７０などの耐性形質を示してもよく、その誘導体、突然変異体、または子孫植物であってもよい。
本発明は、限定されるものではないが、以下のヌクレオチド配列：
配列番号１に記載の配列、
配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
配列番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドであって、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示す前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
−配列番号１に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列であって、ＡＨＡＳのラージサブユニットを含むポリペプチドをコードし、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示す前記ヌクレオチド配列、
またはその相補配列
のうちの１つまたは複数を含むポリペプチドを提供する。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、Ａｌａ９３Ｔｈｒ置換を含むＡＨＡＳのラージユニットのポリペプチドをコードする。
本発明はまた、以下のヌクレオチド配列：配列番号１、配列番号２に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、配列番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドであって、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示す前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；配列番号１に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列であって、ＡＨＡＳのラージサブユニットを含むポリペプチドをコードし、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示す前記ヌクレオチド配列、またはその相補配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む発現カセットも提供する。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、Ａｌａ９３Ｔｈｒ置換を含むＡＨＡＳのラージユニットのポリペプチドをコードし；前記配列は発現を行うためのヌクレオチド配列、例えば、１つまたは複数のプロモーター、エンハンサーまたは他の公知の調節配列に作動可能に連結される。プロモーターは、植物、植物組織、葉緑体、動物、細菌、真菌または酵母細胞中での発現のためのプロモーターであってもよい。
本発明は、以下のヌクレオチド配列：ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、ｂ）配列番号２に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドであって、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示す前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ｄ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列であって、ＡＨＡＳのラージサブユニットを含むポリペプチドをコードし、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示す前記ヌクレオチド配列のうちの１つを有する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチド配列の発現を誘導する作動可能に連結された配列および選択マーカーをさらに含む形質転換ベクターを提供する。ベクターを、それぞれ特定の場合のために適合化される、細菌、真菌、酵母、植物細胞または動物細胞を形質転換するために用いることができる。
本発明は、そのゲノム中に組込まれた、ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列；ｂ）配列番号２に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドであって、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示す前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ｄ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列であって、ＡＨＡＳのラージサブユニットを含むポリペプチドをコードし、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示す前記ヌクレオチド配列；ｅ）ａ）から（ｄ）のヌクレオチド配列の１つと完全に相補的なヌクレオチド配列から選択されるポリヌクレオチドに作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含み、ベクターが選択可能な遺伝子と、前記ヌクレオチド配列の発現を誘導するヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターとをさらに含む、形質転換された植物を提供する。プロモーターは、植物、例えば、植物組織または葉緑体においてポリペプチド発現を誘導するプロモーターである。形質転換植物は、単子葉植物、例えば、ソルガム、トウモロコシ、コメ、もしくはコムギ；または双子葉植物、例えば、ヒマワリ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、タバコもしくはアブラナであってもよい。形質転換植物は、等量の前記除草剤が両方に対して施用された場合に同じ野生型植物と比較して除草剤（イミダゾリノンおよびスルホニルウレア）に対して耐性である。
本発明はまた、除草剤耐性植物または除草剤に対する耐性が増大した植物を取得するための方法であって、ｉ）植物細胞を、ポリヌクレオチドを含む発現カセットで形質転換するステップ、ｉｉ）植物細胞を再生させて、除草剤耐性植物を取得するステップを含み、前記ポリヌクレオチドが、以下のヌクレオチド配列：ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、ｂ）配列番号２に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドであって、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示す前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ｄ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列であって、ＡＨＡＳのラージサブユニットを含むポリペプチドをコードし、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示す前記ヌクレオチド配列およびｅ）ａ）から（ｄ）のヌクレオチド配列の１つと完全に相補的なヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを有する、前記方法も提供する。ＤＮＡ発現カセットは、植物、例えば、植物組織または葉緑体における前記ポリペプチドの発現を誘導するための少なくとも１つのプロモーターを含む。形質転換植物は、単子葉植物、例えば、ソルガム、トウモロコシ、コメ、もしくはコムギ；または双子葉植物、例えば、ヒマワリ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、タバコ、ダイズもしくはアブラナであってもよい。形質転換植物は、等量の前記除草剤が両方に対して施用された場合に野生型植物と比較して除草剤（イミダゾリノンおよびスルホニルウレア）に対して耐性である。前記植物は、除草剤に対して耐性であるＡＨＡＳのラージサブユニットを含む。
イミダゾリノン耐性突然変異ソルガム系（ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ）および元の自家受粉ソルガム系８０２３７または野生型系の用量応答曲線を示す図である。アッセイされた除草剤は、０（対照）、１Ｘ、２Ｘ、３Ｘおよび４Ｘの施用率のイマゼタピル、イマザピルおよびイマザピックであった。除草効果を、未処理の対照と比較した空中組織の乾燥物量（Dry matter ＤＭ）のパーセンテージとして測定した；それぞれの値は３回のアッセイの平均である。 突然変異ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ ＡＨＡＳヌクレオチド配列と、元のエンドガミックソルガム系８０２３７または野生型系のものとのアラインメントを示す図である。ヌクレオチドのＧからＡの置換は、両配列を識別する位置＋２７７に示される。重複するアンプリコン配列を増幅するのに用いられる異なるプライマーに下線を付ける。 ソルガムＡＨＡＳ遺伝子のコドン９３のＳＮＰ Ｇ／Ａに関する遺伝子型決定アッセイを示す図である。特異的ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳマーカーを、ＡＤＶ−ＩＭＩ−ＲｘＦ２ ９０５２３に由来する１７７個のＦ２子孫植物の遺伝子型において分析した。３つのクラスターが明確に定義され、対立遺伝子突然変異体（Ａ／Ａ）のホモ接合植物に対応するドット（黒い丸）、ヘテロ接合植物（Ａ／Ｇ）に対応する三角（黒い三角形）および野生型対立遺伝子（Ｇ／Ｇ）のホモ接合植物の菱形（黒い菱形）として同定された。 ソルガムＡＨＡＳ遺伝子（受託番号ＧＭ６６３３６３．１）のヌクレオチド配列と、Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅヌクレオチド配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ．ｎｅｔ／ｓｅａｒｃｈ．ｐｈｐ）に寄託されたソルガムゲノム配列（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）とをマッチングさせることにより得られた結果を示す図である。このマッチングは、ＡＨＡＳ ＧＭ６６３３６３．１配列が、ソルガムゲノムの染色体４に位置するＡＨＡＳ配列に対する高度に有意な相同性（値ｅ＝０）を示すことを示しており、これは対象の遺伝子がこの連結基に存在することを示す。 Ｓ．ｂｉｃｏｌｏｒ染色体４の連結マップを示す図である。隣接するマーカー間の距離はセンチモルガン（ｃＭ）で与えられる。ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳおよび１７７個のＦ２植物の遺伝子型の染色体４中の７つのＳＳＲを参照するイマゼタピルに対する耐性の染色体位置が示される。このマップは、ＬＯＤ＝３のデフォルトパラメータおよび５０ｃＭの最大Ｋｏｓａｍｂｉ距離を用いる、ＪｏｉｎＭａｐソフトウェアを用いて構築されたものである。
除草剤寛容性植物を得るために、エンドガミックソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）系８０２３７植物を、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）の水性溶液で処理した。処理した種子を植え、開放授粉のために放置した。２７３個のＭ１植物を選択し、それぞれの植物の２個の種子を苗床に植えることによって、合計５４６個のＭ２植物を得た。それぞれの対の１個の植物に由来する花粉を採取し、その対の他の植物を授粉させるために用いた。２７３個の授粉したＭ２植物のそれぞれから得られたＭ３種子を収穫した。合計２７３個の畝間にＭ３子孫を植えた。それぞれのＭ３畝間からの５０個の植物に、１００ｍｌ Ｌ ａ．ｉ．／ｈａのイマゼタピルを噴霧した。畝間からの６８個の植物は、除草剤による処理後に正常な生長および症状の非存在を示し、除草剤に対して耐性であると考えられ、ＶＴ０９−９７５４と同定された。畝間からの耐性植物の系譜を同定し、それらを８０２３７ＥＭＳ２−１９２と命名した（以後、ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒと呼ぶ）。元のＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体から選択された除草剤寛容性Ｍ７突然変異体植物および種子（ＶＴ１１−１１３３１−ＢＫと命名）を取得し、ブダペスト条約の条項の下で、２０１１年１０月１２日に受託番号ＮＣＩＭＢ４１８７０としてＮＣＩＭＢコレクションに寄託した。
本発明は、ＥＭＳで突然変異させたソルガム植物に限定されない。他の突然変異方法、例えば、放射線照射および化学的変異原などの方法により得られたソルガム植物も本発明の範囲内にある。除草剤耐性突然変異植物を、除草剤と共に培養された細胞に対する選択圧および除草剤耐性植物を生成するための耐性細胞の選択のプロセスを用いて取得することもできる。突然変異および育種方法の詳細を、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」Ｆｅｈｒ、１９９３、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に見出すことができる。
続いて、イミダゾリノン耐性植物突然変異体ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ（元の突然変異）に対する除草剤噴霧の効果を、エンドガミックソルガム系８０２３７（Ａｄｖａｎｔａ所有エリート系）の応答と比較した。その目的のために、植物を、畑上で、イミダゾリノンファミリーに属する３つの除草剤：イマゼタピル、イマザピル、およびイマザピックで処理した。４つの異なる施用率をアッセイした：それぞれの除草剤について１Ｘ、２Ｘ、３Ｘ、および４Ｘ。それぞれの除草剤に関する推奨される畑施用率（１Ｘ）を、表１に示す。
Figure 2015512640
噴霧の１０日後、全ての植物を、空中組織における乾燥物量（ＤＭ）についてアッセイした。その結果を図１に示す。
本発明のＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体の応答を、エンドガミック系８０２３７のものと比較した。表２は、未処理対照と比較した乾燥物量のパーセンテージ（ＤＭ％対照）として表した、異なる施用率のイマゼタピル、イマザピル、およびイマザピックの効果を示す。開示された値は、３回の実験の平均である。
Figure 2015512640
これらの結果は、本発明のＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体が４Ｘの施用率でも３つの試験したイミダゾリノン群の除草剤に対して耐性であることを示す。逆に、元のエンドガミック系８０２３７は、推奨される施用率（１Ｘ）が適用される場合でも、全ての除草剤に対して明確に感受性である。
見られるように、本発明の除草剤耐性ソルガム植物は、イマゼタピル、イマザピック、またはイマザピルなどのイミダゾリノン群の除草剤に対して耐性である。
イミダゾリノン耐性ソルガム植物に、公知のイミダゾリノン除草剤群のいずれかの使用の推奨量の４倍である量を噴霧することができる。耐性植物は、例えば、ＮＣＩＭＢ４１８７０種子に由来する植物において観察されるような耐性形質を有してもよく、またはそれは、それから誘導された植物、子孫、もしくはそのゲノム中に、ソルガムＡＨＡＳタンパク質の位置９３または等価な位置にアラニンからトレオニンへの置換を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、野生型ソルガム植物と比較してイミダゾリノン群に由来する１つまたは複数の除草剤に対する耐性が増大した他の植物であってもよい。
さらに、当業者であれば、そのようなアミノ酸位置が、アミノ酸が付加されるか、または例えば、アミノ酸配列のＮ末端から除去されるかどうかに応じて変化してもよいことを認識するであろう。「等価な位置」とは、例示されたアミノ酸位置と同じ保存領域内にある位置を意味することが意図される。
本発明において、除草剤に対する用語「寛容性」および除草剤に対する「耐性」は、同じ意味およびイミダゾリノンまたはスルホニルウレアなどの除草剤に関連して用いられる場合、等価な範囲を有する。
本発明は、有効量の除草剤に対して耐性を示す植物、植物細胞、植物組織を提供する。「有効量」とは、野生型植物、植物細胞または組織の生長を阻害することができるが、耐性植物、植物細胞または植物組織に対する重篤な効果をもたらさない除草剤の量を意味する。除草剤の有効量は、雑草を排除するための推奨量である。野生型植物、細胞または組織は、例えば、イミダゾリノンまたはスルホニルウレアの群に属する除草剤の除草剤耐性形質を示さないものである。用語「植物」は、任意の段階の植物、または植物部分を包含し、前記植物部分は知識を有する植物学者には周知の種子、葉、花、茎、組織または器官であってもよい。
突然変異を検出するために、前記ＡＨＡＳポリペプチドまたはラージサブユニットが除草剤耐性である、アセトヒドロキシ酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする本発明の突然変異ソルガムＡＨＡＳ遺伝子を配列決定した。
突然変異植物に由来するＡＨＡＳ遺伝子ＤＮＡ配列と、野生型ソルガム植物に由来するＡＨＡＳ遺伝子ＤＮＡ配列との比較により、ヌクレオチド位置＋２７７のＧヌクレオチドがＡに変化する点突然変異が同定されたが、これは本発明のＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体から元のソルガム８０２３７系（野生型）を識別するものである。突然変異体および野生型系に由来するＡＨＡＳアミノ酸配列を推定した場合、ヌクレオチド置換（配列番号１のＡＣＧによるＧＣＧ）がコドン９３で突然変異ポリペプチドをコードし、アセトヒドロキシ酸合成酵素活性を示し、突然変異ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ系のソルガムＡＨＡＳタンパク質のラージサブユニットに対応するポリペプチド（配列番号２）中のアラニンからトレオニン（Ａｌａ９３Ｔｈｒ）への置換をもたらすことが観察された。
前記ポリペプチドの位置９３または異なる種に属する別のＡＨＡＳ酵素の等価な位置にアラニンからトレオニン（Ａｌａ９３Ｔｈｒ）への置換を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む植物、植物部分、種子、その子孫、トランスジェニック植物なども本発明の範囲内にある。
少なくとも８５％、９５％、または９８％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドも本発明の範囲内にある。配列同一性パーセントは、２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列のアラインメントにより決定される。２つの配列間のアラインメントのパーセンテージを、例えば、以下の式：
（同一の位置の量／重複する位置の総量）ｘ１００
を用いて算出することができる。
２つの配列間のアラインメントのパーセンテージは、様々な数学アルゴリズム、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３頁のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに含まれるアルゴリズムを用いて決定される。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを用いる場合、対応するプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。配列の比較のために用いられる数学アルゴリズムの別の好ましい非限定例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１〜１７頁のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを用いる場合、ＰＡＭ１２０ウェイト残基テーブル（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを用いることができる。また、アラインメントを手動による検査により実施することもできる。
本発明は、除草剤耐性を付与するポリヌクレオチドおよびタンパク質を含む。除草剤耐性ポリヌクレオチドを参照する場合、それは除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質をコードするポリヌクレオチドを意味すると理解される。除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質は、天然であっても、または突然変異体であってもよく、それらはイミダゾリノンまたはスルホニルウレアの群に属する除草剤に対する耐性を付与する。
イミダゾリノン、例えば、イマゼタピルに対する耐性の継承を、イマゼタピル感受性系とＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体とを交配することにより生成された分離Ｆ２ソルガム集団において評価した。かくして得られたＦ２植物に、発芽後の段階Ｖ６で３Ｘ、２０日間の施用率でイマゼタピル（Ｐｉｖｏｔ（登録商標）、ＢＡＳＦ）を噴霧し、表現型症状を、処理の１０日後に評価した。その結果を表３に提供する。
Figure 2015512640
結果は、Ｆ２植物集団を、３つの表現型カテゴリー：損傷のない植物、萎黄病植物および枯死した植物に個体をグループ化するのを可能にする表現型スコアリングによる視覚的症状に基づいて分類することができることを示す。
配列決定により、本発明の除草剤寛容性ソルガム突然変異体が、アセトヒドロキシ酸合成酵素活性を有するポリペプチドまたはＡＨＡＳタンパク質のラージサブユニット中に点突然変異を有することが示された。配列番号１に記載のヌクレオチド配列は、ヌクレオチドＧが、ヌクレオチド位置＋２７７（コドン９３に対応する）でＡに変化していることを示し、これは本発明の誘導されたＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体から元のソルガムエンドガミック系８０２３７（除草剤に対して感受性である）を識別するものである。この分子マーカーを、ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳと命名した。
除草剤耐性である可能性のある植物、植物部分または種子を検出するためのＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳマーカーの有用性を決定するために、除草剤耐性ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体（ＶＴ０９−９７５４−４８−６−ＢＫ選択）と、除草剤感受性エンドガミック系９０５２３とを交配させることにより生成されたＦ２集団（本明細書ではＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒｘ９０５２３ Ｆ２集団と命名する）に由来する１７７個の植物を試験した。図３は、一例として、Ｆ２集団からのいくつかの植物の対立遺伝子識別を示す。２つの試験した対照を、予想されるクラスターにグループ化した（それぞれ、ホモ接合耐性およびホモ接合感受性の、ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体および野生型９０５２３）。これらのデータにより、分子マーカーＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳが、アセトヒドロキシ酸合成酵素活性を有するポリペプチドまたはソルガムＡＨＡＳタンパク質のラージサブユニットをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド位置＋２７７の３つの対立遺伝子組合せを識別するのに有用であることが確認される。
当業者であれば、ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳマーカーおよびその使用の開示を考慮して、例えば、イミダゾリノンおよび／またはスルホニルウレアの群に属する除草剤、例えば、イマゼタピル、イマザピックなどに対する除草剤耐性植物を同定することができる。同定方法は、本明細書に記載の方法に加えて、任意の他の公知の方法であってもよく、例えば、ＡＳＡ（Ｓｏｌｅｉｍａｎｉら（２００３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｐ ２１：２８１〜２８８頁）、ＰＡＭＳＡ（Ｇａｕｄｅｔら（２００７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｐ ２５：１〜９頁）、ＳＳＣＰ（ＧｅｒｍａｎｏおよびＫｌｅｉｎ（１９９９）Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ９９：３７〜４９頁）またはＴａｑＭａｎ（登録商標）（Ｊｏｎｅｓら（２００８）Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６４：１２〜１５頁）を参照されたい。
耐性表現型と突然変異対立遺伝子数との相関を、ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳマーカーを用いて分析した。この目的のために、Ｆ２子孫（ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒｘ９０５２３）に由来する個々の植物の萎黄病および枯死表現型を、イマゼタピルを噴霧した後に試験した。同時に、ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳマーカーの遺伝子型を試験した。その結果を表４に示す。分子マーカーＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳと、イマゼタピルに対する耐性との相関（表現型の評定として測定）を、カイ二乗独立検定を用いて決定した。この試験により、表現型および遺伝子型共分離に従う、ＡＨＡＳ遺伝子中の誘導された突然変異（特異的ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳマーカーを用いて遺伝子型決定された）と、イマゼタピルに対する耐性との高度に有意な相関を示す確率ｐ＝１．９４８ｅ−４６が得られた。
Figure 2015512640
さらに、除草剤耐性および特異的ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳマーカーの遺伝子マッピングを実行した。ＧｅｎＢａｎｋ（受託番号ＧＭ６６３３６３．１、配列番号４）に開示されたソルガムＡＨＡＳ配列に基づいて、ＢＬＡＳＴ分析を実行して、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒのＤＮＡ配列と、Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ．ｎｅｔ／ｓｅａｒｃｈ．ｐｈｐ）とを一致させた。図４に示される結果は、イミダゾリノン群に属する除草剤に対する耐性と関連するＡＨＡＳ配列がＳｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒゲノムの染色体４中に位置することを示している。この情報に基づくフィンガープリンティング（遺伝子型決定）手順を、様々なＳＳＲ型ＤＮＡ分子マーカーを用いて本発明の突然変異ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ系およびエンドガミック９０２５３系について実行した。染色体４に位置する７個の多型ＳＳＲを、遺伝子型決定のために選択した（Ｍａｃｅ、ＥＳら、Ａ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐ ｏｆ ｓｏｒｇｈｕｍ ｔｈａｔ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｍａｐｓ ａｎｄ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｒｒａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＤＡｒＴ） ｍａｒｋｅｒｓ、ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００９、９：１３頁；Ｓｒｉｎｉｖａｓ、Ｇら、Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｒｏｍ ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ ｄｒｏｕｇｈｔ ｓｔｒｅｓｓ ＥＳＴｓ ｉｎ Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ（Ｌ．）、Ｍｏｅｎｃｈ．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．２００９、１１８：７０３〜７１７頁；Ｒａｍｕ、Ｐら、Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｍａｒｋｅｒｓ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｕｂｌｉｃ ｄｏｍａｉｎ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｒｅｅｄｉｎｇ、Ｍｏｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ２０１０、２６：４０９〜４１８頁；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｂｋ．ａｒｓ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ｐｓｇｄ／ｓｏｒｇｈｕｍ／２００９ＳｏｒｇｈｕｍＳＥＡＭｓ＿ＬＢＫＡＲＳ．ｘｌｓ）。
この手順の結果を用いれば、ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳマーカーと耐性表現型の両方を遺伝子マッピングすることが可能であったが、これはイミダゾリノンに対する耐性および特異的ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳマーカーが、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒの染色体４中の以前に同定されたＳＳＲにフランキングして染色体４中に位置することを示している（図５）。
本発明のポリヌクレオチド（配列番号１）を、トランスジェニック植物を得るために植物中に導入することができる。ポリヌクレオチドを植物、特に、農業目的の植物、例えば、トウモロコシ、ダイズ、ソルガム、コムギ、サトウキビ、アマ、ヒマワリまたは他の植物；野菜、樹木、または観葉植物に導入するための様々な方法がある。トランスジェニック植物を得るためにポリヌクレオチドを導入する方法は当業界で周知であり、組換え方法を用いることもできる。
例えば、ベクターを用いる植物の形質転換のための様々な方法がある（Ａｎ、Ｇ．ら（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｐｙｓｉｏｌ．，８１：３０１〜３０５頁；Ｆｒｙ、Ｊ．ら（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，６：３２１〜３２５頁；Ｂｌｏｃｋ、Ｍ．（１９８８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ．，７６：７６７〜７７４頁；Ｈｉｎｃｈｅｅら（１９９０）Ｓｔａｄｌｅｒ．Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｍｐ．，２０３２１２．２０３〜２１２頁；Ｂａｒｃｅｌｏら（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｊ．，５：５８３〜５９２頁；Ｂｅｃｋｅｒら（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｊ．，５：２９９〜３０７頁；Ｂｏｒｋｏｗｓｋａら（１９９４）Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ．，１６：２２５〜２３０頁；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：２３９〜２４６頁；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：３０９〜３１４頁；Ｄｈｉｒら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９９：８１〜８８頁；Ｃａｓａｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１２１２〜１１２１６頁；Ｄｏｎｇ、Ｊ．Ａ．およびＭｃｈｕｇｈｅｎ、Ａ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．，９１：１３９〜１４８頁；Ｇｏｌｏｖｋｉｎら（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．，９０：４１〜５２頁；Ｇｕｏ Ｃｈｉｎ Ｓｃｉ．，Ｂｕｌｌ．，３８：２０７２〜２０７８頁；Ａｓａｎｏら（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，１３；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ、Ｐ．（１９９４）Ａｇｒｏ．Ｆｏｏｄ．Ｉｎｄ．Ｈｉ Ｔｅｃｈ．，５：１７〜２７頁；Ｅａｐｅｎら（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，１３：５８２〜５８６頁；Ｈａｒｔｍａｎら（１９９４）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：９１９９２３頁；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ、Ｐ．（１９９３）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．−Ｐｌａｎｔ；２９Ｐ：１１９〜１２４頁；Ｄａｖｉｅｓら（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，１２：１８０〜１８３頁；Ｒｉｔａｌａら（１９９４）Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３１７〜３２５頁；ならびにＷａｎ、Ｙ．Ｃ．およびＬｅｍａｕｘ、Ｐ．Ｇ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０４：３７４８頁）。
植物を形質転換するためのいくつかの方法および遺伝子操作技術が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．に記載されている。
ベクターを、米国特許第４，９４５，０５０号およびＣａｓａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、９０：１１２１２頁、１９９３に記載されたものなどの弾道粒子加速技術を用いて導入することもできる。
例えば、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された植物は、除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質を発現し、イミダゾリノンおよび／またはスルホニルウレアなどの除草剤に対する耐性形質を示す。「除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質」とは、除草剤が野生型ＡＨＡＳタンパク質のＡＨＡＳ活性を阻害する濃度でＡＨＡＳ活性を阻害する除草剤の存在下にある場合、野生型ＡＨＡＳ活性のものよりも高いＡＨＡＳ活性を示すタンパク質を意味する。
本発明のポリヌクレオチド配列を、対象、例えば、農業対象の植物において耐性ＡＨＡＳタンパク質を発現させるための発現カセット中に含有させることができる。このカセットは、例えば、少なくとも１つのプロモーターに作動可能に連結された調節配列を含む。プロモーターは当業界で周知であり、例えば、構成的、誘導的、組織特異的、葉緑体特異的プロモーターであってもよく、それらは全て植物中で機能的である。カセットは、当業界で公知の転写終結配列をさらに含む。カセットは、除草剤耐性ＡＨＡＳポリヌクレオチドの発現効率を改善するための様々な調節配列、例えば、イントロン、ウイルス配列などのエンハンサーを含んでもよく；または前記ポリヌクレオチドに結合した、もしくは結合していない、本発明のポリヌクレオチドとは異なる対象の他のポリヌクレオチド配列；またはリーダー配列を含んでもよい。
プロモーターとしては、限定されるものではないが、構成的、誘導的、組織または器官特異的プロモーター、例えば、３５Ｓプロモーター、創傷もしくは化学誘導性プロモーター、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターなどが挙げられる（Ｃｈａｏら、１９９９、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２０：９７９頁；米国特許第５，１８７，２６７号、米国特許第５，０５７，４２２号）。
また、植物において有用であり得る好適な転写ターミネーターも当業者には公知であり、例えば、Ｏｄｅｌｌら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０頁；Ｓａｎｆａｃｏｎら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，５：１４１頁、１９９０；Ｍｕｎｒｏｅら、１９９０ Ｇｅｎｅ ９１：１５１頁；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、１９８７、Ｇｅｎｅ ５６：１２５頁；Ｊｏｓｈｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１５：９６２７頁、１９８７を参照されたい。
「作動可能に連結された」とは、プロモーターと第２の配列との機能的連結を指すことが意図される。プロモーター配列は、第２の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始、媒介する。用語「作動可能に連結された」とは、連結される核酸配列が連続的であり、２つのタンパク質コード領域を結合させるのに必要である場合、連続的であり、同じ読み枠中にあることを意味する。カセットは、複数の発現カセットであってもよい。
本発明のポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドの融合物の形態で、または別々に、他のポリヌクレオチドに結合させることができる。他のポリヌクレオチドは、例えば、当業者には周知である除草剤耐性、昆虫耐性または他の植物部分をコードしてもよい。
植物中での発現を改善するために、本発明のポリヌクレオチドを、例えば、植物にとって好ましいコドンを含有させること、イントロンまたは有害な配列などの配列を欠失させることにより改変することができる。また、突然変異され、例えば、欠失もしくは挿入を示す本発明の耐性ＡＨＡＳポリペプチドまたは本明細書に記載のものとは異なる他の突然変異をコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲内にある。「突然変異ポリヌクレオチド」とは、そのヌクレオチド配列中に永続的な変化を有するポリヌクレオチドを意味する。
本発明のポリヌクレオチドを、置換、欠失、トランケーション、および挿入により変化させることができる。そのような操作のための方法は当業界で一般に公知である。突然変異誘発およびヌクレオチド配列変化のための方法は当業界で周知である（Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８２：４８８〜４９２頁；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：３６７〜３８２頁；ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびそこで引用された参考文献）。対象のタンパク質の生物活性に影響しないアミノ酸置換を、引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．）に見出すことができる。
本発明のＡＨＡＳポリヌクレオチドを含むＤＮＡを、ベクターの一部として様々な植物に導入することができる。好適なベクターの選択は、形質転換のために用いられることが意図される方法および形質転換される植物に依存する。当業者であれば、様々なベクター、例えば、Ｔｉおよび／またはＲｉをよく知っている。Ｔ−ＤＮＡも、ＴｉまたはＲｉベクターを組込むためのフランキング領域として用いられる（ＷＯ８４／０２９１３、Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ ３０３：２０９頁；Ｈｏｒｓｃｈら、１９８４、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：４９６頁；Ｆｒａｌｅｙら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ ８０：４８０３頁）。
ベクターは、発現カセットおよび他のヌクレオチド配列、例えば、抗生物質または除草剤に対する耐性を付与するマーカーなどの選択マーカーおよび植物中での対象のポリヌクレオチド、例えば、配列番号２のＡＨＡＳラージサブユニットポリペプチドの発現を誘導するための配列を含んでもよい。
本発明の耐性ＡＨＡＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、イミダゾリノンおよびスルホニルウレアの型の除草剤に対して耐性であるトランスジェニック植物を取得するのに有用であってもよい。形質転換植物は、双子葉植物または単子葉植物などの任意の型の植物であってもよく、特に、限定されるものではないが、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ種（例えば、Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｒａｐａ、Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、コメ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、キビ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ）、（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ）、（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｔ．Ｔｕｒｇｉｄｕｍ ｓｓｐ．ｄｕｒｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ ｓｐｐ．）、ココナッツ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）、柑橘類の木（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐｐ．）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、サトウダイコン（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．）、野菜、観葉植物、および樹木などの農業対象の植物が挙げられる。好ましくは、本発明の植物は、ソルガムである。
本発明は、以下の実施例により良好に例示されるが、その範囲を限定すると解釈されるべきではない。逆に、本発明の他の実施形態、改変物および等価物が、本明細書を読んだ後に可能となり、当業者であれば、本発明の精神および／または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく提言することができることが明確に理解されるべきである。
［エンドガミックソルガム系８０２３７の突然変異誘発およびイミダゾリノン耐性突然変異体８０２３７ＥＭＳ２−１９２の選択］
エンドガミック系８０２３７に由来する３２０００個の予め発芽させたソルガム種子を、０．０５％ｖ／ｖのエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）の水性溶液中に１６時間浸した。処理された種子を２００７年１２月２１日にＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｖａｎｔａ Ｓｅｅｄｓ ｉｎ Ｖｅｎａｄｏ Ｔｕｅｒｔｏ、Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｏｆ Ｓａｎｔａ Ｆｅ、Ａｒｇｅｎｔｉｎａのプロット１番（３３°４１’４７’’Ｓ；６１°５８’４５’’Ｗ）に植え、それらを開放授粉のために放置した。
合計２７３個のＭ１植物を選択し、それぞれの植物からの２個の種子を２００８年５月２３日にＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｖａｎｔａ Ｓｅｅｄｓ ｉｎ Ｏｒａｎ、Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｏｆ Ｓａｌｔａ、Ａｒｇｅｎｔｉｎａ（２２°４９’３７’’Ｓ；６４°２０’１４’’Ｗ）の苗床に植え、合計５４６個のＭ２植物を得た。それぞれの対の一方の植物から花粉を採取し、その対の他方の植物を授粉させるのに用いた。２７３個の授粉したＭ２植物のそれぞれから得られたＭ３種子を収穫した。合計２７３個の畝間のＭ３子孫を２００８年１２月１６日にＶｅｎａｄｏ Ｔｕｅｒｔｏに植え、それぞれのＭ３畝間に由来する５０個の植物に２００８年１２月２３日に１００ｍｌ Ｌ ａ．ｉ．／ｈａのイマゼタピルを噴霧した。畝間に由来する６８個の植物は除草剤による処理後に正常な生長および症状の非存在を示し、除草剤に耐性であると考えられ、ＶＴ０９−９７５４と同定された。畝間に由来する耐性植物の系譜を同定し、それらを８０２３７ＥＭＳ２−１９２と命名した（以後、ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒと呼ぶ）。
世代の歴史を表５に示す。
Figure 2015512640
［元のソルガムエンドガミック系８０２３７と比較した、耐性ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体におけるイミダゾリノンによる処理に対する応答率の分析］
ソルガム系８０２３７（Ａｄｖａｎｔａ所有のエリート系）および本発明のイミダゾリノン耐性ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体（元の突然変異）に、畑上で、イミダゾリノン群中の３つの除草剤：イマゼタピル、イマザピル、およびイマザピックを噴霧した。４つの異なる施用率をそれぞれの除草剤についてアッセイした：１Ｘ、２Ｘ、３Ｘおよび４Ｘ（１Ｘが推奨される施用率である）（上記の表１を参照されたい）。
畑実験をＶｅｎａｄｏ Ｔｕｅｒｔｏにおいて実行し、植付けを２０１０年１２月１日に行った。除草剤を発芽の２０日後に噴霧した（Ｖ６段階）。全ての処理を、その対応する未処理対照と比較した。実験設計は、３つの複製物に分割したプロットからなっていた（主プロット：除草剤による処理；副プロット：系）。
噴霧の１０日後、全ての植物を、空中組織における乾燥物量（ＤＭ）についてアッセイした。除草剤応答を、対応する未処理対照の空中組織におけるＤＭパーセンテージとして評価した。
かくして、それぞれの施用率ｊに関する除草剤ｉに対して感受性である系を、
ＤＭｉｊ％対照＝（ＤＭｉｊ＊１００）／ＤＭ対照
として表した。ＤＭｉｊ％対照は、それぞれの系に由来するそれぞれの処理に関する３回の実験の平均値である。
［アセトヒドロキシ酸合成酵素活性を有し、イミダゾリノン耐性である本発明の突然変異ポリペプチドをコードするソルガムＡＨＡＳ遺伝子の配列決定］
ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体（ＶＴ１１−１１３３１−ＢＫ選択）および野生型エンドガミック系８０２３７に由来する葉組織に関して配列決定試験を行った。ゲノムＤＮＡを単離し、１００ｎｇ／μｌの最終濃度で水中に再懸濁した。ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体およびソルガム系８０２３７に由来するアセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ）遺伝子の配列決定のために、受託番号ＧＭ６６３３６３．１の下でＧｅｎＢａｎｋに開示されたソルガムＡＨＡＳ配列に基づいて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅のための特異的プライマーを設計した。完全なＡＨＡＳコード配列を表す５つの重複するＤＮＡセグメント（アンプリコン）を生成するためにプライマーを設計した。設計されたプライマーの配列は以下の通りである。
Figure 2015512640
ＰＣＲ混合物は２５μｌの最終容量および以下の成分：１Ｘ反応バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２μＭの各プライマー、０．５μｌ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１００ｎｇのゲノムＤＮＡを有していた。ＰＣＲ反応を、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００サーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）中で実施し、増幅条件は以下の通りであった：９４℃で１分間の初期変性、次いで、９４℃で４５秒間、５７℃で４５秒間、および７２℃で７０秒間の３５サイクルのステップ、ならびに７２℃で１０分間の最終伸長ステップ。
両方ともＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ産物ならびに元のソルガム系８０２３７に関するＳｂＡＨＡＳ−Ｆ１およびＳｂＡＨＡＳ−Ｒ１ＯＬＤ１−Ｒ２プライマーを用いた場合、増幅産物は得られなかった。
この問題を克服するために、２つの新しいプライマーを設計して、第６のアンプリコンを生成した：
Figure 2015512640
上記のものと同じＰＣＲ条件を用いて、第６のアンプリコンを得た。
ＰＣＲによる増幅の結果生じる２μｌの各ＤＮＡ産物をアガロースゲル電気泳動により検査して、分子量マーカーＬｏｗ ＤＮＡ Ｍａｓｓ Ｌａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を参照して断片サイズおよびＤＮＡ濃度見積もり値を分析した。残りのＰＣＲ産物を、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶゲル（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。精製されたＤＮＡを、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者の説明書に従って用いて配列決定した。
各アンプリコンに関して得られたアセトヒドロキシ酸合成酵素の配列決定ファイルを、ＣＡＰ３ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｐｒｏｇｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｐｂｉｌ．ｕｎｉｖ−ｌｙｏｎ１．ｆｒ／ｃａｐ３．ｐｈｐ）を用いて整理した。アセトヒドロキシ酸合成酵素遺伝子の得られるＤＮＡ配列を、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗバージョン２．１プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇ）を用いて整列させた。
［イマゼタピル感受性系と、耐性ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体とを交配させることにより生成された分離Ｆ２ソルガム集団におけるイマゼタピル耐性の継承］
ソルガム系９０５２３（Ａｄｖａｎｔａ所有エリート系、イミダゾリノンに感受性）と、イミダゾリノン耐性ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体（ＶＴ０９−９７５４−４８−６−ＢＫ選択）との間で標的化交配を実行した。得られるＦ１植物を自家授粉させ、Ｆ２種子を収穫した。Ｆ２種子を、２０１０年１０月にＶｅｎａｄｏ Ｔｕｅｒｔｏの畑に植えた。Ｆ２植物（１７７個の植物）に、３ｘの施用率で（商業的使用のために製造業者により推奨される施用率は１Ｘであり、これは１００ｍｌ ａ．ｉ．／ｈａと等しい）、イマゼタピル（Ｐｉｖｏｔ（登録商標）、ＢＡＳＦ）を噴霧した。噴霧の前に、ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体（ＶＴ０９−９７５４−４８−６−ＢＫ選択）と野生型系９０５２３の両方に由来する１７７個のＦ２植物のそれぞれから葉組織を採取して、ゲノムＤＮＡを単離し、遺伝子型決定分析における使用のために最終濃度１００ｎｇ／μｌで水に再懸濁した。
除草剤を、発芽の２０日後に噴霧した（段階Ｖ６）。植物を噴霧の１０日後に評価し、以下の表現型スコアリングに従って視覚的に評価された症状により除草効果を３つのカテゴリーに分類した：
−１＝損傷なし
−２＝萎黄病
−３＝枯死。
［ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳに特異的なＤＮＡマーカーの開発］
ヌクレオチド位置＋２７７（コドン９３）のヌクレオチドＧをＡにより置きかえるＡＨＡＳ遺伝子中の単一の点突然変異は、誘導されたＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体から元のエンドガミックソルガム系８０２３７（除草剤感受性）を識別する。下記群の二重標識されたプライマーおよびプローブを用いて、分子マーカー（本明細書ではＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳと命名される）を設計した：
Figure 2015512640
ＡＢ ７５００サーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳ）を用いるリアルタイムＰＣＲ対立遺伝子識別アッセイにより、遺伝子型決定を行った。ＰＣＲ反応混合物を、１２．５μｌの２Ｘ Ｐｅｒｆｅｃｔａ（登録商標）ｑＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳ）、０．０８μＭのプライマー（フォワードおよびリバース）、０．４μＭのプローブ（１および２）、１０μｌのゲノムＤＮＡならびに最終容量を作るためのＤＮａｓｅ非含有水を含む２５μｌの最終容量で調製した。増幅条件は、９５℃で１０ｍｉｎの１回の初期変性サイクル、次いで、９２℃で１５秒間の変性および６０℃で１ｍｉｎのハイブリダイゼーション／伸長の５０サイクルであった。対立遺伝子識別アッセイの結果を、ＡＢ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＤＳ）７５００ １．４ソフトウェアプログラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳ）を用いて増幅後に分析した。
［除草剤耐性とＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ突然変異体中のＡＨＡＳ突然変異との相関］
ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒｘ９０５２３交配により得られた個々のＦ２子孫植物を、イマゼタピルを用いる噴霧（実施例４に記載の方法を用いる）後に表現型分類（損傷なし、萎黄病および枯死）した後、ＡＨＡＳ中の誘導された突然変異に特異的である分子マーカーＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳを用いて（実施例５に記載の方法を用いる）遺伝子型分類した。
［除草剤耐性および特異的ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳマーカーの遺伝子マッピング］
除草剤耐性および特異的ＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳマーカーを遺伝子マッピングした。Ｇｅｎｂａｎｋ（受託番号ＧＭ６６３３６３．１）に開示されたソルガムＡＨＡＳ配列に基づいて、ＢＬＡＳＴ分析を実行して、それをＰｈｙｔｏｚｏｍｅデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ．ｎｅｔ／ｓｅａｒｃｈ．ｐｈｐ）に寄託されたＳｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒのゲノムＤＮＡ配列と一致させた。
突然変異ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒ系およびエンドガミック系９０２５３の遺伝子型決定（フィンガープリンティング）を、ＳＳＲ型分子マーカー群を用いて実行した。Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒゲノムの染色体４に位置する７個の多型ＳＳＲを、遺伝子型決定のために選択した（Ｍａｃｅ、ＥＳら、Ａ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐ ｏｆ ｓｏｒｇｈｕｍ ｔｈａｔ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｍａｐｓ ａｎｄ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｒｒａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＤＡｒＴ） ｍａｒｋｅｒｓ、ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００９、９：１３頁；Ｓｒｉｎｉｖａｓ、Ｇら、Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｒｏｍ ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ ｄｒｏｕｇｈｔ ｓｔｒｅｓｓ ＥＳＴｓ ｉｎ Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ（Ｌ．）、Ｍｏｅｎｃｈ．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．２００９、１１８：７０３〜７１７頁；Ｒａｍｕ、Ｐら、Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｍａｒｋｅｒｓ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｕｂｌｉｃ ｄｏｍａｉｎ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｒｅｅｄｉｎｇ、Ｍｏｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ２０１０、２６：４０９〜４１８頁；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｂｋ．ａｒｓ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ｐｓｇｄ／ｓｏｒｇｈｕｍ／２００９ＳｏｒｇｈｕｍＳＥＡＭｓ＿ＬＢＫＡＲＳ．ｘｌｓ）。
７つの選択された多型ＳＳＲは以下の通りであった。
Figure 2015512640
試験したＳＳＲのそれぞれに由来する得られるＰＣＲ断片を、自動化配列決定装置ＡＢＩ３１３０ｘ１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるキャピラリー電気泳動により分解した。これらの７個のＳＳＲの遺伝子型決定を、ＡＤＶ−ＩＭＩ−Ｒｘ９０５２３交配から得られるＦ２子孫の１７７個の個体において行った。さらに、これらの同じ１７７個のＦ２子孫植物を、ＡＨＡＳ遺伝子中の導入された突然変異に特異的なＳＮＰ−ＳｂＡＨＡＳマーカーの存在に関して分析した。結果を、Ｆ２子孫植物に関するイマゼタピルの施用時の表現型評定に従って分類し、コンピュータプログラムＪｏｉｎＭａｐ（Ｖａｎ Ｏｏｉｊｅｎ、ＪＷおよびＶｏｏｒｉｐｓ、ＲＥ、ＪｏｉｎＭａｐ ３．０ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐｓ、Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、２００１、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて分析した。
Figure 2015512640

Claims (60)

  1. ソルガムＡＨＡＳタンパク質のラージサブユニットの位置９３にアラニンからトレオニンへの置換を有するポリペプチドをコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチドをゲノム中に含むソルガム植物であって、野生型ソルガム植物と比較して１つまたは複数の除草剤に対する耐性が増大した上記植物。
  2. 前記除草剤が、イミダゾリノンおよびスルホニルウレアからなる群から選択される、請求項１に記載のソルガム植物。
  3. 前記イミダゾリノン除草剤が、イマゼタピル、イマザピル、およびイマザピックからなる群から選択される、請求項２に記載のソルガム植物。
  4. 少なくとも１つのポリヌクレオチドが、配列番号１を含む、請求項１に記載のソルガム植物。
  5. コードされる前記ポリペプチドが配列番号２を含む、請求項１に記載のソルガム植物。
  6. ＮＣＩＭＢ４１８７０に記載のＡＨＡＳ遺伝子中に突然変異を含む、請求項１に記載のソルガム植物。
  7. 前記ソルガム植物が、ＮＣＩＭＢ４１８７０について記載された耐性と同様なイミダゾリノン群の１つまたは複数の除草剤に対する増大した耐性形質を含む、請求項１に記載のソルガム植物。
  8. １つまたは複数の除草剤に対する耐性が増大した前記ソルガム植物が、別のソルガム植物への遺伝子移入により耐性形質を導入するのに有用である、請求項６または７に記載のソルガム植物。
  9. 前記植物がトランスジェニックである、請求項１に記載のソルガム植物。
  10. 前記植物が非トランスジェニックである、請求項１に記載のソルガム植物。
  11. 前記ソルガム植物が、ＮＣＩＭＢ４１８７０などの植物、ＮＣＩＭＢ４１８７０植物の子孫、ＮＣＩＭＢ４１８７０突然変異植物およびＮＣＩＭＢ４１８７０突然変異体の子孫からなる群から選択される、ＮＣＩＭＢ４１８７０の耐性形質を含む除草剤耐性ソルガム植物。
  12. 前記除草剤がイミダゾリノン群に属する、請求項１１に記載のソルガム植物。
  13. 前記植物がトランスジェニックである、請求項１１に記載のソルガム植物。
  14. 前記植物が非トランスジェニックである、請求項１１に記載のソルガム植物。
  15. ソルガムＡＨＡＳタンパク質のラージサブユニットの位置９３にアラニンからトレオニンへの置換を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをゲノム中に含むソルガム種子。
  16. 前記種子が野生型ソルガム植物と比較してイミダゾリノン群中の１つまたは複数の除草剤に対する耐性が増大した植物を生成する、請求項１５に記載の種子。
  17. 前記種子が寄託された種子ＮＣＩＭＢ４１８７０に示されるＡＨＡＳ遺伝子中に突然変異を含む、請求項１５に記載の種子。
  18. 請求項１から１０のいずれか１項に記載の植物の種子。
  19. 請求項１１から１４のいずれか１項に記載の植物の種子。
  20. ａ）ソルガム植物に由来する核酸試料を準備するステップと、
    ｂ）ソルガム植物に由来する前記核酸試料中に存在するＡＨＡＳ遺伝子に対応する領域を増幅する工程と、
    ｃ）イミダゾリノン群に由来する除草剤に対する耐性を付与する突然変異である、増幅された核酸試料中の少なくとも１個の前記突然変異の存在に基づいて除草剤耐性植物を同定するステップと
    を含む、除草剤耐性植物を同定するための方法。
  21. 前記核酸試料がＭＣＩＭＢ４１８７０に存在する突然変異などの少なくとも１個の突然変異を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記少なくとも１個の突然変異がコードされたポリペプチド中にＡｌａ９３Ｔｈｒ置換を含み、前記ポリペプチドがアセトヒドロキシ酸合成酵素活性を有する、請求項２０に記載の方法。
  23. 前記核酸試料が配列番号１を含む、請求項２０に記載の方法。
  24. 前記ポリペプチドが配列番号２を含む、請求項２２に記載の方法。
  25. 前記植物が単子葉植物である、請求項２０に記載の方法。
  26. 前記植物が双子葉植物である、請求項２０に記載の方法。
  27. 前記植物がトランスジェニック植物である、請求項２０に記載の方法。
  28. 前記植物が非トランスジェニック植物である、請求項２０に記載の方法。
  29. 前記除草剤がイミダゾリノンおよびスルホニルウレアの群から選択される、請求項２０に記載の方法。
  30. イミダゾリノン群またはスルホニルウレア群中の、有効量の除草剤を雑草および作物植物に施用するステップを含む、作物植物のごく近くにある雑草を防除する方法。
  31. 前記イミダゾリノン除草剤が、イマゼタピル、イマザピック、およびイマザピルからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記作物植物が、
    ａ）ソルガムＡＨＡＳタンパク質の位置９３にアラニンからトレオニンへの置換を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをそのゲノム中に含むソルガム植物であって、野生型ソルガム植物と比較してイミダゾリノンまたはスルホニルウレアの群中の１つまたは複数の除草剤に対する耐性が増大した前記植物、
    ｂ）ＮＣＩＭＢ４１８７０中などのＡＨＡＳ遺伝子中に突然変異を含むソルガム植物、
    ｃ）ＮＣＩＭＢ４１８７０により示される耐性などの、イミダゾリノンまたはスルホニルウレアの群中の１つまたは複数の除草剤に対する増大した耐性形質を含むソルガム植物、
    ｄ）ソルガム植物ａ）〜ｃ）の植物、子孫、誘導体または突然変異体
    からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
  33. ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、
    ｂ）配列番号２に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
    ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有し、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
    ｄ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも８５％の同一性を有し、ＡＨＡＳのラージサブユニットを含み、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
    ｅ）ヌクレオチド配列ａ）〜（ｄ）の１つと完全に相補的なヌクレオチド配列
    からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
  34. 前記ポリヌクレオチドがＡＨＡＳのラージサブユニット中にＡｌａ９３Ｔｈｒ置換を含むポリペプチドをコードする、請求項３３に記載のポリヌクレオチド。
  35. 発現カセットに作動可能に連結された請求項３３に記載のヌクレオチド配列を含む、発現カセット。
  36. 前記ポリヌクレオチドの発現を誘導する少なくとも１個のプロモーターをさらに含む、請求項３５に記載の発現カセット。
  37. 前記プロモーターが植物、細菌、真菌、動物細胞および原生動物中での発現のためのプロモーターを含む群から選択される、請求項３６に記載の発現カセット。
  38. 請求項３５に記載の発現カセットで形質転換された細胞。
  39. 前記細胞が細菌、真菌、酵母、植物細胞、および動物細胞からなる群から選択される、請求項３８に記載の細胞。
  40. ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、
    ｂ）配列番号２に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
    ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有し、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
    ｄ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも８５％の同一性を有し、ＡＨＡＳのラージサブユニットを含み、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
    ｅ）ヌクレオチド配列ａ）〜（ｄ）の１つと完全に相補的なヌクレオチド配列
    からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを有し、選択可能な遺伝子、前記ヌクレオチド配列の発現を誘導することができるヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも１個のプロモーターをさらに含む、形質転換ベクター。
  41. 細菌、真菌、酵母、植物細胞および動物細胞を含む群から選択される細胞を形質転換するための、請求項４０に記載のベクターの使用。
  42. ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、
    ｂ）配列番号２に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
    ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有し、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
    ｄ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも８５％の同一性を有し、ＡＨＡＳのラージサブユニットを含み、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
    ｅ）ヌクレオチド配列ａ）〜（ｄ）の１つと完全に相補的なヌクレオチド配列
    を含む群から選択されるポリヌクレオチドに作動可能に連結された、植物のゲノム中に組込まれた少なくとも１個のプロモーターを含み、ベクターが選択可能な遺伝子、前記ヌクレオチド配列の発現を誘導することができるヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも１個のプロモーターをさらに含む、形質転換された植物。
  43. 前記プロモーターが組織特異的プロモーターおよび葉緑体特異的プロモーターからなる群から選択される、請求項４２に記載の植物。
  44. 前記植物が単子葉植物である、請求項４２に記載の植物。
  45. 前記植物が双子葉植物である、請求項４２に記載の植物。
  46. 前記植物がソルガム、トウモロコシ、コメ、およびコムギからなる群から選択される、請求項４４に記載の植物。
  47. 前記植物がダイズおよびアブラナからなる群から選択される、請求項４５に記載の植物。
  48. 前記植物が非形質転換植物と比較して増大した除草剤耐性を含む、請求項４２に記載の植物。
  49. 前記除草剤がイミダゾリノンおよびスルホニルウレアからなる群から選択される、請求項４２に記載の植物。
  50. ｉ）ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、
    ｂ）配列番号２に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
    ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有し、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
    ｄ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも８５％の同一性を有し、ＡＨＡＳのラージサブユニットを含み、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および
    ｅ）ヌクレオチド配列ａ）〜ｄ）の１つと完全に相補的なヌクレオチド配列
    の群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む発現カセットまたはベクターであって、前記発現カセットが前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結された少なくとも１個のプロモーターをさらに含み、前記プロモーターが前記ポリヌクレオチドの発現を誘導する、上記発現カセットまたはベクターを用いて植物細胞を形質転換するステップと、
    ｉｉ）前記植物細胞を再生して、除草剤耐性植物を取得するステップと
    を含む、除草剤耐性植物または除草剤耐性が増大した植物を取得するための方法。
  51. 前記プロモーターが植物組織特異的プロモーターを含む、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記プロモーターが葉緑体特異的プロモーターを含む、請求項５０に記載の方法。
  53. 前記除草剤がイミダゾリノンおよびスルホニルウレアからなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
  54. 前記イミダゾリノン除草剤がイマゼタピル、イマザピック、およびイマザピルを含む群から選択される、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記植物が単子葉植物である、請求項５０に記載の方法。
  56. 前記植物が双子葉植物である、請求項５０に記載の方法。
  57. 前記植物がソルガム、トウモロコシ、コメおよびコムギからなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
  58. 前記植物がダイズおよびアブラナからなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
  59. 前記植物が非形質転換植物と比較して増大した除草剤耐性を含む、請求項５０に記載の方法。
  60. 前記植物がＡＨＡＳのラージサブユニットを含み、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性を示す、請求項５０に記載の方法。
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