DE112018006097T5

DE112018006097T5 - Gegen Triazolpyrimidin-Herbizid resistentes Rapsgen und seine Verwendung

Info

Publication number: DE112018006097T5
Application number: DE112018006097.7T
Authority: DE
Inventors: Maolong Hu; Huiming Pu; Weihua Long; Jianqin Gao; Jiefu Zhang; Song Chen; Li Cheng; Qi Peng; Feng Chen; Xiaoying Zhou; Wei Zhang; Sanxiong Fu; Xiaodong Wang
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-08-24
Filing date: 2018-08-24
Publication date: 2020-09-03
Also published as: CA3084844A1; WO2020037642A1; CN111373035B; CN111373035A

Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt ein Rapsgen bereit, das resistent gegen Triazolpyrimidin-Herbizid ist und die Verwendung davon. Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung eine Rapspflanze bereit, die resistent gegen Triazolpyrimidin-Herbizid ist und einen Teil, ein Resistenzgen, ein mutiertes Protein davon und Verwendungen davon.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das technische Gebiet der Pflanzengentechnik, insbesondere auf ein Rapsgen, das resistent ist gegen ein Triazolpyrimidin-Herbizid, und Verwendung davon. Genauer gesagt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Rapspflanze, die resistent ist gegen ein Triazolpyrimidin-Herbizid, und einen Teil, ein Resistenzgen, ein mutiertes Protein und Verwendungen davon.
Stand der Technik
Raps ist die Ölpflanze mit der größten Anbaufläche und der breitesten regionalen Verteilung in China. China ist das Land mit der höchsten Rapsherstellung der Welt. Eine der wichtigsten biologischen Gefahren in der Rapsherstellung ist das Ackerunkraut, das mit den Rapspflanzen nicht nur um Wasser, Dünger und Licht konkurriert, sondern auch das Feldmikroklima der Rapspflanze verändert, und einige Unkräuter sind sogar Zwischenwirte für Schädlinge und Krankheiten der Rapspflanze, wodurch die Ausbreitung von Schädlingen und Krankheiten beschleunigt wird, was den Ertrag und die Qualität der Rapspflanze gravierend beeinträchtigt. Die manuelle Unkrautbeseitigung ist jedoch zeitaufwändig und mühsam, was die Herstellungskosten erhöht. Daher ist die Anwendung von Herbiziden zur Unkrautregulierung auf dem Feld eine unvermeidliche Wahl geworden.
Herbizide inhibieren hauptsächlich das Pflanzenwachstum oder töten Pflanzen ab, indem sie entscheidende Stoffwechselprozesse der Pflanzen inhibieren oder stören. Das Abzielen auf Schlüsselenzyme im Prozess der Aminosäurebiosynthese ist eine wichtige Richtung und ein Hotspot bei der Entwicklung neuer und hochwirksamer Herbizide. Die mit Acetolactat-Synthase (ALS; EC2.2..16) als das Zielenzym entwickelten Herbizide sind zu den Hauptprodukten neuer Hochleistungsherbizide geworden. ALS ist ein Enzym, das den ersten Schritt der Biosynthese von verzweigt-kettigen Aminosäuren (Valin, Leucin und Isoleucin) katalysiert. ALS-Inhibitor-Herbizide können die ALS-Enzymaktivität in Pflanzenzellen inhibieren, die Biosynthese verzweigt-kettiger Aminosäuren (Valin, Leucin und Isoleucin) behindern, wodurch sie die Teilung und das Wachstum von Pflanzenzellen inhibieren. Die Acetolactat-Synthase-Inhibitoren, die entwickelt wurden, schließen hauptsächlich Sulfonylharnstoffe, Imidazolinone, Pyrimidylbenzoate, Triazolpyrimidine (TP) und andere Herbizide ein.
Unter den vielen Acetolactat-Synthase-Inhibitoren haben sich die Triazolpyrimidin-Herbizide seit ihrer erfolgreichen Entwicklung in den 1990er Jahren sehr schnell entwickelt. Es wurde über fast 10 kommerzielle Varianten berichtet, einschließlich hauptsächlich Florasulam, Flumetsulam, Diclosulam, Penoxsulam usw. Triazolpyrimidin-Herbizide weisen einen ähnlichen Wirkmechanismus auf wie Sulfonylharnstoff-Herbizide und sind typische Acetolactat-Synthase-Inhibitoren. Triazolpyrimidin-Herbizide reduzieren die Aktivität von ALS in Pflanzen, und die Synthese von Valin, Leucin und Isoleucin wird inhibiert, was sich auf die Synthese von Proteinen auswirkt und dazu führt, dass die Pflanze das Wachstum stoppt und abstirbt. Das Herbizid wird sowohl von den Pflanzenwurzeln als auch von den Blättern absorbiert, durch den ganzen Körper geleitet, in Meristemen akkumuliert und inhibiert die Zellteilung. Die typischen Symptome der Unkrautbeschädigung sind: Chlorose der Blattmittelrippen, Verfärbung der Blattadern, Bleichen oder Violettfärbung der Blätter, Verkürzung der Internodien, Absterben der obersten Knospe und schließlich Absterben der ganzen Pflanze, wodurch der Zweck der Unkrautvernichtung erreicht wird.
Die Studie ergab, dass es signifikante Unterschiede in der Resistenzfunktionalität gab, wenn die Aminosäuresubstitution an unterschiedlichen Stellen von ALS auftrat und unterschiedliche Aminosäuren wurden an diesen Stellen zur Substitution verwendet (Yu Q, Han HP, Martin M, Vila-Aiub, Powles SB. AHAS herbicide resistance endowing mutations: effect on AHAS functionality and plant growth. J Exp Botany, 2010, 61:3925 - 3934). Die Resistenzwirkungen gegen ALS-Inhibitor-Herbizide, die durch Aminosäuresubstitutionen an unterschiedlichen Stellen hergestellt wurden, sind signifikant unterschiedlich, und gleichzeitig weisen Mutationen an unterschiedlichen Stellen eine komplexere Kreuzresistenzbeziehung gegen andere ALS- Inhibitor-Herbizide auf.
Es besteht auch ein Bedarf im Fachgebiet, Rapspflanzen zu erhalten, die Wachstumsvorteile gegenüber Unkräutern mit starker Vitalität aufweisen, und nicht transgene Rapspflanzen zu erhalten, die Triazolpyrimidin-Herbizide tolerieren können.
Inhalt der vorliegenden Erfindung
Die vorliegende Erfindung befasst sich mit diesem Bedarf und stellt eine mutierte Nukleinsäure von Acetolactat-Synthase (ALS) und ein Protein, das durch solch eine mutierte Nukleinsäure kodiert wird, bereit. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine Rapspflanze, eine Zelle und einen Samen, umfassend eine solche mutierte Nukleinsäure und Protein, und die Mutation verleiht der Rapspflanze Toleranz gegenüber einem Triazolpyrimidin-Herbizid, wobei ein ALS-Polypeptid, das durch das ALS-Gen kodiert wird, eine Aminosäure aufweist, die unterschiedlich zu Tryptophan an Position 556 davon ist, und eine Aminosäure, die unterschiedlich zu Prolin an Position 179 davon ist. In einer bevorzugten Ausführungsform weist das ALS-Polypeptid, das durch das ALS-Gen kodiert wird, eine Doppelmutation auf, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus W556L und P179S; W556L und P179T; W556L und P179L; W556L und P179A. In der am stärksten bevorzugten Ausführungsform weist das ALS-Polypeptid, das durch das ALS-Gen kodiert wird, die folgenden Mutationen auf: W556L und P179S.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte Nukleinsäure bereit, die für eine mutierte Acetolactat-Synthase (ALS3) kodiert, und wobei das mutierte Acetolactat-Synthase(ALS3)-Protein die folgenden Mutationen umfasst:

Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an einer Position, die Position 556 von SEQ ID Nr: 2 entspricht und
Mutation von Prolin (P) zu Serin (S), Threonin (T), Leucin (L) oder Alanin (A) an einer Position, die Position 179 von SEQ ID Nr: 2 entspricht;
bevorzugt weist die isolierte Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz wie in SEQ ID Nr: 3 gezeigt, auf;
bevorzugt, wobei das mutierte ALS3-Protein eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr: 4 gezeigt, aufweist.

In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Expressionskassette, einen Vektor oder eine Zelle bereit, die/der die Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung umfasst. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine Verwendung der Nukleinsäure, der Expressionskassette, des Vektors oder der Zelle oder des mutierten Acetolactat-Synthase(ALS3)-Proteins der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze bereit, die resistent ist gegen ein Herbizid, bevorzugt ist die Pflanze Raps.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze bereit, die resistent ist gegen ein Herbizid, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:

Einführen der Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung in eine Pflanze, bevorzugt Einführen der Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung in eine Pflanze durch einen Schritt wie zum Beispiel Transgenese, Hybridisierung, Rückkreuzung oder vegetative Vermehrung, wobei die Pflanze das mutierte Acetolactat-Synthase(ALS3)-Protein der vorliegenden Erfindung exprimiert und eine Resistenz gegen ein Triazolpyrimidin-Herbizid aufweist.

In noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine nicht transgene Pflanze oder einen Teil davon bereit, die/der gegen ein Triazolpyrimidin-Herbizid resistent ist, die eine isolierte Nukleinsäure umfasst, die für ein mutiertes Acetolactat-Synthase-Protein kodiert, wobei das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein die folgenden Mutationen umfasst:

Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an einer Position, die Position 556 von SEQ ID Nr: 2 entspricht und
Mutation von Prolin (P) zu Serin (S), Threonin (T), Leucin (L) oder Alanin (A) an einer Position, die Position 179 von SEQ ID Nr: 2 entspricht,
bevorzugt, wobei die Pflanze Raps ist; wobei der Teil ein Organ, ein Gewebe oder eine Zelle der Pflanze ist und bevorzugt ein Samen;
bevorzugt, wobei das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein eine Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an einer Position, die Position 556 von SEQ ID Nr: 2 entspricht, und eine Mutation von Prolin (P) zu Serin (S) an einer Position, die Position 179 von SEQ ID Nr: 2 entspricht, umfasst;
stärker bevorzugt, wobei das mutierte ALS3-Protein eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr: 4 gezeigt, aufweist.

In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Regulierung eines Unkrauts in einem Feld bereit, das eine Rapspflanze enthält, wobei das Verfahren umfasst: Anwenden einer wirksamen Menge eines Triazolpyrimidin-Herbizids auf das Feld, das das Unkraut und die Rapspflanze enthält, wobei die Rapspflanze eine isolierte Nukleinsäure umfasst, die für ein mutiertes Acetolactat-Synthase-Protein kodiert, und wobei das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein die folgenden Mutationen umfasst:

Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an einer Position, die Position 556 von SEQ ID Nr: 2 entspricht und
Mutation von Prolin (P) zu Serin (S), Threonin (T), Leucin (L) oder Alanin (A) an einer Position, die Position 179 von SEQ ID Nr: 2 entspricht;
bevorzugt, wobei das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein eine Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an einer Position, die Position 556 von SEQ ID Nr: 2 entspricht, und eine Mutation von Prolin (P) zu Serin (S) an einer Position, die Position 179 von SEQ ID Nr: 2 entspricht, umfasst;
stärker bevorzugt, wobei das mutierte ALS3-Protein eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr: 4 gezeigt, aufweist.

Figurenliste

1 zeigt die Alignment-Ergebnisse von Teilaminosäuresequenzen von Raps ALS3 aus unterschiedlichen Quellen. ALS3, eine Referenzsequenz von Genbank (Zugangsnummer: Z11526); ALS3-Aminosäure-Teilsequenz von ALS3_N131 Wildtypstamm N131; ALS3-Aminosäure-Teilsequenz von ALS3_EM28 resistentes Material EM28; ALS3-Aminosäure-Teilsequenz von ALS3_DS6 resistentes Material DS6. Pfeile zeigen mutierte Aminosäuren an.
2 zeigt die in vitro Aktivitäts-Inhibition von Wildtyp- und mutierten ALS-Enzymen durch Tribenuron-methyl bei unterschiedlichen Konzentrationen.
3 zeigt die in vitro Aktivitäts-Inhibition von Wildtyp- und mutierten ALS-Enzymen durch Imazethapyr bei unterschiedlichen Konzentrationen.
4 zeigt die in vitro Aktivitäts-Inhibition von Wildtyp- und mutierten ALS-Enzymen durch Florasulam bei unterschiedlichen Konzentrationen.

Detaillierte Beschreibung
Die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und ihre unterschiedlichen Merkmale und vorteilhaften Details werden durch Bezugnahme auf die nicht einschränkenden Ausführungsformen und Beispiele, die in den Zeichnungen beschrieben und/oder illustriert und in der folgenden Beschreibung ausführlich beschrieben sind, näher erklärt werden. Es ist zu beachten, dass die in den Zeichnungen beschriebenen Merkmale nicht notwendigerweise maßstabsgetreu gezeichnet sind, und die Merkmale einer Ausführungsform können mit anderen Ausführungsformen verwendet werden, wenn ein Fachmann sie erkennen kann, obwohl sie hier nicht eindeutig beschrieben sind.
Definitionen
Sofern nicht anders angegeben, sind die in den Ansprüchen und der Beschreibung verwendeten Begriffe wie unten aufgeführt definiert.
Der Begriff „nicht transgen“ bezieht sich darauf, dass einzelne Gene nicht über geeignete biologische Träger oder durch beliebige andere physikalische Mittel eingeführt werden. Ein mutiertes Gen kann jedoch durch Bestäubung (natürlich oder durch Zuchtverfahren) weitergegeben werden, um eine andere nicht transgene Pflanze herzustellen, die das jeweilige Gen enthält.
Der Begriff „endogenes“ Gen bezieht sich auf ein Gen in einer Pflanze, das nicht durch gentechnische Verfahren in die Pflanze eingeführt wird.
Die Begriffe „Nukleotidsequenz“, „Polynukleotid“, „Nukleinsäuresequenz“, „Nukleinsäure“ und „Nukleinsäuremolekül“ werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf Nukleotide, Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination aus beiden in Form eines unverzweigten Polymers von beliebiger Länge. Nukleinsäuresequenzen umfassen DNA, cDNA, genomische DNA, RNA, einschließlich künstlicher Formen und gemischter Polymere, einschließlich Sense- und Antisense-Stränge, oder können nicht natürliche oder abgeleitete Nukleotidbasen enthalten, wie der Fachmann diesen Punkt verstehen wird.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Polypeptid“ oder „Protein“ (beide Begriffe werden hierin austauschbar verwendet) auf ein Peptid, Protein oder Polypeptid, das eine Aminosäurekette einer gegebenen Länge umfasst, wobei die Aminosäurereste über kovalente Peptidbindungen verknüpft sind. Die vorliegende Erfindung umfasst jedoch auch Peptid-Imitationen des Proteins/Polypeptids (wobei die Aminosäuren und/oder Peptidbindungen durch funktionelle Analoga ersetzt wurden) sowie andere Aminosäuren als die von den 20 Genen kodierten Aminosäuren, wie zum Beispiel Selenocystin. Peptide, Oligopeptide und Proteine können als Polypeptide bezeichnet werden. Der Begriff Polypeptid bezieht sich auch (schließt nicht aus) auf eine Modifikation des Polypeptids, wie zum Beispiel Glykosylierung, Acetylierung, Phosphorylierung und dergleichen. Diese Modifikation ist in der Grundlagenliteratur und ausführlicher in den Monographien und in der Forschungsliteratur gut dokumentiert.
Aminosäuresubstitution umfasst eine Aminosäureänderung, bei der eine Aminosäure durch einen unterschiedlichen natürlich vorkommenden Aminosäurerest ersetzt wird. Eine solche Substitution kann als „konservativ“ klassifiziert werden, bei der ein Aminosäurerest, der im Wildtyp-ALS-Protein enthalten ist, durch eine zusätzliche natürlich vorkommende Aminosäure mit ähnlichen Eigenschaften ersetzt wird; die Substitution kann, zum Beispiel oder einschließlich in der vorliegenden Erfindung, auch „nicht konservativ“ sein, bei der ein Aminosäurerest, der im Wildtyp-ALS-Protein vorhanden ist, durch eine Aminosäure mit unterschiedlichen Eigenschaften substituiert wird, zum Beispiel durch eine natürlich vorkommende Aminosäure aus einer unterschiedlichen Gruppe (zum Beispiel wird eine geladene oder hydrophobe Aminosäure durch Alanin ersetzt). Wie hierin verwendet, bezieht sich „ähnliche Aminosäure“ auf eine Aminosäure mit einer ähnlichen Aminosäureseitenkette, d.h. eine Aminosäure mit polarer, unpolarer oder nahezu neutraler Seitenkette. Wie hierin verwendet, bezieht sich „unähnliche Aminosäure“ auf eine Aminosäure mit einer unterschiedlichen Aminosäureseitenkette, zum Beispiel ist eine Aminosäure mit einer polaren Seitenkette nicht ähnlich zu einer Aminosäure mit einer unpolaren Seitenkette. Polare Seitenketten neigen im Allgemeinen dazu, auf der Oberfläche des Proteins zu existieren, wo sie mit der Wasserumgebung, die in der Zelle vorhanden ist, interagieren können („hydrophile“ Aminosäuren). Andererseits neigen „unpolare“ Aminosäuren dazu, im Zentrum des Proteins lokalisiert zu sein, wo sie mit ähnlichen unpolaren Nachbarmolekülen interagieren können („hydrophobe“ Aminosäuren). Beispiele von Aminosäuren mit polaren Seitenketten sind Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Histidin, Lysin, Serin und Threonin (alle sind hydrophile Aminosäuren, außer dass Cystein hydrophob ist). Beispiele von Aminosäuren mit unpolaren Seitenketten sind Alanin, Glycin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Phenylalanin, Prolin und Tryptophan (alle hydrophob, außer dass Glycin neutral ist).
Im Allgemeinen wird ein Fachmann wissen, dass sich die Begriffe ALS, ALSL, AHAS oder AHASL auf die Nukleotidsequenz oder Nukleinsäure bzw. die Aminosäuresequenz oder das Polypeptid beziehen, je nach seinem (ihrem) Allgemeinwissen und dem Kontext der Verwendung der Begriffe.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Gen“ auf Nukleotide (Ribonukleotide oder Desoxyribonukleoside) in Form von Polymeren beliebiger Länge. Der Begriff umfasst doppelsträngige und einzelsträngige DNA und RNA und umfasst weiterhin bekannte Arten von Modifikationen, wie zum Beispiel Methylierung, „Capping“, Substitution eines oder mehrerer natürlich vorkommender Nukleotide durch Analoga. Bevorzugt umfasst das Gen eine kodierende Sequenz, die für ein Polypeptid wie hierin definiert kodiert. „Kodierende Sequenz“ ist eine Nukleotidsequenz, die in mRNA transkribiert und/oder in ein Polypeptid translatiert werden kann, wenn sie einer geeigneten regulatorischen Sequenz unterworfen wird oder unter deren Kontrolle ist. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden durch das Translations-Startcodon am 5'-Ende und das Translations-Stoppcodon am 3'-Ende bestimmt. Die kodierende Sequenz kann mRNA, cDNA, rekombinante Nukleinsäuresequenz oder genomische DNA einschließen, ist aber nicht darauf beschränkt, in einigen Fällen kann aber auch ein Intron existieren.
Wenn hierin verwendet kann der Begriff „Brassica napus“ als „B. napus“ abgekürzt werden. Zusätzlich wird hierin der Begriff „Raps“ verwendet. Die drei Begriffe werden austauschbar verwendet und sollten so verstanden werden, dass sie Rapspflanzen in kultivierter Form vollständig einschließen. In ähnlicher Weise kann zum Beispiel der Begriff „Arabidopsis thaliana“ mit „A. thaliana“ abgekürzt werden. Diese beiden Begriffe werden hierin austauschbar verwendet.
Wenn in der vorliegenden Erfindung verwendet, bezieht sich der Begriff „Position“ auf eine Position einer Aminosäure in der hierin beschriebenen Aminosäuresequenz oder eine Position eines Nukleotids in der hierin beschriebenen Nukleotidsequenz, zum Beispiel eine Position in der kodierenden Sequenz des Wildtyp-Raps ALS3-Proteins, wie in SEQ ID Nr: 1 gezeigt, oder der Aminosäuresequenz des Wildtyp-Raps ALS3-Proteins, wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigt, oder seine entsprechende Position. Der Begriff „entsprechend“, wie hierin verwendet, bedeutet, dass die „Position“ auch eine Position zusätzlich zu der durch die oben genannte Nukleotid-/Aminosäurenummerierung bestimmten Position einschließt. Aufgrund der Deletion oder Insertion von Nukleotiden an anderen Positionen in der ALS 5'-untranslatierten Region (UTR) (einschließlich des Promotors und/oder beliebigen anderen regulatorischen Sequenzen) oder des Gens (einschließlich Exon und Intron) kann die Position eines bestimmten Nukleotids, das in der vorliegenden Erfindung ersetzt werden kann, unterschiedlich sein. In ähnlicher Weise kann aufgrund der Deletion oder Insertion von Aminosäuren an anderen Positionen im ALS-Polypeptid die Position einer bestimmten Aminosäure, die in der vorliegenden Erfindung ersetzt werden kann, unterschiedlich sein. Daher sollte die „entsprechende Position“ in der vorliegenden Erfindung so verstanden werden, dass das Nukleotid/die Aminosäure an der angegebenen Nummer unterschiedlich sein kann, aber dennoch ein ähnliches Nukleotid/Aminosäure benachbart aufweisen kann. Das Nukleotid/die Aminosäure, das/die ausgetauscht, deletiert oder inseriert werden kann, ist ebenfalls in dem Begriff „entsprechende Position“ eingeschlossen. Um zu bestimmen, ob ein Nukleotidrest oder ein Aminosäurerest in einer bestimmten ALS-Nukleotid-/Aminosäuresequenz einer bestimmten Position in der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr: 1 oder der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr: 2 entspricht, kann der Fachmann im Fachgebiet bekannte Werkzeuge und Verfahren verwenden, wie zum Beispiel Alignment durch den Menschen oder durch die Verwendung von Computerprogrammen, wie zum Beispiel BLAST (Altschul et al. (1990), Journal of Molecular Biology, 215, 403 - 410) (das das Basic Local Alignment Search Tool darstellt) oder ClustalW (Thompson et al. (1994), Nucleic Acid Res., 22, 4673 - 4680) oder ein beliebiges anderes geeignetes Programm, das zur Erzeugung von Sequenzalignment geeignet ist.
Konkret stellt die vorliegende Erfindung eine Rapspflanze bereit, in der eine Tryptophan W → Leucin-L-Substitution an Position 556 des Polypeptids auftritt, das durch das endogene ALS-Gen der Rapspflanze kodiert wird, die auf die Mutation von einem „G“-Nukleotid zu einem „T“-Nukleotid an der Position zurückzuführen ist, die der Position 1667 der Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID Nr:1 gezeigt, entspricht. Weiterhin tritt eine Prolin P → Serin S-Substitution an Position 179 des Polypeptids auf, das durch das endogene ALS-Gen der Rapspflanze kodiert wird, die auf die Mutation von einem „C“-Nukleotid zu einem „T“-Nukleotid an der Position zurückzuführen ist, die der Position 535 der Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID Nr: 1 gezeigt, entspricht. In der am stärksten bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Rapspflanze bereit, in der das endogene ALS-Gen der Rapspflanze die Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID Nr: 3 gezeigt, umfasst (oder aus ihr besteht), die für ein mutiertes ALS-Polypeptid, wie in SEQ ID Nr: 4 gezeigt, kodiert.
Die ALS-Aktivität kann nach dem in Singh (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 4572 - 4576 beschriebenen Assay-Verfahren gemessen werden. Die ALS-Nukleotidsequenz, die für das hierin erwähnte ALS-Polypeptid kodiert, verleiht bevorzugt Toleranz gegenüber einem oder mehreren hierin beschriebenen Triazolpyrimidin-Herbiziden (oder eine geringere Empfindlichkeit gegenüber den Triazolpyrimidin-Herbiziden). Dies ist auf die hierin beschriebenen Punktmutationen zurückzuführen, die zu Aminosäuresubstitutionen führen. Daher kann die Toleranz gegenüber Triazolpyrimidin-Herbiziden (oder eine geringere Empfindlichkeit gegenüber Triazolpyrimidin-Herbiziden) gemessen werden, indem ALS-Proben aus Zellextrakten einer Pflanze mit einer mutierten ALS-Sequenz und einer Pflanze ohne eine mutierte ALS-Sequenz in Gegenwart der Triazolpyrimidin-Herbizide erhalten werden und ihre Aktivitäten zum Beispiel durch das Verfahren, das in Singh et al (1988) [J. Chromatogr., 444, 251 - 261] beschrieben wird, verglichen werden. Bei der Verwendung von Pflanzen, bevorzugt in Gegenwart von Triazolpyrimidin-Herbiziden in unterschiedlichen Konzentrationen, stärker bevorzugt in Gegenwart des Triazolpyrimidin-Herbizids „Florasulam“ in unterschiedlichen Konzentrationen, wird der Assay der ALS-Aktivitäten im Wildtyp-Zellextrakt oder -Blattextrakt und im erhaltenen mutierten Rapszellextrakt oder Blattextrakt durchgeführt. In ähnlicher Weise gilt „je höher die Toleranz“ oder „je höher die Resistenz“, desto „niedriger die Empfindlichkeit“ und umgekehrt.
Der Begriff „Triazolpyrimidin-Herbizid“ soll nicht auf ein einziges Herbizid beschränkt werden, das die ALS-Enzymaktivität stören kann. Daher kann das „Triazolpyrimidin-Herbizid“ ein Herbizid oder eine Mischung aus zwei, drei, vier oder mehr im Fachgebiet bekannten Herbiziden sein, es sei denn, es ist anders angegeben oder aus dem Kontext offensichtlich. Bei den Herbiziden handelt es sich bevorzugt um die hierin aufgeführten, wie zum Beispiel Florasulam, Flumetsulam, Diclosulam, Penoxsulam usw.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Rapspflanze mit einer endogenen Acetolactat-Synthase(ALS)-Genmutation bereit, die für ein Triazolpyrimidin-Herbizid tolerierbar ist. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Pflanze“, sofern nicht ausdrücklich anders angegeben, eine Pflanze in einem beliebigen Entwicklungsstadium. Ein Teil der Pflanze kann mit der ganzen Pflanze verbunden sein oder kann von der ganzen Pflanze getrennt sein. Ein solcher Teil der Pflanze schließt ein, ist aber nicht beschränkt auf ein Organ, ein Gewebe und eine Zelle der Pflanze, bevorzugt einen Samen. Die Rapspflanze der vorliegenden Erfindung ist in Bezug auf das endogene ALS-Gen nicht transgen. Natürlich kann ein Fremdgen durch Gentechnik oder durch konventionelle Verfahren, wie zum Beispiel Hybridisierung, in die Pflanze übertragen werden.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden basierend auf Beispielen beschrieben, aber die vorliegende Erfindung ist nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Beispiel 1
In der früheren Patentanmeldung (Hu Maolong et al., chinesisches Patent: CN 107245480 A , Mutiertes Acetolactat-Synthase-Protein mit Herbizidresistenz und Verwendung davon) wurde der Wildtyp-Rapsstamm N131 (bekannt und öffentlich verwendet, siehe Pu Huiming, et al., Jiangsu Journal of Agricultural Science, 2010, 26 (6): 1432 - 1434) einer Mutagenesebehandlung mit Ethylmethansulfonat (EMS) unterzogen. In der mutagenisierten M2-Generation durchsuchten und identifizierten wir die Mutante EM28, die gegen Sulfonylharnstoff-Herbizide resistent war. Die EM28-Pflanzensamen wurden am 19. Juni 2017 beim China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC) des China Committee for Culture Collection of Microorganisms, Adresse: Nr. 3, Nr. 1, West Beichen Road, Chaoyang District, Beijing, 100101, hinterlegt, die Zugangsnummer war CGMCC Nr. 14299, und der Stamm wurde Brassica napus genannt. Um ein Keimplasma oder eine Quelle von Raps zu erhalten, der gegen Triazolpyrimidin-Herbizide resistent ist, um den Bedürfnissen der Züchtung Herbizid-resistenter Rapssorten gerecht zu werden, führten wir erneut eine EMS-Mutagenesebehandlung an EM28-Samen durch, und die EMS-Mutagenese wurde mit demselben Verfahren durchgeführt. Als die Sämlinge der M2-Generation bis zum 3-4-Blatt-Stadium wuchsen, wurden sie mit dem Triazolpyrimidin-Herbizid Florasulam [Chemische Bezeichnung: 2',6'-Difluor-5-methoxy-8-fluor[1,2,4]triazol[1,5-c]pyrimidin-2-sulfonanilid. Molekulare Formel: C₁₂H₈F₃N₅O₃S. CAS-Nummer: 145701-23-1] besprüht, wobei das versprühte Florasulam eine Konzentration von 3,75 g a.i. ha^-1 aufwies, wie für die Unkrautregulierung empfohlen, wodurch das Durchsuchen auf Keimplasma durchgeführt wurde, das gegen das Triazolpyrimidin-Herbizid resistent ist. Nach Behandlung für 3 Wochen waren fast alle Rapssämlinge dem Tod nahe, und nur mehr als 20 Sämlinge überlebten und wuchsen normal. Nachdem diese Sämlinge zum 5-6-Blatt-Stadium wuchsen, wurden die mehr als 20 Rapspflanzen, die im Verdacht standen, gegen das Triazolpyrimidin-Herbizid resistent zu sein, auf das Raps-Zuchtfeld verlagert, und die M3-Samen wurden durch Selbstkreuzung im Beutel während der Blütephase in diesem Jahr geerntet. Im hellen Anbauraum wurden die M3-Sämlinge mit dem Herbizid Florasulam bei einer Konzentration von 3,75 g a.i. ha^-1 besprüht, um Resistenzwirkungen zu identifizieren. Ab der Woche 1 nach dem Besprühen wurden die Phytotoxizitätsreaktionen jeden Tag beobachtet. Die Ergebnisse zeigten, dass der Stamm mit der Nummer DS6 eine starke Resistenz ohne beliebige Symptome von Phytotoxizität zeigte und normal wachsen konnte, während andere Stämme und Kontrollen in der Woche 1 nach dem Besprühen Phytotoxizitätsreaktionen aufwiesen, bei denen die Herzblätter der Sämlinge anfingen, gelb zu werden und allmählich verfaulten und schließlich abstarben. Bisher haben wir ein neues Keimplasma DS6 von Brassica napus erhalten, das gegen das Triazolpyrimidin-Herbizid Florasulam resistent war, das vorläufig als RT-1 bezeichnet wird. Später wurde durch klassische genetische Studien festgestellt, dass das Trennungsverhältnis der Überlebens- und Todesstämme in der Population der F2-Generation 3:1 in Bezug auf das Resistenzmerkmal von RT-1 betrug, was mit der genetischen Regel des einzelnen dominanten Gens übereinstimmte. Mit anderen Worten, das mutierte Merkmal wurde von einem dominanten Kerngen kontrolliert.
Beispiel 2: Molekulares Klonieren eines Resistenzgens im neuen Keimplasma von Brassica napus, das gegen Triazolpyrimidin-Herbizid resistent ist
Triazolpyrimidin-Herbizide gehören zu den ALS-Inhibitor-Herbiziden, und das Ziel dieser Herbizide ist die Acetolactat-Synthase. Im Genom von Brassica napus gibt es 3 funktionelle Acetolactat-Synthase-Gene, die an ALS2 und ALS3 (Genbank-Zugangsnummern: Z11525 und Z11526) des A-Genoms sowie ALS1 (Genbank-Zugangsnummer: Z11524) des C-Genoms lokalisiert sind. Basierend auf den drei ALS-Gensequenzen wurden jeweils drei PCR-Primer-Paare entworfen. ALS1 Primer 1: GTGGATCTAACTGTTCTTGA und Primer 2: AGAGATGAAGCTGGTGATC. ALS2 Primer 1: GAGTGTTGCGAGAAATTGCTTund Primer 2: TTGATTATTCTATGCTCTCTTCTG. ALS3 Primer 1: ATGGTTAGATGAGAGAGAGAGAG und Primer 2: GGTCGCACTAAGTACTGAGAG. Das CTAB-Verfahren wurde verwendet, um genomische DNA-Proben des Blattes des resistenten Stammes RT-1 bzw. N131, EM28 zu extrahieren, und die Wildtyp- und mutierten ALS1-, ALS2- und ALS3-Gene wurden PCR-Klonieren unterzogen. 50µl PCR-Reaktionssystem wurde nach den Anweisungen des High-Fidelity-DNA-Polymerase KOD-Plus-Kits von Toyobo (Shanghai) Biotechnology Co., Ltd. hergestellt. Die Amplifikation wurde auf einem MJ Research PTC-200 PCR-Instrument durchgeführt, wobei das Reaktionsprogramm 94°C Vordenaturierung für 5 min, 94°C Denaturierung für 30 s, 55°C Anlagerung für 30 s und 72°C Verlängerung für 2,5 min war, insgesamt für 35 Zyklen. Nach Zugabe von A zum stumpfen Ende wurde das Produkt durch 1,2% (v/w) Agarosegel-Elektrophorese getrennt, gereinigt und mit dem Agarosegel-DNA-Rückgewinnungskit (Katalognummer: DP209) der Beijing Tiangen Company zurückgewonnen, und das gereinigte PCR-Produkt wurde von Nanjing Jinsirui Biological Co., Ltd. sequenziert. Wie bei der Sequenzierung und dem Vergleich festgestellt, zeigte der resistente Stamm RT-1 bei der Detektion die Punktmutationen an zwei Stellen auf dem ALS3-Gen. Das heißt, eine Punktmutation trat an Position +535 auf, wo sich das Nukleotid von C nach T änderte, was zur Mutation von Prolin (P) zu Serin (S) an der Position 179 des entsprechenden kodierten Proteins führte; eine Punktmutation trat an Position +1667 auf, wo sich das Nukleotid von G nach T änderte, was zur Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an der Position 556 des entsprechenden kodierten Proteins führte (1). Daher wies das ALS3-Gen in den resistenten Stämmen im Vergleich zur Mutante EM28 eine neu hinzugefügte Mutationsstelle (P179S) auf, deren Nukleotide in SEQ ID Nr: 3 gezeigt wurden und deren Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr: 4 gezeigt wurde. Die Mutationen an doppelter Stelle (P179S und W556L) des ALS3-Gens verstärkten die Resistenz der resistenten Mutante gegen das Triazolpyrimidin-Herbizid.
Beispiel 3: Bewertung und Identifizierung der Herbizid-Resistenzwirkungen von resistenten Stämmen
Das ursprüngliche Material EM28 war resistent gegen Sulfonylharnstoff- und Imidazolinon-Herbizide und empfindlich gegen Triazolpyrimidin-Herbizide. Daher wurden N131 und EM28 als Kontrollmaterialien verwendet, um die Resistenzwirkungen der resistenten Mutante RT-1 auf Sulfonylharnstoff-, Imidazolinon- und Triazolpyrimidin-Herbizide zu identifizieren und zu bewerten. Das Identifikationsverfahren wurde durch zwei Verfahren durchgeführt: Feld-Identifikationstest und Gewächshaus-Topf-Inkubationstest. Der Feld-Identifikationstest von Raps wurde im isolierten Zuchtbereich für Raps in der Jiangsu Academy of Agricultural Sciences durchgeführt, und der Gewächshaus-Topf-Inkubationstest wurde in einem hellen Anbauraum mit konstanter Temperatur durchgeführt. Nachdem alle Behandlungsmaterialien ausgesät und bis zum Alter von 3-4 Blattsämlingen gezogen worden waren, wurde das Triazolpyrimidin-Herbizid Florasulam [Chemische Bezeichnung: 2',6'-Difluor-5-methoxy-8-fluor[1,2,4]triazol[1,5-c]pyrimidin-2-sulfonanilid], das SU-Herbizid Tribenuron-methyl (Methyl-2-[N-(4-methoxy-6-methyl-1,3,5-triazin-2-yl)-N-methyl-aminoformamidosulfonyl]-benzoat), bzw. das IMI-Herbizid Imazethapyr [(RS)-5-Ethyl-2-(4-isopropyl-4-methyl-5-oxo-1 H-imidazolin-2-yl)-nicotinsäure] versprüht. Nach 3 Wochen Sprühen der Herbizide wurden die Resistenzwirkungen der Sämlinge bei unterschiedlichen Herbizidkonzentrationen entsprechend ihrer Wachstumsleistung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, dass die Mutation des resistenten Materials RT-1 die Resistenz gegen Triazolpyrimidin-Herbizide erhöht. Tabelle 1: Resistenzleistungen von drei Rapsen nach Behandlung mit ALS-Inhibitor-Herbiziden in unterschiedlichen Konzentrationen

Florasulam Tribenuron-methyl Imazethapyr

Material (g a.i. ha^-1) (g a.i. ha^-1) (g a.i. ha^-1)

3,75 7,5 22,5 45 45 90

RT-1 R R R R R R

EM28 S S R R R R

N131 S S S S S S

Anmerkung: R gibt an, dass die Rapspflanzen nach der Herbizidbehandlung gut wuchsen und es keine Phytotoxizität gab; S gibt an, dass das Wachstum der Rapspflanzen nach der Herbizidbehandlung stark inhibiert war, die Phytotoxizitätsleistung offensichtlich war und die Sämlinge schließlich abstarben (dasselbe unten).
Beispiel 4: Inhibitionstest von Herbiziden auf ALS-Enzymaktivität
Entsprechend den Ergebnissen der Resistenzphänotyp-Identifizierung wurde ein in vitro Enzymaktivitätstest durchgeführt, um die Inhibitionswirkungen von drei Herbizidarten, d.h. Florasulam (TP-Art), Tribenuron-methyl (SU-Art) und Imazethapyr (IMI-Art), auf das ALS-Enzym in RT-1, EM28 und dem Wildtyp N131 zu vergleichen, und die Unterschiede zwischen den drei Materialien wurden verglichen. Für die Messung der ALS-Enzymaktivität wurde auf das Verfahren von Singh et al. verwiesen (Singh BK, et al., Analytical Biochemistry, 1988, 171: 173 - 179). Konkret wurden 0,2 g Blattprobe entnommen, gemahlen und mit flüssigem Stickstoff in einem Mörser pulverisiert und die gemahlene Probe wurde in 4,5 ml der ursprünglichen Enzymextraktlösung [100 mM K₂HPO₄, 0,5 mM MgCl2, 0,5 mM Thiaminpyrophosphat (TPP), 10 µM Flavinadenindinukleotid (FAD), 10 mM Natriumpyruvat, 10% (v/v) Glycerin, 1 mM Dithiothreitol, 1 mM Benzylsulfonylfluorid (PMSF), 0,5% (w/v) Polyvinylpyrrolidon] zugegeben, bei 4°C und 12000 rpm für 20 min zentrifugiert. Der Überstand wurde entnommen, mit einem gleichen Volumen an gesättigtem (NH₄)₂SO₄ versetzt, für 30 min auf Eis platziert, bei 4°C und 12000 rpm für 20 min zentrifugiert, der Überstand verworfen, mit 1 ml des ursprünglichen Enzymextrakts versetzt und zur Auflösung geschüttelt, um ALS-Enzymlösung für jede Probe zu erhalten. 200µl der extrahierten ALS-Enzym lösung wurde entnommen und separat mit 360µl 50mM Hepes-NaOH (pH =7,5) -Enzymreaktionspuffer, 80µ 20 mM TPP, 80µl 200µM FAD, 80µl 2M Natriumpyruvat + 200mM MgCl₂ und ALS-Herbizid in unterschiedlichen Konzentrationen versetzt, gut gemischt, für 1h bei 37°C umgesetzt, dann mit 160µl 3M H₂SO₄ versetzt, um die Reaktion zu stoppen und für 15 min bei 60°C einer Decarboxylierung unterzogen; dann mit 780µl 5,5% α-Naphthol-Lösung und 780µl 0,55% Kreatin versetzt, für 15 min einer Farbentwicklung bei 65°C und einer Farbabstimmung bei 530nm unterzogen, der Lichtabsorptionswert wurde abgelesen und die Enzymaktivität wurde gemäß der Standardkurve berechnet. Die ALS-Enzymaktivität der herbizidfreien Kontrolle wurde als 100% dokumentiert und die Wirkungen von Florasulam (TP-Art), Tribenuron-methyl (SU-Art) und Imazethapyr (IMI-Art) auf die ALS-Enzymaktivität in RT-1, EM28 und dem ursprünglichen Wildtyp N131 wurden berechnet.
Wie aus den 2 und 3 ersichtlich ist, wurde mit dem Anstieg der Konzentration des SU-Herbizids Tribenuron-methyl und des IMI-Herbizids Imazethapyr die ALS-Enzymaktivität im Wildtyp N131, EM28 und RT-1 alle unterdrückt, während die mutierten Enzyme in EM28 und RT-1 alle eine gewisse Resistenz gegen die Herbizide zeigten, weil im Vergleich zum Wildtyp N131 mit dem Anstieg der Konzentration von Tribenuron-methyl und Imazethapyr der Inhibitionsverlauf der ALS-Enzymaktivität in EM28 und RT-1 langsam abnahm, was darauf hindeutet, dass die mutierten ALS-Enzyme in EM28 und RT-1 gegen diese beiden Herbizide resistent waren. Gleichzeitig waren die Abnehm-Verläufe von EM28 und RT-1 im Wesentlichen gleich, was darauf hindeutet, dass die Resistenzwirkungen von RT-1 und EM28 auf SU- und IMI-Herbizide im Wesentlichen gleich waren, was mit den Ergebnissen der Phänotyp-Identifikation übereinstimmte.
Aus 4 ist ersichtlich, dass das mutierte Enzym in RT-1 eine starke Resistenz gegen das Triazolpyrimidin-Herbizid Florasulam aufwies, da im Vergleich zu N131 und EM28 mit dem Anstieg der Konzentration von Florasulam die ALS-Enzymaktivität in N131 und EM28 rasch abnahm und den gleichen Änderungsverlauf zeigte, während die mutierte Enzymaktivität in RT-1 durch das Herbizid weniger inhibiert wurde, d.h. selbst unter der Bedingung einer hohen Konzentration (250µmol I^-1) von Florasulam lag die mutierte Enzymaktivität in RT-1 bei etwa 47,3% der Kontrolle. Zu diesem Zeitpunkt wiesen die mutierten ALS-Enzyme in N131 und EM28 jedoch im Grunde keine Aktivität auf, wobei sie nur 8,98% bzw. 19,6% der Kontrolle waren. Zusammenfassend war die Empfindlichkeit des ALS-Enzyms in der Mutante RT-1 gegenüber dem Triazolpyrimidin-Herbizid Florasulam signifikant geringer als die der ALS-Enzyme in N131 und EM28. Dies deutet weiterhin darauf hin, dass die Mutationen an doppelter Stelle des ALS3-Gens von RT-1 RT-1 eine Resistenz gegen das TP-Herbizid Florasulam verleihen.
Beispiel 5: Funktionelle Verifizierung des Resistenzgens in Arabidopsis thaliana

Ein Pflanzenexpressionsvektor wurde konstruiert und das Resistenzgen wurde mit dem konventionellen Agrobacterium-vermittelten Transformationsverfahren in eine Arabidopsis thaliana-Pflanze übertragen und positive homozygote transgene Linien wurden in der Nachkommenschaft von Transgenen mittels PCR auf die Herbizidphänotyp-Identifizierung durchsucht. Kurz gesagt, es wurden spezifische Primer entsprechend der ALS3-Gensequenz entworfen, ALS3-Primer 3: 5'CGCGGTACCCTCTCTCTCTCTCATCTAACCAT3' und ALS3-Primer 4: 5'CGCACTAGTCTCTCTCAGTACTTAGTGCGACC3', Kpnl und Spel-Enzymmodifikationsstellen wurden am 5'-Ende zugefügt und die unterstrichenen Sequenzen waren Enzymverdauungsstellen. Unter Verwendung der genomischen DNA der Mutante RT-1 als eine Matrize wurde das Resistenzgen durch PCR-Amplifikation erhalten, dessen Nukleotide wurden in SEQ ID NR: 3 gezeigt und dessen Aminosäuresequenz wurde in SEQ ID NR: 4 gezeigt. Das PCR-Produkt wurde zurückgewonnen, kloniert und nach dem Verfahren von Beispiel 2 sequenziert, um einen rekombinanten T-Vektor zu erhalten, der das Gen trägt, das für das mutierte Enzym kodiert. Die Fragmente, die das Gen von Interesse enthielten, wurden durch Doppelverdau des T-Vektors mit Kpnl und Spei zurückgewonnen und in den pCAMBIA1390-Vektor (erworben von CAMBI, Australien) ligiert, der ebenfalls doppelt verdaut wurde, um einen rekombinanten Pflanzenexpressionsvektor zu erhalten. Der konstruierte rekombinante Vektor wurde in E. coli DH5a transformiert und das Plasmid wurde für den Enzymverdau und die Sequenzierungsdetektion extrahiert. Der rekombinante Vektor, der durch Detektion bestätigt wurde, das Zielgen korrekt zu enthalten, wurde in den Agrobacterium-Stamm EHA105 transformiert und das Plasmid wurde für PCR und die Identifizierung durch Enzymverdau extrahiert. Der erhaltene rekombinante Stamm wurde kultiviert und mittels Agrobacterium-Infektion-Blüten-Eintauchverfahren in Arabidopsis thaliana transformiert. Nachdem die T0-Generation auf Medium mit Antibiotika durchsucht worden war, wurden die erhaltenen Pflanzen der T1-Generation in Töpfe transplantiert und in einen künstlichen Inkubator zum Wachstum gebracht und die homozygoten transgenen Linien der T3-Generation wurden durch PCR-Screening und Vermehrung erhalten. Im transgenen Sämlingsstadium der T3-Generation wurden 3,75 g a.i. ha^-1 Florasulam zur Resistenzidentifikation gesprüht. Nach 3 Wochen Sprühbehandlung wuchsen alle transgenen Arabidopsis thaliana-Sämlinge gut, während die Wildtyp-Arabidopsis thaliana-Sämlinge (Col) alle vergilbten und abstarben (Tabelle 2), was darauf hinweist, dass die Expression von Nukleotiden in RT-1 wie zum Beispiel das mutierte Acetolactat-Synthase-Gen, wie in SEQ ID Nr: 3 gezeigt, in Arabidopsis thaliana die Funktion aufwies, gegen TP-Herbizide resistent zu sein. Tabelle 2: Resistenzleistungen der in Arabidopsis thaliana und Tabakpflanze exprimierten Resistenzgene

Material	Stamm	Florasulam	Materialbeschreibung
		(3,75 g a.i. ha^-1)
Arabidopsis thaliana	Col	S	Wildtyp Arabidopsis thaliana-
			Kontrolle
	#1	R	Arabidopsis thaliana
			übertragen mit Resistenzgen
	#6	R	Arabidopsis thaliana
			übertragen mit Resistenzgen

Tabakpflanze	Tob	S	Wildtyp Tabakkontrolle
	#13	R	Tabakpflanze übertragen mit Resistenzgen
	#16	R	Tabakpflanze übertragen mit Resistenzgen
	#17	R	Tabakpflanze übertragen mit Resistenzgen

Anmerkung: R gibt an, dass die Pflanze nach der Herbizidbehandlung gut wuchs und es keine Phytotoxizität gab; S gibt an, dass das Pflanzenwachstum nach der Herbizidbehandlung stark inhibiert war, die Phytotoxizität offensichtlich war und die Sämlinge schließlich abstarben.

Beispiel 6: Funktionelle Verifizierung des Resistenzgens in Tabak
Gemäß dem Verfahren von Beispiel 5 wurden die Nukleotide in RT-1, wie zum Beispiel das mutierte Acetolactat-Synthase-Gen, wie in SEQ ID NR: 3 gezeigt, in den Pflanzenexpressionsvektor pCAMBIA1390-Plasmid (erworben von CAM BI, Australien) kloniert. Die positiven Klone wurden ausgewählt und in Agrobacterium EHA105 transformiert, und die Blattscheibe von Nicotiana benthamiana wurde mit dem konventionellen Agrobacterium-vermittelten Transformationsverfahren transformiert. Nachdem die transgenen Tabakpflanzen geerntet worden waren, wurden sie mittels PCR identifiziert und mit 3,75 g a.i. ha^-1 Florasulam im T3-Sämlingsstadium des transgenen Tabaks besprüht, um eine Resistenz zu identifizieren. Nach 3 Wochen Sprühbehandlung wuchsen alle transgenen Tabaksämlinge gut, während die Wildtyp-Tabak-Sämlinge (Tob) alle vergilbten und abstarben (Tabelle 2), was darauf hinweist, dass die Expression von Nukleotiden in RT-1, wie zum Beispiel das mutierte Acetolactat-Synthase-Gen, wie in SEQ ID NR: 3 gezeigt, auch im Tabak die Funktion aufwies, gegen TP-Herbizide resistent zu sein.
Beispiel 7: Funktionelle Verifizierung des Resistenzgens in gewöhnlichem Raps

Die Nukleotide in RT-1, wie zum Beispiel das mutierte Acetolactat-Synthase-Gen, wie in SEQ ID Nr: 3 gezeigt, wurden unter Verwendung eines Hybridisierungsverfahrens in andere gewöhnliche Rapssorten oder -stämme eingeführt, die nicht gegen TP-Herbizide resistent waren. Kurz gesagt wurde RT-1 zur Herstellung von Hybridkombinationen mit den Wiederherstellungslinien 3075R (Pu Huiming et al., 2002, Jiangsu Agricultural Sciences, 4: 33 - 34) und 3018R (Pu Huiming et al, 1999, Jiangsu Agricultural Science, 6: 32 - 33) von gewöhnlichen Rapssorten verwendet, zwei F1-Samen wurden im selben Jahr geerntet und für die zusätzliche Anpflanzung in einem Raps-Vernalisations-Anbauraum verwendet, einzelne Pflanzen mit gleichmäßigem Wachstum wurden im Blühstadium einer Selbstbestäubung im Beutel unterzogen, die F2-Samen wurden geerntet und in der Lishui Plant Science Base der Academy of Agricultural Sciences der Provinz Jiangsu ausgesät, wobei jede F2-Population mit 20 Reihen ausgesät wurde. Einzelne Pflanzenblätter der F2-Population wurden im Sämlingsstadium entnommen, DNA wurde extrahiert, das mutierte ALS3-Gen wurde durch PCR amplifiziert und das Produkt wurde Reinigung, Rückgewinnung und Sequenzierung gemäß den Schritten aus Beispiel 2 unterzogen. Gemäß den Sequenzierungsergebnissen wurde eine homozygote F2-Einzelpflanze, die die Nukleotide in RT-1 aufweist, wie zum Beispiel das mutierte Acetolactat-Synthase-Gen, wie in SEQ ID Nr: 3 gezeigt, durchsucht. Im Blühstadium von Raps wurde jede ausgewählte F2-Einzelpflanze zur Selbstkreuzung in einen Beutel überführt und die F3-Samen wurden geerntet. Im Sämlingsstadium der F3-Generation wurden 3,75 g a.i. ha^-1 Florasulam zur Resistenzidentifikation versprüht. Nach 3 Wochen Sprühbehandlung befanden sich alle ausgewählten Rapssämlinge, in die das Resistenzgen eingeführt wurde, in einem guten Wachstumszustand, während alle Rapssämlinge ohne Resistenzgen vergilbten und abstarben, was darauf hinweist, dass die Expression von Nukleotiden in RT-1 wie zum Beispiel das mutierte Acetolactat-Synthase-Gen, wie in SEQ ID Nr: 3 gezeigt, auch im Raps die Funktion aufwies, gegen TP-Herbizide resistent zu sein (Tabelle 3). Tabelle 3: Resistenzleistungen des auf gewöhnlichen Raps übertragenen Resistenzgens

Materialkombination	Stamm	Florasulam	Materialbeschreibung
		(3,75 g a.i. ha^-1)
3018R*RT -1	3018R	S	Elternkontrolle
	LF2-1-14	R	ausgewählter Stamm
	LF2-1-33	R	ausgewählter Stamm
	LF2-1-45	R	ausgewählter Stamm
	LF2-1-48	R	ausgewählter Stamm
	LF2-1-76	R	ausgewählter Stamm
	LF2-1-107	R	ausgewählter Stamm
3075R*RT -1	3075R	S	Elternkontrolle
	LF2-2-4	R	ausgewählter Stamm
	LF2-2-13	R	ausgewählter Stamm
	LF2-2-25	R	ausgewählter Stamm
	LF2-2-38	R	ausgewählter Stamm
	LF2-2-46	R	ausgewählter Stamm

Beispiel 8: Studie zur Resistenzfunktion von Substitutionen mit unterschiedlichen Aminosäuren an Resistenzmutationsstellen
Um die Resistenzfunktion zu klären, die durch ALS3 hergestellt wird wenn zwei Stellen Pro179 und Trp556 zu anderen Aminosäuren mutiert waren, haben wir eine große Anzahl relevanter Literaturen konsultiert und 3 Aminosäuremutationskombinationen entworfen (Tabelle 4), die manuell in Punktmutationsstellen eingeführt und zur Konstruktion von Pflanzenexpressionsvektoren davon verwendet wurden, und deren Resistenzfunktionen wurden durch Transformation von Arabidopsis thaliana verifiziert. Kurz gesagt, das mutierte RT-1-Genom wurde als eine Matrize verwendet, um orts-spezifische Mutagenese unter Verwendung der PCR-Technologie durchzuführen, die durch die Beauftragung von Nanjing Zhongding Biotechnology Co., Ltd. durchgeführt wurde. Als Ergebnis wurden 3 mutierte Gene erhalten: 4T, in dem sich das Nukleotid an Position +535 des ALS3-Gens von C nach A änderte und sich das Nukleotid an Position +1667 von G nach T änderte, was zur Mutation von Prolin (P) zu Threonin (T) an Position 179 bzw. zur Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an Position 556 des entsprechenden kodierten Proteins führte; 4L, in dem sich das Nukleotid an Position +536 des ALS3-Gens von C nach T änderte und sich das Nukleotid an Position +1667 von G nach T änderte, was zur Mutation von Prolin (P) zu Leucin (L) an Position 179 bzw. zur Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an Position 556 des entsprechenden kodierten Proteins führte; 4A, in dem sich das Nukleotid an Position +535 des ALS3-Gens von C nach G änderte und sich das Nukleotid an Position +1667 von G nach T änderte, was zur Mutation von Prolin (P) zu Alanin (A) an Position 179 bzw. zur Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an Position 556 des entsprechenden kodierten Proteins führte (Tabelle 4).

Gemäß dem Verfahren von Beispiel 5 wurden die obigen 3 mutierten Sequenzen in den Pflanzenexpressionsvektor pCAMBIA1390-Plasmid (erworben von CAMBI, Australien) konstruiert und in Arabidopsis thaliana transformiert. Nach dem Erhalt positiver Sämlinge wurden 3,75 g a.i. ha^-1 Florasulam im Sämlingsstadium zur Resistenzidentifizierung gesprüht. Nach 3 Wochen Sprühbehandlung wuchsen alle transgenen Arabidopsis thaliana-Sämlinge gut, während die nicht transgenen Arabidopsis thaliana-Sämlinge alle vergilbten und abstarben (Tabelle 4), was darauf hinweist, dass die Expression von Sequenzen der obigen 3 Aminosäuremutationskombinationen in Arabidopsis thaliana die Funktion aufwies, gegen TP-Herbizide resistent zu sein. Tabelle 4: Resistenzleistung unterschiedlicher Sequenzen von Aminosäuremutationskombinationen in Arabidopsis thaliana

Nr.	Mutantenname	DNA-Mutationsstellen	entsprechende Am inosäurestellen-Substitutionen	Resistenzleistung
1	4T	+535: CCT/ACT;	P179T; W556L	R
1	4T	+1667: TGG/TTG	P179T; W556L	R
2	4L	+536: CCT/CTT;	P179L; W556L	R
2	4L	+1667: TGG/TTG	P179L; W556L	R
3	4A	+535: CCT/GCT;	P179A; W556L	R
3	4A	+1667: TGG/TTG	P179A; W556L	R

Anmerkung: dickgedruckte Buchstaben in Kursivschrift zeigen mutierte Basen an; R gibt an, dass die transgenen Pflanzen nach der Herbizidbehandlung gut wuchsen und keine Phytotoxizität auftrat.

Obwohl die spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung oben beschrieben worden sind, sollte der Fachmann verstehen, dass es sich hierbei lediglich um Beispiele handelt und der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung durch die beigefügten Ansprüche definiert wird. Der Fachmann kann an diesen Ausführungsformen verschiedene Änderungen oder Modifikationen vornehmen, ohne vom Prinzip und Wesen der vorliegenden Erfindung abzuweichen, aber diese Änderungen und Modifikationen fallen in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

CN 107245480 A [0029]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Yu Q, Han HP, Martin M, Vila-Aiub, Powles SB. AHAS herbicide resistance endowing mutations: effect on AHAS functionality and plant growth. J Exp Botany, 2010, 61:3925 - 3934 [0005]
Altschul et al. (1990), Journal of Molecular Biology, 215, 403 - 410) (das das Basic Local Alignment Search Tool darstellt) oder ClustalW (Thompson et al. (1994), Nucleic Acid Res., 22, 4673 - 4680 [0023]
Singh (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 4572 - 4576 [0025]
Singh et al (1988) [J. Chromatogr., 444, 251 - 261] [0025]
Pu Huiming, et al., Jiangsu Journal of Agricultural Science, 2010, 26 (6): 1432 - 1434) [0029]
Singh BK, et al., Analytical Biochemistry, 1988, 171: 173 - 179 [0032]
Pu Huiming et al., 2002, Jiangsu Agricultural Sciences, 4: 33 - 34) und 3018R (Pu Huiming et al, 1999, Jiangsu Agricultural Science, 6: 32 - 33 [0037]

Claims

Isolierte Nukleinsäure, die für ein mutiertes Acetolactat-Synthase-Protein kodiert, wobei das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein die folgenden Mutationen umfasst: Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an einer Position, die Position 556 von SEQ ID Nr: 2 entspricht; und Mutation von Prolin (P) zu Serin (S), Threonin (T), Leucin (L) oder Alanin (A) an einer Position, die Position 179 von SEQ ID Nr: 2 entspricht; bevorzugt weist die isolierte Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz wie in SEQ ID Nr: 3 gezeigt, auf; bevorzugt weist das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr: 4 gezeigt, auf;
Expressionskassette, Vektor oder Zelle, die die Nukleinsäure nach Anspruch 1 umfasst.
Mutiertes Acetolactat-Synthase-Protein, das die folgenden Mutationen umfasst: Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an einer Position, die Position 556 von SEQ ID Nr: 2 entspricht; und Mutation von Prolin (P) zu Serin (S), Threonin (T), Leucin (L) oder Alanin (A) an einer Position, die Position 179 von SEQ ID Nr: 2 entspricht; bevorzugt, wobei das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein eine Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an einer Position, die Position 556 von SEQ ID Nr: 2 entspricht und eine Mutation von Prolin (P) zu Serin (S) an einer Position, die Position 179 von SEQ ID Nr: 2 entspricht, umfasst; stärker bevorzugt, wobei das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr: 4 gezeigt, aufweist.
Verwendung der Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder der Expressionskassette, des Vektors oder der Zelle nach Anspruch 2 oder des mutierten Acetolactat-Synthase-Proteins nach Anspruch 3 bei der Herstellung einer Pflanze, die gegen ein Triazolpyrimidin-Herbizid resistent ist; bevorzugt ist die Pflanze Raps.
Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, die resistent gegen ein Triazolpyrimidin-Herbizid ist, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: Einführen der Nukleinsäure nach Anspruch 1 in eine Pflanze, bevorzugt Einführen der Nukleinsäure nach Anspruch 1 in eine Pflanze durch Schritte wie zum Beispiel Transgen, Kreuzung, Rückkreuzung oder vegetative Vermehrung, wobei die Pflanze das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein nach Anspruch 3 exprimiert und Resistenz gegen ein Triazolpyrimidin-Herbizid aufweist.
Nicht transgene Pflanze, die resistent gegen ein Triazolpyrimidin-Herbizid ist, oder ein Teil davon, die eine isolierte Nukleinsäure umfasst, die für ein mutiertes Acetolactat-Synthase-Protein kodiert, wobei das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein die folgenden Mutationen umfasst: Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an einer Position, die Position 556 von SEQ ID Nr: 2 entspricht; und Mutation von Prolin (P) zu Serin (S), Threonin (T), Leucin (L) oder Alanin (A) an einer Position, die Position 179 von SEQ ID Nr: 2 entspricht, bevorzugt, wobei die Pflanze ein Raps ist; wobei der Teil ein Organ, ein Gewebe und eine Zelle der Pflanze ist und bevorzugt ein Samen; bevorzugt, wobei das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein eine Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an einer Position, die Position 556 von SEQ ID Nr: 2 entspricht und eine Mutation von Prolin (P) zu Serin (S) an einer Position, die Position 179 von SEQ ID Nr: 2 entspricht, umfasst; stärker bevorzugt, wobei das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr: 4 gezeigt aufweist.
Verfahren zur Regulierung eines Unkrauts in einem Feld, das eine Rapspflanze enthält, wobei das Verfahren Anwenden einer wirksamen Menge eines Triazolpyrimidin-Herbizids auf das Feld umfasst, das das Unkraut und die Rapspflanze enthält, wobei die Rapspflanze eine isolierte Nukleinsäure umfasst, die für ein mutiertes Acetolactat-Synthase-Protein kodiert, wobei das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein die folgenden Mutationen umfasst: Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an einer Position, die Position 556 von SEQ ID Nr: 2 entspricht; und Mutation von Prolin (P) zu Serin (S), Threonin (T), Leucin (L) oder Alanin (A) an einer Position, die Position 179 von SEQ ID Nr: 2 entspricht; bevorzugt, wobei das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein eine Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an einer Position, die Position 556 von SEQ ID Nr: 2 entspricht und eine Mutation von Prolin (P) zu Serin (S) an einer Position, die Position 179 von SEQ ID Nr: 2 entspricht, umfasst; stärker bevorzugt, wobei das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr: 4 gezeigt, aufweist.