KR20190043551A - 벼에서 제초제 저항성/내성과 연관된 돌연변이의 조합을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

제초제, 예를 들어, ACC아제 억제제, 및 HPPD 억제제, 또는 둘 다에 대해 내성/저항성인 벼가 기재된다. ACC아제 억제제에 대해, 2개의 상이한 염색체 영역은 동일한 제초제 부류에 대한 저항성/내성을 제공하는 데 있어서 상승작용적으로 작용한다. 잡초 방제를 위한 제초제 저항성/내성 벼의 용도 및 내성/저항성 벼를 생산하는 방법이 또한 개시된다.

Description

벼에서 제초제 저항성/내성과 연관된 돌연변이의 조합을 위한 방법 및 조성물
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었으며, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 서열 목록을 함유한다. 2017년 8월 4일에 생성된 상기 ASCII 카피는 50970-267333_SEQ.txt로 명명되며, 크기가 58,089 바이트이다.
(1) 2개의 상이한 염색체의 2개의 영역에서의 유전자의 상승작용적 작용으로 인해 억제제의 상대적으로 고 농도에서 ACC아제 억제제에 대해 저항성/내성이고; (2) HPPD 및 ACC아제 억제 제초제 둘 다에 대해 저항성/내성이고; (3) 오직 4-히드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 (HPPD) 억제 제초제에 대해 저항성/내성인 돌연변이체 벼가 개시된다. 제초제가 분무되거나 다른 식으로 처리될 수 있는 필드에서 이들 제초제 저항성/내성 작물을 갖는 벼를 사용하는 잡초 방제 방법이 개시된다. 제초제 저항성/내성 벼를 생산하는 방법이 또한 개시된다.
벼 작물의 가치
벼는 고대 농작물이며, 오늘날 세계의 주요한 식용 작물 중 하나이다. 벼의 2가지 재배종이 있다: 아시아 벼인 오리자 사티바 엘. (Oryza sativa L.), 및 아프리카 벼인 오리자 글라베리마 스토이트 (Oryza glaberrima Steud.). 아시아 종은 세계의 재배되는 벼의 사실상 전부를 구성하며, 미국에서 성장하는 종이다. 3가지 주요한 벼 생산 지역이 미국에 존재한다: 미시시피 델타 (알칸사스, 미시시피, 북동부 루이지애나, 서동부 미주리), 멕시코 연안 (남서부 루이지애나, 남동부 텍사스), 및 캘리포니아 중앙 계곡. 특히 남아메리카 및 동양의 다른 나라는 주요한 벼 생산자이다.
벼는 그것이 뿌리 및 대기 사이의 줄기를 통해 기체 교환을 허용하는 특유한 구조를 갖기 때문에 얕은 침수 하에 성장할 수 있는 소수의 작물 중 하나이다. 얕은 침수 하의 성장은 최량의 수확량을 생성하며, 벼가 통상적으로 중점토, 또는 토양 표면 바로 밑의 불투과성 경반층을 갖는 토양에서 성장하는 이유이다. 이들 토양 유형은 통상적으로 다른 작물에 대해 적합하지 않거나, 기껏해야 작물 수확량이 빈약하다.
벼의 끊임없는 개선은 성장하는 세계 인구를 위해 필요한 영양을 제공하기 위해 불가결하다. 세계 인구의 대부분은 그들의 주요한 영양 공급원으로서 쌀을 소비하며, 작물은 잡초와의 경쟁 및 바람직하지 않은 작용제에 의한 공격을 포함한 다양한 환경적 조건에서 잘 자라야 한다. 벼 개선은 통상적인 육종 실시를 통해 및 또한 재조합 유전적 기법에 의해 수행된다. 이 규율 밖의 것들에 대해 간단해 보이긴 하지만, 작물 개선은 명민한 과학적이고 예술적인 기술을 요구하며, 결과는 일반적으로 예측불가능하다.
특정 육종 목적은 세계의 상이한 벼 생산 지역에서 다소 다양하지만, 수확량을 증가시키는 것은 모든 프로그램에서 주요한 목적이다.
식물 육종은 현존하는 품종의 장점 및 단점의 분석 및 정의로 시작하며, 그 후 새로운 품종을 생산하기 위한 약점의 영역을 개선시키기 위한 프로그램 목표의 확립으로 이어진다. 특정 육종 목표는 단일 품종에서 모 공급원으로부터의 바람직한 형질의 개선된 조합을 조합하는 것을 포함한다. 바람직한 형질은 자발적 또는 유도된 돌연변이로 인해 도입될 수 있다. 바람직한 형질은 보다 높은 수확량, 환경 스트레스, 질환 및 곤충에 대한 저항성, 보다 양호한 줄기 및 뿌리, 저온에 대한 내성, 보다 양호한 작물적 특징, 영양적 가치 및 곡물 품질을 포함한다.
예를 들어, 육종가는 초기에 2종 이상의 모 계통을 선택하고, 교배시킨 후, 많은 새로운 유전적 조합 중에서 바람직한 형질을 위한 선택을 한다. 육종가는 이론적으로 교배를 통해 수십 억의 새롭고 상이한 유전적 조합을 생성할 수 있다. 교배 및 자가수정의 사용에 의한 육종은 세포 수준에서의 직접적 제어를 암시하지 않는다. 그러나, 그 유형의 제어는 재조합 유전적 기법을 사용하여 부분적으로 달성될 수 있다.
계통 육종은 자가-수분 작물, 예컨대 벼의 개선에 통상적으로 사용된다. 예를 들어, 바람직한, 상보적 형질을 소유하는 2개의 모체를 교배하여 F1 세대를 생산한다. 하나 또는 둘 다의 모체는 그들 자신이 이전의 교배로부터 F1을 나타낼 수 있다. 이어서, 2개의 모체가 순수한 계통인 경우 하나 또는 몇몇 F1을 자가수정하는 것으로부터 생성되는 종자를 성장시킴으로써, 또는 모체 중 적어도 하나가 F1인 경우 초기 교배로부터 생성되는 종자를 직접적으로 성장시킴으로써, 분리 집단이 생산된다. 최량의 개별 게놈의 선택은 제1 분리 집단 또는 F2에서 시작할 수 있으며; 그 후, F3에서 시작하여, 최량의 패밀리에서의 최량의 개체가 선택된다. "최량"은 예를 들어, 수확량을 증가시키고, 질환에 저항하는 특정 육종 프로그램의 목표에 따라 정의된다. 전체적으로 다인자 접근법은 유전적 상호작용 때문에 "최량"을 정의하는 데 사용된다. 하나의 유전적 배경에서 바람직한 유전자는 상이한 배경에서 상이할 수 있다. 또한, 유전자의 도입은 다른 바람직한 유전적 특징을 방해할 수 있다. 패밀리의 복제된 시험은 F4 세대에서 시작하여 낮은 유전가능성을 갖는 형질에 대한 선택의 유효성을 개선시킬 수 있다. 순계교배의 진행된 단계 (즉, F6 및 F7)에서, 표현형적으로 유사한 계통의 최량 계통 또는 혼합물은 새로운 모 계통으로서 잠재적 배포에 대해 시험된다.
역교배 육종은 반복친인 바람직한 동형접합성 품종 또는 순계교배된 계통 내로 매우 유전가능한 형질에 대한 유전자를 전달하는 데 사용되었다. 전달되는 형질의 공급원은 공여친으로 지칭된다. 생성된 식물은 반복친의 속성 (예를 들어, 품종) 및 공여친으로부터 전달된 바람직한 형질을 가질 것으로 예상된다. 초기 교배 후, 공여친의 표현형을 소유하는 개체를 선택하고, 반복친과 반복적으로 교배시킨다 (역교배시킨다). 프로세스는 공여친에 의해 제공된 새로운 형질의 추가와 함께 반복친의 유익한 특징 모두를 회복하는 데 사용된다.
유망한 진행된 육종 계통을 철저하게 시험하고, 상업적 표적 영역(들)의 대표적인 환경에서 적어도 3년 이상 동안 적절한 표준과 비교한다. 최량 계통은 새로운 상업적 변종 또는 혼성체의 모체에 대한 후보이며; 소수의 형질에서 여전히 결핍된 것들을 모체로서 사용하여 추가의 선택을 위한 새로운 집단을 생산할 수 있다.
시장화 및 유통의 최종 단계로 이어지는 이들 프로세스는 통상적으로 제1 교배가 이루어진 때로부터 8 내지 12년 걸리며, 전구물질로서 개선된 육종 계통의 개발에 의존할 수 있다. 따라서, 새로운 품종의 개발은 시간-소모적 과정일 뿐만 아니라, 정확한 장래의 계획, 자원의 효율적인 사용, 및 방향의 최소의 변화를 요구한다. 결과는 자연에서 발견되지 않는 신규한 유전적 조합을 포함한다.
육종을 통한 벼의 일부 개선은 벼에서 천연 유전적 변이 및 혼성화 종, 예컨대 야생 벼에 제한될 수 있다. 육종 프로그램에서 새로운 변이의 도입은 통상적으로 기재된 바와 같은 교배 프로그램, 예컨대 계통 또는 역교배 육종을 통해서이다. 그러나, 가끔 새로운 형질, 예컨대 질환 저항성 또는 높이 변화의 도입을 발생시키는 천연 돌연변이가 발견된다. 육종가는 또한 돌연변이 (DNA 서열의 작은 변화)를 벼 게놈 내로 유도함으로써 새로운 형질을 개발하였다. 이들 돌연변이 또는 유전자의 조합의 일부는 자연에서 발견되지 않는다. 통상적으로, EMS 또는 아지드화나트륨 플러스 MNU는 돌연변이유발제로서 사용된다. 이들 화학물질은 통상적으로 A 및 T로 변화된 G 및 C의 DNA에서의 단일 염기 변화를 무작위로 유도한다. 전체적인 효과는 예측불가능하다. 이들 변화의 대부분은 이들이 유전자 코딩 영역 외부에 해당하거나, 유전자 생성물의 아미노산 서열을 변화시키지 않기 때문에 작물에 영향을 갖지 않는다. 그러나, 일부는 새로운 형질을 생성하거나, 이전의 계통 내로 새로운 DNA 변화를 혼입시킨다.
최근까지, 육종가는 DNA 서열에서 돌연변이 부위를 직접 제어하지 못하였다. 유용한 변화의 확인은 유효한 돌연변이가 도입되고, 육종가가 변화의 표현형 효과를 인식하며, 그 돌연변이를 갖는 벼의 작물을 선택하고, 확장할 수 있을 무작위적 가능성에 기인한다.
종자를 돌연변이유발성 화학물질 또는 다른 작용제로 처리하고, 즉시 식재하여 성장시키고, M2 종자를 생산한다. M2 종자는 수많은 새로운 변이를 운반할 것이며; 따라서, 2개의 실험은 동일한 조합을 생성하지 않을 것이다. 이들 변이 중에서, 이전에 벼에 존재하지 않고, 식물 육종가에 의한 선택에 이용가능하지 않은 새로운 형질이 발견되고, 벼 개선에 사용될 수 있다.
새로운 형질을 발견하기 위해, 육종가는 효율적이고 전략적인 선택 전략을 사용해야 하는데, 이는 돌연변이유발 프로세스가 극도로 낮은 빈도의 유용한 새로운 조합을 갖기 때문이다. 수천의 유도된 새로운 유전적 변이체 중에서, 바람직한 새로운 형질을 갖는 것은 오직 하나일 수 있다. 최적 선택 시스템은 수천의 새로운 변이체를 통해 스크리닝하고, 새로운 형질을 운반할 수 있는 소수의 또는 심지어 단일 식물의 검출을 허용할 것이다. 가능한 새로운 형질을 확인하거나 발견한 후, 육종가는 계통 또는 역교배 육종에 의해 새로운 품종을 개발한 후, 새로운 형질 및 품종이 벼 생산자에게 안정하고 유전가능한 가치를 나타내는 지를 입증하기 위해 광범위한 시험을 해야 한다.
재조합 유전적 기법을 사용하여, 벼에서 개선된 특징을 코딩하는 돌연변이를 갖는 핵산 분자는 상업적으로 적합한 게놈을 갖는 벼 내로 도입될 수 있다. 유전자 조작의 새로운 방법, 예컨대 CRISPR, 및 현대 시퀀싱 기법은 육종가가 복잡한 작물 개선을 지시하고, 상업화로의 진행을 가속화하는 것을 허용한다. 돌연변이가 모든 방법에 의해 확인된 후, 이는 재조합 기법에 의해 벼 내로 전달되고, 적합성이 유해하게 영향을 받지 않는 지를 보장하기 위해 시험될 수 있다.
벼에서의 제초제 저항성
작물 분야에서 잡초 및 자원에 대한 다른 경쟁자는 자원에 대해 경쟁하며, 작물의 수확량 및 품질을 크게 감소시킨다. 잡초는, 잡초를 죽이지만, 작물에 해를 끼치지 않는 선택적 제초제의 시용을 통해 작물에서 방제되었다. 통상적으로, 제초제의 선택성은 생화학적 변이 또는 작물 및 잡초 사이의 차이에 기초한다. 일부 제초제는 비-선택적이며, 이는 이들이 모든 또는 거의 모든 식물을 죽임을 의미한다. 비-선택적 또는 넓은 스펙트럼 제초제는, 제초제에 대한 내성 또는 저항성을 전달하는 특이적 단백질을 발현하는 새로운 유전자가 삽입되는 경우, 작물에 사용될 수 있다. 제초제에 대한 저항성은 또한 단백질 및 생화학적 프로세스를 변경시키는 유전적 돌연변이를 통해 작물에서 달성되었다. 이들 돌연변이는 자연에서 발생할 수 있지만, 대부분 이들은 시험관내에서 조직 배양물에서 또는 생체내에서 돌연변이를 유도함으로써 작물에 유도되었다. 불행하게도 일부 예에서, 특히 특정 제초제의 반복된 사용으로, 잡초는 저항성을 제공하는 천연 돌연변이의 비의도된 선택을 통해 저항성을 발생시켰다. 잡초가 특정 제초제에 대해 저항성이 되는 경우, 그 제초제는 더이상 잡초 방제에 유용하지 않다. 잡초에서의 저항성의 발생은 잡초를 방제하기 위한 상이한 작용 방식을 교대로 사용하는 것을 통해 최량으로 지연되며, 이에 따라 저항성 잡초의 발생은 방해를 받는다.
벼 생산은 활엽 식물에 의해 방해를 받으며, 특히 앵미로 지칭되는 잡초를 방제하는 것이 어렵다. 한 가지 어려움은 앵미가, 앵미를 표적화하지만, 재배되는 벼에 해를 끼치지 않는 이용가능한 선택적 제초제가 없는 재배되는 벼 (이들은 가끔 타가 수분함)와 너무나 유전학적으로 유사하기 때문에 발생한다. 방제는 현재 벼를 넓은 스펙트럼 제초제, 예를 들어 이미다졸리논 및 술포닐우레아 제초제에 대해 저항성이 되게 하는 벼에서 발견되는 돌연변이의 개발을 통해 상업적 벼 생산에 제공된다. 다른 유해한 식물, 예컨대 활엽 식물을 억제하는 제초제에 대해 내성인 벼가 필요하다.
지금까지, 대부분의 제초제 내성 벼는 단일 유전자 변화, 특히 억제제에 대한 그의 반응을 변경시키는 표적 효소에서의 변화와 연관된다. 증가된 저항성/내성의 보다 복잡한 원인은 식물 내로 도입되는 것이 바람직할 것인데, 이는 이들이 자연적 인과관계로부터 더 나아가고, 잡초가 저항성을 발생시키는 것에 보다 많은 장애물을 제공하기 때문이다.
이를 다양한 제초제에 대해, 대안적인 작용 방식, 특히 향상된 저항성을 갖는 제초제의 조합에 대해 저항성으로 만드는 벼에서의 새로운 돌연변이를 발견하는 것은 벼 생산에 크게 유익할 것이다. 추가의 바람직한 특징, 및 대안적인 저항성을 갖는 벼 게놈 내로 제초제 저항성을 위한 유전자를 얻고 혼입시키는 것은 도전적이고, 예측불가능하고, 시간 소모적이고, 비용이 들지만, 세계의 증가하는 식량 필요를 충족시키기 위해 필수적이다.
요약
제초제에 대한-특히 ACC아제 및 HPPD 억제 제초제, 및 이들의 조합에 대한 특유한, 일부 조합에서 상승작용적 저항성을 갖는 신규하고 독특한 벼 계통이 본원에 기재되고 개시된다. ACC아제 억제 제초제로는 퀴잘로폽, 프로파퀴자폽 및 플루아지폽을 들 수 있다. HPPD 억제 제초제로는 메소트리온, 벤조비시클론, 및 이들의 조합을 들 수 있다.
FOP 패밀리 제초제에 대한 저항성/내성과 연관된 유전자 영역
돌연변이유발된 집단 개발 및 FOP 제초제 저항성에 대해 수행된 스크리닝은 퀴잘로폽에 대한 저항성과 연관된 2개의 돌연변이된 유전자 영역의 확인을 허용하였다. RTA1로 지정된 이들 저항성 유발 영역 중 하나는 염색체 5에 위치한 ACC아제 유전자의 기지의 표적 유전자좌에 위치하는 것으로 결정되었다. 따라서, 이는 표적 특이적 제초제 저항성 (TSR)의 전형적인 예를 구성한다. RTA2로 지정된 또 다른 작용제는 FOP 제초제 내성에 관여하는 것으로 이전에 보고되지 않고, ACC아제 아미노산 서열과 비관련된 영역에서 염색체 1에 위치하는 것으로 결정되었다. 이 두번째 영역은 비-표적 특이적 저항성 (NTSR) 작용제의 경우인 것으로 보인다.
2가지 계통 RTA1 및 RTA2에서 유전적 배경은 동일하지 않다. 하나는 돌연변이유발되고, 다른 것은 통상적인 계통으로 다시 전환된다.
RTA1 및 RTA2 계통은 ACC아제 억제제 저항성/내성 형질에 대해 동형접합성이고, 순계교배된다.
RTA1 및 RTA2의 제초제 내성 유도 유전자 영역은 본질적으로 내성의 전체 효과를 갖는 동형접합성을 요구하는 열성 효과를 갖는다. 계통은 "RTA1 및 RTA2"로 지정되지만, 이들 용어는 또한 계통 내의 특이적 돌연변이된 영역을 지칭한다. 영역은 제초제 내성과 연관된다.
RTA1은 TSR 메커니즘에 의해 저항성을 부여한다
돌연변이된 저항성 유전자 RTA1은 ACC아제 유전자의 DNA에서 단일 점 돌연변이인 것으로 결정되었으며, 여기서, 야생형, 비돌연변이된 벼에서의 구아닌 (G) 뉴클레오티드는 돌연변이체 DNA에서 아데닌에 의해 대체되고, 이는 단백질에서 기지의 활성 부위에 영향을 미치는 발현된 단백질 표적 부위에서 글리신의 세린으로의 (G에서 S로의) 아미노산 서열의 변화 (G2096S)를 발생시킨다. 이는 ACC아제 단백질에의 제초제의 결합에 영향을 미치고, 식물독성의 발현을 차단하는 ACC아제 효소 (엽록체에서 발견됨)에서의 중요한 결합 부위에서의 제초제 작용의 변화를 발생시킨다. 따라서, 돌연변이를 운반하는 식물은 제초제와의 접촉에 의해 죽지 않는다. 돌연변이는 ACC아제 유전자의 서열 분석에 의해 확인되었으며, 다른 작물에서, 및 식물 종에서 상동성 위치에서 확인된 동일한 FOP-저항성 돌연변이와 정확하게 매칭된다.
RTA2는 NTSR 메커니즘에 의해 저항성을 부여한다
RTA2의 경우, 저항성/내성과 연관된 돌연변이는, 연관 맵핑 분석 및 후에 뮤트맵 (MutMap) (전체 게놈 시퀀싱 전략에 의한 돌연변이 맵핑) 둘 다에 의해 입증된 바와 같이 염색체 1로 맵핑되었다 (염색체 5에 위치한 RTA1과 달리). 염색체 1의 이 영역에서, 중복된 또는 이종상동성 ACC아제 또는 ACC아제-유사 유전자, 즉, FOP 제초제의 표적 유전자의 보고는 없다. 따라서, 이 돌연변이 RTA2에 의해 유발된 퀴잘로폽에 대한 내성의 메커니즘은 "표적 부위"로서 특징화될 수 없다. 대신, RTA2는 문헌에서 "비-표적 부위 또는 대사 기재" 제초제 내성 (NTSR)으로도 지칭되는 "비-표적 부위" 저항성 유전자 영역 또는 부위로 간주된다.
잡초 방제
이들 새로운 계통은 잡초 방제를 위한 개선된 기회를 제공한다.
논에서 잡초를 방제하는 방법은 벼를 복수의 제초제에 대해 저항성인 논에서 사용한다.
논을 적어도 1종의 제초제, 또는 복수의 제초제, 예를 들어, ACC아제-억제제로 알려진 제초제의 패밀리에 속할 수 있는 임의의 것, 또는 HPPD-억제 제초제로서 알려진 제초제의 부류에 속할 수 있는 임의의 것과 접촉시킨다.
제초제 저항성 벼 식물의 생산
제초제 저항성/내성 벼 식물을 성장시키는 방법은 (a) 저항성 벼 종자를 식재하는 단계; (b) 벼 종자를 발아시키는 단계; 및 (c) 1종 이상의 제초제를 벼 식물의 성장을 정상적으로 억제할 제초제의 수준으로 벼 새싹에 시용하고, 작물 확장을 위해 생존한 식물을 선택하는 단계를 포함한다.
제초제-내성 벼 식물을 생산하는 방법은 또한 트랜스진 또는 복수의 트랜스진, 또는 유전자 조작의 새로운 방법, 예컨대 CRISPR을 사용할 수 있다. 이러한 방법의 한 실시양태는 벼 식물의 세포를 트랜스진으로 형질전환시키는 것이며, 여기서, 트랜스진은 조합되는 경우 ACC아제 억제제에 대한 상승작용적 저항성, 또는 1종 이상의 제초제에 대한 생성된 벼 식물에서의 내성을 부여하는 HPPD 및 ACC아제 효소를 생성하는 2개의 상이한 유전자 영역을 코딩한다. 임의의 적합한 세포는 이들 방법의 실시에 사용될 수 있으며, 예를 들어, 세포는 캘러스의 형태일 수 있다.
벼 계통 RTA2 및 RTA1의 게놈으로부터의 유전자 영역 또는 등가물이 없는 식물에 의해 내성화되는 것보다 더 높은 수준으로 ACC아제 억제제에 대해 내성/저항성인 단자엽 식물은 잡초 방제 및 새로운 계통 개발에 적합하다. 등가물은 조합되는 경우 상승작용적 효과를 갖는, 염색체 5 상에 있는 동일한 코딩 결과, 및 염색체 1에서와 동일한 돌연변이의 매개자를 갖는 유전자 영역일 것이다.
벼 계통 RTA2의 게놈에서의 영역은 위치 2096에서 글리신의 세린으로의 치환을 코딩하는 돌연변이이다.
벼 계통 RTA2에서의 벼 염색체 번호 1의 영역은 표 1A 및 1B에 제시된 바와 같은 돌연변이체 뉴클레오티드 서열을 갖는 C1-32083963 및 C1-36386713 사이에 있다. 이 영역은 표 1A 및 1B에서의 개별 위치에 제시된 돌연변이를 갖는 긴밀하게 연관된 영역이다. 돌연변이의 매개자가 벼 식물에 있는 경우, RTA2 효과는 존재한다.
본원에 개시된 벼 식물의 종자는 ATCC 수탁 번호 PTA-122646 및 124233으로서 기탁되어 있다.
저항성을 부여하는 유전자 영역이 없는 식물에 의해 내성화되는 것보다 유의하게 더 높은 수준으로 ACC아제 제초제 억제제에 저항성인 벼를 생산하는 방법은
a. ACC아제 억제제에 대한 저항성/내성을 부여하는 RTA1 및 RTA2로 지정된 벼의 게놈에서의 영역과 실질적으로 동일한 유전자 영역을 얻는 단계; 및
b. 유전자 영역을 벼 계통 내로 도입하여 상업적 작물에 유용한 수준으로 제초제 저항성을 부여하지 않고 야생형 영역을 대체하는 단계
를 포함한다.
제초제 저항성 종자로부터 유래된 세포, 이러한 종자로부터 성장된 식물 및 이러한 식물로부터 유래된 세포, 이러한 종자로부터 성장된 식물의 자손 및 이러한 자손으로부터 유래된 세포는 이 개시내용의 범위 내에 있다. 기탁된 종자로부터 생산된 식물, 및 이러한 식물의 자손의 성장은 전형적으로 상응하는 야생형 식물의 성장을 정상적으로 억제할 제초제의 수준에서, 제초제, 예를 들어 ACC아제 억제, HPPD 억제 또는 둘 다에 대해 저항성/내성일 것이다. 일부 제초제에 대해 일부 천연 (비-유도된) 수준의 내성이 있지만, 그러한 영역은 상업적으로 유용할 수준으로 식물을 보호할 수 없다.
도 1은 형질 내성 시험의 그래프 표현이고; 시험물을 식재하고, 메소트리온을 지시된 비율로 약 1개월 후에 (3 내지 4엽 단계) 시용하고, 제2 시용을 2개의 지시된 처리 상에 약 1주 후에 시용하였고; 벼를 제1 제초제 시용 후 21일에 비분무된 벼에 비해 손상 또는 손해의 퍼센트에 대해 평가하였고; 계통 ML0831266-03093은 HPPD 저항성 계통이고, R0146 및 P1003은 유도된 돌연변이가 없는 대조군 계통이고; 계통 PL1214418M2-73009를 HPPD 내성 계통 ML0831266-03093 (모체는 P1003임) 및 ACC아제 저항성 계통 ML0831265-01493 (모체는 R0146임) 사이의 교배 중에서 선택하였다. 새롭게 개발된 계통 PL1214418M2-73009는 HPPD 억제제에 대한 원래 HPPD 내성 계통 ML0831266-03093과 동등한 내성을 나타낸다.
도 2는 형질 내성 시험의 그래프 표현이고; 시험 벼를 식재하고, 퀴잘로폽을 지시된 비율로 약 5주 후에 시용하였고 (분얼을 개시함); 벼를 제초제 시용 후 4주에 비분무된 벼에 비해 손상 또는 손해의 퍼센트에 대해 평가하였고; 계통 ML0831265-01493은 ACC아제 저항성 계통이고, R0146 및 P1003은 대조군 계통이고; 계통 PL1214418M2-73009를 HPPD 내성 계통 ML0831266-03093 (모체는 P1003임) 및 ACC아제 내성 계통 ML0831265-01493 (모체는 R0146임) 사이의 교배 중에서 선택하였다. 조합된 저항성을 갖는 새롭게 개발된 계통 PL1214418M2-73009는 원래 ACC아제 저항성 계통 ML0831265-01493과 동등하거나 또는 보다 양호함을 나타낸다.
도 3A 내지 3D는 (도 3A) 플롯 70025, ML0831266-03093F2-2(2)A-1(1)A-P-USP-USA (HPPDi+HPPDni), 칼리스토 (Callisto), 2 시용, 출아전 (Preemergence)/침수전 (Preflood) 210/210 grai/ha; (도 3B) 15SAT1, 플롯 03, 1x1x, RTA1, 2 시용, 2-엽 및 침수전, 77+77 grai/ha (도 3C); 15SAT1, 플롯 12, 1x1x_RTA2, 2 시용, 2엽 및 침수전, 77+77 grai/ha; 및 (도 3D) 15SAT1, 플롯 12, 1x1x_RTA1-RTA2, 2 시용, 2-엽 및 침수전, 77+77 grai/ha의 사진이다.
도 4는 메소트리온을 식재 후 약 34일에 지시된 비율로 시용한 형질 내성 시험의 결과의 그래프 표현이다. (분얼을 개시함) 벼를 제초제 시용 후 4주에 비분무된 벼에 비해 손상 또는 손해의 퍼센트에 대해 평가하였고; HPPD 내성 계통 ML0831266-03093 및 조합된 HPPD 및 ACC아제 내성을 갖는 계통 PL1214418M2-73009는 유사한 반응을 나타내며, 이는 완전한 HPPD 내성이 새로운 계통에서 회복되었음을 지시하고; 계통 PL1214418M2-73001을 오직 HPPD 계통 ML0831266-03093으로부터의 HPPD 내성 돌연변이를 운반하도록 선택하고, 계통 PL1214418M2-73013을 오직 HPPD 계통 ML0831266-03093으로부터의 HPPD 비-유도된 내성을 운반하도록 선택하였고; P1003은 HPPD 내성 계통 ML0831266-03093에 대한 비-돌연변이체 모체 계통이며; 420 gmai/ha 초과에서, 심지어 유전적 저항성을 갖는 계통도 손상될 수 있음을 유념한다.
도 5A 및 5B는 형질 내성 시험의 결과의 사진이고; 식재전 시용된 메소트리온 제초제에 의한 잡초 방제를 평가하였고; 플롯을 HPPD 내성 계통 ML0831266-03093의 혼성체로 식재하였고; 식재 직전, 우측 도 5B 상의 플롯은 210 gmai/ha로 메소트리온의 시용을 받았고, 좌측 도 5A 상의 플롯은 식재전 또는 출아후 중 어느 하나에 제초제가 시용되지 않았고; 사진은 잡초 출아에서의 차이를 나타내는 식재 후 4주에 취하였다.
도 6은 형질 내성 시험의 결과의 그래프 표현이고; 퀴잘로폽을 지시된 비율로 식재 후 약 30일에 (3 내지 4엽 단계) 시용하고, 제2 시용을 2개의 지시된 처리 상에 시용하였다. 벼를 제1 제초제 시용 후 21일에 비분무된 벼에 비해 손상 또는 손해의 퍼센트에 대해 평가하였고; 계통 ML0831265-01493은 RTA1 돌연변이를 갖는 ACC아제 내성 계통이고; 계통 ML0831265-02283은 또한 ACC아제 제초제에 대해 내성이지만, 내성은 ACC아제 코딩 유전자에서의 돌연변이로부터의 것이 아니고, R0146은 ACC아제 내성 계통의 둘 다에 대한 모체 계통이고; P1003은 대조군 계통이다.
도 7은 RTA2에 대한 형질 맵핑 실험의 결과를 나타내고; F2 집단은 세포질 웅성 불임 계통 A0109 및 ACC아제 내성 계통 ML0831265-02283 사이의 교배로부터 유래되었고; 집단에서의 F2 개체를 유전자형분석하고, 식재 후 26일에 퀴잘로폽 (116 gmai/ha)을 분무하고, 제초제 시용 후 19일에 퀴잘로폽에 대한 내성에 대해 평가하였고; QTL 맵핑 소프트웨어를 사용하여, 내성에 대한 주요 QTL을 염색체 1 상에서 확인하였다 (화살표에 의해 지시됨).
도 8은 RTA2에 대한 돌연변이 맵핑 실험의 결과를 나타내는 산포도이고; F2 집단은 ACC아제 내성 계통 ML0831265-02283 및 모체 계통 R0146 사이의 교배로부터 유래되었고; F2 집단을 유전자형분석하고, 퀴잘로폽 (116 gmai/ha)을 분무하고, 퀴잘로폽에 대한 저항성에 대해 평가하였고; 오직 ACC아제 저항성 돌연변이를 포함하는 돌연변이는 집단에서 분리성일 것이고; SNP 지수는 비-돌연변이체 계통 R0146으로부터의 변이를 운반하는 시퀀싱 리드의 비율의 척도이고; 1의 점수는 모든 시퀀싱 리드가 변이를 가졌음을 지시하고; 19개의 변이 (돌연변이)는 1의 지수를 가졌고, 염색체 1 상에 함께 그룹핑되었으며 (원형), 이는 내성 유발 돌연변이의 가능한 위치를 지시한다 (서열식별번호 (SEQ ID NO): 9 내지 27).
도 9는 형질 맵핑 실험의 결과를 그래프적으로 나타내고; F2 집단은 HPPD 내성 계통 ML0831266-03093 (HPPDi 유도됨) 및 ACC아제 내성 계통 ML0831265-01493 사이의 교배로부터 유래되었고; 집단을 유전자형분석하고, 메소트리온을 105 gmai/ha에서 분무하고, 메소트리온에 대한 내성에 대해 평가하고, 메소트리온을 630 gmai/ha에서 다시 분무하고, 메소트리온에 대한 내성에 대해 평가하였고; 오직 모체 계통 ML0831266-03093으로부터의 내성에 대한 돌연변이가 유전된 식물이 살아 있을 것으로 예상되었고; QTL 맵핑 소프트웨어를 사용하여 내성에 대한 주요 QTL을 염색체 1 상에서 확인하였다 (화살표에 의해 지시됨) (X 축 - 게놈에서의 염색체 번호; Y-축 =점수, 표현형과의 상관) (돌연변이 맵핑, 염색체 1).
도 10은 돌연변이 맵핑 실험의 결과를 나타내고; F2 집단은 HPPD 내성 계통 ML0831266-03093 및 모체 계통 P1003 사이의 교배로부터 유래되었고; 집단을 유전자형분석하고, 메소트리온을 840 gmai/ha에서 분무하고, 메소트리온에 대한 내성에 대해 평가하였고; 오직 HPPD 내성 돌연변이를 포함하는 돌연변이가 집단에서 분리하고; SNP 지수는 계통 P1003으로부터의 변이를 운반하는 시퀀싱 리드의 비율의 척도이고; 1의 점수는 모든 시퀀싱 리드가 변이를 가졌음을 지시하고; 10개의 변이 (돌연변이)는 1의 지수를 가졌고, 염색체 1 상에 함께 그룹핑되었으며 (원형), 이는 내성 유발 돌연변이의 가능한 위치를 지시한다 (서열식별번호: 28 내지 37).
도 11은 F4 집단에서 확인된 분리체의 표 표현이고; F4 집단은 HPPD 내성 계통 ML0831266-03093 및 ACC아제 내성 계통 ML0831265-01493 사이의 교배로부터의 HPPD 및 ACC아제 내성 둘 다를 운반하는 F2 선택으로부터 유래되었고; 각각의 행은 상이한 계통을 나타내고, 각각의 열은 염색체 1 상의 HPPD 내성 돌연변이에 대한 QTL 내의 분자 마커이고; HPPD 제초제 메소트리온에 대한 이들 계통의 내성 수준을 관찰하는 것은 내성 돌연변이가 특이적 유전자로 맵핑되는 것을 허용한다.
도 12A 및 도 12B는 돌연변이체 계통 ML0831266-03093, 비돌연변이된 원래 (모) 계통 P1003, 및 상이한 유형의 벼 R0146의 비율 반응을 예시하고; 메소트리온을 210 gai/ha의 비율로 식재한 직후 모든 플롯에 걸쳐 시용하였고; 반응 비율을 2 내지 3엽 단계에서 적용하였고; 반응을 엽면 시용 후 21일에 기록하였다. 도 12A = 초기 결과 및 도 12B = 후속 결과.
도 13은 ACC아제 코딩 유전자에서의 카르복실 트랜스퍼라제 코딩 영역에 대한 DNA 서열을 나타내고; RTA1로부터의 돌연변이를 코딩하는 단일 뉴클레오티드 변화 (박스)는 09PM72399 (서열식별번호: 3)로서 지정된 돌연변이체 계통 ML0831265-01493에서 확인된다. 니폰베어 (NIPPONBARE)는 대조군이고 (서열식별번호: 1); R0146 (서열식별번호: 2)은 돌연변이 집단을 생성하는 미토겐으로 처리된 원래 계통이다.
도 14는 ACC아제 유전자의 카르복실 트랜스퍼라제 영역에 대한 단백질 서열의 비교를 나타내고; 코드 09PM72399 (서열식별번호: 5)를 갖는 계통은 계통 ML0831265-01493이고; 이 계통은 블랙-그래스 (Black-Grass)에 비해 위치 2096에서 단일 아미노산의 변화 (박스)를 나타내고; R0146 (서열식별번호: 5)은 돌연변이 집단을 생성하는 돌연변이원으로 처리된 원래 계통이다. [니폰베어는 서열식별번호: 4임]
도 15는 돌연변이체 계통 ML0831266-03093, 비돌연변이된 원래 계통 P1003, 및 상이한 유형의 벼 R0146의 비율 반응을 나타낸다. 메소트리온을 210 gai/ha의 비율로 식재한 직후 모든 플롯에 걸쳐 시용하였다. 반응 비율을 2 내지 3엽 단계에서 적용하였다. 반응을 엽면 시용 후 21일에 기록하였다.
도 16은 본원에 개시된 일부 벼 실시양태에서 저항성인 제초제를 생산하는 데 사용된 교배의 유형의 흐름도이다.
도 17A 내지 17C는 도 17A, 2엽 단독-메소트리온 0.5X, 도 17B, 2엽 단독-메소트리온 0.5X/퀴잘로폽 0.5X; 및 도 17C 2엽 단독-퀴잘로폽 0.5X를 나타낸다. 도 17D는 스태킹된 계통 (Stacked Line) ACC아제 RTA1 + HPPDi + HPPDni 스택에 대한 탱크 믹스 (Tank Mix) 대 순차적 시용 (Sequential Applications)에 대한 반응에 대한 ％ 손상을 나타내는 그래프이다.
도 18은 ACC아제 RTA2 유전자좌로서 정의된, 44k 어레이 마커를 갖는 그 영역에 맵핑된 QTL에 대해 시행된 바와 같은, 뮤트맵 절차에 의해 확인된 돌연변이의 염색체 1에서의 위치를 나타낸다.
도 19는 맵핑된 돌연변이의 정밀 맵핑을 가능하게 하고, RTA2 제초제 저항성과 연관된 원인을 확인하기 위한 대형 F3 집단 내에서 확인된 진행된 하위-재조합 F4 계통을 나타낸다. 이들 F3 식물을 이형접합성 식물이 동형접합성 돌연변이체 식물에 비해 증가된 손상을 나타낸 1X 퀴잘로폽 용량으로 챌린지하는 것은 원인 돌연변이의 가능한 위치를 좁히는 초기 미세-맵핑을 허용하였다. 이어서, F4-유래된 패밀리를 동일한 제초제/용량으로 재스크리닝하여 Chr1QMM36160202_G-A인 것으로 결정된 원인 돌연변이를 확인하였다.
도 20A 내지 도 20D는 ％ 손상 반응 데이터 및 플롯 사진을 나타낸다. 시험된 물질은 ACC아제-억제제 저항성 조합된 ACC아제 계통 (RTA1 + RTA2), RTA1 및 RTA2 단일 및 스택 RTA1+HPPDi+HPPDni를 포함하였다. 2회의 시용 (2엽 및 침수전 단계에서)은 둘 다의 시용에 대해 동일한 비율을 사용하였다. ACC아제 스택은 심지어 퀴잘로폽의 4X 표지 비율에서도 침수전 시용 후 4주에 손상을 나타내지 않는다. 형질의 이 조합은 어느 하나의 단일 ACC아제 내성 돌연변이체 단독보다 퀴잘로폽 시용에 유의하게 더 내성이다. 도 20A 대조군 플롯, 도 20B 1X 퀴잘로폽, 도 20C 오직 생존한 계통과 조합된 ACC아제를 갖는 4X 퀴잘로폽 플롯. (모든 화상은 침수전 시용 후 4주에 취해짐)), 도 20D 플롯 순서 (좌측에서 우측으로) RTA1, RTA2, RTA1+ RTA2, RTA1+ HPPD i+ HPPDni, P1003, R0146.
요약: ACC아제 조합된 계통 (G2096S + RTA2 1)은 심지어 퀴잘로폽의 4X 표지 비율에서도 침수전 시용 후 4주에 손상을 나타내지 않는다.
도 21A 내지 도 21E는 증가하는 용량의 주요 FOP 제초제에 의해 챌린지된 경우, ACC아제 계통 RTA1, RTA2, 및 스택 RTA1+RTA2 뿐만 아니라 스택 RTA2+HPPDi+HPPDni에 대한 플롯 사진 및 ％손상 반응을 나타낸다. ACC아제 억제제 저항성 조합된 계통 (RTA1 + RTA2)은 시험된 모든 FOP 제초제의 보다 높은 시용률에서 침수전 시용 후 4주에 단일 돌연변이체 계통보다 유의하게 더 적은 손상을 나타낸다. ACC아제 조합된 돌연변이 계통에서의 손상이 이전의 시험보다 이 시험에서 퀴잘로폽에 대해 약간 더 높았던 반면, 손상은 심지어 높은 시용률에서도 최소이다. 시험된 형질 조합 중에서 내성의 수준 사이의 차이는 보다 높은 비율을 시용한 경우 훨씬 더 명백하게 된다. 프로파퀴자폽은 모든 형질 조합에 걸쳐 손상의 가장 높은 비율을 계속 유발한다. 2X 이하의 비율에서의 플루아지폽은 RTA1을 함유하는 임의의 형질 조합으로 생존가능한 것으로 보이지만, 4X에서 오직 조합된 ACC아제 계통은 최소의 손상을 나타낸다. 도 21A 비처리 대조군, 도 21B 4X 퀴잘로폽, 도 21C 4X 플루아지폽, 도 21D 4X 프로파퀴자폽. 침수전 시용 후 4주. 플롯 순서 (좌측에서 우측으로) G2096S, RTA2, G2096S + RTA2, G2096S + HPPD, P1003, R0146. 도 21E 그래프 표현.
도 22A 내지 22D는 L 내지 R을 나타냄; RTA1; 도 22A 대조군, 도 22B 퀴잘로폽 1X, 도 22C 퀴잘로폽 2X, 및 도 22D 퀴잘로폽 4X; 도 22E 내지 도 22H는 RTA1-RTA2를 나타냄; 도 22E 대조군, 도 22F 퀴잘로폽 1X, 도 22G 퀴잘로폽 2X, 및 도 22H 퀴잘로폽 4X. 화상 침수전 시용 후 9주.
도 23은 ACC아제-억제제 FOP 패밀리 퀴잘로폽, 플루아지폽 및 프로파퀴자폽의 상이한 제초제로 챌린지된 경우, ACC아제 생성물 RTA1, RTA2 및 RTA1+RTA2 돌연변이된 계통에 대한 수확량 반응을 나타낸다. 순차적 2-엽 및 침수전 퀴잘로폽 시용 후의 수확량 반응.
도 24는 순차적 및 침수전 후의 ACC아제-억제제 FOP 패밀리 퀴잘로폽, 플루아지폽 및 프로파퀴자폽의 상이한 제초제로 챌린지된 경우, ACC아제 생성물 RTA1, RTA2 및 RTA1+RTA2 돌연변이된 계통에 대한 ％ 손상 반응을 나타낸다.
상세한 설명
1. 상승작용적 ACC아제 억제제 저항성/내성
FOP 제초제에 대한 라이스텍 (RiceTec)에서의 내부-돌연변이유발 집단 스크리닝은 독립적으로 이들 제초제에 대한 내성을 부여하는 2개의 돌연변이유발된 염색체 영역, RTA1 및 RTA2의 확인을 허용하였다. 이들 독립적으로 유래된 돌연변이체 내성 계통의 각각을 진행시키고, 초기 스크리닝 후에 평가하여 이들 새로운 변이체를 추가로 특징화하고, 그들의 내성 효과를 평가하고, 새로운 표현형에 대한 원인이 되는 원인 돌연변이 또는 돌연변이들을 결정하고, 그들의 상업적 잠재성을 평가하였다. 이들 연구의 완결은 몇몇 세대의 집단 진행 및 실험을 요구하였다. 이들 연구는 주요 목적으로서 염색체 위치를 정확히 찾아내는 표현형의 DNA 마커 연관/QTL 맵핑; 유전자 작용 연구; 생성물 사양 및 가치를 평가하기 위한 용량, 시용의 타이밍 및 제초제 연구 및 또한 이들 표현형과 연관된 돌연변이를 특징화하기 위한 전체 게놈 시퀀싱/돌연변이 맵핑 분석을 포함하였다. 단일 유전적 배경에서의 이들 2가지 돌연변이의 스태킹을 포함하는 추가의 연구를 또한 수행하여 이들 독립적으로 개발된 돌연변이체 사이의 상호작용 및 FOP 제초제 내성에서의 그들의 잠재적인 길항작용적 또는 상승작용적 효과를 평가하였다.
돌연변이된 내성 유전자 RTA1은 지질 생합성을 방해하는 이 패밀리의 제초제에 대한 기지의 표적 유전자의 위치, 즉, 아세틸 CoA 효소 유전자좌에 정확하게 맵핑되는 것으로 밝혀졌으며, 이는 명백하게 표적 부위 저항성 (TSR) 발생을 나타내는 것이다. TSR에서 전형적으로, 돌연변이된 대립유전자는 제초제와의 정상적인 상호작용을 방해하거나, 차단하는 발현된 단백질에서의 아미노산 변화를 컨디셔닝함으로써, 식물독성의 발현을 방지하거나, 제한하는 변형을 갖는다. RTA1은 나중에 돌연변이 맵핑 분석을 통해, 그에 의해 야생형에서의 구아닌 뉴클레오티드가 돌연변이체에서 아데닌에 의해 대체되는 ACC아제 유전자의 DNA에서의 단일 점 돌연변이이며, 이는 아세틸-coA 및 FOP 제초제가 상호작용하여 식물독성을 개시시키는 중요한 결합 부위 중 하나에서 발현된 단백질에서의 아미노산의 변화 (G에서 S로)를 발생시키는 것으로 결정되었다. ACC아제 효소에서의 중요한 결합 부위에서의 이 변화 (엽록체에서 발견됨)는 제초제에 대한 친화도를 감소시켜, ACC아제 활성 및 식물독성의 차단을 방지하였다. 따라서, 돌연변이를 운반하는 식물은 제초제에 의해 죽지 않는다. 돌연변이는 서열에 의해 확인되었으며, 동일한 ACC아제 유전자에 대한 다른 작물에서의 상동 위치에서 확인되는 동일한 FOP-내성 돌연변이와 매칭된다.
RTA2의 경우, 내성과 연관된 돌연변이 또는 돌연변이들은 연관/QTL 분석에 의해 및 시퀀싱-돌연변이 맵핑에 의해 나타난 바와 같이 염색체 1 상에 위치한다. 벼의 이 영역 (염색체 1)에서 FOP 제초제의 표적 유전자인 중복된 또는 이종상동성 ACC아제 또는 ACC아제-유사 유전자의 보고가 없기 때문에, RTA2는 비-표적 부위 저항성 (NTSR)의 경우를 대표하는 것으로 추정된다.
ML0831265-01493 (ATCC 기탁 PTA-12933, 돌연변이 G2096S, 향후 "RTA1"로 지칭됨) 및 ML0831265-02283 (ATCC 기탁 PTA-13619 ("RTA2"))으로 지정된 돌연변이체 벼 계통의 실시양태는 단독으로 또는 조합으로 ACC아제 억제제에 대해 저항성/내성이다. (미국 특허 9,370,149 B2).
표 1A 및 1B는 제초제 저항성과 연관된 RTA2에서의 영역에 대한 서열 및 유전적 정보를 제시한다. RTA1 (G2096S)과 조합되어 이 영역은 FOP 제초제에 대해 상승작용적인 거의 독립적인 저항성을 부여한다. 제초제 내성으로부터 얻어진 결과의 중첩은 맵핑 및 F3-4 재조합 정밀 맵핑을 달성하며, 돌연변이 맵핑으로, RTA2 비-표적 부위 제초제 내성에서의 추정상 원인 인자로서, 오. 사티바 (O. sativa) (아종 인디카 (ssp indica)), 및 오. 사티바 (아종 자포니카 (ssp japonica)) 서열 참조 둘 다와 대조되는 상기 열거된 26개의 돌연변이를 확인하였다.
염색체 1에서의 가깝게 연관된 돌연변이의 매개자는 RTA1과 조합되는 경우 제초제 내성을 가져오는 상승작용적 작용과 연관된다. RTA2 돌연변이는 초기에 염색체 1 영역에서의 벼 염기 쌍 위치 3660202에서의 오리자 사티바로부터의 C2H2 아연 핑거 단백질을 코딩하는 유전자 ZOS1-16의 핵산 코딩 서열에서의 G에서 A로의 변화를 유발하는 돌연변이로 맵핑되었다. ACC아제 억제제에 대한 상승작용적 반응과 상관되는 이 영역은 제초제 내성 벼에서 전에 보고되지 않았다. 퀴잘로폽에 대한 저항성을 부여하는 염색체 1 상의 또 다른 벼 영역의 보고는 발견되지 않았다. RTA2가 벼에서 그것만으로인 경우, ACC아제 억제제에 대한 증가된 저항성/내성이 있지만, 돌연변이는 또한 RTA1 돌연변이를 발현하는 벼와 조합되는 경우 ACC아제 억제제에 대한 저항성/내성을 최량으로 유발하도록 작동한다.
이전에 언급된 바와 같이, RTA1 및 RTA2 식물의 제초제 내성의 특이적 수준은 중등도이거나 낮았기 때문에, 둘 다의 메커니즘의 스태킹된 조합을 생성하는 RTA1 및 RTA2 돌연변이체 계통 사이의 교배가 이루어졌으며, 신규한 유전자 조합 사이의 가능한 상호작용을 조사하였다. 목표 스태킹된 생성물은 마커 C1-3208396 및 C1-36386713을 사용하여, 및 염색체 5에서의 ACC아제 유전자좌에 대한 마커를 사용하여 염색체 1 저항성 반수체에 대한 간단한 마커 보조 선택 (Marker Assisted Selection) (MAS)에 의해 급속하게 얻어졌다. RTA1-RTA2 이중 동형접합성 계통에 대해 수행된 제초제 용량, 시용의 타이밍 및 활성 성분의 실험은 2가지 독립적인 내성 변이체 사이의 매우 강한 상승작용적 효과가 존재하며, 그에 의해 이중 동형접합성 돌연변이체는 바람직한 시용 (2-엽 단계)의 임계 초기 창에서 식물독성을 갖지 않는 퀴잘로폽의 80 oz/acre의 최대 용량에 대해 내성화하여, 거의 용량-독립적 내성을 효과적으로 제공하며, 그에 의해 대부분의 보고된 유도된 또는 자발적 ACC아제 돌연변이체는 오직 필드 용량 시용에 대해 내성화함을 밝혀내었다.
둘 다의 유전자 돌연변이의 스태킹은 ATCC PTA-122646 (RL-122546-8)에 기탁된 종자에 의해 예시된다. ACC아제 억제제에 대한 상승작용적 저항성은 스태킹된 돌연변이를 갖는 벼에서 관찰되었다.
"스태킹된 돌연변이체 공여자" 및 "전환" (표 12) 사이의 차이는 RTA1 및 RTA2가 동일한 R0146 돌연변이유발된 집단으로부터 독립적으로 확인된다는 것이다. 2가지 독립적 유전자좌 사이의 잠재적인 상승작용적 효과를 평가하려는 의도로, 동형접합성 RTA1 및 RTA2 계통을 F5 수준에서 상호교배하고, 둘 다의 동형접합성 제초제 내성 돌연변이를 운반하는 F2 자손을 선택하여 이중 RTA1-RTA2 스태킹된 공여자 RL1225468 (PTA-122646)을 생성하였다.
원래 돌연변이체 집단으로부터 유래된 F5 계통의 상호교배인 스태킹된 공여자 RL1225468은 전체 게놈에 걸쳐 무작위 돌연변이를 운반한다. 게놈 전반에 걸쳐 오직 야생형 R0146 대립유전자를 운반하는 "클린" 공여자를 개발하기 위해, Chr5 ACC아제 RTA1 유전자좌 및 Chr1 RTA2 유전자좌에서를 제외하고, 역교배 프로그램을 수행하여 돌연변이된 대립유전자를 통상적인 R0146 계통 내로 전달하였다. 계통 16USGE40004-34는 R0146으로 3회 역교배되고, ATCC에 PTA-124233 하에 제출된 원래 교배 RL1225468/R0146으로부터의 BC3F3 선택이다. 상승작용은 둘 다의 유전적 배경의 사용에 존재하였다.
표적 효소인 본원에 개시된 RTA1에서의 돌연변이와 NTSR에서의 RTA2 돌연변이의 조합에 의해 생성된 제초제 저항성/내성을 발견한 것은 놀랍고도 예상치 못한 결과이다. 서열 분석에 기초하여, ACC아제 유전자는 벼에서 염색체 5 상에 위치한다. 유전자의 일부는 염색체 10 상에 중복되지만, ACC아제 유전자의 어느 부분도 염식체 1 상에 보고되어 있지 않다.
RTA1로와 같이, 제초제 저항성 메커니즘이 기지의 표적 단백질/유전자에서의 변이와 직접적으로 연관되고, 그에 의해 저항성의 대사가 명백하게 추론되는 TSR과 비교하여, NTSR 메커니즘은 특징화하기가 훨씬 더 곤란하며, 광범위한 유전자, 유전자 작용, 및 유전자 상호작용 연구를 요구한다.
FOP 제초제에 대한 NTSR은 대사 저항성, 예컨대 구획화, 이동의 차단, 해독, 활성화의 차단 또는 식물독성의 방지의 다른 형태를 촉발시키는 메커니즘의 개시로부터 발생할 수 있는 것으로 상정된다. 또한, 최근의 연구는 마이크로RNA (miRNA)가 NTSR을 발생시키는 '유전자 조절' 메커니즘에 관여할 수 있음을 보였다. 일반적으로, NTSR 메커니즘 및 제초제에 관여하는 분자 상호작용은 TSR에서 발견되는 것보다 더 복잡한 메커니즘이다.
RTA1 돌연변이 및 RTA2 영역을 운반하는 식물의 상승작용적 효과를 설명하는 가능한 메커니즘은 생화학적 프로세스 (제초제를 해독함)에 의해, 또는 엽록체로의 제초제의 전위, (구획화) 또는 ACC아제 효소에 영향을 미치는 제초제를 방지하는 다른 대사 기능을 제한함으로써 제초제를 파괴하는 것을 포함한다. 제초제를 해독하거나, 시토크롬 (Cytochrome) P450 모노-옥시게나제, 글루타티온 트랜스퍼라제, 아릴 아실아미디아제 또는 기타와 같은 세포 보호에 관여하는 유전자를 활성화시키는 데 있어서 '조절자'로서 간접적으로 작용하는 것은 NTSR 메커니즘이다.
그들의 게놈에서의 둘 다의 돌연변이를 갖는 벼의 저항성/내성에서의 상승작용 때문에, RTA1 및 이전에 "ACC아제 미지의" 돌연변이 (현재 RTA2로 지칭됨)를 스태킹하는 것에 있어서의 상당한 유익이 있었다.
이중 돌연변이의 유익은 도 20, 21, 22, 23, 및 24에 예시되어 있다.
표 7은 제초제로 분무된 (그와 접촉된) 식물에서의 ％ 손상을 범주화하기 위한 기준을 열거한다.
2. 계통 ML0831265-02283 (RTA2)에서의 ACC아제 제초제에 대한 내성에 대한 원인 돌연변이의 확인
대개 ACC아제 제초제에 대한 내성은 내성 계통 ML0831265-01493 (돌연변이 G2096S 또는 RTA1)에서의 경우와 같이, ACC아제 유전자의 카르복실 트랜스퍼라제 영역에서의 돌연변이로부터 유래된다. 그러나, 시퀀싱 후, 계통 ML0831265-02283에서의 ACC아제 유전자의 카르복실 트랜스퍼라제 영역은 돌연변이가 발견되지 않았다. 이 결과는 계통 ML0831265-02283에서의 내성이 비-표적 부위 프로세스로부터 유래됨을 지시한다.
계통 ML0831265-02283에서의 내성에 대한 원인 돌연변이를 발견하는 것은 계통 ML0831266-03093에서의 HPPD 내성에 대한 원인 돌연변이 및 천연 내성을 발견하는 것에 대해 기재된 바와 같은 연관 맵핑 및 돌연변이 맵핑 ("mut 맵핑")을 포함하였다.
계통 ML0831265-02283에서의 내성을 유발하는 염색체 영역 또는 QTL을 발견하기 위한 연관 맵핑은 형질에 대한 집단 분리를 요구한다. 이 집단은 내성 계통을 웅성 불임 세포질 계통 A0109와 교배시킴으로써 제조되었다. 이 교배로부터 수집된 F1을 성장시키고, 자가-수분시켜 F2 집단을 제조하였다. F2 집단은 ACC아제 내성에 대해 분리되었다. 800개의 F2 종자를 식재하고, 잎 조직을 모종으로부터 수집하여 각각의 식물의 유전자형분석을 허용하였다. 모종이 3주령이 되었을 때, 전체 F2 집단에 퀴잘로폽 (116 gmai/ha)을 분무하였다. 모종을 제초제 시용 후 19일에 내성에 대해 평가하였다. 표준 QTL 맵핑 소프트웨어를 사용하여 각각의 F2 개체의 유전자형 및 연관된 내성 반응을 분석하여 제초제 내성과 연관된 분자 마커를 확인하였다. 이 분석 후, 게놈 영역 (QTL)을 염색체 1 상의 내성에 대해 확인하였다 (도 9). QTL에 플랭킹된 연관 마커 및 QTL의 피크에 플랭킹된 QTL 내부의 마커를 계통 ML0831265-02283으로부터 유래된 제초제 내성을 선택하는 데 적합한 것으로서 확인하였다. 대략 250개의 유전자가 플랭킹 마커 사이에 있다.
원인 돌연변이를 발견하기 위한 돌연변이 맵핑 전략을 HPPD 돌연변이 내성에 대한 QTL을 발견하는 데 사용된 것과 동일한 방식으로 이용하였다. 돌연변이 맵핑 집단을 생성하여 차세대 시퀀싱에 의한 게놈 시퀀싱을 통해 원인 내성 돌연변이를 발견하였다. 돌연변이체 계통 ML0831265-02283을 원래 비-돌연변이체 모체 R0146과 역교배시켰다. 교배의 F1 자손을 자가수정시켜 내성 유발 돌연변이에 대해 분리하는 F2 집단을 생성하였다. 오직 돌연변이만이 이 집단에서 분리하는데, 이는 돌연변이가 오직 ML0831265-02283 및 R0146 사이의 게놈 차이이기 때문이다.
F2 집단을 개체로서 식재하고, 잎 조직을 수집하고, DNA를 각각의 개체로부터 추출하여 집단을 표현형분석한 후 유전자형 분석에 사용하였다. ACC아제 제초제 퀴잘로폽을 F2 집단에 3 내지 4엽 단계 및 116 gmai/ha의 농도에서 시용하였다. 제초제 시용에서 생존한 개체를 내성인 것으로 점수화하고, 죽은 것들을 감수성인 것으로 점수화하였다.
20개의 생존한 F2 개체 및 죽은 20개의 세트로부터 유래된 DNA를 각각 함께 각각 벌크화하고, 돌연변이체 계통 ML0831265-02283 및 비-돌연변이체 모체 계통 R0146 둘 다와 함께 시퀀싱하였다. 원인 돌연변이의 맵핑은 생존한 개체를 대표하는 벌크에서의 모든 돌연변이의 빈도에 접근하는 지수에 기초하였다. 지수는 비-돌연변이체 모체 계통 R0146과는 상이한 변이를 운반한 시퀀싱 리드의 비율로부터 유래되었다. 변이를 갖는 시퀀싱 리드가 보다 많을 수록, 지수는 1에 보다 가까웠고, 모든 시퀀싱 리드가 변이를 가진 경우 지수는 1과 같았다.
이들 결과의 분석은 염색체 1 상의 11개의 돌연변이 중 19개의 돌연변이를 포함하는 2개의 군이 1의 지수 점수를 가짐을 나타내었다 (도 10). 이 결과는 여기서 확인된 돌연변이가 모두 연관 맵핑에 의해 염색체 1 상에 확인된 QTL 영역 내에 위치하기 때문에 QTL 연관 맵핑을 확인시켜 준다. 분자 마커 (SNP)를 돌연변이의 각각에 대해 제조하였다 (표 4). 이들 마커를 정밀 맵핑에 사용하여 원인 돌연변이를 발견하고, 계통 ML0831265-02283으로부터 유래된 ACC아제 내성을 상업적 벼 계통으로 육종화하였다.
이전의 시험에서와 같이, RTA1 + RTA2에서 관찰된 손상은 제초제 화학과 무관하게 모든 비율에 걸쳐 매우 낮다. 도 24 RTA1은 1X 퀴잘로폽 및 프로파퀴자폽 둘 다로의 10％ 미만의 손상률, 및 2015 필드 평균보다 약간 더 낮은 2X 시용률에서 거의 40％의 손상률을 갖는 이전의 연구와 일치하는 손상을 나타내었다. 또한, 이전에 관찰된 바와 같이, 플루아지폽에 대한 손상률은 다른 FOP 제초제 중 어느 하나보다 훨씬 더 낮았다. 수확량 데이터는 퀴잘로폽의 1X 및 2X 시용률 둘 다로의 RTA1에서의 양호한 수확량 보유를 나타낸다. 2X 퀴잘로폽에서 RTA1에 대해 기록된 보다 높은 손상률은 수확량에 대한 부정적 효과를 갖지 않은 것으로 보인다. RTA1 + RTA2는 처리 대 비처리 대조군 플롯에서 수확량 감소를 나타내었지만, 제초제 화학 또는 시용률은 처리 사이에서 수확량에 대한 오직 최소 효과를 가졌다.
3. HPPD 내성 원인의 돌연변이를 발견하기 위한 돌연변이 맵핑
둘 다의 자포니카 (니폰베어 (Nipponbare) 품종) 및 인디카 (93-11 품종) 참조 게놈 서열을 사용한 돌연변이 맵핑 분석은 신규한 FOP 내성 표현형과 연관된 것과 동일한 염색체 1을 확인하였다.
돌연변이 맵핑 집단을 생성하여 차세대 시퀀싱에 의한 게놈 시퀀싱을 통해 내성 원인의 돌연변이를 발견하였다. 돌연변이체 계통 ML0831266-03093을 원래 비-돌연변이체 모체 P1003과 역교배시켰다. 교배의 F1 자손을 자가수정시켜 내성 유발 돌연변이에 대해 분리할 F2 집단을 생성하였다. 오직 돌연변이만이 이 집단에서 분리할 것인데, 이는 돌연변이가 오직 ML0831266-03093 및 P1003 사이의 게놈 차이이기 때문이다.
F2 집단을 개체로서 식재하고, 잎 조직을 수집하고, DNA를 각각의 개체로부터 추출하여 집단을 표현형분석한 후 유전자형분석에 사용하였다. 이 방법에서, 집단의 모두는 집단을 메소트리온 제초제에 대해 특정 수준으로 내성이 되게 하는 천연 내성 유전자를 운반할 것이다. 천연 내성을 내성 원인의 돌연변이로부터 구별하기 위해, 메소트리온을 내성 원인의 돌연변이가 없는 모든 개체가 죽도록 높은 비율 (840 gmai/ha)로 집단에 시용하였다.
20개의 생존한 F2 개체 및 죽은 20개의 세트로부터 유래된 DNA를 각각 함께 각각 벌크화하고, 돌연변이체 계통 ML0831266-03093 및 비-돌연변이체 모체 계통 P1003 둘 다와 함께 시퀀싱하였다. 원인 돌연변이의 맵핑은 생존한 개체를 대표하는 벌크에서의 모든 돌연변이의 빈도에 접근하는 지수에 기초하였다. 지수는 비-돌연변이체 모체 계통 P1003과는 상이한 변이를 운반한 시퀀싱 리드의 비율로부터 유래되었다. 변이를 갖는 시퀀싱 리드가 보다 많을 수록, 지수는 1에 보다 가까웠고, 모든 시퀀싱 리드가 변이를 가진 경우 지수는 1과 같았다.
메소트리온에 대한 높은 내성을 유발하는 단일 돌연변이를 예측하였다. 대신 데이터는 원인 돌연변이를 발견하는 데 있어서 또 다른 수준의 곤란성을 도입하는 1의 점수를 갖는 돌연변이의 피크를 나타내었다. 결과는 연관 맵핑을 통해 발견된 염색체 1 상의 QTL이 내성 원인의 돌연변이의 게놈 위치임을 확인시켜 주었다 (도 10). 돌연변이의 피크 내에 1의 지수를 갖는 7개의 돌연변이가 있으며, 이들 중 어느 것도 메소트리온 제초제에 대한 내성에 대한 자명한 원인이 아니다. 마커를 돌연변이에 대해 개발하여 원인 저항성 돌연변이(들)를 발견하는 것을 용이하게 하였다.
확인된 QTL 및 돌연변이 내에 고르게 분포된 재조합 점을 갖는 계통의 세트를 확인하였다 (도 11). 이들 계통은 각각의 재조합이 다중 개체에 대한 제초제 내성에 대한 표현형분석을 허용하는 동형접합성 조건에서 회복되었다 (전체 플롯). 이들 계통의 분석은 내성 돌연변이 및 천연 유전자가 염색체의 작은 영역으로 좁아지는 것을 허용하였다.
기재된 전략을 통해, 내성 원인의 돌연변이 및 천연 내성 유전자를 함유하는 특이적 게놈 영역은 이제 알려져 있으며, 상업적 제품을 개발하는 데 유용하다. 상업적 제품은 이들이 벼 작물에 해를 끼치지 않고 앵미를 포함한 만연한 잡초를 방제할 비율에서의 메소트리온 제초제의 시용에 생존하기 때문에 벼 생산에 유용하다. 특이적 게놈 위치는 상업적 제품의 개발에서 HPPD 내성 형질에 대해 선택하기 위한 각각의 QTL의 플랭킹 영역 상의 분자 마커의 사용을 허용한다.
오직 105 gm ai/ha로 메소트리온을 분무한 개체의 세트, 630 gm ai/ha의 순차적 시용이 이어진 세트, 및 420 gm ai/ha로 분무한 최종 군을 포함한 F2 개체의 3개의 군의 유전자 맵핑은 메소트리온에 대한 저항성을 제어하는 2가지 유전자를 나타낸다. 105 gm ai/ha로 분무한 집단에서, SNP 마커 BG-id2004662에 대한 강한 연관을 갖는 염색체 2 상에서 발견되는 단일 QTL은 대부분 우세한 방식으로 작용하였다. 이 마커 및 QTL은 계통 P1003에서 내재적 내성을 확인한다. 마커는 새로운 메소트리온 내성 계통의 육종 및 선택에 유용하다. 이 QTL의 발견은 메소트리온 제초제의 사용을 통해 잡초를 방제하는 새로운 방법을 갖는 새로운 벼 변종의 상업적 개발을 용이하게 한다. 연관 마커 BG-id2004662의 발견은 메소트리온 및 계통 P1003으로부터 유래된 다른 제초제에 대한 내성을 육종하고, 선택하기 위한 신규한 발견 및 선택 전략이다.
보다 높은 비율의 메소트리온 (420 및 630 gm ai/ha)을 분무한 F2 개체의 2가지 군에서, 제2 QTL은 SNP 마커 WG-id1002788에 대한 강한 연관을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이 QTL은 메소트리온에 대한 높은 내성에 대한 원인 돌연변이의 입증된 유전자 위치이다. 염색체 1 상의 돌연변이 육종을 통해 개발된 QTL 및 계통 P1003에서 발견된 QTL의 조합된 내성은 메소트리온에 대한 신규한 내성을 제공하며, 연관 분자 마커와 조합되어 새로운 벼 변종의 빠르고 효율적인 육종을 용이하게 한다 (도 16).
4. ACC아제 및 HPPD 억제제 둘 다에 대해 저항성인 벼
ACC아제 및 HPPD 억제제 둘 다에 대해 저항성인 벼의 실시양태는 PL121448M2-80048 (ATCC 기탁 PTA-121362) 및 PL 1214418M2-73009 (ATCC 기탁 PTA-121398)로 지정된 벼를 포함한다. (미국 특허 9,303,270 B2).
5. 잡초 방제
농부에 의해 사용되는 회전에서 대안적으로 사용되는 단일 생성물로서, 동일한 유전적 배경에서 피라미드화된 또는 스태킹된 상이한 제초제 저항성 유전자를 갖는 벼 계통은, 이들 실시가 표적화된 잡초 중에서 제초제 저항성 변이체의 발생을 감속시키기 때문에, 제초제의 유용 수명을 연장하는 데 있어서 중요한 도구 또는 전략을 나타낸다. 잡초 방제를 위해 이들 저항성을 혼성체 또는 변종 내로 배치하는 몇몇 방법, 뿐만 아니라 혼성체 종자 생산을 위한 선택안이 가능하다. 본원에 기재된 벼 계통은 벼에서의 잡초 방제를 위한 새로운 방법을 나타내며, 잡초를 방제하기 위한 많은 가능한 전략 중 임의의 것에서 배치되고, 이들 및 다른 잡초 방제 방법의 장기 사용을 제공할 수 있다. 특히, ACC아제 또는 HPPD 억제 제초제에 대해, 및 ACC아제 및 HPPD 억제제 둘 다에 대해 내성인 돌연변이체 벼가 개시된다.
상이한 역학을 통해 동일한 부류의 제초제에 대한 내성을 제공하는 상이한 돌연변이를 포함한 다중 제초제에 대한 저항성의 공급원을 개발하는 것을 통해, 보다 많은 선택안이 벼에서의 잡초 방제에 이용가능하다. 청구된 벼 계통은 잡초 방제를 위한 새로운 작용 방식을 갖는 제초제를 사용하는 능력을 제공한다. 예를 들어, HPPD 억제제와 조합하여 ACC아제 억제 제초제를 사용하는 능력은 벼에서 이전에 보고되지 않은 작용 방식을 나타낸다. 동일한 제초제에 대한 저항성을 갖지만, 다른 방식의 원인 작용을 갖는 계통을 조합하는 것을 포함하는 이들 벼 계통의 사용은 재배자의 필드에서 잡초 방제를 위한 새로운 선택안을 제공하며, 따라서 잡초 저항성의 발생을 감속시킨다. 상이한 돌연변이를 갖는, 잡초 방제를 위해 이 저항성을 혼성체에 배치하는 몇몇 방법 뿐만 아니라 혼성체 종자 생산을 위한 선택안이 가능하다.
제초제 저항성/내성 벼 식물의 부근에서 잡초의 성장을 제어하는 방법은 또한 본 개시내용의 범위 내에 있다. 이러한 방법의 한 예는 1종 이상의 제초제를 벼 식물의 필드에 벼 식물의 성장을 정상적으로 억제할 제초제의 수준으로 시용하는 것이다. 예를 들어, 적어도 1종의 제초제는 HPPD 활성을 억제한다.
논에서 잡초 방제를 최대화하기 위해, 존재하는 잡초의 스펙트럼을 커버하는 상이한 제초제가 요구될 수 있으며, 이번에는 작물 주기에 따라 수 회의 시용은 단일 시용에 의해 제공되는 유효한 방제의 창 및 종종 단일 제초제 시용에 의해 제공되는 보호보다 더 긴 그의 표적 잡초가 발아할 수 있는 시간의 창 사이의 중첩에 따라 임의의 하나의 특정 제초제에 대해 요구될 수 있다. 온도, 및 토양 수분 조건은 제초제 효능의 창, 잡초 발아 및 성장의 순간의 창 둘 다에 영향을 미치는 핵심적 인자이다. 이들 인자에 기초하여, 제초제 방제 모델은 대개 작물 주기 동안 순차적인 반복된 시용을 포함한다.
표준 제초제 내성 시스템, 예를 들어, 이미다졸리논 제초제에 대한 저항성을 위해 벼에서 상업적으로 현재 사용되는 것에서, 제초제의 제1 시용은 2엽 단계에서 시용되며, 제2 시용은 식물이 분얼되는 경우 영구적 침수의 확립 직전 최소 10일 후에 이어진다. 제2 시용의 목적은 이들이 침수에 의해 효과적으로 억제될 수 있기 전에, 제1 시용 후에 발아하였을 수 있는 잡초를 제거하는 것이다. ACC아제 억제제 제초제를 포함한 일부 형질에서, 제초제 시용의 타이밍은 유효한 잡초 방제를 위해서 뿐만 아니라 식물 그 자체에서 관찰되는 내성의 수준을 위해서도 중요할 수 있다. 라이스텍에서 개발 하에 있는 한 형질에서, 제초제 시용에 대한 반응에서 관찰된 식물 손상은 식물 단계와 가깝게 정렬된다. 이 계통에서, 매우 조기 출아후 시용은 1엽 단계에서 훨씬 더 높은 손상을 유발하며, 관찰된 손상은 제1 곁눈을 통해 식물의 각각의 성장 단계에서 감소한다. 일부 제초제 내성 형질은 심지어 비록 출아후 내성이 우수하더라도 출아전 시용에 대한 내성을 나타내지 않는다. 식물 성장 단계에 연관된 이 가변적 제초제 반응은 새로운 제초제 내성 생성물의 안전한 사용법의 경계를 확립하기 위한 주의 깊은 시험을 요구한다.
양호한 수확량을 위한 벼 생산은 특이적 잡초 방제 실시를 요구한다. 일부 제초제는 식재 후 그러나 작물 출아 전에 출아전 제초제로서 시용되고; 다른 것들은 출아후 제초제로서 시용된다. 벼의 경우, 출아후 시용은 작물이 침수되기 전에, 후의 것일 수 있다. 바람직한 시용은 통상적으로 성장하는 식물에서 열린 잎의 수에 의해 정의되는 바와 같은, 작물의 발달 단계에 따른 시간이다. 제초제 시용의 타이밍은 잡초 방제의 효율을 최대화하는 관점에서 뿐만 아니라, 제초제 내성 작물에 대한 영향을 최소화하는 관점에서 중요한 인자이다. 이 고려사항은 돌연변이유발된, 천연 발생 또는 트랜스제닉 제초제 저항성이 대개 용량 및 시용 타이밍 효과에 완전히 독립적이지 않다는 사실로부터 기인한다. 제초제 저항성의 상이한 유전자는 상이한 용량 반응, 뿐만 아니라 시용 반응의 타이밍을 가지며, 그에 의해, 전형적으로 저항성 작물에서 식물독성은 용량이 특정 수준 초과 증가함에 따라 증가하거나, 저항성 작물에 대한 식물독성은 주어진 제초제 용량에 대한 시용의 다양한 타이밍에 따라 다양하다.
이 시용의 대상인 신규한 제초제 저항성 유전자의 평가를 벼 농사 작업에 전형적으로 사용되는 시용률을 커버하는 적합한 제초제 용량의 범위로, 또한 제조자-권고된 용량으로부터의 가능한 편차를 고려하면서 수행하였다. 권고된 제조자 또는 최량 실시 권고된 용량인 1X를 고려하여, 가장 빈번히 평가되는 추가의 용량은 2X 및 4X이며, 일부 실험은 다른 값을 포함한다. 생성물 및 활성 성분 함량에 의한 용량에 대한 참조는 표 11에 제공된다.
벼 생산의 경우, ACC아제-억제 제초제의 표적인 잡초 앵미 방제, 및 HPPD-억제제 메소트리온 제초제로 표적화되는 활엽 잡초는 침수 전에 식물 성장의 초기 단계 동안 최량으로 이용되는데, 이는 정수의 존재 하에서 이 기법 자체가 수확전에 모든 방법으로 유효한 잡초 억제를 제공하기 때문이다. 또한, 이들 제초제에 대해, 저항성 작물에 대한 식물독성이 보다 어린 모종에 대해 더 높음을 고려하여, 최적 방제 창과 일치하게, 이들 신규한 제초제 저항성 유전자의 평가는 주로 2엽 단계, 및 4엽 단계에서의 시용을 포함하며, 침수는 바람직하게는 5 내지 6엽 단계에서 일어난다.
6. 제초제의 조합
상이한 제초제 저항성 유전자의 조합을 고려하는 데 있어서, 조합이 동일한 제초제에 대한 2개 이상의 상이한 작용 방식, 또는 상이한 패밀리 또는 기능의 제초제에 대한 2개 이상의 유전자를 포함하는지 여부와 무관하게, 본원에 기재된 실시양태의 일부가 입증한 바와 같이, 유전자 대 유전자 상호작용으로부터 생성되는 길항작용적 또는 상승작용적 상호작용이 관찰될 수 있다. ACC아제-억제 제초제 RTA1 및 RTA2에 대해 저항성인 신규한 돌연변이된 유전자의 조합은 개별적으로 작용하는 2개의 유전자의 상가적 저항성보다 훨씬 우수한 제초제 내성을 생성하며, 이는 상승작용을 입증한다. 제초제 내성은 동일한 제초제에 대한 저항성을 부여하는 2가지 작용 메커니즘으로부터 발생한다.
또한, 각각 상이한 제초제 패밀리에 대해 특이적인 상이한 제초제 저항성 유전자의 조합을 고려하는 데 있어서, 이 조합이 분무자가 제초제의 혼합물을 적재하는 것을 가능하게 하고, 이는 이번에는 작물 상에서의 기계 통과를 감소시킨다는 예상을 갖고, 상승작용적 또는 길항작용적 상호작용은 본원에 기재된 실시양태의 일부에 의해 입증된 바와 같이, 제초제 생성물 사이에 일어날 수 있다. ACC아제-억제제 패밀리의 제초제에 의해 챌린지되는 경우, 유전자 G2096S에 의해 벼 식물에 부여되는 저항성은 RTA1 유전자, 및 또한 HPPD-억제제 제초제 메소트리온에 대한 저항성을 부여하는 HPPD1i + HPPD2ni 유전자 둘 다를 운반하는 벼 식물에 의해 나타난 것보다 유의하게 더 높다. 식물이 메소트리온의 동등한 작업 용량과 조합된 ACC아제-억제 제초제의 동일한 용량을 함유한 탱크 믹스로 챌린지되는 경우. 상이한 제초제가 임의의 순서로 개별적으로 시용되고, 기간이 시용 사이에 허용되는 경우, 제초제에 대한 반응은 각각의 단일 유전자를 운반하는 계통에서 관찰된 것과 유사하다. 이들 효과는 2가지 제초제가 작물 시용을 위해 탱크에서 조합되는 경우, 제제 사이의 길항작용적 상호작용을 입증한다. 이 관찰은 퀴잘로폽을 메소트리온과 조합하는 경우 이루어졌다.
물질 및 방법
돌연변이 집단 확립
등록되는 제초제 저항성/내성 계통을 개발하기 위한 돌연변이 육종 프로그램을 개시하였다. P1003, R0146, 및 P1062를 포함한 3가지 벼 계통의 대략 10,000개의 종자 (인의 평균 중량에 의해 추정됨)를 돌연변이원 아지드화나트륨 (AZ) 및 메틸-니트로소우레아 (MNU) 둘 다에 노출시킴으로써 영구적 돌연변이체 집단을 생성하였다. 처리된 종자를 식재하였다. 개체 식물을 수확하여 8,281개의 잠재적으로 돌연변이 계통을 생성하였다. 계통을 형질 스크리닝을 위한 영구적 돌연변이체 집단으로서 신뢰하여 유지하였다.
미국 성장 조건에 대한 적응을 나타내는 인디카-유형 임성회복친 계통 R0146을 라이스텍 육종 프로그램 (RiceTec Breeding Program) 내로 혼입하고, 4가지 다른 라이스텍 임성회복친 R 계통과 교배시켜 평가에 요구되는 집단을 개시하였다. 그때에 활성 라이스텍 R 계통과 비교할 경우 상이한 기원 중에서, R0146은 신규한 복원 유전자를 라이스텍 유전자 풀에 제공할 것이다. 우수한 적응, 유형, 생산성 및 복원 능력을 나타내어, R0146의 사용 및 그의 초기 선택은 미국 라이스텍 육종 프로그램 내에서 꾸준하게 증가하였다. R0146 및 그의 선택이 미국 육종 파이프라인에서의 중요성에서 증가하였기 때문에, 그들의 이용은 또한, 그들이 또한 뛰어난 성능을 나타낸 라이스텍 남아메리카 육종 프로그램으로 연장되었다. R0146은 시험 위치에 걸쳐 가장 넓은 적응가능성, 및 다양한 자성 계통과의 가장 높은 조합 적성을 갖는 것으로서 두드러지고, 높은 성능의 혼성체 조합을 일관되게 생산한 임성회복친 계통이었다. 제초제 내성 형질의 발견을 위한 돌연변이유발을 겪는 단일 임성회복친 계통으로서 R0146을 사용하는 결정을 하였다. 다른 계통은 그때에 라이스텍 육종 파이프라인에서의 관통의 그 수준을 갖지 않았으며, 이는 R0146을 돌연변이유발 노력으로부터 추구되는 신규한 유전자의 빠르고 폭넓은 이용을 위한 최량의 후보자로서 위치시킨다.
ACC아제 억제제에 대한 향상된 내성/저항성
ACC아제 제초제에 대한 내성에 대한 돌연변이체 계통 ML0831265-02283의 입증.
스크리닝 후, 대규모 돌연변이체 집단인 계통 ML0831265-02283은 또한 ACC아제 제초제 퀴잘로폽의 시용에서 생존하였다. 계통을 증가시켜 ACC아제 제초제에 대한 그의 내성을 평가하기 위한 보다 대규모의 시험을 위한 충분한 종자를 얻었다. 계통 ML0831265-02283에서의 ACC아제 제초제에 대한 내성을, 계통의 필드 플롯 (5 피트 × 10 피트)에 비-돌연변이체 모체 계통 R0146, 제2 비-돌연변이체 계통 P1003, 및 ACC아제 내성 계통 ML0831265-01493을 식재함으로써 입증하였다. ACC아제 제초제 퀴잘로폽을 4엽 단계에서 표지된 비율 (77 gmai/ha)의 0.5x, 1x, 2x, 및 4x 배수에서 시용하였다. 제초제를 시용한 후 21일에 플롯을 제초제 시용을 갖지 않은 대조군 플롯에 기초하여 벼에 유발된 퍼센트 손상에 대해 평가하였다 (도 6). 데이터는 계통 ML0831265-02283의 내성을 확인시켜 주며, 이는 퀴잘로폽의 2x 및 4x 비율에서 보다 적은 손상에 의해 나타난 바와 같이 심지어 계통 ML0831265-01493보다 더 큰 내성을 가질 수 있다.
계통 ML0831266-03093 및 ML0831265-01493에서의 내성을 조합함에 의한 HPPD 및 ACC아제 억제 제초제에 대한 내성의 발생
HPPD 효소를 표적화하는 제초제는 주로 활엽 잡초를 방제한다. 그러나, 벼에서의 시험은 특히 메소트리온 제초제로의 잡초 앵미를 포함한, 벼에서의 화본과 잡초의 만연한 방제를 나타낸다.
한편, ACC아제 제초제의 주요 잡초 표적은 벼, 화본과 잡초, 및 앵미를 포함한 단자엽 식물이다. 그러나, 일부 ACC아제 제초제는 벼에 대해 보다 낮은 활성을 갖는다. 이 단점은 가능하게는 앵미로 전달되는데, 이는 식물이 매우 가깝게 관련되기 때문이다. HPPD 내성 및 ACC아제 내성을 단일 벼 계통 내로 조합시키는 것은 벼에 대한 넓은 스펙트럼 잡초 방제 전략을 허용한다. HPPD 제초제는 활엽 잡초를 방제하며, 앵미를 포함한 단자엽 잡초의 방제를 위한 ACC아제 제초제의 효과를 향상시킨다.
HPPD 내성을 ACC아제 내성과 단일 벼 계통 내로 조합시키는 것을, HPPD 내성 계통 ML0831266-03093을 ACC아제 내성 계통 ML0831265-01493과 교배시킴으로써 HPPD 내성 맵핑 프로젝트로 개시하였다. 맵핑에서, 메소트리온을 먼저 낮은 비율 (105 gmai/ha)에서, 그 후 높은 비율 (630 gmai/ha)에서 시용함으로써, F2 집단 식물을 HPPD 내성을 위해 선택하였다. 이 프로세스에서, 마커 또는 제초제 내성 스크리닝 중 어느 하나 또는 둘 다에 의한 HPPD 내성의 장래의 선택을 허용하는 분자 마커를 또한 개발하였다.
HPPD 제초제 메소트리온에 대해 내성인 식물을 확인한 후, 그들을 또한 ACC아제 공여친 계통 ML0831265-01493에서의 RTA1 돌연변이에 대한 ACC아제 내성 기능적 마커로 시험하였다. ACC아제 RTA1 마커를 개발하기 위한 정보는 도 13, 14에 있다.
이 프로세스 후, 적어도 이형접합성 조건에서, 제초제 저항성에 대한 ACC아제 돌연변이, 및 염색체 1 및 염색체 2 상에 HPPD 유전자 제초제 저항성을 갖는 25개의 F2 식물의 세트를 확인하였다. 식물을 성숙 시 수확을 위해 또 다른 필드로 이식하였다. 25개의 식물 중에서, 8개는 ACC아제 돌연변이에 대해 동형접합성이었고, 1개의 식물은 ACC아제 돌연변이, HPPD 내성 돌연변이, 및 비-유도된 내성 유전자에 대해 동형접합성이었다. 25개의 식물을 개화 시 자루에 넣고, 종자를 성숙 시 각각의 식물로부터 개별적으로 수확하였다.
식물의 초기 성숙 군을 가능한 한 빨리 수확하고, 종자를 온실에 식재하여 F4 세대로 빠르게 진행하는 것을 도왔다. F3 식물에 대한 선택을 HPPD 내성 돌연변이 및 천연 내성 ACC아제 기능적 돌연변이에 플랭킹된 분자 마커에 의해 수행하였다. 모든 선택된 게놈 영역에 대한 동형접합성 식물은 F5 세대로 진행하였다. F5 종자는 ACC아제 제초제 및 HPPD 제초제 메소트리온에 대한 내성을 갖는 것으로 확인되었다. F5 계통 중에서 PL1214418M2-80048을 높은 종자 수확량 및 위치 RTA1에서의 ACC아제 내성 돌연변이, HPPD 내성 돌연변이, 및 HPPD 내성 천연 유전자에 대해 동형접합성인 것으로 인해 선택하였다. 계통 PL1214418M2-80048로부터의 종자를 ATCC에 기탁하고, 기탁 번호 PTA-121362를 부여하였다 (표 12 참조).
제2 계통을 F3 종자를 행으로 식재함으로써 개발하였다. 식물에 HPPD 제초제 메소트리온을 분무하고, 비분무된 대조군에 비해 거의 없거나 전혀 없는 손상 때문에 선택하였다. 잎 조직을 또한 수집하고, 식물을 ACC아제 내성 돌연변이 RTA1, HPPD 돌연변이 내성, 및 HPPD 비-유도된 내성의 유전에 대해 시험하였다. 모든 3가지 내성 유전자 또는 QTL에 대해 동형접합성인 식물을 확인하고, 수확하였다. F4 종자 (PL1214418M2-73009)를 모든 3가지 내성 유전자 또는 QTL을 운반하는 식물로부터 함께 벌크화하고, ACC아제 및 HPPD 제초제 둘 다에 대한 내성에 대해 시험하기 위해 또는 그에 대한 새로운 공여자 계통으로서 사용하였다. 공급원 PL1214418M2-73009의 종자를 ATCC에 기탁하고, 기탁 번호 PTA-121398을 부여하였다 (표 5 참조).
HPPD 및 ACC아제를 조합한 새로운 계통의 내성은 육종 집단에서 동등하며, 선택가능하다
종자 공급원 PL1214418M2-73009를 HPPD 저항성 계통 ML0831266-03093 및 ACC아제 저항성 계통 ML0831265-01493 사이의 교배로부터 개발하였으며, 새로운 계통에서 HPPD 및 ACC아제 억제제에 대한 동등한 내성을 입증하기 위한 시험을 허용하는 데 충분하였다. 2가지 시험을 수행하여 새로운 계통 PL1214418M2-73009에서의 ACC아제 및 HPPD 제초제 둘 다에 대한 내성의 회복을 측정하였다. 2가지 형질을 조합한 계통에서의 내성의 회복은 형질이 유전가능하며, 제초제 저항성을 갖는 새로운 변종 및 혼성체를 생산하는 데 사용될 수 있음을 예시할 것이다. 이들 시험은 대개 정량적 형질에 대한 복잡한 QTL을 회복하는 것이 곤란하고, 일부의 경우, 형질 반응은 유전적 배경에 의존하기 때문에 중요하다. 첫번째 실험에서, 메소트리온 (HPPD 제초제)에 대해 저항성인 계통을, 계통 PL1214418M2-73009, HPPD 저항성 계통 ML0831266-03093 및 야생형 벼 계통 P1003 및 R0146을 플롯 (5 피트 x 10 피트)에 식재함으로써 평가하였다. 메소트리온을 표지된 시용률 (210 gmai/ha)의 0.5x, 1x, 2x, 및 4x 배수에서 시용하였다. 1x 및 2x 비율을 갖는 2가지 추가의 처리, 그 후, 14일 후에 동일한 비율을 갖는 제2 시용이 포함되었다. 계통 ML0831266-03093으로부터의 HPPD 저항성의 완전한 회복은 계통 PL1214418M2-73009에서 달성되었는데, 이는 이것 및 원래 형질 계통이 제초제 시용에 대해 동일한 반응을 가졌기 때문이다 (도 1). 이들 결과는 HPPD 저항성 형질이 상업적 제품을 개발하기 위해 육종되고, 선택될 수 있음을 나타낸다.
계통 ML0831265-01493에서와 같은 RTA1 돌연변이로부터의 ACC아제 억제제 저항성의 회복을 확인하기 위한 또 다른 시험을 수행하였다. 이 시험에서, 조합된 HPPD 및 ACC아제 내성을 갖는 새로운 계통 PL1214418-73009는 ACC아제 내성에 대한 원래 공여자 계통 ML0831265-01493 (플롯에 식재됨), ML0831266-03093, P1003, R0146 모체 계통을 포함한 다른 다양한 계통과 함께 행으로 식재하였다. 계통을 모두 ACC아제 제초제 플루아지폽으로 표지 시용률 (210 gmai/ha)의 0.5x, 1x, 2x, 및 4x 배수에서, 및 퀴잘로폽으로 표지 시용률 (77 gmai/ha)의 0.5x, 1x, 2x, 및 4x 배수에서 시험하였다. 이들 시험에서, ACC아제 내성이 유전된 3가지 새로운 계통은 모두 공여자 계통 ML0831265-01493이 그랬던 것처럼 ACC아제 제초제에 대한 동등한 내성을 나타내었다 (도 2).
HPPD 제초제에 대한 내성은, 이것이 제초제에 의해 표적화되는 유전자와는 상이한 2개의 유전자를 요구하기 때문에, ACC아제 내성보다 더 복잡하다. 이 보다 큰 복잡성에도 불구하고, 동등한 내성은 천연 내성 유전자 및 돌연변이 내성 둘 다의 선택을 통해 회복되었다. 이 교배에서 ACC아제 모체 계통 ML0831265-01493은 HPPD 제초제 메소트리온에 대해 매우 민감하였으며, 따라서, HPPD 내성에 대해 임의의 기여를 할 것으로 예상되지 않았다. HPPD 제초제에 대한 저항성/내성은 아마도 이들이 선택 프로세스의 초점이었기 때문에 이들 2개의 유전자 단독에 의해 유발되며, 새로운 계통 PL1214418M2-73009는 동등한 저항성을 나타낸다. 이들 결과는 ACC아제 및 HPPD 억제제 둘 다에 대한 저항성이 유전되며, 벼에서 HPPD 및 ACC아제 억제제 저항성 둘 다의 상업적 개발을 위해 임의의 벼로 육종될 수 있음을 나타낸다.
P1003으로부터의 HPPD 내성 돌연변이 및 비-유도된 내성 유전자로부터의 내성 기여의 확인
HPPD 및 ACC아제 제초제에 대한 저항성/내성을 갖는 새로운 계통 (PL1214418M2-80048 및 PL1214418M2-73009)을 개발하는 육종 프로세스 동안, 2가지 다른 계통을 또한 조사하여 HPPD 내성 돌연변이 및 HPPD 내성 천연 유전자의 기여를 측정하였다. 계통 PL1214418M2-73001은 ACC아제 내성 및 오직 HPPD 내성을 갖는 반면, 돌연변이 PL1214418M2-73013은 ACC아제 내성 및 오직 HPPD 천연 내성 유전자를 운반한다. 이들 선택은 HPPD 제초제에 대한 내성이 요구되는 2개의 유전자의 각각의 내성 효과의 추정을 허용한다. 각각의 유전자의 내성 효과를, 돌연변이로부터의 HPPD 내성 및 비-유도된 내성 둘 다를 갖는 새롭게 개발된 계통 PL1214418M2-73009, HPPD 내성 계통 ML0831266-0309, 및 비-유도된 모체 계통 P1003을 포함한 단일 행에서 계통을 성장시킴으로써 측정하였다. 필드 플롯을 4엽 단계에서 HPPD 제초제 메소트리온으로 210 gmai/ha의 표지된 시용률의 0.5x, 1x, 2x, 및 4x 배수에서 시용하였다.
플롯을 제초제를 시용한 후 4주에 평가하였다. 결과는 천연 내성 유전자 단독 (PL1214418M2-73013)이 모체 계통 P1003과 유사한 내성 수준을 제공하였음을 나타내었다 (도 4). 이 결과는 QTL 플랭킹 마커 내에 위치한 염색체 2 상에 위치한 천연 내성 유전자가 비-돌연변이체 계통 P1003에서의 내성의 유일한 원인 공급원인 경우 예상될 것이다. 오직 QTL 플랭킹 마커 내의 염색체 1 상에 위치한 HPPD 돌연변이를 운반하는 계통 PL1214418M2-73001은 비-돌연변이체 계통 P1003 및 HPPD 돌연변이체 계통 ML0831266-0309 사이의 중간의 내성을 나타낸다. 이 결과는 HPPD 돌연변이가 천연 내성 유전자보다 향상된 내성 뿐만 아니라 보다 더 큰 수준의 내성을 제공함을 나타낸다. 또한, 이는 또한 HPPD 돌연변이가 HPPD 천연 내성 유전자와 독립적으로 기능함을 시사한다. 2개의 유전자는 또한 오직 2개를 새로운 계통 PL1214418M2-73009에서 조합함으로써 내성 수준이 원래 돌연변이체 계통 ML0831266-0309와 동등하게 되기 때문에, 상가적 방식으로 기능하는 것으로 보인다.
ACC아제 억제제 및 HPPD 억제제로의 벼 작물에서의 잡초 및 앵미의 방제
비-돌연변이체 벼, 예컨대 계통 R0146 및 P1003을 방제하는 제초제 활성 또는 능력은 제초제가 벼 작물에서 앵미 또는 야생 잡초 벼를 얼마나 잘 방제할 것인지의 양호한 예측자이다. 앵미 및 야생 잡초 벼는 벼와 매우 유사하며, 심지어 벼와 교배하는 능력을 갖는다. 이 유사성은 이들 잡초가 벼 작물에서 방제되기가 그렇게 곤란한 이유이다. 개시된 돌연변이체 계통 (ML0831265-01493, ML0831265-02283, ML0831266-03093, PL1214418M2-80048, 및 PL1214418M2-73009)은 벼 작물에 통상적인 앵미, 야생 잡초 벼, 및 다른 잡초에 대한 새로운 잡초 방제 전략을 제공한다. 이들 계통은 통상적으로 벼 작물을 죽이거나 그에 대한 수확량 감소 손상을 유발할 제초제에 대한 벼 내성을 제공한다.
내성 계통을 시험하면서, 대조군으로서 및 앵미/야생 잡초 벼 방제 전략으로서 상업적 잠재성의 지표로서 모체 계통을 또한 시험하였다. 이들 시험은 단독으로 또는 다양한 조합으로 및 시용 타이밍으로 시용된 제초제의 선택 처리가 벼 작물에서의 새로운 잡초 방제 전략을 제공함을 나타내었다.
벼는 특정 ACC아제 억제제 제초제에 대해 내성이며, 예를 들어 시할로폽은 벼에 사용하기 위해 등록되어 있다. 그러나, 다른 ACC아제 제초제는 다양한 정도로 벼를 죽이거나 심각하게 손상시킨다. 시험 후, 플루아지폽 및 퀴잘로폽을 포함한 몇몇 이들 다른 제초제는 벼에서 통상적인 화본과 잡초, 예컨대 돌피의 양호한 방제를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 벼에서의 통상적인 잡초의 방제는 또한 특히 식재전 또는 보다 높은 비율 (210 gmai/ha의 표지된 비율의 2x)에서 시용되는 경우, 메소트리온 단독으로 달성되었다 (도 5A 및 도 5B). 잡초 방제를 제공하는 제초제의 둘 다의 유형의 시용된 비율은 HPPD 및 ACC아제 제초제 둘 다에 대한 내성을 갖는 조합된 계통을 포함한 각각의 ACC아제 및 HPPD 내성 계통의 내성 수준 내에 충분히 있다.
단일 계통 (PL1214418M2-80048 및 PL1214418M2-73009)으로의 HPPD 및 ACC아제 내성의 개발은 탱크 믹스에서 또는 상이한 시간에 개별적으로 ACC아제 및 HPPD 제초제의 시용을 포함하는 추가의 잡초 방제 전략을 위한 기회를 제공한다. HPPD 제초제 메소트리온의 매우 유효한 식재전 시용은 이제 단독으로 또는 HPPD 제초제와 조합하여 시용된 ACC아제 제초제로 이어질 수 있다. 이 전략은 HPPD 제초제에 의해 제공되는 활엽 잡초 방제에 의한 벼 작물에서의 전체 스펙트럼 잡초 방제, 및 ACC아제 제초제에 의한 화본과 잡초 방제를 제공한다. 또한, ACC아제 제초제에 의한 화본과 및 앵미/잡초 벼의 방제는 HPPD 억제 제초제에 의해 제공되는 활성에 의해 크게 향상된다. 이 전략은 벼에 대한 보다 낮은 활성을 갖는 ACC아제 억제 제초제가 사용되는 경우, 앵미의 방제에 특히 유효할 것으로 예상된다.
이 특정 잡초 방제 시스템은 현재 사용되는 제초제에 대한 내성을 발생시키는, 앵미를 포함한 일부 잡초로 인해 벼 작물에서 매우 유용하다. 이 잡초 방제 전략의 사용은 벼 작물에서 상이한 작용 방식 제초제의 회전을 허용한다. 제초제 작용의 상이한 방식을 회전시킴으로써, 저항성 잡초의 발생은 감속되거나 방지되어, 모든 이용가능한 잡초 방제 방법의 보다 장기 사용을 허용한다.
HPPD 억제 제초제에 대한 내성에 대한 돌연변이체 계통 ML0831266-03093의 입증
"돌연변이 집단"의 초기 스크리닝 후, 손해가 없는 계통을 선택하고, 제초제의 상이한 비율을 사용한 추가의 실험에서 시험하였다. 특히, 2가지 상이한 비율의 메소트리온을 출아전에 시용하고, 이에 더하여 추가의 엽면 시용을 또한 시용한 비율 반응 실험을 수행하였다. 이 실험은 한 돌연변이체 계통을 대조군에 비해 메소트리온 제초제에 대한 우수한 저항성 (더 적은 손상)을 갖는 것으로서 구별하였다 (도 12A 및 도 12B). 이 지정된 ML0831266-03093의 자손은 메소트리온 제초제에 대한 저항성을 갖는 새로운 계통으로서 유지된다. 계통 (ML0831266-03093)은 등록된 벼 계통으로 역교배된 저항성의 공급원이거나, 새로운 등록된 벼 계통을 개발하기 위한 육종에 직접적으로 사용된다. 개발된 계통은 벼에서의 잡초를 방제하는 대안적인 작용 방식을 제공하는 새로운 혼성체의 개발에 사용하기 위한 제초제 저항성의 공급원이다. 재배자에게 이 기회를 제공하는 것은 높은 수확량을 제공하는 데 및 이용가능한 잡초 방제 기술의 유용 수명을 연장하는 데 둘 다에 있어서 크게 가치 있다.
돌연변이체 계통 ML0831266-03093은 상이한 비율의 제초제로 계통을 스크리닝하는 것을 통해 메소트리온 (통상적인 HPPD 억제 제초제)에 대한 내성을 갖는 것으로 밝혀졌다. ML0831266-03093의 내성 수준은 원래 비-돌연변이체 (천연) 계통 P1003보다 훨씬 더 큰 것으로 밝혀졌다.
원래 계통 P1003은 메소트리온에 대한 천연 내성을 갖는다. 원래 계통의 이 비-유도된 저항성은 때때로 돌연변이체 계통의 저항성을 마스킹하며, 이는 돌연변이체 계통 ML0831266-03093의 향상된 저항성을 자명하지 않게 만든다.
형질의 추가의 입증은 돌연변이체 계통 ML0831266-03093을 통상적인 벼 잡초의 존재 하에서 시험하는 것을 포함하였다. 돌연변이체 계통은 메소트리온의 시용된 비율에 대해 완전히 내성이었던 반면, 만연한 잡초 집단은 제초제에 의해 양호하게 방제되었다 (도 6A 및 도 6B). 화본과 잡초 방제의 이 수준은 메소트리온이 단자엽 식물에서 활엽 잡초를 방제하는 것을 위해 표지되기 때문에 완전히 예상치 않은 것이었다. 이 결과는 계통 ML0831266-03093 및 유래된 계통과 조합되어 메소트리온 및 다른 HPPD 억제 제초제가 벼에서 새로운 잡초 방제 시스템을 나타냄을 지시한다. 화본과 잡초 및 특정 유형의 벼에 대한 메소트리온의 높은 활성은 시스템이 벼 작물에서 앵미를 방제하는 데 사용될 수 있었음을 지시한다.
메소트리온 및 다른 HPPD 억제 제초제는 HPPD 유전자를 표적화한다. 제초제 내성의 증가는 HPPD 유전자에서의 돌연변이를 통해 달성될 수 있었다. 유전자 서열 내의 돌연변이는 효소 구조를 충분히 변경시켜 그것이 제초제에 의해 억제되는 것을 방지할 수 있지만, 여전히 그것이 그의 정상적인 생리학적 기능을 수행하는 것을 허용한다. 이를 타당한 내성 메커니즘으로서 가정하여, HPPD 유전자를 돌연변이체 계통 ML0831266-03093 및 원래 계통 P1003 둘 다에서 생거 (Sanger) 시퀀싱에 의해 시퀀싱하였다. 놀랍게도, HPPD 유전자에서 돌연변이는 발견되지 않았다. 계통 ML0831266-03093에서의 제초제 내성은 비-표적 부위 프로세스로부터 유래되는 것으로 보인다.
실시예
실시예 1: ACC아제 억제제에 대한 내성과 연관된 RTA2로 지정된 돌연변이의 위치
뮤트맵 집단은 벼 계통 R0146 X ML-083126502283F2 사이의 교배로부터의 F2 식물이었다. 사진을 제초제 분무 후 16일에 취하였다.
제초제 퀴잘로폽을 시험 필드 상에 분무하였다. 제초제 분무 후 30일에, 식물은 제초제에 대한 매우 명백한 '흑 및 백 반응'을 나타내었다 [제초제 분무 후 16일에 제초제에 대한 저항성 (1 또는 3으로 점수화됨) 또는 감수성 (7 또는 9로 점수화됨) 중 어느 하나를 나타내었다]. 식물을 먼저 제초제 분무 후 16일에 및 그 후 제초제 분무 후 21일에 점수화하였다.
'미지의 돌연변이 RTA2'를 운반하는 돌연변이체 식물은 저항성이었다. 3주령 식물에 퀴잘로폽을 분무하고, 제초제 반응을 분무 후 21일에 점수화하였다. 감수성 증상은 이미 퀴잘로폽 분무 후 7일에 관찰되었지만, 점수화는 21일에 수행되었다. 제21일에, 대다수의 식물은 제초제에 대한 매우 명백한 '흑 및 백' 반응을 나타내었으며, 즉, 제초제에 대한 저항성 (점수 1)을 나타내었거나, 완전히 죽었다 (점수 9). 소수의 식물은 3 (잎에 대한 손상이 거의 없거나, 새로운 잎 성장이 관찰되고, 아마도 식물이 생존할 것임) 또는 점수 5 (초관의 반이 손상되고, 식물이 생존할 것인지 아닌지 여부를 예측하기 곤란함), 또는 점수 7 (잎에 대한 보다 많은 손상, 식물은 생존하지 않을 것임)로 점수화되었다.
R0146 벼 집단에서 ACC아제 저항성 돌연변이체의 검출 후, 뮤트맵 접근법을 사용하여 연관 분석에 의해 퀴잘로폽 저항성 표현형과 연관된 돌연변이(들)를 특징화하였다.
뮤트맵 프로세스: 돌연변이유발은 에틸 메탄 술포네이트 (EMS)에 의한 참조 게놈 서열을 갖는 벼 품종이다. 생성된 돌연변이체, 이 경우 반 왜소증 표현형을 돌연변이유발 전에 동일한 품종의 야생형 식물과 교배시켰다. 생성된 F1을 자가-수분시켜 돌연변이체 및 야생형 표현형에 대해 분리하는 F2 자손을 얻었다. 돌연변이체의 야생형 모 계통과의 교배는 돌연변이체 및 야생형 사이의 F2 세대에서의 표현형 차이의 검출을 보장하였다. 돌연변이체 표현형을 나타내는 식물 F2의 DNA를 벌크화하고, 전체 게놈 시퀀싱한 후, 참조 서열에 대해 정렬하였다. 오직 돌연변이체 서열로 구성된 서열 리드를 갖는 SNP (1의 SNP 지수)는 돌연변이체 표현형에 대한 원인 SNP와 추정상 가깝게 연관된다.
ACC아제 억제제 저항성과 연관된 추정상 돌연변이의 가장 강한 지시는 염색체 1에 의해 관찰되었으며, 순차적 돌연변이의 스트링은 가장 높은 SNP 지수를 갖는다.
원인 영역은 도 18 및 표 1A, 1B 및 2에서 확인된 염색체 1에서의 영역에 위치하였다.
실시예 2: 단일 대립유전자 용량에서 단일 저항성 유전자의 부가에 의한, 한 ACC아제-억제 제초제 패밀리, FOP에 대한 저 용량 저항성을 갖는 혼성체 벼의 생산.
ML0831265-01493에 의해 제공되는 ACC아제 억제 제초제 저항성은 제초제에 대해 저항성인 혼성체 종자를 생성하는 웅성 또는 자성 모체 중 어느 하나를 통해 혼성체 내로 개별적으로 배치된다. 저항성이 오직 웅성 모체에 배치되는 경우, 잡초 방제를 위한 그의 사용 외에도, 혼성체 종자에 시용되는 경우 제초제는 오염성 자성 자가수정된 종자를 죽인다. 한편, 저항성이 오직 자성 모체를 통해 배치되는 경우, 재배자는 오염성 웅성 자가수정된 종자를 제거할 수 있다. 이 접근법의 효능은 제초제 저항성 유전자의 유전자 작용에 의존하며, 그에 의해 단일 대립유전자 존재는 여전히 생존가능한 것이 되는 생존가능한 제초제 내성을 부여해야 한다.
재배자는 그들이 구매하고, 그들의 필드에 시용하는 저항성의 유형을 교대시켜 잡초가 제초제에 대한 저항성을 발생시킬 기회를 감소시킬 수 있다. ACC아제 억제 제초제는, 주로 활엽 잡초의 방제에 대해서이지만, 또한 앵미의 일부 향상된 방제를 허용한다. 보다 높은 비율에서, 이는 특정 유형의 벼를 죽일 것이다. 저항성이 교잡 수분으로부터 앵미에서 발생한 경우, 이는 여전히 다음 시즌에 상이한 제초제 부류로 방제될 수 있었다.
실시예 3: 단일 대립유전자 용량에서 단일 저항성 유전자의 부가에 의한 한 HPPD 억제 제초제에 대한 저 용량 저항성을 갖는 혼성체 벼의 생산.
ML0831266-03093에 의해 제공되는 HPPD 억제 제초제 저항성은 제초제에 대해 저항성인 혼성체 종자를 생성하는 웅성 또는 자성 모체 중 어느 하나를 통해 혼성체 내로 개별적으로 배치된다. 저항성이 오직 웅성 모체에 배치되는 경우, 잡초 방제를 위한 그의 사용 외에도, 혼성체 종자에 시용되는 경우 제초제는 오염성 자성 자가수정된 종자를 죽인다. 한편, 저항성이 오직 자성 모체를 통해 배치되는 경우, 재배자는 오염성 웅성 자가수정된 종자를 제거할 수 있다. 이 접근법의 효능은 제초제 저항성 유전자의 유전자 작용에 의존하며, 그에 의해 단일 대립유전자 존재는 여전히 생존가능한 것이 되는 생존가능한 제초제 내성을 부여해야 한다.
재배자는 그들이 구매하고, 그들의 필드에 시용하는 저항성의 유형을 교대시켜 잡초가 제초제에 대한 저항성을 발생시킬 기회를 감소시킬 수 있다. HPPD 억제 제초제는, 주로 활엽 잡초의 방제에 대해서이지만, 또한 앵미의 일부 향상된 방제를 허용한다. 보다 높은 비율에서, 이는 특정 유형의 벼를 죽일 것이다. 저항성이 교잡 수분으로부터 앵미에서 발생한 경우, 이는 여전히 다음 시즌에 상이한 제초제 부류로 방제될 수 있었다.
실시예 4: 이중 대립유전자 용량에서 단일 저항성 유전자의 부가에 의한 HPPD 또는 ACC아제 억제 제초제 중 어느 하나에 대한 보다 높은 수준의 저항성을 갖는 혼성체 벼의 생산.
ML0831266-03093에 의해 제공되는 HPPD 억제 제초제 저항성 또는 ML0831265-01493에 의해 제공되는 ACC아제 억제 제초제 저항성은 혼성체의 웅성 및 자성 모체 둘 다 내로 배치된다. 생성된 혼성체 종자는 메소트리온 및 다른 HPPD 억제 제초제, 또는 ACC아제-억제 제초제에 대한 저항성을 가질 수 있다. 이 방식으로 제공되는 저항성은 보다 강하며, 보다 높은 비율의 제초제를 시용할 수 있는 가능성을 통해 보다 양호한 잡초 방제를 제공한다.
실시예 5: 특유한 제초제 또는 제초제 패밀리에 대한 다중 독립적 저항성 유전자에 대해 저항성인 혼성체 벼의 생산
제초제 또는 제초제 패밀리 또는 군에 대한 저항성을 부여하는 2개 이상의 독립적으로 유전자는, 각각의 하나를 혼성체의 모체 중 어느 하나 또는 둘 다에 개별적으로 부가함으로써 단일 혼성체에 배치된다. 혼성체에서 스태킹되는 유전자의 유전자 작용에 따라, 이들은 단일 모체에서 유전자이입되어, 상업적 혼성체에서 단일 대립유전자 용량을 생성할 수 있거나, 이들은 자성 및 웅성 모 계통 둘 다에 부가되어, 그 유전자좌에 대한 상업적 혼성체에서 동형접합성, 이중 대립유전자 용량을 생성할 수 있다. 이 방식으로의 배치는 상이한 저항성 유전자에 의해 제공되는 상보 효과로 인해, 혼성체가 동일한 대립유전자 투여량 하에서 단일 저항성 유전자 중 어느 하나를 운반하는 보다 높은 제초제 저항성을 갖는 혼성체 종자를 발생시킨다. 계통 ML0831266-03093에서 HPPDni 대립유전자를 수반한 HPPDi 돌연변이된 유전자 상에서의 스태킹은 HPPD-억제 제초제 내성에 대해 상이한 독립적 저항성 유전자좌/대립유전자가 조합되어 단일 유전자 중 어느 하나에 의해 부여된 보다 큰 저항성의 생성물을 생성하는 경우를 나타낸다. 유사하게, 계통 RL1225468에서 RTA1+RTA2의 ACC아제 스택은 FOP 패밀리의 ACC아제-억제 제초제에 대한 저항성을 위한 2개의 독립적인 유전자를 조합하는 경우, 부가된 저항성의 대등한 예를 나타낸다.
실시예 6: 제초제 부류, 예컨대 메소트리온 및 FOP 제초제의 각각에 대한 1개 이상의 제초제 저항성 유전자의 부가에 의한, 상이한 제초제 부류, 예컨대 HPPD-억제제 및 ACC아제-억제제에 속하는 제초제에 대해 저항성인 혼성체 벼의 생산.
1. 메소트리온 및 적어도 1종의 다른 제초제 부류, ACC아제-억제제에 대한 저항성은 메소트리온 (또는 다른 제초제 부류 ACC아제)에 대한 저항성을 갖는 웅성 모체 및 다른 저항성을 갖는 자성 모체를 사용함으로써 단일 혼성체에 배치된다. 방법은 재배자가 단일 구매를 하지만, 어느 제초제를 시용할 지를 선택할 수 있는 것을 허용한다. 단일 부류의 제초제가 임의의 한 시즌에 사용되고, 시즌 사이에 회전될 수 있거나, 대안적으로 둘 다의 제초제가 단일 시즌 내에 시용될 수 있었다. 또한, 이 방법에 의한 배치시, 둘 다의 제초제, 또는 하나의 유형 또는 다른 유형의 시용을 통한 혼성체 종자에서 둘 다의 모체의 자가수정된 종자를 오염시키는 요소는 오직 1종의 제초제의 시용을 통해 제거된다.
2. 배치의 또 다른 방법에서, 메소트리온 저항성 및 ACC아제-억제제 저항성은 둘 다의 저항성을 갖는 웅성 모체와의 혼성체를 제조하는 것을 통해 배치된다. 그 후, 재배자는 어떤 제초제 부류를 시용할 지 또는 단일 시즌 내에 둘 다를 시용할 지를 선택하기 위한 선택안을 갖는다. 또한, 어느 하나의 제초제의 시용을 통해, 오염성 자가수정된 자성 종자는 제거될 것이다. 대안적으로 둘 다의 제초제 부류 저항성은 자성 모체에 제공되며, 이는 재배자에게 잡초 방제를 위한 동일한 선택안을 제공한다.
3. 또 다른 실시양태는 메소트리온 저항성을 둘 다의 모체에, 및 또 다른 제초제 저항성을 오직 한 모체, 예컨대 웅성 모체 내로 배치하는 것이다. 그 후, 혼성체 종자는 메소트리온 저항성에 대해 동형접합성이지만, 다른 것은 그렇지 않다. 이와 같은 계획은 제초제로의 초기 시용을 오직 웅성 모체에만 적용하는 데 사용되며, 이는 잡초 방제 및 오염성 자성 자신의 제거를 제공한다. 시즌에서 나중에, 메소트리온 또는 또 다른 HPPD 억제제 제초제가 시용될 수 있다. 둘 다의 제초제의 유용 수명은 잡초 저항성의 발생을 제한하거나 제거하는 것을 통해 연장된다. 또 다른 적용에서, 이 방법은 종자 생산 분야에서 잡초를 방제하기 위한 메소트리온 또는 다른 HPPD 억제제 제초제의 사용을 허용하며, 이는 보다 깨끗한 종자를 허용한다.
4. 대안적으로, 상이한 제초제는 혼성체 모체의 둘 다에 배치될 수 있었으며, 메소트리온/HPPD 억제제는 오직 웅성 모체에 배치된다.
5. 제초제 저항성 계통을 배치하기 위한 다른 실시양태는 다른 형질, 예컨대 다른 부류의 제초제에 대한 저항성, 또는 중요한 다른 형질을 포함한다.
실시예 7: 종자 생산
제초제 저항성은 또한 종자 생산에 사용된다. 예로서, 이것이 자성 모체 내로 배치되어, 이것을 저항성으로 만드는 경우, 제초제는 종자 생산 필드에 시용되어 종자를 세팅하기 전에 웅성 식물을 죽여서, 종자 생산 필드가 벌크로서 수확되게 한다. 또한, 종자의 순도는 또한 각각의 모체에서 오직 하나를 갖는 2가지 제초제 저항성을 배치하는 것을 통해 입증될 수 있다. 자가수정된 종자를 검출하고, 다른 모체에 적용된 제초제를 시용함으로써 제거한다.
실시예 8: 활엽 잡초의 방제 및 그래스의 제한된 방제
임의의 조합에 의해, 혼성체에 배치되는 경우 저항성은 메소트리온 또는 다른 HPPD 억제 제초제에 대한 저항성을 제공한다. 이 배치는 화본과, 예컨대 앵미의 일부 제한된 방제를 갖는 활엽 잡초를 방제하기 위한 벼에서의 새로운 작용 방식을 발생시킨다. 추가의 선택안 또는 잡초의 넓은 스펙트럼 방제는 화본과 잡초 방제를 제공하는 제초제, 예컨대 ACC아제 억제 제초제에 대한 또 다른 저항성을 동일한 혼성체에서의 배치에 의해 제공한다. 다른 작용 방식으로의 배치를 통해, 잡초 저항성의 발생은 보다 가능성 있게는 다중 작용 방식의 사용을 통해 방지된다.
실시예 9: 제초제 생물검정을 사용한 제초제 내성 벼의 선택
메소트리온 내성이 유전된 물질의 선택은 간단한 제초제 생물검정에 의해 달성된다. 동형접합성 개체로부터의 이형접합성 개체의 구별 및 일부 유형의 벼의 배경에서 유전된 내성 수준으로부터 돌연변이 계통의 내성 수준을 허용하는 높은 비율의 메소트리온 (적어도 420 gm ai/ha)을 시용한다. 한 예에서, 105 gm ai/ha의 비율을 시용하고, 3주 후에 630 gm ai/ha의 제2 시용이 이어진다. 또 다른 예에서, 420 gm ai/ha의 비율을 단일 시용에서 시용한다. 추가의 또 다른 예는 제초제를 630 gm ai/ha의 비율로 시용하는 것을 수반한다. 제초제 시용은 모종 성장의 3 내지 4엽 단계에서 수행된다. 이상적인 상황은 원래 돌연변이체 메소트리온 내성 공여자 계통 ML0831266-03093, 돌연변이 계통의 야생형, P1003의 일렬의 식물, 및 교배에서 다른 모체로서 포함되는 일렬의 계통으로부터의 식물의 세트가 선택되도록 또한 식물 부근에 또는 내에 식재하는 것이다. 이들 대조군 계통은 대조군 계통으로 선택되는 식물에서의 반응의 비교를 통해 ML0831266-03093 돌연변이체 계통에 의해 제공되는 내성의 유전에 대한 용이한 구별을 허용한다. 오직 살아 있고 상대적으로 건강한 식물이 유전되고, ML0831266-03093 돌연변이체 계통에 의해 제공되는 내성 수준에 대해 동형접합성이 될 것이다.
실시예 10: HPPD 및 ACC아제 억제 제초제 둘 다에 대해 저항성인 벼의 생산
메소트리온 및 가능하게는 HPPD 억제제를 포함한 다른 제초제에 대해 내성인 돌연변이체 계통 ML0831266-03093을 ACC아제 제초제 및 보다 구체적으로 "폽" 유형의 ACC아제 제초제에 대한 내성을 갖는 돌연변이체 계통 ML0831265-01493과 교배시켰다. 한 예에서, ML0831266-03093 식물은 자성 모체이며, 수분은 계통 ML0831265-01493으로부터의 식물에 의한다. 또 다른 실시양태에서, 모체는 ML0831266-03093이 수분 모체로서 기능하도록 반전된다. 메소트리온 및 ACC아제 제초제 내성 둘 다가 유전된 생성된 F1 종자를 수확한다. F1 개체는 부분적으로 우세한 수준에서 둘 다의 제초제에 대한 내성을 가지며, 따라서, 이들은 어느 정도의 내성을 나타내지만, 내성 모체 계통과 동일한 수준으로는 아니다.
F1 종자를 식재하고, 생성된 식물을 자가-수분시켜 F2 종자를 생산하며, 이는 집단을 메소트리온 및 ACC아제 제초제 둘 다에 대한 내성에 대해 분리하게 만든다. 이 집단을 제초제 생물검정에 의해 스크리닝하여 원래 돌연변이체 계통 ML0831266-03093으로부터 유전된 내성을 가지며, 저항성에 대해 동형접합성인 개체를 확인한다. 동형접합성 개체로부터의 이형접합성 개체의 구별 및 P1003이었던 ML0831266-03093 계통을 생성하기 위한 돌연변이에 사용된 원래 계통을 포함한 일부 유형의 벼의 배경에서의 내성 수준으로부터의 돌연변이 계통의 내성 수준을 허용하는 높은 비율의 메소트리온을 시용한다.
한 예에서, 105 gm ai/ha의 비율을 시용한 후, 3주 후에 630 gm ai/ha의 제2 시용이 이어진다. 또 다른 예에서, 420 gm ai/ha의 비율을 단일 시용에서 시용한다. 추가의 또 다른 예는 630 gm ai/ha의 비율로 제초제를 시용하는 것을 수반한다. 제초제 시용은 모종 성장의 3 내지 4엽 단계에서 수행된다. 이상적인 상황은 원래 돌연변이체 메소트리온 공여자 계통 ML0831266-03093, 돌연변이 계통의 야생형, P1003의 일렬의 식물, 및 다른 모체 ML0831265-01493으로서 포함되는 일렬의 계통으로부터의 식물의 세트를 또한 F2 집단 부근에 또는 내에 식재하는 것이다. 이들 대조군 계통은 이들 대조군 계통에 대한 F2 식물에서의 반응의 비교를 통해 ML0831266-03093 돌연변이체 계통에 의해 제공되는 내성의 유전에 대한 용이한 구별을 허용할 것이다. 오직 살아 있고 상대적으로 건강한 식물이 유전되고, ML0831266-03093 돌연변이체 계통에 의해 제공되는 내성 수준에 대해 동형접합성일 것이다.
실시예 11: ACC아제 및 HPPD 내성 벼 계통을 선택하고 개발하기 위한 공동-우성 마커 검정
간단한 공동-우성 마커 검정은 계통 ML0831265-01493으로부터 유래된 ACC아제 제초제에 대한 유전을 위해 선택하는 데 이용가능하다. 마커는 단일 뉴클레오티드 다형성 마커로서 개발되며, 계통 ML0831265-01493에서 ACC아제 내성에 대한 위치 RTA1 (블랙그래스 번호)에서의 원인 돌연변이를 검출한다. 실시예 8에서 이용된 바와 같은 메소트리온 생물검정 후에 생존한 식물 모두를 조직 수집을 위해 샘플링하고, DNA를 알려진 방법에 의해 추출하고, 샘플을 SNP 검정으로 시험한다. 그 후, 생존한 식물의 하위세트를 또한 마커 보조 선택을 통해 ACC아제 제초제에 대한 동형접합성 내성을 갖는 것으로서 확인한다.
메소트리온 및 ACC아제 제초제 둘 다에 대한 내성을 갖는 개체를 자가수정시켜 F3 패밀리를 생산하고, 다른 중요한 작물적 특징에 대해 추가로 선택한다. F3 계통을 자가수정시키고, 정제하여 메소트리온 및 ACC아제 제초제에 대한 이중 저항성을 갖는 새로운 계통 또는 변종을 유도한다. 이러한 계통은 둘 다의 제초제의 사용이 보다 완전하고 넓은-스펙트럼 잡초 방제를 제공하기 때문에 매우 가치 있다.
또 다른 실시양태에서, 메소트리온 및 ACC아제 둘 다에 대한 내성을 갖는 개체는 역교배 (BC) 육종 프로그램에서 형질 공여자로서 사용된다. 한 개체 또는 소수의 개체를 선택한 후, 이들을 수분 모체 또는 자성 모체 중 어느 하나로서 사용한다. 또 다른 보다 정예의 바람직한 계통은 형질이 전달되는 반복친으로서 기능한다.
제1 교배 후, F1 식물을 다시 반복친과 교배시킨다. 이 교배 및 반복친과의 계속되는 교배로부터 생성된 역교배 종자를 마커로 또는 제초제 내성의 유전에 대한 제초제 생물검정 또는 마커 및 생물검정의 조합을 통해 시험한다. 최량의 상황에서, 기능적 돌연변이에 대한 마커가 사용된다. 대안적으로, 메소트리온에 대한 제초제 생물검정은 BC 종자에 적용되거나, 가능하게는 BC 종자는 내성의 유전을 입증하기 위해 시험되는 자손이다. 더욱이, 제초제 생물검정은 또한 ACC아제 제초제에 대한 내성이 유전된 개체를 확인하는 데 사용된다. 이 프로세스는 반복친 게놈이 메소트리온 및 ACC아제 제초제에 대한 내성에 대한 2가지 새로운 형질과 함께 회복될 때까지 반복된다. 마지막 역교배 후, 개체를 적어도 1종의 식물에서 동형접합성 저항성 수준에서 이중 제초제 내성을 회복하도록 자가수정시킨다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 메소트리온 및 ACC아제 제초제 둘 다에 대한 저항성을 갖는 개체를 제3 계통과 교배시키고, 이어서 자가수정시키거나, 심지어 다른 계통과 교배시킨다. 생성된 새로운 계통 및 생식질을 시험하고, 다른 작물적인 중요한 형질에 대해 평가한다. 마지막으로, 벼에 대해 신규한 조합인 메소트리온 또는 다른 HPPD 제초제 및 ACC아제 제초제 둘 다에 대한 내성을 갖는 새로운 변종 또는 웅성 또는 자성 계통을 개발한다.
실시예 12: 돌연변이체 벼 ML0831266-03093
돌연변이체 계통 ML0831266-03093은 원래 돌연변이 처리된 계통 P1003을 포함한 일부 벼 유형에서 천연적으로 발견되는 내성을 초과하는 메소트리온 제초제에 대한 높은 내성 수준을 갖는 것으로 입증된다. 돌연변이체 계통을 행으로 식재하거나, 대안적으로 전체 플롯을 식재하고, 비돌연변이된 계통 (P1003) 및 다른 유형의 벼의 행 또는 전체 플롯을 식재한다. 메소트리온을 출아전 시용하거나, 대안적으로 이를 벼 식물의 3 내지 4엽 단계에서 출아후 시용한다. 다양한 비율의 메소트리온을 출아전, 출아전, 그 후 출아후, 또는 출아후 단일 또는 순차적 시용으로 시용한다. 출아후 시용은 벼의 3 내지 4엽 단계에서 시용된다.
메소트리온의 낮은 비율 (105 gm ai/ha)로 시용되면, 돌연변이체 계통 뿐만 아니라 원래 비돌연변이된 계통 둘 다는 생존한다. 그러나, 다른 유형의 벼, 예컨대 ACC아제 내성을 갖는 돌연변이체 계통 ML0831265-01493 및 연관된 비돌연변이된 계통 R0146은 메소트리온의 이들 비율에서 죽는다. 메소트리온 제초제를 보다 높은 비율로 시용하는 것은 명백하게 새롭고 신규한 내성 수준을 나타내는데, 이는 오직 돌연변이체 계통 ML0831266-03093은 생존하는 반면, 원래 비돌연변이된 계통 P1003 및 모든 다른 시험된 계통은 죽거나 심각하게 손상되기 때문이다. 메소트리온에 대한 보다 높은 내성은 계통 ML0831266-03093을 상업적으로 가치 있게 만드는데, 이는 둘 다의 내성이 방제되거나 새로운 변종으로 육종될 수 있고, 이것이 메소트리온 제초제 및 가능하게는 다른 HPPD 억제 제초제의 시용으로 벼에서 상업적 잡초 방제를 허용하는 매우 충분한 수준의 것이기 때문이다 (초기 결과, 도 12B 1년 후의 새로운 결과, 및 도 13- 다양한 벼 계통에 대한 시험 결과).
실시예 13: 상이한 제초제에 대해 저항성인 돌연변이체 계통 사이의 교배
메소트리온 및 가능하게는 다른 HPPD 억제 제초제에 대한 내성을 갖는 돌연변이체 계통 ML0831266-03093 (ATCC PTA-13620)과 ACC아제 제초제에 대한 내성을 갖는 돌연변이체 계통 ML0831265-01493 (ATCC PTA-12933) 사이의 교배는 둘 다의 제초제 내성이 유전된 F1 종자를 생산하였다. F1의 자가수정 후, 식물 F2 개체를 제초제 생물검정을 통해 또는 대안적으로 분자 마커로 선택한다. ACC아제의 경우, 기능적 분자 마커는 위치 G2096S (블랙 그래스 넘버링 시스템에 기초함)에서의 돌연변이가 선택되도록 기재된다. 더욱이, 염색체 1 및 염색체 2 상의 QTL에 연관된 마커 또는 제초제 생물검정을 사용하여, 메소트리온 및 ACC아제 (다른 HPPD 제초제 또는 다른 제초제 포함)에 대한 내성을 회복시킨다.
메소트리온 (다른 HPPD 제초제 및 가능하게는 다른 제초제 포함)에 대한 내성에 대해 선택된 개체는 역교배 전환 프로그램에 또는 메소트리온 및 다른 제초제에 대한 상업적 수준의 내성을 갖는 새로운 변종 및 혼성체를 개발하기 위한 육종에 사용될 수 있다. 생물검정 또는 염색체 1 및 염색체 2 QTL 중 어느 하나로의 선택은 제초제 내성을 갖고, 벼에서 새로운 잡초 방제 선택안을 나타내는 신규한 변종 또는 혼성체의 개발을 위한 돌연변이체 내성과 함께 P1003에서 유전된 내성의 회복을 발생시킨다. 돌연변이체 계통의 내성 수준은 다른 계통보다 우수하며, 다양한 상업적 적용 방법을 허용한다.
둘 다의 제초제에 대한 내성을 갖는 개체 식물은 둘 다의 ACC아제 억제 제초제, 메소트리온, 다른 HPPD 억제 제초제, 및 다른 제초제에 대한 내성을 갖는 새로운 변종 및 혼성체를 개발하기 위한 육종에 사용된다. 새로운 변종 및 혼성체는 상업적 제품이다. 상업적 제품은 벼 생산에 상업적으로 사용된다. 생산 공정에서, ACC아제 및 메소트리온 둘 다 또는 다른 제초제는 잡초를 방제하기 위해 벼 작물에 시용될 수 있다. 한 예에서, 메소트리온 또는 다른 제초제는 발아하는 잡초를 방제하고, 잔류의 잡초 방제를 제공하기 위해 식재전 시용된다. 벼 작물의 발아 후, ACC아제 제초제는 화본과 잡초를 방제하기 위해 시용된다. 또 다른 예에서, 메소트리온 또는 등가물 둘 다는 식재전 시용되고, 제2 시용은 1 또는 2회의 시용으로 ACC아제 제초제와 함께 출아후 이루어진다. 또 다른 예에서, 메소트리온 및 ACC아제 제초제 둘 다 또는 다른 HPPD 제초제를 포함한 다른 제초제는 1 또는 2회의 시용으로 출아후 시용된다. 이러한 방식으로, 벼에서 전체 스펙트럼 잡초 방제를 제공하기 위한 새롭고 신규한 전략이 시행된다. 또한, 이들 제초제는 벼 작용 방식에서 이전에 사용되지 않은 새로운 것을 갖는다. 따라서, 이 전략은 잡초 방제를 위해서 뿐만 아니라 잡초 방제를 위한 다중 작용 방식의 시용을 통해 이 전략 및 기타의 유용한 수명을 연장시키는 방법으로서 상업적 용도를 갖는다.
실시예 14: HPPD 및 ACC아제 제초제에 대해 저항성인 이중 돌연변이체
간단한 공동-우성 마커 검정은 계통 ML0831265-01493으로부터 유래된 ACC아제 제초제에 대한 유전에 대해 선택하는 데 이용가능하다. 마커는 단일 뉴클레오티드 다형성 마커로서 개발되며, 계통 ML0831265-01493에서 ACC아제 내성에 대한 위치 RTA1 (블랙그래스 번호)에서의 원인 돌연변이를 검출한다. 실시예 11에서 이용된 바와 같은 메소트리온 생물검정 후에 생존한 식물 모두를 조직 수집을 위해 샘플링하고, DNA를 알려진 방법에 의해 추출하고, 샘플을 SNP 검정으로 시험한다. 그 후, 생존한 식물의 하위세트를 또한 마커 보조 선택을 통해 ACC아제 제초제에 대한 동형접합성 내성을 갖는 것으로서 확인한다.
또 다른 실시양태에서, 메소트리온 및 ACC아제 둘 다에 대한 내성을 갖는 개체는 역교배 육종 프로그램에서 형질 공여자로서 사용된다. 하나의 개체 또는 소수의 개체를 선택한 후, 이들을 수분 모체 또는 자성 모체 중 어느 하나로서 사용한다. 또 다른 보다 정예의 바람직한 계통은 형질이 전달되는 반복친으로서 기능한다. 제1 교배 후, F1 식물을 다시 반복친과 교배시킨다. 이 교배 및 반복친과의 계속되는 교배로부터 생성된 역교배 종자를 마커로 또는 제초제 내성의 유전에 대한 제초제 생물검정 또는 마커 및 생물검정의 조합을 통해 시험한다. 최량의 상황에서, 기능적 돌연변이에 대한 마커가 사용된다. 대안적으로, 메소트리온에 대한 제초제 생물검정은 BC 종자에 적용되거나, 가능하게는 BC 종자는 내성의 유전을 입증하기 위해 시험되는 자손이다. 더욱이, 제초제 생물검정은 또한 ACC아제 제초제에 대한 내성이 유전된 개체를 확인하는 데 사용된다. 이 프로세스는 반복친 게놈이 메소트리온 및 ACC아제 제초제에 대한 내성에 대한 2가지 새로운 형질과 함께 회복될 때까지 반복된다. 마지막 역교배 후, 개체를 적어도 1종의 식물에서 동형접합성 저항성 수준에서 이중 제초제 내성을 회복하도록 자가수정시킨다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 메소트리온 및 ACC아제 제초제 둘 다에 대한 저항성을 갖는 개체를 제3 계통과 교배시키고, 이어서 자가수정시키거나, 심지어 다른 계통과 교배시킨다. 생성된 새로운 계통 및 생식질을 시험하고, 다른 작물적인 중요한 형질에 대해 평가한다. 마지막으로, 벼에 대해 신규한 조합인 메소트리온 또는 다른 HPPD 제초제 및 ACC아제 제초제 둘 다에 대한 내성을 갖는 새로운 변종 또는 웅성 또는 자성 계통을 개발한다.
실시예 15: ACC아제 및 HPPD 제초제 둘 다에 대한 이중 저항성에 기초한 벼 에서의 전체 스펙트럼 잡초 방제
생산 공정에서, ACC아제 및 메소트리온 둘 다 또는 다른 제초제는 잡초를 방제하기 위해 벼 작물에 시용될 수 있다. 한 예에서, 메소트리온 또는 다른 제초제는 발아하는 잡초를 방제하고, 잔류의 잡초 방제를 제공하기 위해 식재전 시용된다. 벼 작물의 발아 후, ACC아제 제초제는 화본과 잡초를 방제하기 위해 시용된다. 또 다른 예에서, 둘 다의 메소트리온은 식재전 시용되고, 제2 시용은 1 또는 2회의 시용으로 ACC아제 제초제와 함께 출아후 이루어진다. 또 다른 예에서, 메소트리온 및 ACC아제 제초제 둘 다 또는 다른 HPPD 제초제를 포함한 다른 제초제는 1 또는 2회의 시용으로 출아후 시용된다. 이러한 방식으로, 벼에서 전체 스펙트럼 잡초 방제를 제공하기 위한 새롭고 신규한 전략이 시행된다. 또한, 이들 제초제는 벼 작용 방식에서 이전에 사용되지 않았다. 따라서, 이 전략은 잡초 방제를 위해서 뿐만 아니라 잡초 방제를 위한 다중 작용 방식의 시용을 통해 이 전략 및 기타의 유용한 수명을 연장시키는 방법으로서 상업적 용도를 갖는다.
부다페스트 조약 하의 종자 기탁 (표 5 및 12 참조)
라이스텍 악티엔게젤샤프트 (Ricetec AKTIENGESELLSCHAFT)에 의한 종자 기탁은 미국 버지니아주 20110 마나사스 유니버시트 불바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection) (ATCC)에 이루어졌다. 기탁일 및 ATCC 수탁 번호는 ML0831266-03093 (PTA-13620, 2013년 3월 19일); ML0831265-01493 (PTA-12933, 2012년 5월 31일); ML0831265-02283 (PTA-13619, 2013년 3월 19일); PL1214418M2-80048 (PTA-121632, 2014년 6월 30일), R4225468 (PTA-122646, 2015년 11월 15일)이다. 모든 제한은 특허의 허여 시 제거될 것이며, 기탁은 37 C.F.R. §§1.801 내지 1.809의 모든 요건을 충족시키는 것으로 의도되고, 부다페스트 조약 요건을 충족시킨다. 기탁은 30년, 또는 마지막 요청 후 5년, 또는 특허의 집행가능한 수명의 기간 (어느 것이든 보다 긴 것) 동안 기탁기관에 유지될 것이며, 그 기간 동안 필요에 따라 대체될 것이다.
정의
설명 및 이어지는 표에서, 다수의 용어가 사용된다. 이러한 용어가 주어지는 범위를 포함한 명세서 및 청구범위의 명확하고 일관된 이해를 제공하기 위해, 하기 정의가 제공된다:
아세틸-조효소. 카르복실라제 (ACC아제; EC 6.4.1.2) 효소는 식물 엽록체에서 말로닐-CoA를 신생 지방산 합성 경로의 출발로서 합성한다. 그래스 엽록체에서 ACC아제는 N-말단 수송 펩티드를 통해 색소체 내로 수송되는 다기능적, 핵-게놈-코딩된, 매우 큰, 단일 폴리펩티드이다. 그래스 엽록체에서의 활성 형태는 동종이량체성 단백질이다.
그래스에서 ACC아제 효소는 3가지 부류의 제초제 활성 성분에 의해 억제된다. 2가지 가장 만연한 부류는 아릴옥시페녹시프로파노에이트 ("FOP") 및 시클로헥산디온 ("DIM")이다. 이들 2가지 부류 외에도, 제3 부류 페닐피라졸린 ("DEN")이 기재되었다.
ACC아제 효소의 카르복실 트랜스퍼라제 영역에서의 특정 돌연변이는 ACC아제 제초제에 대해 저항성이 되는 그래스를 발생시킨다. 잡초 블랙-그래스에서 ACC아제 제초제의 FOP 또는 DIM 부류에 대한 저항성을 제공하는 적어도 5개의 돌연변이가 기재되었다. ACC아제 효소를 이들 제초제에 대해 저항성이 되게 하는 일부 돌연변이는 감소된 적합성과 연관될 수 있다.
대립유전자. 대립유전자는 유전자의 많은 대안적 형태 중 임의의 하나이며, 이들의 모두는 일반적으로 하나의 형질 또는 특징과 관련된다. 배수체 세포 또는 유기체에서, 주어진 유전자의 2개의 대립유전자는 한 쌍의 상동성 염색체 상의 상응하는 유전자좌를 점유한다.
역교배. 혼성체 자손을 모체 중 하나와, 예를 들어, 제1 세대 혼성체 F1을 F1 혼성체의 모 유전자형 중 하나와 교배시키는 프로세스.
블렌드. 벼 혼성체의 벼 종자를 또 다른 벼 혼성체, 벼 변종 또는 벼 순계교배물의 1, 2, 3, 4개 이상의 종자와 물리적으로 혼합하여 이 블렌드에서 벼 종자 및 식물의 모두의 특징을 함유하는 작물을 생산하는 것.
세포. 본원에 사용된 바와 같은 세포는 단리되든지, 조직 배양물에 있든지, 식물 또는 식물 부분에 혼입되든지, 식물 세포를 포함한다.
품종. 재배 하에서 존속하는 변종 또는 주.
배아. 배아는 성숙한 종자 내에 함유되는 작은 식물이다.
본질적으로 모든 생리학적 및 형태학적 특징. 전환된 유전자로부터 유래된 특징을 제외하고, 혼성체 또는 품종의 본질적으로 모든 생리학적 및 형태학적 특징을 갖는 식물.
곡물 수확량. 주어진 영역으로부터 수확된 곡물의 중량. 곡물 수확량은 또한 영역 당 원추화서의 수를 원추화서 당 곡물의 수와 곱하고, 곡물 중량을 곱합으로써 간접적으로 측정될 수 있다.
식물에 대한 손상. 시험 식물을 대조군과 비교하고, 시험 식물이 동일한 높이; 비정상적 색상, 예를 들어 녹색이 아닌 황색; 통상적인 잎 형상, 주름, 보다 소수의 곁눈이 아닌지를 발견함으로써 정의된다.
유전자좌. 유전자좌는 DNA 서열에 의해 점유되는 염색체 상의 위치이며; 이는 1개 이상의 형질, 예컨대, 예를 들어, 웅성 불임, 제초제 내성, 곤충 저항성, 질환 저항성, 왁스성 전분, 변형된 지방산 대사, 변형된 피트산 대사, 변형된 탄수화물 대사 및 변형된 단백질 대사를 부여한다. 형질은 예를 들어, 역교배에 의한 변종의 게놈 내로 도입된 천연 발생 유전자, 천연 또는 유도된 돌연변이, 또는 유전자 형질전환 기법을 통해 도입된 트랜스진에 의해 부여될 수 있다. 유전자좌는 단일 염색체 위치에서 통합된 1개 이상의 대립유전자를 포함할 수 있다.
유도된. 본원에 사용된 바와 같은 용어 유도된은 돌연변이원으로의 처리 후에 나타나는 유전적 저항성을 의미한다.
비-유도된. 본원에 사용된 바와 같은 용어 비-유도된은 유도된으로 알려지지 않은 유전적 저항성을 의미하며; 유도된 저항성보다 게놈에서 상이한 위치에 있다.
식물. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "식물"은 종자 또는 곡물 또는 꽃밥이 제거된 식물을 포함한 미성숙한 또는 성숙한 전체 식물에 대한 언급을 포함한다. 식물을 생산할 종자 또는 배아는 또한 식물인 것으로 간주된다.
식물 부분. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "식물 부분" (또는 벼 식물, 또는 그의 부분)은 원형질체, 잎, 줄기, 뿌리, 근단, 꽃밥, 종자, 곡물, 배아, 화분, 배주, 자엽, 배축, 포영, 원추화서, 꽃, 싹, 조직, 세포, 분열조직 세포 등을 포함한다.
정량적 형질 유전자좌 (QTL). 통상적으로 연속적으로 분포되는 일부 정도로 수치적으로 측정가능한 형질을 제어하는 유전자좌.
재조합/비-재조합. 비-모체 조합이 일어나는 경우 벼 모체는 재조합이다.
재생. 재생은 조직 배양물로부터의 식물의 발달을 지칭한다.
저항성/저항성의 1 . 야생형 저항성에 대해 통상적으로 치사적인 제초제의 용량에의 노출 후 생존하고 번식하는 식물의 유전된 능력은 천연 발생이거나, 조직 배양 또는 돌연변이유발에 의해 생성되는 변이체의 유전자 조작 또는 선택과 같은 기법에 의해 유도될 수 있다.
단일 유전자 전환된 (전환). 단일 유전자 전환된 (전환)은 교배 및 역교배를 통해 순계교배물 내로 전달된 단일 유전자를 보유하면서, 순계교배물의 본질적으로 모든 바람직한 형태학적 및 생리학적 특징이 회복된, 역교배로 지칭되는 식물 육종 기법에 의해 개발된 식물을 포함한다. 상기 용어는 또한 관련 기술분야에 공지된 유전자 조작 기법을 통한 단일 유전자의 도입을 지칭할 수 있다.
스태킹. 하나 초과의 사물을 동일한 수용 실체에 부가하는 것. "스태킹된" 상태를 달성하는 방법은 단일 매개자에서 2개 이상의 유전자를 매개자-스태킹하고, 스택을 달성하기 위한 단일 형질전환을 수행하고; 형질을 단계적으로 부가하는 동일한 수용체 내로의 순차적인 형질전환을 수행하고; 상이한 형질을 운반하는 모체를 간단히 말단 교배함으로써 스태킹된 혼성체를 달성하고; 순차적 돌연변이유발 또는 교배, 및 스태킹된 상태를 한 모체 내로 고정하는 것에 의해 다중 형질을 갖는 계통을 개발하는 방법; 및 그의 변형을 포함한다.
상승작용. 문헌 [Herbicide Handbook of the Weed Science Society of America, Ninth Edition, 2007, p. 429]에 기재된 바와 같이, "'상승작용'은 조합되는 경우의 효과가 개별적으로 적용되는 각각의 인자에 대한 반응에 기초하여 예측된 효과보다 더 크도록 하는 2개 이상의 인자의 상호작용이다"
하기 방정식은 제초제에 대한 돌연변이, 예를 들어, A 및 B의 조합으로 벼에서 예상되는 저항성/내성을 계산하는 데 사용될 수 있다:
예상치=A+B-(AxB/100)
A=제초제의 동일한 농도에서의 돌연변이 A의 관찰된 효능;
B=제초제의 동일한 농도에서의 돌연변이 B의 관찰된 효능.
제초제 맥락에서 상승작용적은 제초제의 사용이 각각의 제초제 단독의 사용으로 가능한 A + B의 잡초 방제 효과에 비해 증가된 잡초 방제 효과를 생성시킴을 의미할 수 있다. 또는 상승작용적은 단일 돌연변이로의 벼의 효과에 비해 조합된 돌연변이 (스태킹됨)로의 벼의 저항성/내성 수준으로 간주될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제초제에 의해 유발되는 바람직하지 않은 식물에 대한 손해 또는 손상은 비처리 대조군 식물과 비교한 경우, 0％ 내지 100％의 스케일을 사용하여 평가되며, 여기서, 0％는 바람직하지 않은 식물에 대한 손해가 없음을 지시하고, 100％는 바람직하지 않은 식물의 완전한 파괴를 지시한다.
내성/내성의. 제초제 처리 후에 생존하고 번식하는 종의 유전된 능력은 식물을 내성으로 만드는 선택 또는 유전자 조작이 없었음을 암시한다.
저항성/내성은 본원에서 다소 호환가능하게 사용되며; 특이적 벼 식물에 대해 유전자형 정보는 시용되는 제초제, 제초제의 강도, 및 식물의 반응에 대해 제공된다.
RTA1 (G209S)과 조합되어 가깝게 연관된 돌연변이의 이 매개자는 FOP 제초제에 대한 상승작용적 저항성을 부여한다.
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1 Weed Science Society of America, Weed Technology, vol. 12, issue 4 (October-December, 1998, p. 789)
<표 1A>
ACC아제 억제제 내성 벼 RTA2와 연관된 돌연변이체 뉴클레오티드
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
<표 1B>
ACC아제 억제제 내성 벼 RTA2와 연관된 돌연변이체 뉴클레오티드2
Figure pct00006
Figure pct00007
--------------------------
2 표 1A에서 보다 짧은 버전을 포함한다.
<표 2>
원래 비돌연변이된 모체 계통과 비교하여, 메소트리온에 대한 저항성을 나타내는 돌연변이체 벼 계통의 표현형 특징.
Figure pct00008
<표 3>
메소트리온에 대한 내성을 갖는 ML0831266-03093 및 ACC아제 억제 제초제에 대한 내성을 갖는 ML0831265-01493의 교배로부터 유래된 F2 개체에 적용된 3가지 상이한 제초제 생물검정 후의 내성 식물의 수.
Figure pct00009
<표 4>
ACC아제 돌연변이 RTA2 -QTL 출발 및 종료 SNP 마커 서열
Figure pct00010
<표 5>
본원에 인용된 벼 계통의 요약 (또한 표 12 참조)
Figure pct00011
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3 HPPDi =화학적으로 유도된 유전자 영역의 변화와 연관된 유도된 HPPD 억제제 내성/저항성.
HPPDni =HPPD 억제제에 대한 천연 내성/저항성.
RTA1 = ACC아제 억제제에 대한 내성과 연관된, 돌연변이로 인한 ACC아제 효소에서 치환체 G2096S.
RTA2 = 표 1A 및 1B 참조.
<표 6>
HPPD 및 ACC아제 저항성/내성 (RTA1 + HPPDi + HPPDni) 둘 다를 갖는 2개의 계통의 작물적 특징.
Figure pct00012
<표 7>
벼에서의 제초제 손상 등급화 스케일
Figure pct00013
<표 8>
ACC아제 생성물 상의 1X 퀴잘로폽 시용에 대한 요약 통계학 및 ％ 손상에 대한 평균 비교
％ 손상의 일원 분석- 형질에 의한 등급화 5 (침수전 시용 후 4주), 2-엽 제초제 비율 (표지의 배수)=1X
Figure pct00014
<표 9>
ACC아제 생성물 상의 2X 퀴잘로폽 시용에 대한 요약 통계학 및 ％ 손상에 대한 평균 비교
％ 손상의 일원 분석- 형질에 의한 등급화 5 (침수전 시용 후 4주), 2-엽 제초제 비율 (표지의 배수)=2X
Figure pct00015
<표 10>
ACC아제 생성물 상의 4X 퀴잘로폽 시용에 대한 요약 통계학 및 ％ 손상에 대한 평균 비교
％ 손상의 일원 분석- 형질에 의한 등급화 5 (침수전 시용 후 4주), 2-엽 제초제 비율 (표지의 배수)=4X
Figure pct00016
<표 11>
사용된 참조 제초제 제품, 및 용량
Figure pct00017
<표 12>
부다페스트 조약 하의 벼 종자 기탁 (또한 표 5 참조)
Figure pct00018
간행물
이 출원에 인용된 모든 간행물은 이들이 본 발명과 관련된 물질 및/또는 방법과 관련되는 정도로 본원에 참조로 포함된다.
Agarwal et al., Plant Mol Biol (2007) 65:467-485. Genome-wide identification of C2H2 zincfinger gene family in rice and their phylogeny and expression analysis
Akira, Abe et al., Genome sequencing reveals agronomically important loci in rice using MutMap Nature Biotechnology 30,174-178 (2012), Published online 22 January 2012.
Wright, Mark H. et al., Genome-wide association mapping reveals a rich genetic architecture of complex traits in Oryza sativa. Nat. Comm 2:467 | DOI: 10.1038/ncomms1467, Published Online 13 Sep 2011.The marker information can be accessed from The Rice Diversity Home Page and downloading the file "44K GWAS Data" (http://www.ricediversity.org/index.cfm).
Zhao, Keyan et al. (2011). Genome-wide association mapping reveals a rich genetic architecture of complex traits in Oryza sativa. Nat Comm 2:467 | DOI: 10.1038/ncomms1467, Published Online 13 Sep 2011
SEQUENCE LISTING <110> RICETEC AKTIENGESELLSCHAFT <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR COMBINATIONS OF MUTATIONS ASSOCIATED WITH HERBICIDE RESISTANCE/TOLERANCE IN RICE <130> 50970-267333 <140> <141> <150> 62/371,582 <151> 2016-08-05 <160> 65 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2501 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 cctgttctgc taggaataat agaactacat actgctatga ttttccactg gtgagttgac 60 tgctccctta tattcaatgc attaccatag caaattcata ttcgttcatg ttgtcaaaat 120 aagccgatga aaattcaaaa ctgtaggcat ttgaaactgc agtgaggaag tcatggtcct 180 ctagtacctc tggtgcttct aaaggtgttg aaaatgccca atgttatgtt aaagctacag 240 agttggtatt tgcggacaaa catgggtcat ggggcactcc tttagttcaa atggaccggc 300 ctgctgggct caatgacatt ggtatggtag cttggacctt gaagatgtcc actcctgaat 360 ttcctagtgg tagggagatt attgttgttg caaatgatat tacgttcaga gctggatcat 420 ttggcccaag ggaagatgca ttttttgaag ctgttaccaa cctagcctgt gagaagaaac 480 ttcctcttat ttatttggca gcaaattctg gtgctcgaat tggcatagca gatgaagtga 540 aatcttgctt ccgtgttggg tggtctgatg atggcagccc 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attactttta tgatatgtct 300 aaattacttt tagatttcac taagttactt cttagacata taaaagtaaa ttcagtaaag 360 cctaaaagta attacatata ttatagcagt aacttataac a 401 <210> 55 <211> 401 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 55 aacgtcgacg agaaccgggc tcccaactga cggtcacgcg agagctgcac gaaacgagcc 60 tcgacgacga tcccatccgt ccgtccgtcg ctgcggctgc tgctgctgcc gccacaggcg 120 gtcagagcct ctggcacgat gccaacacgc gggcacgtgg tagggcagca cgggccattc 180 aggtggtgtt tggatccagg gacttaactt tattctctat atttagacac taatttaaaa 240 tattaaatat agattactta caaaactaat tacataaatg aaagctaatt tgtgtgataa 300 cttttttaag cttaattaat ccataattag agaatgttta atgtagcatc acataagcta 360 atcatggatt aattaggctc aatagattcg tctcgcgaat t 401 <210> 56 <211> 401 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 56 cgtccgccga agcgcacgac cggcgcggcg tggggagcgg cgagtcgagc agctgcggga 60 gcttctcgcc gtcggcgcca ttgcaccgca gcccctcctt gtcccgcctg gtgacgattt 120 ccatgggcat tgcgccgact gactgtgtcg gcagcatgca tcgtctcggg cgttcaacgt 180 gtggagggga cgacgtataa gagtacacgc gaagactgta ggtagaggtg cttttcccgc 240 gaaaagtggc agtagcggcg gttggacagt aaccttcgtg tatggttgtg tgttcatctc 300 acgtactgtt cttttgcctc tcgctagctc gttcccgtga tcaaggtgca tgctcgatgg 360 ccttaatggt ggaggttgcc gaaaggtagc agaggaaatc a 401 <210> 57 <211> 401 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 57 ggatggatag taaatataat atgaattgat ctattggatc agttatatat atatatatat 60 atatatatat atatatatat atatatatat atatatagac acacacacac acaatgagga 120 tggtaaatta gtgacaatat atgaatgtgt tctattgtca aaacgaaagg gatcgatgag 180 ttatatctct aggttaatta gtttacaacg aagagttgaa gctggaataa acaagtcaaa 240 attatatctg tataacatca tagtaatgcc gaccatgtac gcatccacat ggccatacag 300 caacatcaga aacagaattt aattaattat ttgactaaac ccagaatcat ttgctgctgc 360 atcgaatcgt tcctctcgtc atcgccgacg caaacatgcg c 401 <210> 58 <211> 401 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 58 ctatgagtta gctagctaac gtgtatgatg tccaatgatt aagtgacact ttttttctgt 60 ctaatataat catccatctc atcatatcat tagctccttg tgcttgtgcg ttcactgttc 120 agagaagctg gttatcctcc ctgataagaa cagccgggag gtcagtgtgc tatggttttg 180 tttagttctg gaatgatcca gtcacccagc acaattgact ggctgagtgt tgcattaagc 240 aaatctggac cggatttgag ggaattttct cgcgcagtgg agatctatga taaatctcgt 300 accgatccag catagtgatt cgtccgcggg attaatactg taactaatcc atagattagc 360 gccattattg aaacacgctt tcttcttatt gttgttatta t 401 <210> 59 <211> 401 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 59 actctgtagt ctgcaaggag cggtggcgag cagtggcgcg cgaagtcgat agggtggcga 60 gcggacggag tggcgacgga gagcctgcgg gagtcgagat cgtccgggga agcaacgacg 120 gcaacgacgg cagccttgta tcccgtcggc gaggtcacgc tcggccattg cgcacctctc 180 ccttcgccca tcgccatcga gcccccaccc acggcgcccg gccatccccg gcgaggagct 240 ctgtttttgg tgggtgtcgg cggagttgga acgaaggagg gtcgttctcg gcatcgatgt 300 cgccatctcc gatcctccac cgccaccgcc gccctccccc cctccattgc cgacccctcc 360 ccggcgtcga gaaaatcctc gcccgacctc agcaacaaga a 401 <210> 60 <211> 401 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 60 tagactgcat cgccacctgc cgccgaactg cgccgtgctg ccgcccgccg gtgccctctc 60 cttcacctcc cgctgcatcg ccgcctgccg ccaagcgcac ggcgaagggt aaggagtcgt 120 ggcggcgcgg 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Claims (22)

  1. 내성/저항성을 부여하는 벼 계통 RTA2 및 RTA1의 게놈으로부터의 유전자 영역 또는 그의 등가물이 없는 식물에 의해 내성화되는 것보다 더 높은 수준으로 ACC아제 억제제에 대해 내성/저항성인 단자엽 식물.
  2. 제1항에 있어서, 벼 식물인 단자엽 식물.
  3. ACC아제 효소의 아미노산 서열의 위치 2096에서 글리신의 세린으로의 치환을 코딩하는 돌연변이인 제1항에서의 벼 계통 RTA1의 유전자 영역.
  4. 표 1A에 제시된 바와 같은 돌연변이체 뉴클레오티드 및 표 1B에서의 상류 및 하류 플랭킹 영역을 갖는 위치 C1-32083963 및 C1-36386713 사이인 제1항의 벼 계통 RTA2에서의 염색체 번호 1의 유전자 영역.
  5. 표 1A에 제시된 바와 같은 위치에서의 염색체 1 상의 유전자 돌연변이의 매개자이며, 여기서 ACC아제 효소의 아미노산 서열에서 G2096S 치환을 코딩하는 돌연변이 염색체 5와 조합되는 경우, 동형접합성 형태의 매개자의 존재가 ACC아제 억제제에 대한 상승작용적 저항성/내성을 가져오는 것인 매개자.
  6. ATCC 수탁 번호 PTA-122646 및 124233으로서 기탁된 제1항의 벼 식물의 종자.
  7. 제2항에 있어서, HPPD 억제제에 대해 내성/저항성인 것으로 추가로 규정되는 단자엽 벼 식물.
  8. a. 벼를 논에 두는 단계이며, 여기서 벼는 제초제에 대해 저항성이고, 제초제는 ACC아제 억제제, HPPD 억제제, 및 둘 다를 포함하는 것인 단계, 및
    b. 잡초를 죽이는 것으로 알려진 수준으로 벼가 저항성인 제초제 중 적어도 1종과 논을 접촉시키는 단계
    를 포함하는, 논에서 잡초를 방제하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, ACC아제 억제 제초제가 아릴옥시페녹시 프로피오네이트, 플루아지폽 및 퀴잘로폽으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, HPPD 억제 제초제가 메소트리온, 벤조비시클론, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. a. 조합되어 저항성/내성을 부여하는 RTA1 및 RTA2로 지정된 벼의 게놈에서의 영역의 등가물인 유전자 영역을 얻는 단계; 및
    b. 유전자 영역을 벼 계통 내로 도입하여 야생형 영역을 대체하는 단계
    를 포함하는, 저항성을 부여하는 유전자 영역이 없는 식물에 의해 내성화되는 것보다 유의하게 더 높은 수준으로 ACC아제 제초제 억제제에 대해 저항성인 벼를 생산하는 방법.
  12. 벼 식물을 트랜스진으로 형질전환시키는 단계를 포함하며, 트랜스진이 제9항 또는 제10항의 군으로부터 선택되는 제초제에 대한 저항성을 부여하고, 트랜스진이 RTA1 및 RTA2의 영역 또는 등가물을 갖는 것인, 제초제 저항성 벼 식물을 생산하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, ACC아제 코딩 유전자의 프로모터, 종결자, 선택가능한 마커, 또는 다른 도메인 및 염색체 1 상의 RTA2에서의 유전자 영역의 임의의 연계로, 벼를 RTA1 또는 RTA2로부터의 유전자 영역으로 형질전환시키는 단계를 포함하는, 제초제 내성 벼를 생산하는 방법.
  14. 제15항, 제17항, 제19항 및 제22항 중 어느 한 항의 식물을 상이한 유전적 배경의 벼 식물과 교배하는 단계, 및 생성된 혼성체 벼 종자를 수확하는 단계를 포함하는, 벼 종자를 생산하는 방법.
  15. 제14항의 방법에 의해 생산된 종자로부터 생산된 제초제 내성 벼 식물.
  16. 종자의 대표적 샘플이 ATCC 수탁 번호 PTA-122646 또는 124233 하에 기탁된 것인 벼 종자.
  17. 제16항의 종자를 성장시킴으로써 생산된 벼 식물, 또는 그의 부분.
  18. 제15항 또는 제17항의 식물의 화분 또는 배주.
  19. 제16항의 벼 식물의 생리학적 및 형태학적 특징 모두를 갖는 벼 식물, 또는 그의 부분.
  20. 제15항 또는 제17항의 벼 식물로부터의 원형질체 또는 세포로부터 생산된 조직 배양물이며, 여기서 조직 배양물의 상기 세포 또는 원형질체는 잎, 화분, 배아, 자엽, 배축, 분열조직 세포, 뿌리, 근단, 암술, 꽃밥, 꽃, 줄기, 포영 및 원추화서로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물 부분으로부터 생산되는 것인 조직 배양물.
  21. 제15항 또는 제17항의 식물로부터 생산된 원형질체.
  22. 제16항의 벼 식물의 형태학적 및 생리학적 특징 모두를 갖는, 제20항의 조직 배양물로부터 재생된 벼 식물.
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