ES2915407T3 - Procedimientos y composiciones para combinaciones de mutaciones asociadas a la resistencia/tolerancia a los herbicidas en el arroz - Google Patents

Abstract

Una planta de arroz que comprende en su genoma: a) una mutación en el cromosoma 5 que codifica una sustitución G2096S en la secuencia de aminoácidos de la enzima ACCasa; y b) las siguientes mutaciones del cromosoma 1: T en lugar de C en la posición 32083963; A en lugar de G en la posición 32165584; A en lugar de G en la posición 32177487; C en lugar de T en la posición 32459172; G en lugar de A en la posición 32785958; C en lugar de T en la posición 32821747; A en lugar de G en la posición 33147227; T en lugar de C en la posición 33201871; C en lugar de T en la posición 33760443; C en lugar de T en la posición 33760496; CT en lugar de C en la posición 34079372; A en lugar de G en la posición 34374172; G en lugar de A en la posición 34440547; A en lugar de G en la posición 34482064; A en lugar de G en la posición 34680949; C en lugar de T en la posición 34801475; T en lugar de C en la posición 34976760; A en lugar de G en la posición 35080808; A en lugar de G en la posición 35498447; A en lugar de G en la posición 35645244; A en lugar de G en la posición 35779866; A en lugar de G en la posición 35800575; A en lugar de G en la posición 35866927; A en lugar de G en la posición 36096211; A en lugar de G en la posición 36160202; y A en lugar de G en la posición 36386713.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos y composiciones para combinaciones de mutaciones asociadas a la resistencia/tolerancia a los herbicidas en el arroz

ANTECEDENTES

Se divulga un arroz mutante que es (1) resistente/tolerante a los inhibidores de la ACCasa a una concentración relativamente alta de inhibidores debido a la acción sinérgica de los genes en 2 regiones de 2 cromosomas diferentes; (2) resistente/tolerante tanto a los herbicidas inhibidores de la HPPD como de la ACCasa; y (3) resistente/tolerante sólo a los herbicidas inhibidores de la 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD). Se divulgan procedimientos de control de las malezas utilizando arroz con estos cultivos resistentes a los herbicidas en campos que pueden ser asperjados o tratados de otra manera con el herbicida. También se divulgan procedimientos para producir el arroz tolerante a los herbicidas.

Valor de los cultivos de arroz

El arroz es un cultivo agrícola antiguo y hoy en día es uno de los principales cultivos alimentarios del mundo. Hay dos especies cultivadas de arroz: Oryzasativa L., el arroz asiático, y Oryza glaberrima Steud. el arroz africano. La especie asiática constituye prácticamente la totalidad del arroz cultivado en el mundo y es la que se cultiva en Estados Unidos. En Estados Unidos existen tres grandes regiones productoras de arroz: el Delta del Misisipi (Arkansas, Misisipi, noreste de Luisiana, sureste de Missouri), la Costa del Golfo (suroeste de Luisiana, sureste de Texas) y el Valle Central de California. Otros países, sobre todo de Sudamérica y Oriente, son grandes productores de arroz.

El arroz es uno de los pocos cultivos que pueden crecer en una inundación poco profunda ya que tiene una estructura única que permite el intercambio de gases a través de los tallos entre las raíces y la atmósfera. El crecimiento en una inundación poco profunda da lugar a los mejores rendimientos y es la razón por la que el arroz se suele cultivar en suelos arcillosos pesados, o en suelos con una capa dura impermeable justo debajo de la superficie del suelo. Estos tipos de suelo no suelen ser adecuados para otros cultivos o, en el mejor de los casos, los cultivos rinden poco.

La mejora constante del arroz es imprescindible para proporcionar la nutrición necesaria a una población mundial creciente. Una gran parte de la población mundial consume arroz como su principal fuente de nutrición, y los cultivos deben prosperar en diversas condiciones ambientales, incluyendo la competencia con las malezas y los ataques de agentes desfavorables. La mejora del arroz se lleva a cabo mediante prácticas de cruzamiento convencionales y también mediante técnicas de genética recombinante. Aunque parezca sencillo para los ajenos a esta disciplina, la mejora de los cultivos requiere una gran habilidad científica y técnica, y los resultados son generalmente imprevisibles.

Aunque los objetivos específicos de cruzamiento varían un poco en las diferentes regiones productoras de arroz del mundo, el aumento del rendimiento es un objetivo primordial en todos los programas.

El cruzamiento de las plantas comienza con el análisis y la definición de los puntos fuertes y débiles de los cultivares existentes, seguido del establecimiento de los objetivos del programa, para mejorar las áreas de debilidad para producir nuevos cultivares. Los objetivos específicos de cruzamiento incluyen la combinación en un solo cultivar de una combinación mejorada de rasgos deseables de las fuentes parentales. Los rasgos deseables pueden introducirse debido a mutaciones espontáneas o inducidas. Entre los rasgos deseables se encuentran un mayor rendimiento, resistencia al estrés ambiental, a las enfermedades y a los insectos, mejores tallos y raíces, tolerancia a las bajas temperaturas, mejores características agronómicas, valor nutricional y calidad del grano.

Por ejemplo, el cultivador selecciona y cruza inicialmente dos o más líneas parentales, seguido de la selección de los rasgos deseados entre las muchas combinaciones genéticas nuevas. En teoría, el cultivador puede generar miles de millones de combinaciones genéticas nuevas y diferentes mediante el cruce. El cruzamiento mediante el cruce y la autofecundación no implica un control directo a nivel celular. Sin embargo, ese tipo de control puede lograrse en parte mediante técnicas de genética recombinante.

El cruzamiento del pedigrí se utiliza habitualmente para la mejora de los cultivos autógamos, como el arroz. Por ejemplo, dos progenitores que poseen rasgos favorables y complementarios se cruzan para producir una generación F¹. Uno o ambos progenitores pueden representar a su vez una F¹ de un cruce anterior. Posteriormente se produce una población segregante, cultivando las semillas resultantes de la autofecundación de una o varias F¹ si los dos parentales son líneas puras, o cultivando directamente la semilla resultante del cruce inicial si al menos uno de los parentales es una F¹. La selección de los mejores genomas individuales puede comenzar en la primera población segregante o F²; luego, a partir de la F³, se seleccionan los mejores individuos de las mejores familias. "Lo mejor" se define con base en los objetivos de un determinado programa de cruzamiento, por ejemplo, aumentar el rendimiento o resistir a las enfermedades. En general, se utiliza un enfoque multifactorial para definir "lo mejor" debido a las interacciones genéticas. Un gen deseable en un fondo genético puede diferir en un fondo diferente. Además, la introducción del gen puede alterar otras características genéticas favorables. Las pruebas replicadas de las familias pueden comenzar en la generación F⁴ para mejorar la eficacia de la selección de los rasgos con baja heredabilidad. En una fase avanzada de la endogamia (es decir, F6 y F⁷), las mejores líneas o mezclas de líneas fenotípicamente similares se prueban para su posible liberación como nuevas líneas parentales.

El cruzamiento por retrocruzamiento se ha utilizado para transferir genes de un rasgo altamente heredable a un cultivar homocigótico deseable o a una línea endogámica que es el progenitor recurrente. La fuente del rasgo que se va a transferir se denomina progenitor donante. Se espera que la planta resultante tenga los atributos del progenitor recurrente (por ejemplo, el cultivar) y el rasgo deseable transferido del progenitor donante. Tras el cruce inicial, se seleccionan los individuos que poseen el fenotipo del progenitor donante y se cruzan repetidamente (retrocruzamiento) con el progenitor recurrente. El proceso se utiliza para recuperar todas las características beneficiosas del progenitor recurrente con la adición del nuevo rasgo aportado por el progenitor donante.

Las líneas prometedoras de cruzamiento avanzado se someten a pruebas exhaustivas y se comparan con los estándares adecuados en entornos representativos de las áreas comerciales objetivo durante al menos tres o más años. Las mejores líneas son candidatas a nuevas variedades comerciales o a ser progenitores de híbridos; las que siguen siendo deficientes en algunos rasgos pueden utilizarse como progenitores para producir nuevas poblaciones para su posterior selección.

Estos procesos, que conducen a la etapa final de comercialización y distribución, suelen durar entre 8 y 12 años desde que se realiza el primer cruce y pueden basarse en el desarrollo de líneas de cruzamiento mejoradas como precursoras. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos cultivares no sólo es un proceso que lleva mucho tiempo, sino que requiere una planificación previa precisa, un uso eficiente de los recursos y un mínimo de cambios de dirección. Los resultados incluyen nuevas combinaciones genéticas que no se encuentran en la naturaleza.

Una parte de la mejora del arroz a través del cruzamiento puede limitarse a la variación genética natural del arroz y de las especies hibridadas, como el arroz silvestre. La introducción de una nueva variación en un programa de cruzamiento suele realizarse a través del programa de cruces descrito, como el cruzamiento por pedigrí o por retrocruzamiento. Sin embargo, ocasionalmente se encuentran mutaciones naturales que dan lugar a la introducción de nuevos rasgos, como la resistencia a las enfermedades o los cambios de altura. Los cultivadores también han desarrollado nuevos rasgos induciendo mutaciones (pequeños cambios en la secuencia del ADN) en el genoma del arroz. Algunas de estas mutaciones o combinaciones de genes no se encuentran en la naturaleza. Comúnmente, se utilizan EMS o azida sódica más MNU como agentes mutagénicos. Estas sustancias químicas inducen aleatoriamente cambios de una sola base en el ADN, normalmente de G y C cambiadas a A y T. Los efectos generales son imprevisibles. La mayoría de estos cambios no tienen ningún efecto en el cultivo porque quedan fuera de las regiones de codificación del gen o no cambian la secuencia de aminoácidos del producto génico. Sin embargo, algunos producen nuevos rasgos o incorporan nuevos cambios de ADN en líneas anteriores.

Hasta hace poco, un cultivador no tenía control directo de los sitios de mutación en la secuencia de ADN. La identificación de cambios útiles se debe a la posibilidad aleatoria de que se induzca una mutación eficaz y de que el cultivador reconozca los efectos fenotípicos del cambio y pueda seleccionar y ampliar los cultivos de arroz que tengan esa mutación.

Las semillas se tratan con el producto químico mutagénico u otro agente y se plantan inmediatamente para que crezcan y produzcan semillas M2. La semilla M2 llevará numerosas variaciones nuevas; por lo tanto, no habrá dos experimentos que produzcan las mismas combinaciones. Entre estas variaciones se pueden encontrar nuevos rasgos que antes no existían en el arroz y que no estaban disponibles para la selección por parte de un fitocultivador y que se pueden utilizar para la mejora del arroz.

Para encontrar nuevos rasgos, el cultivador debe utilizar estrategias de selección eficientes y estratégicas porque el proceso mutagénico tiene una frecuencia extremadamente baja de nuevas combinaciones útiles. Entre los miles de nuevas variantes genéticas inducidas puede haber sólo una con un nuevo rasgo deseable. Un sistema de selección óptimo examinará miles de nuevas variantes y permitirá detectar unas pocas o incluso una sola planta que pueda ser portadora de un nuevo rasgo. Después de identificar o encontrar un posible nuevo rasgo, el cultivador debe desarrollar un nuevo cultivar por medio de cruzamientos de pedigrí o retrocruzamiento, seguido de extensas pruebas para verificar que el nuevo rasgo y el cultivar presentan un valor estable y heredable para los productores de arroz.

Utilizando técnicas de genética recombinante, las moléculas de ácido nucleico con mutaciones que codifican características mejoradas en el arroz, pueden ser introducidas en el arroz que tiene genomas comercialmente adecuados. Los nuevos procedimientos de manipulación genética, como CRISPR, y las modernas técnicas de secuenciación permiten a los cultivadores dirigir complejas mejoras de los cultivos y acelerar el progreso hacia la comercialización. Una vez identificada una mutación por el procedimiento que sea, se puede transferir al arroz mediante técnicas de recombinación y comprobar que no afecta negativamente a su aptitud.

Resistencia a los herbicidas en el arroz

Las malezas y otros competidores por los recursos en los campos de cultivo compiten por los recursos y reducen en gran medición el rendimiento y la calidad de la cosecha. Las malezas se han controlado en los cultivos mediante la aplicación de herbicidas selectivos que matan las malezas, pero no dañan el cultivo. Por lo general, la selectividad de los herbicidas se basa en las variaciones bioquímicas o en las diferencias entre el cultivo y las malezas. Algunos herbicidas no son selectivos, es decir, matan todas o casi todas las plantas. Los herbicidas no selectivos o de amplio espectro pueden utilizarse en los cultivos si se insertan nuevos genes que expresen proteínas específicas que transmitan tolerancia o resistencia al herbicida. La resistencia a los herbicidas también se ha conseguido en los cultivos mediante mutaciones genéticas que alteran las proteínas y los procesos bioquímicos. Estas mutaciones pueden surgir en la naturaleza, pero sobre todo se han inducido en los cultivos, ya sea in vitro en cultivos de tejidos o induciendo mutaciones in vivo. Desgraciadamente, en algunos casos, especialmente con el uso repetido de un determinado herbicida, las malezas han desarrollado resistencia a través de la selección involuntaria de mutaciones naturales que proporcionan resistencia. Cuando las malezas se vuelven resistentes a un determinado herbicida, éste deja de ser útil para su control. La mejor manera de retrasar el desarrollo de la resistencia en las malezas es alternar el uso de diferentes modos de acción para controlarlas, interrumpiendo el desarrollo de las malezas resistentes.

La producción de arroz está plagada de plantas de hoja ancha y de una maleza particularmente difícil de controlar llamada arroz rojo. Una de las dificultades se debe a que el arroz rojo es tan parecido genéticamente al arroz cultivado (ocasionalmente se polinizan de forma cruzada) que no hay herbicidas selectivos disponibles que se dirijan al arroz rojo, pero que no dañen al arroz cultivado. En la actualidad, el control se realiza en la producción comercial de arroz mediante el desarrollo de mutaciones encontradas en el arroz que lo hacen resistente a los herbicidas de amplio espectro, por ejemplo, los herbicidas de imidazolinona y sulfonilurea. Se necesitan arroces resistentes a los herbicidas que inhiban otras plantas nocivas, como las de hoja ancha.

Hasta la fecha, la mayoría de los arroces tolerantes a los herbicidas están asociados a un único cambio genético, en particular un cambio en una enzima diana que altera su respuesta a los inhibidores. Sería deseable introducir causas más complejas de aumento de la resistencia/tolerancia en las plantas, porque se alejan de las causas naturales y proporcionan más obstáculos para que las malezas desarrollen resistencia. Los documentos WO 2013/016210 A1, US 2015/038331 A1y WO 2015/025031 A1 divulgan arroz mutante tolerante a diferentes herbicidas, incluyendo inhibidores de ACCasa y HPPD.

Encontrar nuevas mutaciones en el arroz que lo hagan resistente a una variedad de herbicidas, a combinaciones de herbicidas con modos de acción alternativos, en particular una resistencia mejorada, beneficiaría enormemente la producción de arroz. La obtención e incorporación de genes de resistencia a los herbicidas en los genomas del arroz con características favorables adicionales y resistencias alternativas es un reto, imprevisible, largo y caro, pero necesario para satisfacer las crecientes necesidades alimentarias del mundo.

SUMARIO

La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.

Se describen y divulgan en el presente documento líneas de arroz novedosas y distintivas con resistencias únicas, en algunas combinaciones sinérgicas, a los herbicidas, en particular a los herbicidas inhibidores de la ACCasa y la HPPD, y a sus combinaciones. Los herbicidas inhibidores de la ACCasa incluyen el quizalofop, el propaquizafop y el fluazifop. Los herbicidas inhibidores de la HPPD incluyen la mesotriona, el benzobiciclón y sus combinaciones.

Regiones genéticas asociadas con la resistencia/tolerancia a los herbicidas de la familia FOP

El desarrollo de poblaciones mutagénicas y el cribado realizado para la resistencia al herbicida FOP, permitió identificar dos regiones genéticas mutadas asociadas a la resistencia al Quizalofop. Se determinó que una de estas regiones causantes de la resistencia, designada RTA1, estaba localizada en el conocido locus diana del gen ACCasa situado en el cromosoma 5. Por lo tanto, constituye un ejemplo típico de resistencia a herbicidas específicos objetivo (TSR). Se determinó que otro agente, designado RTA2, estaba localizado en el cromosoma 1, en una región que anteriormente no se había reportado como involucrada en la tolerancia a los herbicidas FOP, y que no estaba relacionada con la secuencia de aminoácidos de la ACCasa. Esta segunda región parece ser un caso de agente de resistencia específica no objetivo (NTSR).

Los antecedentes genéticos no son los mismos en las dos líneas RTA1 y RTA2. Uno es mutagénico, el otro se convierte de nuevo en la línea convencional.

Las líneas RTA1 y RTA2 son homocigóticas para los rasgos de resistencia/tolerancia al inhibidor de la ACCasa y son consanguíneas.

Las regiones genéticas inductoras de tolerancia a los herbicidas de RTA1 y RTA2 tienen efectos esencialmente recesivos que requieren homocigosidad para tener el efecto completo de la tolerancia. Las líneas se denominan "RTA1 y RTA2", pero estos términos también se refieren a las regiones específicas mutadas dentro de las líneas. Las regiones están asociadas a la tolerancia a los herbicidas.

RTA1 confiere resistencia por un mecanismo TSR

El gen de resistencia mutado RTA1, se determinó que era una mutación puntual única en el ADN del gen de la ACCasa, en la que un nucleótido de guanina (G) en el arroz de tipo salvaje, no mutado, se sustituye por adenina en el ADN mutante, lo que da lugar a un cambio en la secuencia de aminoácidos de glicina a serina (G a S) en el sitio objetivo de la proteína expresada que afecta a un sitio activo conocido en la proteína (G2096S). Esto provoca un cambio en la acción del herbicida en un sitio de unión crítico en la enzima ACCasa (que se encuentra en los cloroplastos), que afecta a la unión del herbicida a la proteína ACCasa, y bloquea la expresión de la fitotoxicidad. Así, las plantas que llevan la mutación no mueren por contacto con el herbicida. La mutación se identificó mediante el análisis de la secuencia del gen de la ACCasa y coincide exactamente con mutaciones idénticas de resistencia a la FOP identificadas en posiciones homólogas en otros cultivos y en especies vegetales.

RTA2 confiere resistencia por un mecanismo NTSR

En el caso de RTA2, la mutación asociada a la resistencia/tolerancia fue mapeada en el Chr.1 (a diferencia de RTA1 que se localiza en el Chr.5), como se evidenció tanto por el análisis de mapeo de ligamiento como posteriormente por MutMap (estrategia de mapeo de mutaciones por secuenciación del genoma completo). En esta región del cromosoma 1 no se ha informado de la existencia de genes duplicados u ortólogos de la ACCasa o genes similares a la ACCasa, el gen diana de los herbicidas FOP. Por lo tanto, el mecanismo de tolerancia al Quizalofop causado por esta mutación RTA2, no puede ser caracterizado como "sitio objetivo". En cambio, el RTA2 se considera una región o sitio genético de resistencia "no basada en el objetivo", también denominada en la literatura como tolerancia a herbicidas "no basada en el objetivo o en el metabolismo" (NTSR).

Control de las malezas

Estas nuevas líneas presentan mejores oportunidades para el control de las malezas.

Un procedimiento para controlar las malezas en un campo de arroz utiliza el arroz del campo resistente a una pluralidad de herbicidas.

El campo de arroz se pone en contacto con al menos un herbicida, o una pluralidad de herbicidas, por ejemplo, cualquiera que pueda pertenecer a la familia de herbicidas conocidos como inhibidores de la ACCasa, o cualquiera que pueda pertenecer a la clase de herbicidas conocidos como herbicidas inhibidores de la HPPD.

Producción de plantas de arroz resistentes a los herbicidas

Un procedimiento para cultivar plantas de arroz resistentes/tolerantes a los herbicidas incluye (a) plantar semillas de arroz resistentes; (b) permitir que las semillas de arroz broten; (c) aplicar uno o más herbicidas a los brotes de arroz a niveles de herbicida que normalmente inhibirían el crecimiento de una planta de arroz, y seleccionar las plantas supervivientes para la expansión del cultivo.

Los procedimientos de producción de plantas de arroz tolerantes a herbicidas también pueden utilizar un transgén o una pluralidad de transgenes, o nuevos procedimientos de manipulación genética como CRISPR. Una realización de dicho procedimiento consiste en transformar una célula de una planta de arroz con transgenes, en la que los transgenes codifican 2 regiones genéticas diferentes que, cuando se combinan, conducen a una resistencia sinérgica a los inhibidores de la ACCasa, o a una HPPD y a una enzima ACCasa que confiere tolerancia a las plantas de arroz resultantes a uno o más herbicidas. En la práctica de estos procedimientos puede utilizarse cualquier célula adecuada, por ejemplo, la célula puede estar en forma de callo.

Una planta monocotiledónea tolerante/resistente a los inhibidores de la ACCasa, a niveles superiores a los tolerados por las plantas sin regiones genéticas de los genomas de las líneas de arroz RTA2 y RTA1 o sus equivalentes, es adecuada para el control de las malezas y el desarrollo de nuevas líneas. Los equivalentes serían regiones genéticas con el mismo resultado de codificación que está en el cromosoma 5, y el mismo vector de mutaciones que en el cromosoma 1, con efectos sinérgicos cuando se combinan.

La región en el genoma de la línea de arroz RTA2 es una mutación que codifica una sustitución de glicina por serina en la posición 2096.

La región del cromosoma de arroz número 1 en la línea de arroz RTA2 se encuentra entre la posición CI-32083963 y CI-36386713 con secuencias de nucleótidos mutantes como se muestra en la Tabla 1Ay 1B. Esta región es una región estrechamente vinculada con las mutaciones mostradas en las posiciones individuales en las tablas 1A y 1B. Cuando el vector de mutaciones está en una planta de arroz, el efecto RTA2 está presente.

Las semillas de las plantas de arroz divulgadas en el presente documento están depositadas con los números de acceso ATCC PTA-122646 y 124233.

Un procedimiento de producción de arroz resistente a los inhibidores de herbicidas de la ACCasa, a niveles significativamente más altos que los tolerados por las plantas sin regiones genéticas que confieren resistencia, incluye:

a. obtener regiones genéticas que sean sustancialmente iguales a las regiones de los genomas del arroz designadas RTA1 y RTA2 que confieren resistencia/tolerancia a los inhibidores de la ACCasa; y

b. introducir las regiones genéticas en las líneas de arroz para reemplazar las regiones de tipo salvaje que no confieren resistencia a los herbicidas a niveles útiles para los cultivos comerciales.

Las células derivadas de semillas resistentes a los herbicidas, las plantas cultivadas a partir de dichas semillas y las células derivadas de dichas plantas, la progenie de las plantas cultivadas a partir de dichas semillas y las células derivadas de dicha progenie están dentro del alcance de la presente divulgación. El crecimiento de las plantas producidas a partir de las semillas depositadas, y la progenie de dichas plantas será típicamente resistente/tolerante a los herbicidas, por ejemplo, inhibidores de la ACCasa, inhibidores de la HPPD o ambos, a niveles de herbicidas que normalmente inhibirían el crecimiento de una planta correspondiente de tipo salvaje. Existen algunos niveles naturales (no inducidos) de tolerancia a algunos herbicidas, pero esas regiones no pueden proteger a las plantas a niveles que sean comercialmente útiles.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

FIG. 1 es una representación gráfica de un ensayo de tolerancia a los rasgos; el ensayo se plantó, se aplicó mesotriona en las tasas indicadas aproximadamente un mes después (estado de 3-4 hojas), y se realizó una segunda aplicación en los dos tratamientos indicados aproximadamente una semana después; se evaluó el arroz en cuanto al porcentaje de lesiones o daños en comparación con el arroz no asperjado veintiún días después de la primera aplicación del herbicida; la línea ML0831266-03093 es la línea resistente a HPPD y R0146 y P1003 son líneas de control sin mutación inducida; la línea PL1214418M2-73009 se seleccionó a partir de un cruce entre la línea tolerante a HPPD ML0831266-03093 (cuyo progenitor es P1003) y la línea resistente a ACCasa ML0831265-01493 (cuyo progenitor es R0146). La línea recién desarrollada PL1214418M2-73009 muestra una tolerancia equivalente a la línea original tolerante a la HPPD ML0831266-03093 a los inhibidores de la HPPD.

FIG. 2 es una representación gráfica de un ensayo de tolerancia a los rasgos; el arroz del ensayo se plantó, se aplicó quizalofop en las tasas indicadas aproximadamente 5 semanas después (iniciando el ahijamiento); el arroz se evaluó para el porcentaje de lesión o perjuicio en comparación con el arroz no asperjado cuatro semanas después de la aplicación del herbicida; la línea ML0831265-01493 es la línea resistente a la ACCasa y R0146 y p 1003 son las líneas de control; la línea PL1214418M2-73009 fue seleccionada a partir de un cruce entre la línea tolerante al HPPD ML0831266-03093 (cuyo progenitor es P1003) y la línea tolerante a la ACCasa ML0831265-01493 (cuyo progenitor es R0146). La línea recientemente desarrollada PL1214418M2-73009, que tiene resistencia combinada, se muestra equivalente o mejor que la línea original resistente a la ACCasa ML0831265-01493.

FIGs. 3A-3D son fotografías de (FIG. 3A) Parcela 70025, ML0831266-03093F2-2(2)A-1(1)A-P-USP-USA (HPPDi+HPPDni), Callisto, 2 aplicaciones, Preemergencia/Preflotación 210/210 grai/ha; (FiG. 3B) 15SAT1, Parcela 03, 1x1x, RTA1, 2 aplicaciones, 2 hojas y pre-inundación, 77+77 grai/ha (FIG. 3C); 15SAT1, Parcela 12, 1x1x_RTA2, 2 aplicaciones, 2 hojas y pre-inundación, 77+77 grai/ha; y (FIG. 3D) 15SAT1, Parcela 12, 1x1x_RTA1-RTA2, 2 aplicaciones, 2 hojas y pre-inundación, 77+77 grai/ha.

FIG. 4 es una representación gráfica de los resultados de un ensayo de tolerancia a los rasgos en el que se aplicó mesotriona en las tasas indicadas aproximadamente 34 días después de la siembra. (iniciando el ahijamiento) el arroz fue evaluado para el porcentaje de lesión o daño en comparación con el arroz no asperjado cuatro semanas después de la aplicación del herbicida; la línea tolerante a HPPD ML0831266-03093 y la línea con tolerancia combinada a HPPD y ACCasa PL1214418M2-73009 muestran una respuesta similar indicando que la tolerancia total a HPPD fue recuperada en la nueva línea; la línea PL1214418M2-73001 fue seleccionada para llevar sólo la mutación tolerante al HPPD de la línea ML0831266-03093 y la línea PL1214418M2-73013 fue seleccionada para llevar sólo la tolerancia no inducida a1HPPD de la línea ML0831266-03093; P1003 es la línea parental no mutante para la línea tolerante a1HPPD ML0831266-03093; nótese que por encima de 420 gmai/ha, incluso las líneas con resistencia genética pueden resultar dañadas.

FIGs. 5A y 5B son fotografías de los resultados de los ensayos de tolerancia a los rasgos; se evaluó el control de las malezas mediante un herbicida de mesotriona aplicado antes de la plantación; las parcelas se plantaron con un híbrido de la línea tolerante al HPPD ML0831266-03093; justo antes de la plantación, la parcela de la derecha FIG. 5B recibió una aplicación de mesotriona a 210 gmai/ha; la parcela de la izquierda FIG. 5A no se le aplicó ningún herbicida ni antes ni después de la siembra; se tomaron fotos cuatro semanas después de la siembra que muestran las diferencias en el aspecto de las malezas.

FIG. 6 es una representación gráfica de los resultados de un ensayo de tolerancia a rasgos quizalofop se aplicó en las tasas indicadas aproximadamente 30 días después de la siembra (estado de 3-4 hojas), y se realizó una segunda aplicación en los dos tratamientos indicados. Se evaluó el arroz para determinar el porcentaje de lesiones o daños en comparación con el arroz no asperjado veintiún días después de la primera aplicación del herbicida; la línea ML0831265-01493 es la línea tolerante a la ACCasa con la mutación RTA1; la línea ML0831265-02283 también es tolerante a los herbicidas de la ACCasa, sin embargo, la tolerancia no procede de una mutación en el gen codificador de la ACCasa, R0146 es la línea parental de ambas líneas tolerantes a la ACCasa; P1003 es una línea de control.

FIG. 7 muestra los resultados de un experimento de mapeo de rasgos para RTA2; se derivó una población F2 de un cruce entre una línea de esterilidad masculina citoplásmica A0109 y la línea tolerante a ACCasa ML0831265-02283; los individuos F2 de la población fueron genotipados, asperjados con quizalofop (116 gmai/ha) veintiséis días después de la siembra, y evaluados para la tolerancia al quizalofop diecinueve días después de la aplicación del herbicida; utilizando el software de mapeo de QTL, se identificó un QTL principal para la tolerancia en el cromosoma uno (indicado por la flecha).

FIG. 8 es un diagrama de dispersión que muestra los resultados de un experimento de mapeo de mutaciones para RTA2; se derivó una población F2 de un cruce entre la línea tolerante a la ACCasa ML0831265-02283 y la línea parental R0146; la población F2 fue genotipada, asperjada con quizalofop (116 gmai/ha) y evaluada para la resistencia al quizalofop; sólo las mutaciones que incluyen mutaciones resistentes a la ACCasa se segregan en la población; el índice SNP es una medición de la proporción de lecturas de secuenciación que llevan una variación de la línea no mutante R0146; una puntuación de uno indica que todas las lecturas de secuenciación tenían la variación; 19 variaciones (mutaciones) tenían un índice de uno y se agruparon en el cromosoma uno (marcado con un círculo) indicando la ubicación probable de las mutaciones que causan tolerancia (SEQ ID NOS 9-27).

FIG. 9 representa gráficamente los resultados de los experimentos de mapeo de rasgos; se derivó una población F2 de un cruce entre la línea tolerante a HPPD ML0831266-03093 (inducida por HPPDi) y la línea tolerante a ACCasa ML0831265-01493; la población fue genotipada, asperjada con mesotriona a 105 gmai/ha, evaluada para la tolerancia a la mesotriona, y asperjada de nuevo con mesotriona a 630 gmai/ha, y evaluada para la tolerancia a la mesotriona; sólo se esperaba que vivieran las plantas que heredaban la mutación para la tolerancia de la línea parental ML0831266-03093; utilizando el software de mapeo de QTL se identificó un QTL principal para la tolerancia en el cromosoma uno (indicado por la flecha) (eje X - número de cromosoma en el genoma; eje Y = puntuación, correlación con el fenotipo) (mapeo de mutaciones, cromosoma 1).

FIG. 10 muestra los resultados de los experimentos de mapeo de mutaciones; se derivó una población F2 de un cruce entre la línea tolerante al HPPD ML0831266-03093 y la línea parental P1003; la población fue genotipada, asperjada con mesotriona a 840 gmai/ha y evaluada para la tolerancia a la mesotriona; sólo las mutaciones que incluyen la mutación tolerante al HPPD segregan en la población; el índice SNP es una medición de la proporción de lecturas de secuenciación que llevan una variación de la línea P1003; una puntuación de uno indica que todas las lecturas de secuenciación tenían la variación; diez variaciones (mutaciones) tenían un índice de uno y se agruparon en el cromosoma uno (marcado con un círculo) indicando la ubicación probable de la mutación causante de la tolerancia (SEQ ID NOS 28-37).

FIG. 11 es una representación tabular de los segregantes identificados en una población F4; la población F4 se derivó de selecciones F2 portadoras de tolerancia a la HPPD y a la ACCasa de un cruce entre la línea tolerante a la HPPD ML0831266-03093 y la línea tolerante a la ACCasa ML0831265-01493; cada fila representa una línea diferente y cada columna es un marcador molecular dentro del QTL para la mutación tolerante a HPPD en el cromosoma 1; la observación del nivel de tolerancia de estas líneas al herbicida HPPD mesotriona permite asignar la mutación de tolerancia a un gen específico.

FIGs. 12AyFIG. 12B ilustra la respuesta a la tasa de la línea mutante ML0831266-03093, la línea original no mutada (parental) P1003, y un tipo diferente de arroz R0146; se aplicó mesotriona en todas las parcelas inmediatamente después de la siembra a una tasa de 210 gai/ha; las tasas de respuesta se aplicaron en la etapa de 2-3 hojas; la respuesta se registró veintiún días después de la aplicación foliar. FIG. 12A= resultados iniciales y FIG. 12B = resultados posteriores.

FIG. 13 muestra una secuencia de ADN para la región codificante de la carboxiltransferasa en el gen codificador de la ACCasa; se identifica un cambio de un solo nucleótido (recuadro) que codifica una mutación de RTA1 en la línea mutante ML0831265-01493 que se designa como 09PM72399 (SEQ ID NO: 3). NIPPONBARE es un control (SEQ ID NO: 1); R0146 (SEQ ID NO: 2) es la línea original tratada con un mitógeno para producir una población de mutaciones.

FIG. 14 muestra la comparación de las secuencias de proteínas para la región de la carboxil transferasa del gen de la ACCasa; la línea con el código 09PM72399 (SEQ ID NO: 5) es la línea ML0831265-01493; esta línea muestra un cambio de un solo aminoácido (recuadro) en la posición 2096, en relación con Black-Grass; R0146 (SEQ ID NO: 5) es la línea original tratada con un mutágeno para producir una población de mutaciones. [NIPPONBARE es SEQ ID NO: 4]

FIG. 15 muestra la respuesta a la tasa de la línea mutante ML0831266-03093, la línea original no mutada P1003 y un tipo diferente de arroz R0146. La mesotriona se aplicó en todas las parcelas inmediatamente después de la plantación a una tasas de 210 gai/ha. Las tasas de respuesta se aplicaron en la fase de 2-3 hojas. La respuesta se registró veintiún días después de la aplicación foliar.

FIG. 16 es un diagrama de flujo de un tipo de cruce utilizado para producir resistencia a los herbicidas en algunas realizaciones de arroz divulgadas en el presente documento.

FIGs. 17A-17C muestran la FIG. 17A, 2 hojas sólo-mesotriona 0,5X, FIG. 17B, 2 hojas sólo-mesotriona 0,5X/Quizalofop 0,5X; y FIG. 17C 2 hojas sólo-Quizalofop 0,5X. FIG. 17D son gráficos que representan el % de lesión para la respuesta a la Mezcla en Tanques frente a las Aplicaciones Secuenciales para la línea apilada ACCasa RTA1 HPPDi HPPDni.

FIG. 18 muestra la localización, en el cromosoma 1, de las mutaciones identificadas por el procedimiento MutMap, tal y como se implementó para el QTL mapeado en esa región con los marcadores del arreglo 44k, definido como el locus ACCasa RTA2.

FIG. 19 muestra las líneas sub-recombinantes F4 avanzadas que fueron identificadas dentro de una gran población F3 para permitir el mapeo fino de las mutaciones mapeadas y para identificar la causal que está asociada con la resistencia al herbicida RTA2. La exposición de estas plantas F3 con una dosis 1X de Quizalofop, a la que las plantas heterocigotas mostraron un mayor lesión en relación con las plantas mutantes homocigotas, permitió un mapeo fino inicial que redujo la posición probable de la mutación causal. Posteriormente, las familias derivadas de F4 se volvieron a analizar con el mismo herbicida/dosis para identificar una mutación causal que se determinó que era Chr1QMM36160202_G-A.

FIGs. 20A-FIG. 20D que muestra el % de datos de la respuesta a la lesión y las imágenes de la parcela. El material analizado incluía líneas combinadas resistentes a los inhibidores de la ACCasa (RTA1 RTA2), la RTA1 y la RTA2 individuales y el apilamiento RTA1+HPPDi+HPPDni. En dos aplicaciones (en la fase de 2 hojas y antes de la inundación) se utilizó la misma tasa para ambas aplicaciones. El apilamiento de ACCasa no muestra ningún lesión 4 semanas después de la aplicación previa a la inundación, incluso con una tasa de Quizalofop 4 veces superior a la indicada en la etiqueta. Esta combinación de rasgos es significativamente más tolerante a la aplicación de Quizalofop que cualquiera de los mutantes de tolerancia a la ACCasa por separado. FIG. 20A, parcela de control FIG. 20B 1X Quizalofop, FIG. 20C Parcela de Quizalofop 4Xcon sólo la línea combinada ACCasa que sobrevive, (todas las imágenes tomadas 4 semanas después de la aplicación de la pre-inundación), FIG.20d Orden de Plat (de izquierda a derecha) RTA1, RTA2, RTA1+ RTA2, RTA1 HPPD i+ HPPDni, p 1003, R0146. Resumen: La línea combinada ACCasa (G2096S RTA2 1) no muestra ningún lesión 4 semanas después de la aplicación de pre-inundación, incluso con una tasa de etiqueta 4X de Quizalofop.

FIGs. 21A-FIG. 21E, muestran las imágenes de las parcelas y el % de respuesta a la lesión para las líneas ACCasa RTA1, RTA2, y los apilamientos RTA1+RTA2, así como el apilamiento RTA2+HPPDi+HPPDni, cuando son expuestos por dosis crecientes de los principales herbicidas FOP. Las líneas combinadas resistentes a los inhibidores de la ACCasa (RTA1 RTA2) muestran un lesión significativamente menor que las líneas mutantes individuales 4 semanas después de la aplicación previa a la inundación a tasas de aplicación más altas de todos los herbicidas FOP probados. Aunque el lesión en la línea de mutación combinada ACCasa fue ligeramente superior a Quizalofop en este ensayo que en los anteriores, el lesión es mínimo incluso con altas tasas de aplicación. Las diferencias entre los niveles de tolerancia entre las combinaciones de rasgos ensayadas se hacen mucho más evidentes cuando se aplican tasas más altas. Propaquizafop sigue causando las mayores tasas de daños en todas las combinaciones de rasgos. El fluazifop a tasas de 2X o menos parece viable con cualquier combinación de rasgos que contenga RTA1, pero a 4X sólo la línea combinada ACCasa muestra un lesión mínimo. FIG. 21A control sin tratar, FIG. 21B 4X Quizalofop, FIG. 21C 4X Fluazifop, FIG. 21D 4X Propaquizafop. 4 semanas después de la aplicación de la pre-inundación. Orden de las parcelas (de izquierda a derecha) G2096S, RTA2, G2096S RTA2, G2096S HPPD, P1003, R0146. FIG. 21e representación gráfica.

Las FIGs 22A-22D muestran de izquierda a derecha; RTA1; FIG. 22A Control, FIG. 22B Quizalofop IX, FIG.

22C Quizalofop 2X, y FIG. 22D Quizalofop 4X; FIG. 22E-FIG. 22H muestra RTA1-RTA2; FIG. 22E Control, FIG, 22F Quizalofop IX, FIG. 22G Quizalofop 2X, y FIG. 22H Quizalofop 4X. Imágenes de 9 semanas después de la aplicación de la pre-inundación.

FIG. 23 muestra la respuesta de rendimiento para los productos de la ACCasa RTA1, RTA2 y las líneas mutadas RTA1+RTA2, cuando son expuestas con diferentes herbicidas de la familia de los inhibidores de la ACCasa FOP Quizalofop, Fluazifop y Propaquizafop. Respuesta del rendimiento tras la aplicación secuencial de 2 hojas y de quizalofop antes de la inundación.

FIG. 24 muestra el % de respuesta a la lesión y para los productos de la ACCasa RTA1, RTA2 y las líneas mutadas RTA1+RTA2, cuando se les expone con diferentes herbicidas de la familia de los inhibidores de la ACCasa FOP quizalofop, fluazifop y propaquizafop después de la secuenciación y la pre-inundación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

1. Resistencia/tolerancia sinérgica a los inhibidores de la ACCasa

El cribado de poblaciones mutagénicas internas en RiceTec, para los herbicidas FOP, permitió identificar dos regiones cromosómicas mutagénicas, RTA1 y RTA2, que conferían independientemente la tolerancia a estos herbicidas. Cada una de estas líneas tolerantes mutantes derivadas de forma independiente fue adelantada y evaluada después del cribado inicial, para caracterizar más estas nuevas variantes, evaluar su efecto de tolerancia, determinar la mutación o mutaciones causales responsables de los nuevos fenotipos y evaluar su potencial comercial. La realización de estos estudios requirió varias generaciones de avance poblacional y experimentación. Estos estudios incluyeron, como objetivos principales, el mapeo de enlace/QRI de marcadores de ADN del fenotipo para precisar la posición cromosómica; estudios de acción génica; estudios de dosis, momento de aplicación y herbicidas para evaluar la especificación y el valor del producto y también análisis de secuenciación del genoma completo/mapeo de mutaciones para caracterizar las mutaciones asociadas a estos fenotipos. También se llevaron a cabo otros estudios que incluían el apilamiento de estas dos mutaciones en fondos genéticos individuales para evaluar la interacción entre estos mutantes desarrollados de forma independiente y su potencial efecto antagónico o sinérgico en la tolerancia al herbicida FOP.

El gen de tolerancia mutado RTA1, fue encontrado para mapear exactamente a la ubicación del gen diana conocido para esta familia de herbicidas que interfieren con la biosíntesis de lípidos, el locus de la enzima Acetil CoA, en lo que claramente representa una ocurrencia de resistencia al sitio objetivo (TSR). En la TSR típicamente, el alelo mutado tiene una modificación que condiciona un cambio de aminoácido en la proteína expresada que interfiere, o bloquea, la interacción normal con el herbicida impidiendo, o limitando, la expresión de la fitotoxicidad. Más tarde se determinó que RTA1, mediante un análisis de mapeo de mutaciones, era una mutación puntual en el ADN del gen de la ACCasa por la que un nucleótido de guanina en el tipo salvaje se sustituye por una adenina en el mutante, lo que da lugar a un cambio de aminoácido (de G a S) en la proteína expresada en uno de los sitios de unión críticos en los que los herbicidas Acetil-coA y FOP interactúan para provocar la fitotoxicidad. Este cambio en un sitio de unión crítico en la enzima ACCasa (que se encuentra en los cloroplastos), redujo la afinidad al herbicida, evitando el bloqueo de la actividad de la ACCasa y la fitotoxicidad. Así, las plantas que llevan la mutación no mueren por el herbicida. La mutación fue identificada por la secuencia y coincide exactamente con mutaciones idénticas de tolerancia a FOP identificadas en posiciones homólogas en otros cultivos, para el mismo gen ACCasa.

En el caso de RTA2, la mutación o las mutaciones asociadas a la tolerancia se localizan en el cromosoma 1, tal y como muestran los análisis de enlace/QTL y el mapeo de secuencias-mutaciones. Dado que en esta región del arroz (cromosoma 1) no hay informes de genes duplicados u ortólogos de la ACCasa o genes similares a la ACCasa, gen diana de los herbicidas FOP, se asume que RTA2 representa un caso de resistencia en sitios no objetivo (NTSR).

Las realizaciones de líneas de arroz mutante designadas ML0831265-01493 (depósito ATCC PTA-12933, mutación G2096S, en adelante denominada "RTA1") y ML0831265-02283 (depósito ATCC PTA-13619 ("RTA2")) son resistentes/tolerantes a los inhibidores de la ACCasa por separado o en combinación. (Pat. de EE.UU. 9,370,149 B2).

Las tablas 1Ay 1B presentan la secuencia y la información genética para la región en RTA2 asociada con la resistencia a los herbicidas. Esta región en combinación con RTA1 (G2096S) confiere una resistencia sinérgica casi independiente al herbicida FOP. La superposición de los resultados obtenidos del mapeo del efecto de la tolerancia a los herbicidas y del mapeo fino de la recombinación F3-4, con el mapeo de mutaciones, identificó las 26 mutaciones antes mencionadas, que contrastan con las referencias de la secuencia de O. sativa (ssp indica), y de O. sativa (sspjaponica), como los factores causales putativos en la tolerancia a los herbicidas del sitio no objetivo de RTA2.

Un vector de mutaciones estrechamente vinculadas en el cromosoma 1 se asocia con la acción sinérgica que efectúa la tolerancia a los herbicidas cuando se combina con RTA1. La mutación RTA2 inicialmente se asignó a una mutación que causa un cambio de G a A en la secuencia codificadora de ácido nucleico del gen ZOS1-16 que codifica una proteína de dedo de zinc C2H2 de Oryza sativa en la posición del par de bases del arroz 3660202 en la región del cromosoma 1. Esta región, que se correlaciona con una respuesta sinérgica a los inhibidores de la ACCasa, no ha sido reportada antes en arroz tolerante a herbicidas. No se ha encontrado ningún informe sobre otra región del arroz en el cromosoma 1 que confiera resistencia al quizalofop. Cuando RTA2 está por sí mismo en el arroz, hay una mayor resistencia/tolerancia a los inhibidores de la ACCasa, pero la mutación funciona para causar resistencia/tolerancia a los inhibidores de la ACCasa mejor cuando se combina con el arroz que también expresa la mutación RTA1.

Debido a que los niveles específicos de tolerancia a los herbicidas de las plantas RTA1 y RTA2 por separado eran moderados o bajos, como se indicó anteriormente, se realizaron cruces entre las líneas mutantes RTA1 y RTA2 para producir una combinación apilada de ambos mecanismos y se buscaron posibles interacciones entre la novedosa combinación genética. El producto final apilado se obtuvo rápidamente mediante una simple selección asistida por marcadores (MAS) para el haplotipo resistente del cromosoma 1 utilizando los marcadores C1-3208396 y C1-36386713, y utilizando marcadores para el locus ACCAsa del cromosoma 5. Los experimentos de tasas de herbicida, momento de aplicación e ingrediente activo, realizados en la línea homocigota doble RTA1-RTA2 revelaron que existe un efecto sinérgico muy fuerte entre las dos variantes de tolerancia independientes, por lo que el mutante homocigota doble tolera en la ventana crítica temprana de la aplicación deseable (etapa de 2 hojas), una dosis máxima de 80 oz/acre, de Quizalofop sin fitotoxicidad, proporcionando efectivamente una tolerancia casi independiente de la dosis, mientras que la mayoría de los mutantes ACCasa inducidos o espontáneos reportados sólo toleran aplicaciones de dosis de campo.

El apilamiento de ambas mutaciones genéticas se ejemplifica con semillas depositadas en el ATCC PTA-122646 (RL-122546-8). Se observó una resistencia sinérgica al inhibidor de la ACCasa en el arroz con la mutación apilada.

La diferencia entre un "donante mutante apilado" y una "conversión" (Tabla 12) es que RTA1 y RTA2 se identifican independientemente de la misma población mutagenizada R0146. Con la intención de evaluar los posibles efectos sinérgicos entre los dos loci independientes, se cruzaron líneas homocigóticas RTA1 y RTA2 en el nivel F5, y se seleccionó la progenie F2 portadora de ambas mutaciones homocigóticas tolerantes a herbicidas para crear el donante doble RTA1-RTA2 apilado RL1225468 (PTA-122646).

El donante apilado RL1225468, al ser un cruce de líneas F5 derivadas de las poblaciones mutantes originales, lleva mutaciones aleatorias en todo el genoma. Con el fin de desarrollar un donante "limpio" que portara únicamente alelos R0146 de tipo salvaje en todo el genoma, excepto en el locus Chr5 ACCasa RTA1 y en el locus Chr1 RTA2, se llevó a cabo un programa de retrocruzamiento para transferir los alelos mutados a una línea R0146 convencional. La línea 16USGE40004-34, es una selección BC³ F³ del cruce original RL1225468/R0146, retrocruzado con R0146 tres veces, y archivado en ATCC bajo PTA-124233. El sinergismo estuvo presente en el uso de ambos fondos genéticos.

Es un resultado sorprendente e inesperado encontrar resistencia/tolerancia a los herbicidas efectuada por una combinación de una mutación en una enzima diana, divulgada en el presente documento RTA1, con mutaciones RTA2 en un NTSR. Según el análisis de la secuencia, el gen de la ACCasa se localiza en el cromosoma 5 del arroz. Una parte del gen está duplicada en el cromosoma 10, pero no hay ninguna parte del gen ACCasa en el cromosoma 1.

En comparación con la TSR, en la que el mecanismo de resistencia a los herbicidas está directamente asociado con la variación en la proteína/gen diana conocido, por lo que el metabolismo de la resistencia se infiere claramente, como en el caso de la RTA1, los mecanismos de la NTSR son mucho más difíciles de caracterizar y requieren amplios estudios de genes, de acción génica y de interacción génica.

Se postula que la NTSR para los herbicidas FOP, podría surgir de la aparición de mecanismos que desencadenan la resistencia metabólica como la compartimentación, el bloqueo del movimiento, la desintoxicación, el bloqueo de la activación u otras formas de prevención de la fitotoxicidad. Asimismo, estudios recientes han demostrado que los microARN (miARN) pueden estar implicados en los mecanismos de "regulación génica" que conducen a la NTSr . En general, los mecanismos de NTSR y la interacción molecular en la que interviene el herbicida son mecanismos más complejos que los encontrados en TSR.

Los posibles mecanismos que explican los efectos sinérgicos de las plantas que portan la mutación RTA1 y la región RTA2 incluyen la descomposición del herbicida mediante procesos bioquímicos (desintoxicación del herbicida), o la limitación de la translocación del herbicida al cloroplasto, (compartimentación) u otras funciones metabólicas que evitan que los herbicidas afecten a la enzima ACCasa. La desintoxicación del herbicida o la actuación indirecta como "regulador" en la activación de genes implicados en la protección celular como la citocromo P450 monooxigenasa, las glutatión transferasas, las acilamidiasas de arilo u otros, son mecanismos NTSR.

Hubo beneficios significativos en el apilamiento de la RTA1 y la mutación anteriormente "ACCasa Desconocida" (ahora llamada RTA2), debido al sinergismo en la resistencia/tolerancia del arroz con ambas mutaciones en su genoma.

Los beneficios de las dobles mutaciones se ilustran en las FIGs. 20, 21, 22, 23 y 24.

La tabla 7 enumera los criterios para categorizar el % de lesión en la planta asperjada (puesta en contacto) con un herbicida.

2. Identificación de la mutación causal de la tolerancia a los herbicidas ACCasa en la línea ML0831265-02283 (RTA2)

A menudo la tolerancia a los herbicidas ACCasa se deriva de una mutación en la región de la carboxil transferasa del gen ACCasa, como es el caso de la línea tolerante ML0831265-01493 (mutación G2096S o RTA1). Sin embargo, después de secuenciar la región de la carboxil transferasa del gen de la ACCasa en la línea ML0831265-02283 no se encontró ninguna mutación. Este resultado indica que la tolerancia en la línea ML0831265-02283 se deriva de un proceso de sitio no objetivo.

El hallazgo de la mutación causal para la tolerancia en la línea ML0831265-02283 implicó el mapeo de enlaces y el mapeo de mutaciones como ("mapeo mut") descrito para encontrar la mutación causal y la tolerancia nativa para la tolerancia a la HPPD en la línea ML0831266-03093.

El mapeo de ligamiento para encontrar la región cromosómica o QTL que causa la tolerancia en la línea ML0831265-02283 requiere una población que segregue para el rasgo. Esta población se hizo cruzando la línea tolerante con la línea de citoplasma estéril masculina A0109. La F1 obtenida de este cruce se cultivó y se dejó autopolinizar para obtener una población F2. La población F2 segregó para la tolerancia a la ACCasa. Se plantaron 800 semillas F2 y se recogió tejido foliar de las plántulas para permitir el genotipado de cada planta. Cuando las plántulas tenían tres semanas, toda la población F2 se asperjó con quizalfop (116 gmai/ha). Se evaluó la tolerancia de las plántulas diecinueve días después de la aplicación del herbicida. Se utilizó un software estándar de mapeo de QTL para analizar los genotipos de cada individuo F2 y la respuesta de tolerancia asociada para identificar marcadores moleculares vinculados a la tolerancia a los herbicidas. Tras este análisis se identificó una región genómica (QTL) para la tolerancia en el cromosoma uno (FIG. 9). Los marcadores vinculados que flanquean el QTL y los marcadores dentro del QTL que flanquean el pico del QTL fueron identificados como adecuados para seleccionar la tolerancia a los herbicidas derivada de la línea ML0831265-02283. Aproximadamente 250 genes se encuentran entre los marcadores de flanqueo.

La estrategia de mapeo de mutaciones para encontrar la mutación causal se empleó de la misma manera que se utilizó para encontrar el QTL para la tolerancia a la mutación HPPD. Se creó una población de mapeo de mutaciones para encontrar la mutación de tolerancia causal mediante la secuenciación genómica por secuenciación de próxima generación. La línea mutante ML0831265-02283 se cruzó con el progenitor original no mutante R0146. La progenie F1 del cruce se autofecundó para producir una población F2 que segrega la mutación causante de la tolerancia. Sólo las mutaciones se segregan en esta población porque las mutaciones son la única diferencia genómica entre ML0831265-02283 y R0146.

La población F2 se plantó como individuos, y se recogió tejido foliar y se extrajo ADN de cada individuo para utilizarlo en el genotipado después de fenotipar la población. El herbicida ACCasa quizalofop se aplicó a la población F2 en la fase de 3-4 hojas y a una concentración de 116 gmai/ha. Los individuos que sobrevivieron a la aplicación del herbicida fueron calificados como tolerantes y los que murieron fueron calificados como susceptibles.

El ADN derivado de un conjunto de veinte individuos F2 supervivientes y de veinte que murieron se agrupó y secuenció respectivamente junto con la línea mutante ML0831265-02283 y la línea parental no mutante R0146. El mapeo de la mutación causal se basó en un índice que accedía a la frecuencia de todas las mutaciones en la masa que representaba a los individuos supervivientes. El índice se obtuvo a partir de la proporción de lecturas de secuenciación que portaban una variación diferente de la línea parental no mutante R0146. Cuantas más lecturas de secuenciación tuvieran la variación, más se acercaría el índice a uno, y si todas las lecturas de secuenciación tuvieran la variación, el índice sería igual a uno.

El análisis de estos resultados mostró dos grupos que incluían 19 mutaciones de once mutaciones en el cromosoma uno con una puntuación de índice de uno (FIG. 10). Este resultado confirma los resultados del mapeo de enlaces QTL, ya que todas las mutaciones identificadas en el presente documento se encuentran dentro de la región QTL identificada en el cromosoma uno por el mapeo de enlaces. Se realizaron marcadores moleculares (SNP) para cada una de las mutaciones (Tabla 4). Estos marcadores se utilizaron en el mapeo fino para encontrar la mutación causal y para el cruzamiento de la tolerancia a la ACCasa derivada de la línea ML0831265-02283 en líneas comerciales de arroz.

Al igual que en los ensayos anteriores, el lesión observado en RTA1 RTA2 es muy bajo en todas las tasas, independientemente de la química del herbicida. FIG. 24 RTA1 mostró daños consistentes con estudios anteriores con tasas de daños por debajo del 10 % tanto con Quizalofop 1X como con Propaquizafop, y tasas de daños cercanas al 40 % con tasas de aplicación 2X, lo que es ligeramente inferior a la media de campo de 2015. También, como se ha observado anteriormente, las tasas de daños del Fluazifop fueron mucho menores que los de cualquiera de los otros herbicidas FOP. Los datos de rendimiento muestran una buena retención del rendimiento en RTA1 con las tasas de aplicación 1X y 2X de Quizalofop. Las mayores tasas de daños registrados en RTA1 con 2X de Quizalofop no parecen haber tenido un efecto negativo en el rendimiento. RTA1 RTA2 mostraron una reducción del rendimiento en las parcelas tratadas frente a las de control sin tratar, pero la química del herbicida o la tasa de aplicación sólo tuvieron un efecto mínimo sobre el rendimiento entre los tratamientos.

3. Mapeo de mutaciones para encontrar la mutación causante de la tolerancia a la HPPD

El análisis de mapeo de mutaciones, utilizando la secuencia del genoma de referencia de la japónica (cultivar Nipponbare) y de la índica (cultivar 93-11), identificó el mismo cromosoma 1 como asociado al novedoso fenotipo de tolerancia a FOP.

Se creó una población de mapeo de mutaciones para encontrar la mutación causal de tolerancia mediante la secuenciación genómica por secuenciación de próxima generación. La línea mutante ML0831266-03093 se cruzó con el progenitor original no mutante P1003. La progenie F1 del cruce se autofecundó para producir una población F2 que segregará la mutación causante de la tolerancia. Sólo las mutaciones se segregarán en esta población porque las mutaciones son la única diferencia genómica entre ML0831266-03093 y P1003.

La población F2 se plantó como individuos y se recogió tejido foliar y se extrajo ADN de cada individuo para utilizarlo en el genotipado después de que la población fuera fenotipada. Con este procedimiento, toda la población será portadora del gen de tolerancia nativo, lo que hará que la población sea tolerante hasta cierto nivel al herbicida mesotriona. Para diferenciar la tolerancia nativa de la mutación causante de la tolerancia se aplicó mesotriona a la población con una tasa elevada (840 gmai/ha), de modo que todos los individuos sin la mutación causante de la tolerancia murieron.

El ADN derivado de un conjunto de veinte individuos F2 supervivientes y de veinte que murieron se agrupó y secuenció respectivamente junto con la línea mutante ML0831266-03093 y la línea parental no mutante P1003. El mapeo de la mutación causal se basó en un índice que accedía a la frecuencia de todas las mutaciones en la masa que representaba a los individuos supervivientes. El índice se derivó a partir de la proporción de lecturas de secuenciación que portaban una variación diferente de la línea parental no mutante P1003. Cuantas más lecturas de secuenciación tuvieran la variación, más se acercaría el índice a uno, y si todas las lecturas de secuenciación tuvieran la variación, el índice sería igual a uno.

Se predijo una única mutación causante de la alta tolerancia a la mesotriona. En cambio, los datos mostraban un pico de mutaciones con una puntuación de 1 que introducía otro nivel de dificultad para encontrar la mutación causal. El resultado confirmó que el QTL en el cromosoma 1 encontrado a través del mapeo de enlace es la ubicación genómica de la mutación casual de tolerancia (FIG. 10). Dentro del pico de mutaciones hay siete mutaciones con un índice de uno, ninguna de las cuales es una causa evidente de tolerancia al herbicida mesotriona. Se desarrollaron marcadores para las mutaciones a fin de facilitar la búsqueda de la(s) mutación(es) de resistencia casual.

Se identificó un conjunto de líneas con puntos de recombinación distribuidos uniformemente dentro de los QTLs y mutaciones identificados (FIG. 11). Estas líneas se recuperaron en una condición homocigota para cada recombinación, lo que permitió el fenotipado de la tolerancia a los herbicidas en múltiples individuos (parcelas completas). El análisis de estas líneas permitió reducir la mutación de tolerancia y el gen nativo a una pequeña región del cromosoma.

A través de la estrategia descrita, las regiones genómicas específicas que contienen la mutación causal de la tolerancia y el gen nativo de la tolerancia son ahora conocidas y útiles para el desarrollo de productos comerciales. Los productos comerciales son útiles en la producción de arroz, ya que sobreviven a la aplicación del herbicida mesotriona en tasas que controlarán las malezas predominantes, incluido el arroz rojo, sin dañar el cultivo de arroz. La localización genómica específica permite el uso de marcadores moleculares en las regiones flanqueantes de cada QTL para seleccionar el rasgo de tolerancia al HPPD en el desarrollo de productos comerciales.

El mapeo genético de los tres grupos de individuos F2, incluyendo el conjunto de individuos asperjados con mesotriona a sólo 105 gm ai/ha, el conjunto seguido de una aplicación secuencial de 630 gm ai/ha, y el grupo final asperjado con 420 gm ai/ha, muestra dos genes que controlan la resistencia a la mesotriona. En la población asperjada con 105 gm de ai/ha un único QTL encontrado en el cromosoma 2 con fuerte vinculación al marcador SNP BG-id2004662 actuó de forma mayoritariamente dominante. Este marcador y QTL identifica la tolerancia inherente en la línea P1003. El marcador es útil para el cruzamiento y selección de nuevas líneas tolerantes a la mesotriona. El descubrimiento de este QTL facilita el desarrollo comercial de nuevas variedades de arroz con un nuevo procedimiento para controlar las malezas mediante el uso del herbicida mesotriona. El hallazgo del marcador vinculado BG-id2004662 es un hallazgo novedoso y una estrategia de selección para el cruzamiento y selección de la tolerancia a la mesotriona y otros herbicidas derivados de la línea P1003.

En los dos grupos de individuos F2 asperjados con las tasas más altas de mesotriona (420 y 630 gm ai/ha) se encontró un segundo q Tl con fuerte vinculación al marcador SNP WG-id1002788. Este QTL es la posición genética demostrada de la mutación causal para la alta tolerancia a la mesotriona. La tolerancia combinada del QTL desarrollado a través del cruzamiento por mutación en el cromosoma 1 y el QTL descubierto en la línea P1003 proporciona una nueva tolerancia a la mesotriona y, combinada con los marcadores moleculares vinculados, facilita el cruzamiento rápido y eficiente de nuevas variedades de arroz (FIG. 16).

4. Arroz resistente a los inhibidores de la ACCasa y la HPPD

Las realizaciones de arroz resistentes tanto a los inhibidores de la ACCasa como de la HPPD, incluyen el arroz designado PL121448M2-80048 (depósito ATCC PTA-121362) y PL 1214418M2-73009 (depósito ATCC PTA-121398). (Pat. de EE.UU. 9,303,270 B2).

5. Control de las malezas

Las líneas de arroz que tienen diferentes genes de resistencia a los herbicidas, ya sea en forma de pirámide o apiladas en el mismo fondo genético o, como productos individuales que se utilizan alternativamente en la rotación utilizada por el agricultor, representan una herramienta o estrategia crítica en la extensión de la vida útil de los herbicidas, ya que estas prácticas frenan el desarrollo de variantes resistentes a los herbicidas entre las malezas objetivo. Existen varios procedimientos para implantar estas resistencias en los híbridos o variedades para el control de las malezas, así como opciones para la producción de semillas híbridas. Las líneas de arroz descritas en el presente documento representan nuevos procedimientos para el control de las malezas en el arroz y pueden desplegarse en cualquiera de las muchas estrategias posibles para el control de las malezas y proporcionar el uso a largo plazo de estos y otros procedimientos de control de las malezas. En particular, se divulga el arroz mutante tolerante a los herbicidas inhibidores de la ACCasa o de la HPPD, y a los inhibidores tanto de la ACCasa como de la HPPD.

A través del desarrollo de fuentes de resistencia a múltiples herbicidas, incluyendo diferentes mutaciones que producen tolerancia a través de diferentes mecánicas a la misma clase de herbicida, hay más opciones disponibles para el control de las malezas en el arroz. Las líneas de arroz reivindicadas ofrecen la posibilidad de utilizar herbicidas con un nuevo modo de acción para el control de las malezas. Por ejemplo, la capacidad de utilizar un herbicida inhibidor de la ACCasa en combinación con un inhibidor de la HPPD, representa un modo de acción no reportado previamente en el arroz. El uso de estas líneas de arroz, incluyendo la combinación de líneas con resistencia al mismo herbicida, pero con otros modos de acción causal, proporciona nuevas opciones para el control de las malezas en los campos del productor, frenando así el desarrollo de la resistencia a las mismas. Existen varios procedimientos para desplegar esta resistencia en los híbridos para el control de las malezas, así como opciones para la producción de semillas híbridas, con diferentes mutaciones.

Un procedimiento para controlar el crecimiento de las malezas en las proximidades de las plantas de arroz resistentes/tolerantes a los herbicidas también está dentro del alcance de la divulgación. Un ejemplo de tales procedimientos es la aplicación de uno o más herbicidas a los campos de plantas de arroz a niveles de herbicida que normalmente inhibirían el crecimiento de una planta de arroz. Por ejemplo, al menos un herbicida inhibe la actividad de la HPPD.

Para maximizar el control de las malezas en un campo de arroz, pueden ser necesarios diferentes herbicidas para cubrir el espectro de las malezas presentes y, a su vez, pueden ser necesarias varias aplicaciones a lo largo del ciclo de cultivo para cualquier herbicida en particular, dependiendo del solapamiento entre la ventana de control eficaz proporcionada por una sola aplicación y la ventana de tiempo durante la cual su maleza objetivo puede germinar, que a menudo es más larga que la protección proporcionada por una sola aplicación de herbicida. La temperatura y las condiciones de humedad del suelo son factores clave que afectan tanto a la ventana de eficacia de los herbicidas como a la ventana del momento de germinación y crecimiento de las malezas. Basándose en estos factores, los modelos de control de herbicidas suelen incluir la aplicación repetida y secuencial durante el ciclo del cultivo.

En un sistema estándar de tolerancia a los herbicidas, por ejemplo, uno utilizado actualmente de forma comercial en el arroz, para la resistencia a los herbicidas de imidazolinona, la primera aplicación del herbicida se aplica en la fase de 2 hojas, con la segunda aplicación siguiente un mínimo de 10 días después justo antes del establecimiento de la inundación permanente cuando las plantas están brotando. El objetivo de la segunda aplicación es eliminar las malezas que puedan haber germinado después de la primera aplicación antes de que puedan ser suprimidas eficazmente por la inundación. En algunos rasgos, incluidos los herbicidas inhibidores de la ACCasa, el momento de las aplicaciones del herbicida puede ser crítico no sólo para el control eficaz de las malezas, sino también para el nivel de tolerancia observado en las propias plantas. En un rasgo que se está desarrollando en RiceTec, el lesión a la planta observado en respuesta a la aplicación de herbicidas, se alinea estrechamente con la etapa de la planta. En esta línea, las aplicaciones de post-emergencia muy tempranas causan un lesión mucho mayor en la etapa de 1 hoja, con un lesión observado que disminuye en cada etapa de crecimiento de la planta hasta el primer brote. Algunos rasgos de tolerancia a los herbicidas incluso no muestran tolerancia a las aplicaciones preemergentes aunque la tolerancia a la postemergencia sea excelente. Esta respuesta variable al herbicida ligada a la etapa de crecimiento de la planta requiere pruebas cuidadosas para establecer los límites de la utilización segura de un nuevo producto tolerante a herbicidas.

La producción de arroz para obtener buenos rendimientos requiere prácticas específicas de control de las malezas. Algunos herbicidas se aplican como preemergentes, después de la siembra pero antes de la emergencia del cultivo; otros como postemergentes. En el caso del arroz, la aplicación postemergente puede ser antes de que se inunden los cultivos, o después. Las aplicaciones preferidas suelen ser temporales, según la fase de desarrollo del cultivo, definida por el número de hojas abiertas en la planta en crecimiento. El momento de las aplicaciones de herbicidas es un factor importante, no sólo desde la perspectiva de maximizar la eficacia del control de las malezas, sino también desde la perspectiva de minimizar el impacto en el cultivo tolerante a los herbicidas. Esta consideración se deriva del hecho de que las resistencias a los herbicidas mutagénicos, naturales o transgénicos no suelen ser completamente independientes de los efectos de la dosis y el momento de la aplicación. Los diferentes genes de resistencia a los herbicidas tienen diferentes respuestas a la dosis, así como al momento de la aplicación, por lo que, normalmente, la fitotoxicidad en el cultivo resistente aumenta a medida que la dosis se incrementa más allá de un determinado nivel, o la fitotoxicidad para el cultivo resistente varía con los diferentes momentos de la aplicación para una determinada dosis de herbicida.

La evaluación de los novedosos genes de resistencia a los herbicidas, objeto de esta solicitud, se llevó a cabo con una gama de dosis de herbicida adecuadas que cubren las tasas de aplicación utilizadas normalmente para las operaciones de cultivo de arroz, teniendo en cuenta también las posibles desviaciones de las dosis recomendadas por el fabricante. Considerando la IX, la dosis recomendada por los fabricantes o la mejor práctica, las dosis adicionales más frecuentemente evaluadas son 2X y 4X con algunos experimentos que incluyen otros valores. En la Tabla 11 se ofrece una referencia a las dosis por productos y al contenido de ingredientes activos.

En el caso de la producción de arroz, el control ddel arroz rojo herboso, que es un objetivo de los herbicidas inhibidores de la ACCasa, y las malezas de hoja ancha dirigidas con el herbicida inhibidor de la HPPD mesotriona, se utilizan mejor durante las primeras etapas de crecimiento vegetativo, antes de la inundación, porque esta técnica en sí misma, en presencia de agua estancada, proporciona una supresión eficaz de las malezas, hasta la precosecha. Además, teniendo en cuenta que para estos herbicidas la fitotoxicidad para el cultivo resistente es mayor para las plántulas más jóvenes, coincidiendo con la ventana óptima de control, las evaluaciones de estos nuevos genes de resistencia a herbicidas incluyen la aplicación principalmente en la etapa de 2 hojas, y en la etapa de 4 hojas, con la inundación preferentemente en la etapa de 5-6 hojas.

6. Combinación de herbicidas

Al considerar combinaciones de diferentes genes de resistencia a herbicidas, independientemente de si la combinación incluye dos o más modos de acción diferentes para el mismo herbicida, o dos o más genes para herbicidas de diferentes familias o funciones, pueden observarse interacciones antagónicas o sinérgicas resultantes de las interacciones entre genes, como se ha puesto de manifiesto en algunas de las realizaciones descritas en el presente documento. La combinación de los novedosos genes mutados resistentes a los herbicidas inhibidores de la ACCasa RTA1 y RTA2, dan como resultado una tolerancia a los herbicidas que es muy superior a la resistencia aditiva de los dos genes actuando individualmente, demostrando sinergismo. La tolerancia a los herbicidas es el resultado de dos mecanismos de acción que confieren resistencia al mismo herbicida.

Además, al considerar una combinación de diferentes genes de resistencia a herbicidas, cada uno específico para una familia de herbicidas diferente, con la expectativa de que esta combinación permitiría mezclar los herbicidas en el tanque del aspersor, lo que a su vez reduce las pasadas de la máquina sobre el cultivo, pueden producirse interacciones sinérgicas o antagónicas entre los productos herbicidas, como también se evidencia en algunas de las realizaciones descritas en el presente documento. La resistencia conferida a las plantas de arroz por el gen G2096S, cuando son expuestas por herbicidas de la familia de los inhibidores de la ACCasa, es significativamente mayor que la mostrada por una planta de arroz que lleva tanto el gen RTA1, como los genes HPPD1i HPPD2ni que confieren resistencia al herbicida inhibidor de la HPPD mesotriona. Si la planta es expuesta con una mezcla en tanque que contenía la misma dosis de herbicida inhibidor de la ACCasa combinada con una dosis de trabajo equivalente de mesotriona. Cuando los diferentes herbicidas se aplican individualmente, en cualquier orden, y se deja un tiempo entre las aplicaciones, la respuesta a los herbicidas es similar a la observada en las líneas que llevan los respectivos genes individuales. Estos efectos demuestran una interacción antagónica entre las formulaciones, cuando los dos herbicidas se combinan en el tanque para la aplicación al cultivo. Esta observación se hizo al combinar quizalofop con mesotriona.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

Establecimiento de la población de mutaciones

Se inició un programa de cruzamiento por mutación para desarrollar líneas propias resistentes/tolerantes a los herbicidas. Se creó una población mutante permanente exponiendo aproximadamente 10.000 semillas (estimadas por el peso medio de un grano) de tres líneas de arroz, incluyendo P1003, R0146 y P1062, a los mutágenos azida sódica (AZ) y metil-nitrosourea (MNU). Las semillas tratadas se plantaron. Se cosecharon plantas individuales creando 8.281 líneas potencialmente mutantes. Las líneas se han mantenido en confianza como una población mutante permanente para el cribado de rasgos.

La línea restauradora de tipo índica R0146, que mostraba la adaptación a las condiciones de cultivo de los Estados Unidos, se incorporó al Programa de Cruzamiento de RiceTec y se cruzó con otras 4 líneas R restauradoras del RiceTec para iniciar las poblaciones necesarias para la evaluación. De origen diferente al de las líneas R de RiceTec activas en ese momento, se esperaba que la R0146 aportara nuevos genes de restauración al fondo genético de RiceTec. Al mostrar una excelente adaptación, tipo, productividad y capacidad de restauración, el uso de R0146 y sus selecciones tempranas se incrementó de forma constante dentro del Programa de Cruzamiento del RiceTec de Estados Unidos. A medida que el R0146 y sus selecciones aumentaron su importancia en el proceso de cruzamiento de los Estados Unidos, su utilización también se extendió a los programas de cruzamiento de RiceTec Sudamérica, donde también mostraron un rendimiento excepcional. R0146 fue la línea de restauradores que destacó por tener la más amplia adaptabilidad en todos los lugares de prueba, y la más alta aptitud de combinación con diversas líneas femeninas, y que produjo consistentemente una combinación híbrida de alto rendimiento. Se decidió utilizar la R0146 como la única línea restauradora que se sometería a mutagénesis para descubrir rasgos de tolerancia a los herbicidas. Ninguna otra línea tenía en ese momento ese nivel de penetración en la línea de cruzamiento de RiceTec, lo que situaba a la R0146 como la mejor candidata para la utilización rápida y amplia de los nuevos genes buscados en el esfuerzo de mutagénesis.

Mayor tolerancia/resistencia a los inhibidores de la ACCasa

Validación de la línea mutante ML0831265-02283 para la tolerancia a los herbicidas ACCasa.

Tras el cribado de una gran población de mutantes, la línea ML0831265-02283 también sobrevivió a la aplicación del herbicida quizalofop de la ACCasa. La línea se incrementó para obtener suficiente semilla para ensayos más grandes para evaluar su tolerancia a los herbicidas ACCasa. La tolerancia a los herbicidas ACCasa en la línea ML0831265-02283 se validó plantando en las parcelas de campo (5 pies por 10 pies) de la línea, la línea parental no mutante R0146, una segunda línea no mutante P1003, y la línea tolerante a ACCasa ML0831265-01493. El herbicida quizalofop de la ACCasa se aplicó en la fase de cuatro hojas en múltiplos de 0,5x, 1x, 2x y 4x de la tasa etiquetada (77 gmai/ha). Veintiún días después de la aplicación del herbicida, se evaluó el porcentaje de daños causados al arroz en comparación con las parcelas de control a las que no se aplicó el herbicida (FIG. 6). Los datos confirman la tolerancia de la línea ML0831265-02283 e incluso puede ser más tolerante que la línea ML0831265-01493, como lo demuestra el hecho de que se produzcan menos daños con las tasas 2x y 4x de quizalofop.

Desarrollo de tolerancia a herbicidas inhibidores de HPPD y ACCasa mediante la combinación de las tolerancias en las líneas ML0831266-03093 y ML0831265-01493

Los herbicidas que se dirigen a la enzima HPPD, controlan principalmente las malezas de hoja ancha. Sin embargo, los ensayos en arroz muestran un control predominante de las malezas en el arroz, incluido el arroz rojo arroz rojo herboso, especialmente con el herbicida mesotriona.

Por otro lado, el objetivo principal de los herbicidas ACCasa son las plantas monocotiledóneas, incluyendo el arroz, las malewzas de pasto y el arroz rojo. Sin embargo, algunos herbicidas ACCasa tienen una actividad menor en el arroz. Es probable que esta debilidad se transfiera al arroz rojo, ya que las plantas están muy relacionadas. La combinación de la tolerancia a la HPPD y la tolerancia a la ACCasa en una sola línea de arroz permite una estrategia de control de malezas de amplio espectro para el arroz. El herbicida HPPD controla las malezas de hoja ancha y potencia el efecto de los herbicidas ACCasa para el control de las malezas monocotiledóneas, incluido el arroz rojo.

La combinación de la tolerancia a HPPD con la tolerancia a ACCasa en una sola línea de arroz se inició con el proyecto de mapeo de la tolerancia a HPPD cruzando la línea tolerante a HPPD ML0831266-03093 con la línea tolerante a ACCasa ML0831265-01493. En el mapeo de las plantas de la población F2 se seleccionó la tolerancia a1HPPD aplicando primero mesotriona a una tasa baja (105 gmai/ha) y luego una tasa alta (630 gmai/ha). En este proceso también se desarrollaron marcadores moleculares que permitirán la futura selección de la tolerancia a la HPPD mediante marcadores o el cribado de la tolerancia a los herbicidas, o ambos.

Después de identificar las plantas que eran tolerantes al herbicida HPPD mesotriona, también se probaron con el marcador funcional de tolerancia a la ACCasa para la mutación RTA1 en la línea parental donante de ACCasa ML0831265-01493. La información para desarrollar los marcadores ACCasa RTA1 se encuentra en las FIGs. 13, 14.

Después de este proceso, se identificó un conjunto de 25 plantas F2 con la mutación ACCasa a la resistencia a los herbicidas, y la resistencia genética a los herbicidas HPPD en el cromosoma 1 y el cromosoma 2, al menos en la condición heterocigota. Las plantas se trasplantaron a otro campo para cosecharlas en su madurez. De las 25 plantas, ocho eran homocigóticas para la mutación de la ACCasa y una planta era homocigótica para la mutación de la ACCasa, la mutación de tolerancia a la HPPD y el gen de tolerancia no inducida. Las 25 plantas se embolsaron en el momento de la floración y la semilla se cosechó en la madurez de cada planta individualmente.

Se cosechó un grupo de plantas de maduración temprana lo antes posible y se plantaron las semillas en el invernadero para ayudar a avanzar rápidamente a la generación F4. Las selecciones en las plantas F3 se realizaron mediante marcadores moleculares que flanquean la mutación de tolerancia a la HPPD y la tolerancia nativa la mutación funcional de la ACCasa. Las plantas homocigotas para todas las regiones genómicas seleccionadas pasaron a la generación F5. Se confirmó que la semilla F5 portaba tolerancia a los herbicidas ACCasa y al herbicida HPPD mesotriona. Entre las líneas F5 se seleccionó la PL1214418M2-80048 por su alto rendimiento de semilla y por ser homocigota para la mutación de tolerancia a la ACCasa en la posición RTA1, la mutación de tolerancia a la HPPD y el gen nativo de tolerancia a la HPPD. La semilla de la línea PL1214418M2-80048 se depositó en el ATCC con el número de depósito PTA-121362 (véase la Tabla 12).

Se desarrolló una segunda línea plantando semillas F3 en hileras. Las plantas se asperjaron con el herbicida HPPD mesotriona y se seleccionaron para que tuvieran poco o ningún lesión en comparación con los controles no asperjados. También se recogió tejido foliar y se analizó la herencia de la mutación RTA1 de tolerancia a la ACCasa, la tolerancia a la mutación HPPD y la tolerancia no inducida a la HPPD. Se identificaron y cosecharon plantas homocigotas para los tres genes de tolerancia o QTLs. La semilla F4 (PL1214418M2-73009) se agrupó a partir de plantas portadoras de los tres genes de tolerancia o QTLs y se utilizó para probar o como nueva línea donante de tolerancia a los herbicidas ACCasa y HPPD. La semilla de la fuente PL1214418M2-73009 se depositó en el ATCC y se le dio el número de depósito PTA-121398 (véase la Tabla 5).

La tolerancia de las nuevas líneas que combinan HPPD y ACCasa es equivalente y seleccionable en las poblaciones de cruzamiento

La fuente de semillas PL1214418M2-73009 se desarrolló a partir de un cruce entre la línea resistente a la HPPD ML0831266-03093 y la línea resistente a la ACCasa ML0831265-01493 y fue suficiente para permitir las pruebas para verificar la tolerancia equivalente a los inhibidores de la HPPD y la ACCasa en las nuevas líneas. Se realizaron dos ensayos para medir la recuperación de la tolerancia a los herbicidas ACCasa y HPPD en la nueva línea PL1214418M2-73009. La recuperación de la tolerancia en la línea que combina los dos rasgos ilustrará que los rasgos son heredables y pueden utilizarse para producir nuevas variedades e híbridos portadores de resistencia a los herbicidas. Estos ensayos son importantes ya que a menudo es difícil recuperar QTLs complejos para rasgos cuantitativos o, en algunos casos, la respuesta de un rasgo depende de los antecedentes genéticos. En el primer ensayo se evaluó la resistencia de las líneas a la mesotriona (herbicida HPPD) plantando la línea PL1214418M2-73009, la línea resistente a HPPD ML0831266-03093 y las líneas de arroz de tipo silvestre P1003 y R0146 en parcelas (5 pies x 10 pies). La mesotriona se aplicó en múltiplos de 0,5x, 1x, 2x y 4x de la dosis de aplicación etiquetada (210 gmai/ha). Se incluyeron dos tratamientos adicionales con una tasa de 1xy 2x, seguidos de una segunda aplicación 14 días después con las mismas tasas. La recuperación total de la resistencia al HPPD de la línea ML0831266-03093 se logró en la línea PL1214418M2-73009, ya que ésta y la línea de rasgo original tuvieron la misma respuesta a las aplicaciones de herbicidas (FIG. 1). Estos resultados demuestran que el rasgo de resistencia a la HPPD puede ser criado y seleccionado para desarrollar productos comerciales.

Se realizó otro ensayo para confirmar la recuperación de la resistencia al inhibidor de la ACCasa a partir de la mutación RTA1 como en la línea ML0831265-01493. En este ensayo, la nueva línea PL1214418-73009 con tolerancia combinada a HPPD y ACCasa se plantó en una hilera junto con otras líneas diversas, incluyendo la línea donante original ML0831265-01493 (plantada en una parcela), ML0831266-03093, P1003, R0146 línea madre para la tolerancia a ACCasa. Todas las líneas se probaron con los herbicidas ACCasa fluazifop a 0,5x, 1*, 2* y 4* múltiplos de la tasa de aplicación de la etiqueta (210 gmai/ha) y quizalofop a 0,5*, 1*, 2* y 4* múltiplos de la tasa de aplicación de la etiqueta (77 gmai/ha). En estos ensayos, las tres nuevas líneas que heredaron la tolerancia a la ACCasa mostraron una tolerancia a los herbicidas ACCasa equivalente a la de la línea donante ML0831265-01493 (FIG. 2).

La tolerancia a los herbicidas HPPD es más compleja que la tolerancia a la ACCasa porque requiere dos genes diferentes del gen al que se dirige el herbicida. A pesar de esta mayor complejidad, se recuperó la tolerancia equivalente a través de la selección tanto del gen de la tolerancia nativa como de la tolerancia a la mutación. La línea parental de ACCasa ML0831265-01493 en este cruce fue altamente sensible al herbicida HPPD mesotriona y por lo tanto no se esperaba que contribuyera a la tolerancia a HPPD. Es probable que la resistencia/tolerancia a los herbicidas HPPD se deba principalmente a estos dos genes, ya que en ellos se centró el proceso de selección, y la nueva línea PL1214418M2-73009 muestra una resistencia equivalente. Estos resultados demuestran que la resistencia a los inhibidores de la ACCasa y la HPPD es hereditaria y puede ser criada en cualquier arroz para el desarrollo comercial de la resistencia a los inhibidores de la HPPD y la ACCasa en el arroz.

Identificación de la contribución a la tolerancia de la mutación de tolerancia HPPD y del gen de tolerancia no inducido de P1003

Durante el proceso de cruzamiento para desarrollar nuevas líneas (PL1214418M2-80048 y PL1214418M2-73009) con resistencia/tolerancia a los herbicidas HPPD y ACCasa, también se investigaron otras dos líneas para determinar la contribución de la mutación de tolerancia a HPPD y del gen nativo de tolerancia a HPPD. La línea PL1214418M2-73001 es portadora de la tolerancia a la ACCasa y sólo de la tolerancia a la HPPD, mientras que la mutación PL1214418M2-73013 es portadora de la tolerancia a la ACCasa y sólo del gen de la tolerancia nativa a la HPPD. Estas selecciones permiten estimar el efecto de tolerancia de cada uno de los dos genes necesarios para la tolerancia a los herbicidas HPPD. El efecto de la tolerancia de cada gen se midió cultivando las líneas en hileras individuales, incluyendo la línea recientemente desarrollada PL1214418M2-73009 que lleva tanto la tolerancia a HPPD de la mutación como la tolerancia no inducida, la línea tolerante a HPPD ML0831266-0309, y la línea parental no inducida P1003. Las parcelas de campo se asperjaron en la fase de 4 hojas con el herbicida HPPd mesotriona en múltiplos de 0,5x, 1x, 2x y 4x de la tasa de aplicación etiquetada de 210 gmai/ha.

Las parcelas se evaluaron 4 semanas después de la aplicación del herbicida. Los resultados mostraron que el gen nativo de tolerancia solo (PL1214418M2-73013) dio niveles de tolerancia similares a la línea madre PI003 (FIG. 4). Este resultado se esperaría si el gen de tolerancia nativo localizado en el cromosoma 2 situado dentro de los marcadores que flanquean el QTL es la única fuente causante de tolerancia en la línea no mutante P1003. La línea PL1214418M2-73001, que sólo porta la mutación HPPD localizada en el cromosoma 1 dentro de los marcadores que flanquean el QTL, muestra una tolerancia intermedia entre la línea no mutante P1003 y la línea mutante HPPD ML0831266-0309. Este resultado demuestra que la mutación HPPD no sólo proporciona una mayor tolerancia, sino también un mayor nivel de tolerancia que el gen de tolerancia nativo. Además, también sugiere que la mutación HPPD funciona independientemente del gen de tolerancia nativo HPPD. Los dos genes también parecen funcionar de forma aditiva, ya que sólo combinando los dos en la nueva línea PL1214418M2-73009 el nivel de tolerancia es equivalente al de la línea mutante original ML0831266-0309.

Control de las malezas y del arroz rojo en los cultivos de arroz con inhibidores de la ACCasa e inhibidores de la HPPD

La actividad del herbicida o la capacidad de controlar el arroz no mutante, como la línea R0146 y P1003, es un buen indicador de la eficacia de los herbicidas para controlar el arroz rojo o el arroz herboso salvaje en un cultivo de arroz. El arroz rojo y el arroz herboso salvaje son muy similares al arroz, incluso con la capacidad de cruzarse con el arroz. Esta similitud es la razón por la que estas malezas son tan difíciles de controlar en un cultivo de arroz. Las líneas mutantes (ML0831265-01493, ML0831265-02283, ML0831266-03093, PL1214418M2-80048 y PL1214418M2-73009) divulgadas ofrecen una nueva estrategia de control de malezas para el arroz rojo, el arroz herboso salvaje y otras malezas comunes en los cultivos de arroz. Estas líneas dan al arroz tolerancia a los herbicidas que normalmente matan o causan daños en el rendimiento del cultivo de arroz.

Mientras se probaban las líneas tolerantes, también se probaron las líneas parentales para que sirvieran de control y como indicación del potencial comercial como estrategia de control del arroz rojo/arroz herboso salvaje. Estos ensayos demostraron que los tratamientos selectos de los herbicidas aplicados solos o en diversas combinaciones y momentos de aplicación ofrecen una nueva estrategia de control de las malezas en los cultivos de arroz.

El arroz es tolerante a ciertos herbicidas inhibidores de la ACCasa, por ejemplo el cyhalofop está registrado para su uso en el arroz. Sin embargo, otros herbicidas de la ACCasa matan o dañan gravemente el arroz en diversos grados. Tras las pruebas, se comprobó que varios de estos otros herbicidas, incluidos el fluazifop y el quizalofop, ofrecen un buen control de las malezas comunes, como la hierba de los corrales, en el arroz. El control de las malezas comunes en el arroz también se logró con mesotriona sola, especialmente cuando se aplicó antes de la siembra o en tasas más altas (2 veces la tasa etiquetada de 210 gmai/ha) (FIGs. 5A y FIG. 5B). Las tasas aplicadas de ambos tipos de herbicidas que dan el control de las malezas están bien dentro del nivel de tolerancia de las respectivas líneas tolerantes a ACCasa y HPPD, incluyendo las líneas combinadas que tienen tolerancia a los herbicidas HPPD y ACCasa.

El desarrollo de la tolerancia a HPPD y ACCasa en líneas individuales (PL1214418M2-80048 y PL1214418M2-73009) da la oportunidad de una estrategia adicional de control de malezas que implica aplicaciones de herbicidas ACCasa y HPPD en una mezcla en tanque o individualmente en diferentes momentos. La muy eficaz aplicación previa a la plantación del herbicida HPPD mesotriona puede seguirse ahora con herbicidas ACCasa aplicados solos o en combinación con herbicidas HPPD. Esta estrategia proporciona un control completo de las malezas en un cultivo de arroz mediante el control de las malezas de hoja ancha que proporciona el herbicida HPPD, y el control de las malezas de la hierba mediante el herbicida ACCasa. Además, el control de las hierbas y el arroz rojo/arroz herboso por parte de los herbicidas ACCasa se ve muy reforzado por la actividad que proporciona el herbicida inhibidor de HPPD. Se prevé que esta estrategia sea especialmente eficaz para el control del arroz rojo cuando se utilicen herbicidas inhibidores de la ACCasa que tengan una menor actividad sobre el arroz.

Este sistema particular de control de malezas es muy útil en los cultivos de arroz debido a que algunas malezas, incluyendo el arroz rojo, desarrollan tolerancia a los herbicidas utilizados actualmente. El uso de esta estrategia de control de malezas permite la rotación de diferentes modos de acción de los herbicidas en los cultivos de arroz. Al rotar los diferentes modos de acción de los herbicidas, se retrasa o se evita el desarrollo de malezas resistentes, lo que permite el uso a largo plazo de todos los procedimientos de control de malezas disponibles.

Validación de la línea mutante ML0831266-03093 para la tolerancia a los herbicidas inhibidores de la HPPD

Tras el cribado inicial de la "población de mutaciones", se seleccionaron las líneas sin daños y se probaron en experimentos adicionales utilizando diferentes tasas de herbicida. En particular, se realizó un experimento de respuesta a la tasa en el que se aplicaron dos tasas diferentes de mesotriona en preemergencia, además de una aplicación foliar adicional. Este experimento diferenció una línea mutante que tenía una resistencia superior (menos lesión) al herbicida mesotriona en comparación con el control (FIGs. 12Ay FIG. 12B). La progenie de esta designada como ML0831266-03093 se mantiene como una nueva línea portadora de resistencia al herbicida mesotriona. La línea (ML0831266-03093) es una fuente de resistencia que se retrocruzó en líneas de arroz propias o se utilizó directamente en el cruzamiento para desarrollar nuevas líneas de arroz propias. Las líneas desarrolladas son una fuente de resistencia a los herbicidas para su uso en el desarrollo de nuevos híbridos que ofrecen un modo de acción alternativo para controlar las malezas en el arroz. Ofrecer esta oportunidad a los cultivadores es de gran valor tanto para obtener altos rendimientos como para prolongar la vida útil de las tecnologías disponibles para el control de las malezas.

Se encontró que la línea mutante ML0831266-03093 es tolerante a la mesotriona (un herbicida común que inhibe la HPPD) mediante el cribado de la línea con diferentes tasas del herbicida. El nivel de tolerancia del ML0831266-03093 resultó ser mucho mayor que el de la línea original no mutante (nativa) P1003.

La línea original P1003, lleva la tolerancia natural a la mesotriona. Esta resistencia no inducida de la línea original a veces enmascaraba la resistencia de la línea mutante haciendo que la resistencia mejorada de la línea mutante ML0831266-03093 no fuera evidente.

La validación adicional del rasgo implicó el ensayo de la línea mutante ML0831266-03093 en presencia de malezas comunes del arroz. La línea mutante fue completamente tolerante a las tasas de mesotriona aplicadas, mientras que la población de malezas predominante fue bien controlada por el herbicida (FIGs. 6A y FIG. 6B). Este nivel de control de las malezas fue totalmente inesperado, ya que la mesotriona está indicada para el control de las malezas de hoja ancha en los cultivos de monocotiledóneas. Este resultado indica que la mesotriona y otros herbicidas inhibidores de HPPD en combinación con la línea ML0831266-03093 y líneas derivadas, representan un nuevo sistema de control de malezas en el arroz. La elevada actividad de la mesotriona sobre las malezas de la hierba y ciertos tipos de arroz indica que el sistema podría utilizarse para controlar el arroz rojo en un cultivo de arroz.

La mesotriona y otros herbicidas inhibidores de la HPPD se dirigen al gen HPPD. El aumento de la tolerancia a los herbicidas podría conseguirse mediante una mutación en el gen HPPD. Una mutación dentro de la secuencia del gen puede alterar la estructura de la enzima lo suficiente como para impedir que sea inhibida por el herbicida, pero permitiendo que siga desempeñando su función fisiológica normal. Asumiendo esto como un mecanismo de tolerancia plausible, el gen HPPD fue secuenciado por Sanger tanto en la línea mutante ML0831266-03093 como en la línea original P1003. Sorprendentemente, no se encontró ninguna mutación en el gen HPPD. La tolerancia al herbicida en la línea ML0831266-03093 parece derivarse de un proceso que no es el sitio objetivo.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Localización de la mutación denominada RTA2 asociada con la tolerancia a los inhibidores de la ACCasa

Una población de MutMap fueron plantas F2 de un cruce entre la línea de arroz R0146 X ML-083126502283F2. Las fotos se tomaron 16 días después de la aspersión del herbicida.

El herbicida Quizalofop fue asperjado en los campos de prueba. Treinta días después de la aspersión del herbicida, las plantas mostraron una clara "respuesta en blanco y negro" al herbicida [mostraron o bien resistencia al herbicida (puntuación 1 o 3) o bien susceptibilidad (puntuación 7 o 9) 16 días después de la aspersión del herbicida. Las plantas se puntuaron primero a los 16 días de la aspersión del herbicida y luego a los 21 días de la misma.

Las plantas mutantes que portaban la "mutación desconocida RTA2" eran resistentes. las plantas de 3 semanas de edad fueron rociadas con Quizalofop y la respuesta al herbicida se calificó 21 días después de la aspersión. Los síntomas susceptibles se observaron ya 7 días después de la aspersión de Quizalofop, pero la puntuación se hizo a los 21 días. En el día 21, la mayoría de las plantas mostraron respuestas muy claras "en blanco y negro" al herbicida, es decir, mostraron resistencia al herbicida (puntuación 1) o estaban completamente muertas (puntuación 9). Pocas plantas obtuvieron una puntuación de 3 (se observan pocos daños en las hojas o el crecimiento de nuevas hojas, y lo más probable es que las plantas sobrevivan) o una puntuación de 5 (la mitad de la copa está dañada y es difícil predecir si las plantas sobrevivirán o no), o una puntuación de 7 (más daños en las hojas, las plantas no sobrevivirán).

Tras la detección de mutantes resistentes a la ACCasa en la población de arroz R0146, se utilizó el enfoque MutMap para caracterizar mediante análisis de vinculación la(s) mutación(es) asociada(s) al fenotipo de resistencia al Quizalofop.

El proceso de MutMap: La mutagénesis es un cultivar de arroz con una secuencia genómica de referencia por medio de sulfonato de etilmetano (EMS). El mutante generado, en este caso un fenotipo semi-enano, se cruzó con una planta de tipo salvaje del mismo cultivar antes de la mutagénesis. La F1 resultante se autopolinizó para obtener una progenie F2 que segregara los fenotipos mutante y salvaje. El cruce del mutante con la línea parental de tipo salvaje garantizó la detección de diferencias fenotípicas en la generación F2 entre el mutante y el tipo salvaje. El ADN de las plantas F2 que mostraban el fenotipo mutante se agrupó y se sometió a la secuenciación del genoma completo, seguida de la alineación con la secuencia de referencia. Los SNP con lecturas de secuencias compuestas únicamente por secuencias mutantes (índice SNP de 1) están supuestamente vinculados al SNP causal del fenotipo mutante.

La indicación más fuerte de mutaciones putativas asociadas con la resistencia a los inhibidores de la ACCasa se observó en el cromosoma 1, con una cadena de mutaciones secuenciales con el mayor índice de SNP.

La región casual se localizó en una región del cromosoma 1 identificada en la FIG. 18 y las Tablas 1A, 1B y 2.

Ejemplo 2: Producción de arroz híbrido con baja dosis de resistencia a una familia de herbicidas inhibidores de la ACCasa, los FOP, mediante la adición de un único gen de resistencia en una sola dosis alélica.

La resistencia al herbicida inhibidor de ACCasas proporcionada por el ML0831265-01493 se despliega individualmente en los híbridos a través del progenitor masculino o femenino, lo que da lugar a que la semilla híbrida sea resistente al herbicida. Si la resistencia se despliega sólo en el progenitor masculino, entonces, además de su uso para el control de las malezas, el herbicida, cuando se aplica a la semilla híbrida, mata la semilla femenina autofecundada contaminante. Por otro lado, si la resistencia se despliega sólo a través del progenitor femenino, los cultivadores pueden eliminar la semilla masculina autofecundada contaminante. La eficacia de este enfoque depende de la acción del gen resistente a los herbicidas, por lo que la presencia de un solo alelo debe seguir confiriendo tolerancia a los herbicidas para ser viable.

Los cultivadores pueden alternar el tipo de resistencia que compran y aplican en sus campos para reducir la posibilidad de que las malezas desarrollen resistencia al herbicida. El herbicida inhibidor de la ACCasa, aunque principalmente para el control de las malezas de hoja ancha, también permite un mayor control del arroz rojo. A mayores tasas, matará ciertos tipos de arroz. Si la resistencia surgiera en el arroz rojo a partir de la polinización cruzada, aún podría controlarse con una clase diferente de herbicida en la siguiente temporada.

Ejemplo 3: Producción de arroz híbrido con baja dosis de resistencia a un herbicida inhibidor de HPPD mediante la adición de un único gen de resistencia en una sola dosis alélica.

La resistencia al herbicida inhibidor de la HPPD proporcionada por el ML0831266-03093 se despliega individualmente en los híbridos a través del progenitor masculino o femenino, lo que hace que la semilla híbrida sea resistente al herbicida. Si la resistencia se despliega sólo en el progenitor masculino, entonces, además de su uso para el control de las malezas, el herbicida, cuando se aplica a la semilla híbrida, mata la semilla femenina autofecundada contaminante. Por otro lado, si la resistencia se despliega sólo a través del progenitor femenino, los cultivadores pueden eliminar la semilla masculina autofecundada contaminante. La eficacia de este enfoque depende de la acción del gen resistente a los herbicidas, por lo que la presencia de un solo alelo debe seguir confiriendo tolerancia a los herbicidas para ser viable.

Los cultivadores pueden alternar el tipo de resistencia que compran y aplican en sus campos para reducir la posibilidad de que las malezas desarrollen resistencia al herbicida. El herbicida inhibidor de la HPPD, aunque principalmente para el control de las malezas de hoja ancha, también permite un mayor control del arroz rojo. A mayores tasas, matará ciertos tipos de arroz. Si la resistencia surgiera en el arroz rojo a partir de la polinización cruzada, aún podría controlarse con una clase diferente de herbicida en la siguiente temporada.

Ejemplo 4: Producción de arroz híbrido con mayor nivel de resistencia a los herbicidas inhibidores de la HPPD o de la ACCasa mediante la adición de un único gen de resistencia en dosis alélicas dobles.

La resistencia a los herbicidas inhibidores de la HPPD proporcionada por el documento ML0831266-03093 o las ACCasas inhibidoras de la resistencia a los herbicidas proporcionadas por el documento ML0831265-01493 se despliegan en los progenitores masculinos y femeninos de un híbrido. La semilla híbrida resultante puede ser resistente a la mesotriona y a otros herbicidas inhibidores de la HPPD, o a los herbicidas inhibidores de la ACCasa. La resistencia proporcionada de esta manera es más fuerte y ofrece un mejor control de las malezas gracias a la posibilidad de poder aplicar mayores tasas de herbicida.

Ejemplo 5: Producción de arroz híbrido resistente a múltiples genes de resistencia independientes para un único herbicida o familia de herbicidas

Dos o más genes independientes que confieren resistencia a un herbicida o a una familia o grupo de herbicidas, se despliegan en un solo híbrido añadiendo cada uno por separado a uno o a ambos progenitores de1Híbrido. Dependiendo de la acción génica de los genes que se apilen en el híbrido, pueden ser introgresados en un solo parental, resultando en una dosis alélica única en el híbrido comercial, o pueden ser añadidos tanto a las líneas parentales femeninas como a las masculinas, resultando en una dosis alélica doble y homocigótica en el híbrido comercial para ese locus. El despliegue de esta manera da como resultado una semilla híbrida que tiene una mayor resistencia a los herbicidas que un híbrido que lleva un solo gen resistente bajo una dosificación alélica idéntica, debido al efecto de complementación proporcionado por los diferentes genes de resistencia. El apilamiento del gen mutado HPPDi con los alelos HPPDni en la línea ML0831266-03093 representa un caso de este tipo en el que diferentes loci/alelos de resistencia independientes para la tolerancia al herbicida inhibidor de HPPD se combinan para producir un producto de mayor resistencia que la conferida por cualquiera de los genes individuales. De manera similar, el apilamiento de ACCasa de RTA1+RTA2, en la línea RL1225468 representa un ejemplo paralelo de resistencia añadida al combinar dos genes independientes para la resistencia a los herbicidas inhibidores de ACCasa de la familia FOP.

Ejemplo 6: Producción de arroz híbrido resistente a herbicidas pertenecientes a diferentes clases de herbicidas, tales como los inhibidores de la HPPD y los inhibidores de la ACCasa, mediante la adición de 1 o más genes de resistencia a herbicidas para cada una de las clases de herbicidas, tales como los herbicidas Mesotriona y FOP.

1. La resistencia a la mesotriona y al menos a otra clase de herbicida, los inhibidores de la ACCasa, se despliega en un solo híbrido utilizando un progenitor masculino que porta la resistencia a la mesotriona (o a la otra clase de herbicida ACCasa) y uno femenino que porta la otra resistencia. El procedimiento permite al agricultor hacer una única compra pero poder elegir qué herbicida aplicar. Se puede utilizar una sola clase de herbicida en una temporada y rotar entre temporadas, o bien se pueden aplicar ambos herbicidas en una misma temporada. Además, el despliegue por este procedimiento, los elementos que contaminan la semilla propia de ambos progenitores en la semilla híbrida mediante la aplicación de ambos herbicidas, o de un tipo u otro, se eliminan mediante la aplicación de un solo herbicida.

2. En otro procedimiento de despliegue la resistencia a la mesotriona y la resistencia al inhibidor de ACCAsa se despliega mediante la realización de un híbrido con un progenitor macho que porta ambas resistencias. El agricultor tiene entonces la opción de elegir qué clase de herbicida aplicar o de aplicar ambos en una misma temporada. Además, mediante la aplicación de cualquiera de los dos herbicidas se eliminaría la contaminación de las semillas femeninas autógamas. Alternativamente, ambas clases de resistencia a los herbicidas se proporcionan en el progenitor femenino, dando al cultivador las mismas opciones para el control de las malezas.

3. Otra forma de realización es desplegar la resistencia a la mesotriona en ambos progenitores, y otra resistencia al herbicida en un solo progenitor, como el progenitor masculino. Las semillas híbridas son entonces homocigóticas para la resistencia a la mesotriona pero no para la otra. Un esquema como éste se utiliza para hacer una aplicación temprana con el herbicida puesto sólo en el progenitor masculino, proporcionando el control de las malezas y la eliminación de los femeninos contaminantes. Más adelante en la temporada se puede aplicar mesotriona u otro herbicida inhibidor de HPPD. La vida útil de ambos herbicidas se prolonga al limitar o eliminar el desarrollo de la resistencia de las malezas. En otra aplicación, este procedimiento permite el uso de mesotriona u otro herbicida inhibidor de HPPD para controlar las malezas en los campos de producción de semillas, lo que permite obtener semillas más limpias.

4. Alternativamente, un herbicida diferente podría ser desplegado en ambos progenitores híbridos y el inhibidor de la mesotriona/HPPD es desplegado sólo en el progenitor masculino.

5. Otras realizaciones para el despliegue de líneas resistentes a los herbicidas incluyen otros rasgos como la resistencia a otras clases de herbicidas, u otros rasgos de importancia.

Ejemplo 7: Producción de semillas

La resistencia al herbicida también se utiliza para la producción de semillas. Por ejemplo, si se despliega en el progenitor femenino, haciéndolo resistente, el herbicida se aplica en el campo de producción de semillas para matar las plantas masculinas antes de la siembra, de modo que se coseche un campo de producción de semillas a granel. Además, la pureza de la semilla también puede verificarse mediante el despliegue de dos resistencias a herbicidas con sólo una en cada progenitor. La semilla autodeterminada se detecta y se elimina aplicando un herbicida puesto en el otro progenitor.

Ejemplo 8: Control de las malezas de hoja ancha y control limitado de las gramíneas

La resistencia cuando se despliega en un híbrido, por cualquier combinación, proporciona resistencia a la mesotriona u otros herbicidas inhibidores de la HPPD. Este despliegue da lugar a un nuevo modo de acción en el arroz para el control de las malezas de hoja ancha, con cierto control limitado de las gramíneas, como el arroz rojo. Otras opciones o el control de amplio espectro de las malezas se proporciona mediante el despliegue en el mismo híbrido de otra resistencia a los herbicidas que proporcionan el control de las malezas de la hierba, como los herbicidas inhibidores de la ACCasa. Mediante el despliegue con otros modos de acción es más probable que se evite el desarrollo de la resistencia de las malezas a través del uso de múltiples modos de acción.

Ejemplo 9: Selección de arroz resistente a los herbicidas mediante un bioensayo con herbicidas

La selección del material que hereda la tolerancia a la mesotriona se realiza mediante un sencillo bioensayo con herbicidas. Se aplica una tasa elevada de mesotriona (al menos 420 gm ai/ha) que permite diferenciar los individuos heterocigotos de los homocigotos y el nivel de tolerancia de la línea de mutación del nivel de tolerancia inherente en el fondo de algunos tipos de arroz. En un ejemplo, se aplica una tasa de 105 gm ai/ha, seguida tres semanas después por una segunda aplicación de 630 gm ai/ha. En otro ejemplo, se aplica una tasa de 420 gm ai/ha en una sola aplicación. Otro ejemplo consiste en aplicar el herbicida a una tasa de 630 gm ai/ha. Las aplicaciones de herbicidas se realizan en la fase de tres a cuatro hojas del crecimiento de la plántula. La situación ideal es tener también plantadas cerca o dentro de las plantas a seleccionar un conjunto de plantas de la línea donante original mutante tolerante a la mesotriona ML0831266-03093, una hilera de plantas del tipo salvaje de la línea de mutación, P1003, y una hilera de la línea implicada como el otro progenitor en el cruce. Estas líneas de control permiten una fácil diferenciación para la herencia de la tolerancia proporcionada por la línea mutante ML0831266-03093 mediante la comparación de la respuesta en las plantas a seleccionar con las líneas de control. Sólo las plantas que vivan y estén relativamente sanas habrán heredado y serán homocigóticas para el nivel de tolerancia proporcionado por la línea mutante ML0831266-03093.

Ejemplo 10: Producción de arroz resistente a los herbicidas inhibidores de la HPPD y de la ACCasa

La línea mutante ML0831266-03093 que es tolerante a la mesotriona y probablemente a otros herbicidas incluyendo los inhibidores de HPPD, fue cruzada con la línea mutante ML0831265-01493 que tiene tolerancia a los herbicidas ACCasa y más específicamente al tipo "fop" de herbicidas ACCasa. En un ejemplo, las plantas ML0831266-03093 son el progenitor femenino y la polinización es por una planta de la línea ML0831265-01493. En otra realización, los progenitores se invierten de manera que el ML0831266-03093 sirve como progenitor polinizador. Las semillas F1 resultantes se cosechan habiendo heredado la tolerancia a los herbicidas mesotriona y ACCasa. Los individuos de la F1 son tolerantes a ambos herbicidas a un nivel parcialmente dominante, por lo que muestran cierta tolerancia pero no al mismo nivel que las líneas parentales tolerantes.

Las semillas F1 se plantan y se permite que las plantas resultantes se autopolinicen para producir semillas F2 haciendo una población que segrega para la tolerancia tanto a la mesotriona como a los herbicidas ACCasa. Esta población se criba mediante un bioensayo con herbicidas para identificar los individuos que han heredado la tolerancia de la línea mutante original ML0831266-03093 y son homocigotos para la resistencia. Se aplica una alta tasa de mesotriona que permite diferenciar los individuos heterocigotos de los homocigotos y el nivel de tolerancia de la línea de mutación del nivel de tolerancia en el fondo de algunos tipos de arroz, incluida la línea original utilizada para la mutación para crear la línea ML0831266-03093, que era P1003.

En un ejemplo, se aplica una tasa de 105 gm ai/ha, seguida tres semanas después por una segunda aplicación de 630 gm ai/ha. En otro ejemplo, se aplica una tasa de 420 gm ai/ha en una sola aplicación. Otro ejemplo consiste en aplicar el herbicida a una tasa de 630 gm ai/ha. Las aplicaciones de herbicidas se realizan en la fase de tres a cuatro hojas del crecimiento de la plántula. La situación ideal es haber plantado también cerca o dentro de la población F2 un conjunto de plantas de la línea donante original de mesotriona mutante ML0831266-03093, una fila de plantas del tipo salvaje de la línea de mutación, P1003, y una fila de la línea implicada como el otro progenitor ML0831265-01493. Estas líneas de control permitirán diferenciar fácilmente la herencia de la tolerancia proporcionada por la línea mutante ML0831266-03093 mediante la comparación de la respuesta en las plantas F2 con estas líneas de control. Sólo las plantas que vivan y estén relativamente sanas habrán heredado y serán homocigóticas para el nivel de tolerancia proporcionado por la línea mutante ML0831266-03093.

Ejemplo 11: Un ensayo de marcadores codominantes para seleccionar y desarrollar líneas de arroz tolerantes a la ACCasa y a la HPPD

Se dispone de un ensayo simple de marcadores codominantes para seleccionar la herencia a los herbicidas ACCasa derivados de la línea ML0831265-01493. El marcador se desarrolla como un marcador polimórfico de un solo nucleótido y detecta la mutación causal en la posición RTA1 (número de Blackgrass) para la tolerancia a la ACCasa en la línea ML0831265-01493. Todas las plantas supervivientes tras el bioensayo con mesotriona, tal y como se empleó en el Ejemplo 8, se muestrean para la recogida de tejidos, se extrae el ADN por procedimientos conocidos y se analizan las muestras con el ensayo SNP. Un subgrupo de las plantas supervivientes también se identifica como portador de tolerancia homocigota a los herbicidas ACCasa mediante selección asistida por marcadores.

Los individuos con tolerancia tanto a la mesotriona como a los herbicidas ACCasa se autofecundan para producir familias F3 y se seleccionan además por otros caracteres agronómicos importantes. Las líneas F3 se autoreproducen y purifican para obtener una nueva línea o variedad con doble resistencia a los herbicidas mesotriona y ACCasa. Estas líneas son muy valiosas, ya que el uso de ambos herbicidas proporciona un control de las malezas más completo y de amplio espectro.

En otra realización, los individuos con tolerancia tanto a la mesotriona como a la ACCasa se utilizan como donantes de rasgos en un programa de cruzamiento retrocruzado (BC). Tras seleccionar uno o varios individuos, se utilizan como progenitor polinizador o como progenitor femenino. Otra línea más elitista y deseable sirve de progenitor recurrente al que se transfieren los rasgos.

Tras el primer cruce, las plantas F1 se cruzan de nuevo con el progenitor recurrente. La semilla resultante de este cruce y los cruces en curso con el progenitor recurrente se prueban con marcadores o a través de bioensayos de herbicidas para la herencia de la tolerancia al herbicida o una combinación de marcadores y bioensayos. En la mejor situación se utilizan marcadores para las mutaciones funcionales. Alternativamente, se aplica un bioensayo de herbicida para la mesotriona a la semilla BC o posiblemente la semilla BC se somete a pruebas de progenie para verificar la herencia de la tolerancia. Además, se utiliza un bioensayo con herbicidas para identificar los individuos que también han heredado la tolerancia a los herbicidas ACCasa. Este proceso se repite hasta que se recupera el genoma parental recurrente junto con los dos nuevos rasgos de tolerancia a los herbicidas mesotriona y ACCasa. Después del último retrocruzamiento, los individuos se autofecundan para recuperar las tolerancias duales a los herbicidas en un nivel de resistencia homocigota en al menos una planta.

En otra realización, los individuos con resistencia tanto a la mesotriona como a los herbicidas ACCasa se cruzan con una tercera línea y posteriormente se autofecundan o incluso se cruzan con otras líneas. Las nuevas líneas y el germoplasma resultante se ensayan y evalúan para otros rasgos agronómicos importantes. Por último, se desarrollan nuevas variedades o líneas masculinas y femeninas con tolerancia tanto a la mesotriona u otros herbicidas HPPD como a los herbicidas ACCasa, una combinación novedosa para el arroz.

Ejemplo 12: Arroz mutante ML0831266-03093

Se ha demostrado que la línea mutante ML0831266-03093 es portadora de un alto nivel de tolerancia al herbicida mesotriona más allá de la tolerancia encontrada naturalmente en algunos tipos de arroz, incluyendo la línea original tratada con la mutación P1003. La línea mutante se planta en hileras o, alternativamente, se plantan parcelas enteras y filas de la línea no mutada (P1003) y otros tipos de arroz o parcelas enteras. La mesotriona se aplica en preemergencia o, alternativamente, en postemergencia en la fase de tres a cuatro hojas de las plantas de arroz. Se aplican varias tasas de mesotriona en preemergencia, en preemergencia seguida de postemergencia, o en postemergencia con una aplicación única o secuencial. Las aplicaciones postemergentes se realizan en el estadio de 3-4 hojas del arroz.

Con tasas bajas (105 gm ai/ha) de mesotriona aplicada, tanto la línea mutante como la línea original no mutada sobreviven. Sin embargo, otros tipos de arroz, como la línea mutante con tolerancia a la ACCasa ML0831265-01493 y la línea asociada no mutada R0146 mueren con estas tasas de mesotriona. La aplicación del herbicida mesotriona en tasas más altas muestra claramente un nuevo y novedoso nivel de tolerancia, ya que sólo la línea mutante ML0831266-03093 sobrevive, mientras que la línea original no mutada P1003 y todas las demás líneas probadas mueren o resultan gravemente dañadas. La mayor tolerancia a la mesotriona hace que la línea ML0831266-03093 sea de valor comercial, ya que tanto la tolerancia puede ser controlada o criada en nuevas variedades y es de un nivel lo suficientemente alto como para permitir el control comercial de las malezas en el arroz con la aplicación del herbicida mesotriona y posiblemente otros herbicidas inhibidores de la HPPD (resultados iniciales, FIG. 12B nuevos resultados después de 1 año, y FIG. 13- resultados de ensayos en varias líneas de arroz).

Ejemplo 13: Cruces entre líneas mutantes resistentes a diferentes herbicidas

El cruce entre la línea mutante ML0831266-03093 (ATCC PTA-13620) con tolerancia a la mesotriona y posiblemente a otros herbicidas inhibidores de la HPPD con la línea mutante ML0831265-01493 con (ATCC PTA-12933) tolerancia a los herbicidas ACCasa produjo semillas F1 que heredaban ambas tolerancias a los herbicidas. Tras la autofecundación de las plantas F1 F2, los individuos se seleccionan mediante bioensayos con herbicidas o, alternativamente, con marcadores moleculares. En el caso de la ACCasa se describe un marcador molecular funcional de manera que se selecciona la mutación en la posición G2096S (basada en el sistema de numeración de la Black grass). Además, utilizando marcadores ligados a los QTL del cromosoma 1 y del cromosoma 2 o bioensayos de tolerancia a la mesotriona y a la ACCasa, incluyendo otros herbicidas HPPD u otros herbicidas.

Los individuos seleccionados para la tolerancia a la mesotriona, incluyendo otros herbicidas HPPD y posiblemente otros herbicidas, pueden ser utilizados en un programa de conversión de retrocruzamiento o en el cruzamiento para desarrollar nuevas variedades e híbridos con un nivel comercial de tolerancia a la mesotriona y otros herbicidas. La selección con bioensayos o con los QTLs del cromosoma 1 y del cromosoma 2 conduce a la recuperación de la tolerancia inherente en P1003 junto con la tolerancia mutante para el desarrollo de una nueva variedad o híbrido con tolerancia a herbicidas y que representa nuevas opciones de control de malezas en el arroz. El nivel de tolerancia de la línea mutante es superior al de otras líneas y permite varios procedimientos de aplicación comercial.

Las plantas individuales con tolerancia a ambos herbicidas se utilizan en el cruzamiento para desarrollar nuevas variedades e híbridos con tolerancia a ambos herbicidas inhibidores de la ACCasa, la mesotriona, otros herbicidas inhibidores de la HPPD y otros herbicidas. Las nuevas variedades e híbridos son productos comerciales. Los productos comerciales se utilizan comercialmente para la producción de arroz. En el proceso de producción pueden aplicarse al cultivo de arroz tanto ACCasa como mesotriona u otros herbicidas para controlar las malezas. En un ejemplo, la mesotriona u otros herbicidas se aplican antes de la siembra para controlar las malezas en germinación y proporcionar un control residual de las mismas. Tras la germinación del cultivo de arroz se aplican herbicidas ACCasa para controlar las malezas. En otro ejemplo, se aplica mesotriona o su equivalente antes de la siembra y se realiza una segunda aplicación postemergente junto con un herbicida ACCasa con una o dos aplicaciones. En otro ejemplo, tanto la mesotriona como un herbicida ACCasa u otros herbicidas, incluidos otros herbicidas HPPD, se aplican de forma post­ emergente con una o dos aplicaciones. De esta manera se implementa una nueva y novedosa estrategia para proporcionar un control de malezas de espectro completo en el arroz. Además, estos herbicidas tienen nuevos modos de acción no utilizados anteriormente en el arroz. Por lo tanto, esta estrategia tiene aplicación comercial no sólo para el control de las malezas, sino como procedimiento para ampliar la vida útil de esta estrategia y de otras mediante la aplicación de múltiples modos de acción para el control de las malezas.

Ejemplo 14: Doble mutante resistente a los herbicidas HPPD y ACCasa

Se dispone de un ensayo simple de marcadores codominantes para seleccionar la herencia a los herbicidas ACCasa derivados de la línea ML0831265-01493. El marcador se desarrolla como un marcador polimórfico de un solo nucleótido y detecta la mutación causal en la posición RTA1 (número de Blackgrass) para la tolerancia a la ACCasa en la línea ML0831265-01493. Todas las plantas supervivientes tras el bioensayo con mesotriona, tal y como se ha empleado en el ejemplo 11, se muestrean para la recogida de tejidos, se extrae el ADN por procedimientos conocidos y se analizan las muestras con el ensayo SNP. Un subgrupo de las plantas supervivientes también se identifica como portador de tolerancia homocigota a los herbicidas ACCasa mediante selección asistida por marcadores.

En otra realización, los individuos con tolerancia tanto a la mesotriona como a la ACCasa se utilizan como donantes de rasgos en un programa de cruzamiento retrocruzado. Tras seleccionar uno o varios individuos, se utilizarán como progenitor polinizador o como progenitor femenino. Otra línea más elitista y deseable sirve de progenitor recurrente al que se transfieren los rasgos. Tras el primer cruce, las plantas F1 se cruzan de nuevo con el progenitor recurrente. La semilla resultante de este cruce y los cruces en curso con el progenitor recurrente se prueban con marcadores o a través de bioensayos de herbicidas para la herencia de la tolerancia al herbicida o una combinación de marcadores y bioensayos. En la mejor situación se utilizan marcadores para las mutaciones funcionales. Alternativamente, se aplica un bioensayo de herbicida para la mesotriona a la semilla BC o posiblemente la semilla BC se somete a pruebas de progenie para verificar la herencia de la tolerancia. Además, se utiliza un bioensayo con herbicidas para identificar los individuos que también han heredado la tolerancia a los herbicidas ACCasa. Este proceso se repite hasta que se recupera el genoma parental recurrente junto con los dos nuevos rasgos de tolerancia a los herbicidas mesotriona y ACCasa. Después del último retrocruzamiento, los individuos se autofecundan para recuperar las tolerancias duales a los herbicidas en un nivel de resistencia homocigota en al menos una planta.

En otra realización, los individuos con resistencia tanto a la mesotriona como a los herbicidas ACCasa se cruzan con una tercera línea y posteriormente se autofecundan o incluso se cruzan con otras líneas. Las nuevas líneas y el germoplasma resultante se ensayan y evalúan para otros rasgos agronómicos importantes. Por último, se desarrollan nuevas variedades o líneas masculinas y femeninas con tolerancia tanto a la mesotriona u otros herbicidas HPPD como a los herbicidas ACCasa, una combinación novedosa para el arroz.

Ejemplo 15: Control de las malezas de espectro completo en el arroz basado en la doble resistencia a los herbicidas ACCasa y HPPD

En el proceso de producción, tanto la ACCasa como la mesotriona u otros herbicidas pueden aplicarse al cultivo de arroz para controlar las malezas. En un ejemplo, la mesotriona u otros herbicidas se aplican antes de la siembra para controlar las malezas en germinación y proporcionar un control residual de las mismas. Tras la germinación del cultivo de arroz se aplican herbicidas ACCasa para controlar las malezas. En otro ejemplo, la mesotriona se aplica antes de la siembra y se realiza una segunda aplicación postemergente junto con un herbicida ACCasa con una o dos aplicaciones. En otro ejemplo, tanto la mesotriona como un herbicida ACCasa u otros herbicidas, incluidos otros herbicidas HPPD, se aplican de forma post-emergente con una o dos aplicaciones. De esta manera se implementa una nueva y novedosa estrategia para proporcionar un control de malezas de espectro completo en el arroz. Además, estos herbicidas no se han utilizado anteriormente en los modos de acción del arroz. Por lo tanto, esta estrategia tiene aplicación comercial no sólo para el control de las malezas, sino como procedimiento para ampliar la vida útil de esta estrategia y de otras mediante la aplicación de múltiples modos de acción para el control de las malezas.

Depósitos de semillas en virtud del Tratado de Budapest (véanse las Tablas 5 y 12)

Los depósitos de semillas de Ricetec AKTIENGESELLSCHAFT se realizaron en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va 20110, Estados Unidos de América. Las fechas de depósito y los números de acceso del ATCC son: ML0831266-03093 (PTA-13620, 19 de marzo de 2013); ML0831265-01493 (PTA-12933, 31 de mayo de 2012); ML0831265-02283 (PTA-13619, 19 de marzo de 2013); PL1214418M2-80048 (PTA-121632, 30 de junio de 2014), R4225468 (PTA-122646, 15 de noviembre de 2015). Todas las restricciones se eliminarán tras la concesión de una patente, y los depósitos pretenden cumplir todos los requisitos de 37 C.F.R. §§1.801-1.809, y satisfacer los requisitos del Tratado de Budapest. El depósito se mantendrá en la entidad depositaria durante un periodo de treinta años, o cinco años después de la última solicitud, o durante la vida ejecutiva de la patente, lo que sea más largo, y se sustituirá según sea necesario durante ese periodo.

DEFINICIONES

En la descripción y las tablas que siguen, se utilizan varios términos. Con el fin de proporcionar una comprensión clara y coherente de la especificación y las reivindicaciones, incluyendo el alcance que debe darse a dichos términos, se proporcionan las siguientes definiciones:

Acetil-Coenzima. Las enzimas carboxilasas (ACCasa; EC 6.4.1.2) sintetizan el malonil-CoA como inicio de la vía de síntesis de ácidos grasos de novo en los cloroplastos de las plantas. La ACCasa en los cloroplastos de las gramíneas es un polipéptido multifuncional, codificado en el genoma nuclear, muy grande y único, que se transporta al interior del plástido a través de un péptido de tránsito N-terminal. La forma activa en los cloroplastos de las gramíneas es una proteína homodimérica.

Las enzimas ACCasas de las hierbas son inhibidas por tres clases de ingredientes activos herbicidas. Las dos clases más frecuentes son los ariloxifenoxipropanoatos ("FOP") y las ciclohexanodionas ("DIM"). Además de estas dos clases, se ha descrito una tercera clase, las fenilpirazolinas ("DENs").

Ciertas mutaciones en la región de la carboxil transferasa de la enzima ACCasa hacen que las hierbas se vuelvan resistentes a los herbicidas ACCasa. En la maleza Black-Grass se han descrito al menos cinco mutaciones que proporcionan resistencia a los herbicidas FOP o DIM de la clase ACCasa. Algunas mutaciones que hacen que las enzimas ACCasa sean resistentes a estos herbicidas pueden estar asociadas a una disminución de la aptitud.

Alelo. Alelo es una cualquiera de las muchas formas alternativas de un gen, todas ellas relacionadas generalmente con un rasgo o característica. En una célula u organismo diploide, los dos alelos de un determinado gen ocupan loci correspondientes en un par de cromosomas homólogos.

Retrocruzamiento. Proceso de cruzar una progenie híbrida con uno de los progenitores, por ejemplo, un híbrido F1 de primera generación con uno de los genotipos parentales del híbrido F1.

Mezcla. Mezclar físicamente semillas de arroz de un híbrido de arroz con semillas de uno, dos, tres, cuatro o más de otro híbrido de arroz, variedad de arroz o arroz endogámico para producir un cultivo que contenga las características de todas las semillas y plantas de arroz de esta mezcla.

Célula. La célula, tal como se utiliza en el presente documento, incluye una célula vegetal, ya sea aislada, en cultivo de tejidos o incorporada a una planta o parte de la planta.

Cultivar. Variedad o cepa que persiste en el cultivo.

Embrión. El embrión es la pequeña planta que contiene una semilla madura.

Esencialmente todas las características fisiológicas y morfológicas. Una planta que tiene esencialmente todas las características fisiológicas y morfológicas del híbrido o del cultivar, excepto las características derivadas del gen convertido.

Rendimiento del grano. Peso del grano cosechado en un área determinada. El rendimiento de los granos también puede determinarse indirectamente multiplicando el número de panículas por superficie, por el número de granos por panícula y por el peso del grano.

Lesión a la planta. Se define al comparar una planta de prueba con los controles y encontrar que la planta de prueba no tiene la misma altura; un color anormal, por ejemplo, amarillo y no verde; una forma de hoja habitual, rizada, menos brotes.

Locus. Un locus es una posición en un cromosoma ocupada por una secuencia de ADN; confiere uno o más rasgos como, por ejemplo, esterilidad masculina, tolerancia a los herbicidas, resistencia a los insectos, resistencia a las enfermedades, almidón ceroso, metabolismo modificado de los ácidos grasos, metabolismo modificado del ácido fítico, metabolismo modificado de los carbohidratos y metabolismo modificado de las proteínas. El rasgo puede ser, por ejemplo, conferido por un gen de origen natural introducido en el genoma de la variedad mediante retrocruzamiento, una mutación natural o inducida, o un transgén introducido mediante técnicas de transformación genética. Un locus puede comprender uno o más alelos integrados en una única localización cromosómica.

Inducido. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término inducido significa que la resistencia genética apareció tras el tratamiento con el mutágeno.

No inducido. Tal y como se utiliza en este documento, el término no inducido significa la resistencia genética que no se conoce como inducida; se encuentra en una ubicación diferente en el genoma, que la resistencia inducida.

Planta. Tal y como se utiliza en este documento, el término "planta" incluye la referencia a una planta entera inmadura o madura, incluida una planta de la que se han retirado las semillas o los granos o las anteras. La semilla o el embrión que producirá la planta también se considera la planta.

Parte de la planta. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "parte de la planta" (o una planta de arroz, o una parte de ella) incluye protoplastos, hojas, tallos, raíces, puntas de raíces, anteras, semillas, granos, embriones, polen, óvulos, cotiledones, hipocótilos, glumas, panículas, flores, brotes, tejidos, células, células meristemáticas y similares.

Loci de rasgos cuantitativos (QTL). Loci genéticos que controlan hasta cierto punto rasgos medibles numéricamente que suelen estar distribuidos de forma continua. Recombinante/no recombinante. Si se produce una combinación no parental, la patente del arroz es recombinante.

Regeneración. La regeneración se refiere al desarrollo de una planta a partir de un cultivo de tejidos.

Resistencia/Resistencia1. La capacidad heredada de una planta para sobrevivir y reproducirse tras la exposición a una dosis de herbicida normalmente letal para el tipo silvestre la resistencia puede ser natural o inducida por técnicas como la ingeniería genética o la selección de variantes producidas por cultivo de tejidos o mutagénesis.

Gen único convertido (conversión). La conversión de un solo gen (conversión) incluye las plantas desarrolladas mediante una técnica de cruzamiento vegetal llamada retrocruzamiento, en la que se recuperan esencialmente todas las características morfológicas y fisiológicas deseadas de una variedad endogámica, conservando un solo gen transferido 1 Weed Science Society of America, Weed Technology, vol. 12, número 4 (octubre-diciembre, 1998, p. 789) a la variedad endogámica mediante cruces y retrocruces. El término también puede referirse a la introducción de un solo gen mediante técnicas de ingeniería genética conocidas en la técnica.

Apilamiento. Añadir más de una cosa a la misma entidad receptora. Los procedimientos para lograr el estado "apilado" incluyen: procedimientos de apilamiento vectorial de dos o más genes en un solo vector y hacer una sola transformación para lograr el apilamiento; hacer transformaciones secuenciales en el mismo receptor añadiendo rasgos paso a paso; lograr un híbrido apilado simplemente mediante el cruce final de parentales portadores de rasgos diferentes; desarrollar líneas con rasgos múltiples mediante mutagénesis o cruce secuencial, y fijar el estado apilado en uno de los parentales; y sus variantes.

Sinergismo. Como se describe en el Herbicide Handbook of the Weed Science Society of America, novena edición, 2007, p. 429"'sinergismo' [es] una interacción de dos o más factores de tal manera que el efecto cuando se combina es mayor que el efecto previsto basado en la respuesta a cada factor aplicado por separado"

La siguiente ecuación puede utilizarse para calcular la resistencia/tolerancia esperada en el arroz con combinaciones de mutaciones a herbicidas, por ejemplo, A y B

Esperada=A+B-(AxB/l()0)

A= eficacia observada de la mutación A a la misma concentración de herbicida;

B=eficacia observada de la mutación B a la misma concentración de herbicida.

Sinérgico en el contexto del herbicida puede significar que el uso del herbicida resulta en un efecto de control de maleza incrementado comparado con los efectos de control de maleza de A B que son posibles con el uso de cada herbicida solo. O sinérgico puede considerarse como el nivel de resistencia/tolerancia del arroz, con mutaciones combinadas (apiladas) en comparación con los efectos de un arroz con una sola mutación.

En algunas realizaciones, el lesión o la lesión a la vegetación no deseada causada por el herbicida se evalúa utilizando una escala de 0 % a 100 %, cuando se compara con la vegetación de control no tratada, donde 0 % indica que no hay lesión a la vegetación no deseada y 100 % indica la destrucción completa de la vegetación no deseada.

Tolerancia/Tolerante. La capacidad inherente de una especie para sobrevivir y reproducirse tras el tratamiento con herbicidas implica que no hubo selección o manipulación genérica para hacer que la planta fuera tolerante.

Resistencia/tolerancia se utilizan de forma intercambiable en el presente documento; para un genotipo específico de planta de arroz se proporciona información sobre el herbicida aplicado, la potencia del herbicida y la respuesta de la planta.

Este vector de mutaciones estrechamente vinculadas en combinación con RTA1 (G209S) confiere resistencia sinérgica al herbicida FOP.

Tabla 1A: Nucleótidos mutantes asociados con el arroz RTA2 tolerante a los inhibidores de la ACCasa

continuación

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Tabla 1B: Nucleótidos mutantes asociados al arroz tolerante al inhibidor de la ACCasa RTA22

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Tabla 2: Características fenotípicas de una línea de arroz mutante que muestra resistencia a la mesotriona, con comparación con la línea parental original no mutada.

Tabla 3: Número de plantas tolerantes después de tres diferentes bioensayos con herbicidas aplicados a un individuo F2 derivado de un cruce de ML0831266-03093 con tolerancia a mesotriona y ML0831265-01493 con tolerancia a herbicidas inhibidores de ACCasa.

Tabla 5 Resumen de las líneas de arroz citadas en este documento (véase también la Tabla 12)

Tabla 6: Características agronómicas de dos líneas que portan tanto la resistencia/tolerancia a la HPPD como a la ACCasa (RTA1 HPPDi HPPDni).

Tabla 7 Escala de calificación de daños por herbicidas en el arroz

continuación

_o Q_

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Una planta de arroz que comprende en su genoma:

a) una mutación en el cromosoma 5 que codifica una sustitución G2096S en la secuencia de aminoácidos de la enzima ACCasa; y

b) las siguientes mutaciones del cromosoma 1:

T en lugar de C en la posición 32083963;

A en lugar de G en la posición 32165584;

A en lugar de G en la posición 32177487;

C en lugar de T en la posición 32459172;

G en lugar de A en la posición 32785958;

C en lugar de T en la posición 32821747;

A en lugar de G en la posición 33147227;

T en lugar de C en la posición 33201871;

C en lugar de T en la posición 33760443;

C en lugar de T en la posición 33760496;

CT en lugar de C en la posición 34079372;

A en lugar de G en la posición 34374172;

G en lugar de A en la posición 34440547;

A en lugar de G en la posición 34482064;

A en lugar de G en la posición 34680949;

C en lugar de T en la posición 34801475;

T en lugar de C en la posición 34976760;

A en lugar de G en la posición 35080808;

A en lugar de G en la posición 35498447;

A en lugar de G en la posición 35645244;

A en lugar de G en la posición 35779866;

A en lugar de G en la posición 35800575;

A en lugar de G en la posición 35866927;

A en lugar de G en la posición 36096211;

A en lugar de G en la posición 36160202; y

A en lugar de G en la posición 36386713.

2. Polen u óvulo de la planta de la reivindicación 1, en el que la planta es homocigota para las mutaciones enumeradas en llos apartados a) y b) de la reivindicación 1.

3. Un cultivo de tejidos producido a partir del polen de la reivindicación 2.

4. Un cultivo de tejidos producido a partir de protoplastos o células de la planta de arroz de la reivindicación 1, en el que dichas células o protoplastos del cultivo de tejidos se producen a partir de una parte de la planta seleccionada del grupo que consiste en hojas, embriones, cotiledones, hipocótilos, células meristemáticas, raíces, puntas de raíces, pistilos, anteras, flores, tallos, glumas y panículas.

5. Un protoplasto producido a partir de una planta de la reivindicación 1.

6. Un procedimiento para producir arroz resistente a los inhibidores de herbicidas de la ACCasa, a niveles significativamente más altos que los tolerados por las plantas sin regiones genéticas que confieren resistencia, comprendiendo el procedimiento:

a) obtener regiones genéticas que comprendan las mutaciones enumeradas en los apartados a) y b) de la reivindicación 1 que, en combinación, confieren resistencia/tolerancia; y

b) introducir dichas regiones genéticas en las líneas de arroz para sustituir las regiones de tipo salvaje,

en el que el procedimiento no es un proceso esencialmente biológico para la producción de plantas.