DE112018006599T5

DE112018006599T5 - Gegen Pyrimidinylsalicylat-Herbizid resistentes Rapsgen und dessen Verwendung

Info

Publication number: DE112018006599T5
Application number: DE112018006599.5T
Authority: DE
Inventors: Maolong Hu; Huiming Pu; Weihua Long; Jianqin Gao; Jiefu Zhang; Song Chen; Li Cheng; Qi Peng; Feng Chen; Xiaoying Zhou; Sanxiong Fu; Wei Zhang; Xiaodong Wang
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-08-24
Filing date: 2018-08-24
Publication date: 2020-09-10
Also published as: CN112154207B; WO2020037648A1; CN112154207A; CA3087906A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt ein Rapsgen bereit, das resistent gegen Pyrimidinylsalicylat-Herbizid ist, und Verwendungen davon, und stellt weiterhin eine Rapspflanze bereit, die resistent gegen Pyrimidinylsalicylat-Herbizid ist, und einen Teil davon.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das technische Gebiet der Pflanzengentechnik, insbesondere auf ein Rapsgen, das gegen ein Pyrimidinylsalicylat-Herbizid resistent ist, und die Verwendung davon. Genauer gesagt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Rapspflanze, die gegen ein Pyrimidinylsalicylat-Herbizid resistent ist, und einen Teil, ein Resistenzgen, ein mutiertes Protein und die Verwendung davon.
Stand der Technik
Raps (Brassica napus L.) ist die Ölpflanze Nummer eins in China, wobei für mehr als die Hälfte der Bevölkerung des Landes eine Quelle für Speiseöl bereitgestellt wird. Eine der wichtigsten biologischen Gefahren in der Rapsproduktion ist das Ackerunkraut, das nicht nur mit den Rapspflanzen um Wasser, Dünger und Licht konkurriert, sondern auch das Feldmikroklima der Rapspflanze verändert, und einige Unkräuter sind sogar Zwischenwirte für Schädlinge und Krankheiten der Rapspflanze, was die Ausbreitung von Schädlingen und Krankheiten beschleunigt, den Ertrag und die Qualität der Rapspflanze ernsthaft beeinträchtigt. Die manuelle Unkrautbekämpfung ist jedoch zeitaufwändig und mühsam, wobei die Produktionskosten erhöht werden. Daher ist die Anwendung von Herbiziden zur Unkrautregulierung auf dem Feld eine unvermeidliche Wahl geworden.
Herbizide inhibieren hauptsächlich das Pflanzenwachstum oder töten Pflanzen ab, indem sie entscheidende Stoffwechselprozesse der Pflanzen inhibieren oder stören. Abzielen auf Schlüsselenzyme im Prozess der Aminosäurebiosynthese ist eine wichtige Richtung und ein Hotspot bei der Entwicklung neuer und hochwirksamer Herbizide. Die mit Acetolactat-Synthase (ALS; EC2.2..16) als das Zielenzym entwickelten Herbizide sind zu den Hauptprodukten neuer Hochleistungsherbizide geworden. ALS ist ein Enzym, das den ersten Schritt der Biosynthese von verzweigt-kettigen Aminosäuren (Valin, Leucin und Isoleucin) katalysiert. ALS-Inhibitor-Herbizide können die ALS-Enzymaktivität in Pflanzenzellen inhibieren, die Biosynthese von verzweigt-kettigen Aminosäuren (Valin, Leucin und Isoleucin) behindern, wodurch die Teilung und das Wachstum von Pflanzenzellen inhibiert wird. In den frühen 1990er Jahren entwickelte die Kumiai Chemical Company of Japan eine neue Klasse von ALS-Herbiziden, d.h. Pyrimidinylsalicylat-Herbizide, auch bekannt als Pyrimidinyl(thio)benzoat-Herbizide, die die Acetolactat-Synthase als das Ziel verwenden. Die erste kommerzielle Variante dieser Klasse von Herbiziden ist Pyrithiobac-natrium. In der Folge wurde 1993 Pyriminobac-methyl entwickelt und 1996 wurde Bispyribac-Natrium (Nominee) entwickelt.
Seit der Anwendung von ALS-Herbiziden in der Landwirtschaft wurde beobachtet, dass empfindliche Pflanzenarten (einschließlich natürlich vorkommender Unkräuter) gelegentlich spontane Toleranz gegenüber solchen Herbiziden zeigen. Die Substitution einer einzigen Base an einer bestimmten Stelle des ALS-Gens führt in der Regel zu mehr oder weniger Resistenz. Pflanzen mit mutierten ALS-Allelen zeigen ein unterschiedliches Level an Toleranz gegenüber ALS-Herbiziden, abhängig von der chemischen Struktur des ALS-Herbizids und der Punktmutationsstelle des ALS-Gens.
Die Studie fand heraus, dass es signifikante Unterschiede in der Resistenzfunktionalität gab, wenn die Aminosäuresubstitution an unterschiedlichen Stellen von ALS auftrat und an diesen Stellen unterschiedliche Aminosäuren zur Substitution verwendet wurden (Yu Q, Han HP, Martin M, Vila-Aiub, Powles SB. AHAS herbicide resistance endowing mutations: effect on AHAS functionality and plant growth. J Exp Botany, 2010, 61: 3925 - 3934). Die Resistenzwirkungen gegen ALS-Inhibitorherbizide, die durch Aminosäuresubstitutionen an unterschiedlichen Stellen hergestellt werden, sind signifikant unterschiedlich, und gleichzeitig weisen Mutationen an unterschiedlichen Stellen eine komplexere Kreuzresistenzbeziehung gegen andere ALS-Inhibitorherbizide auf.
Im Fachgebiet besteht auch ein großer Bedarf Rapspflanzen zu erhalten, die Wachstumsvorteile gegenüber Unkräutern mit starker Lebensfähigkeit aufweisen, und nicht transgene Rapspflanzen zu erhalten, die Pyrimidinylsalicylat-Herbizide tolerieren können.
Inhalt der vorliegenden Erfindung
Die vorliegende Erfindung geht auf diesen Bedarf ein und stellt eine mutierte Nukleinsäure der Acetolactat-Synthase (ALS) und ein Protein, das durch diese mutierte Nukleinsäure kodiert wird, bereit. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine Rapspflanze, eine Zelle und einen Samen, umfassend eine solche mutierte Nukleinsäure und Protein, und die Mutation verleiht der Rapspflanze Toleranz gegenüber einem Pyrimidinylsalicylat-Herbizid, wobei ein ALS-Polypeptid, das durch das ALS-Gen kodiert wird, eine Aminosäure aufweist, die unterschiedlich zu Tryptophan an Position 556 davon ist, und eine Aminosäure, die unterschiedlich zu Serin an Position 635 davon ist. In einer bevorzugten Ausführungsform weist das ALS-Polypeptid, das durch das ALS-Gen kodiert wird, eine Doppelmutation auf, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus W556L und S635N; W556L und S635T; W556L und S635I. In der am stärksten bevorzugten Ausführungsform weist das ALS-Polypeptid, das durch das ALS-Gen kodiert wird, die folgenden Mutationen auf: W556L und S635N.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte Nukleinsäure bereit, die für eine mutierte Acetolactat-Synthase (ALS3) kodiert, und wobei das mutierte Acetolactat-Synthase(ALS3)-Protein die folgenden Mutationen umfasst:

Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an einer Position, die Position 556 von SEQ ID Nr: 2 entspricht und
Mutation von Serin (S) zu Asparagin (N), Threonin (T) oder Isoleucin (I) an einer Position, die Position 635 von SEQ ID Nr: 2 entspricht;
bevorzugt weist die isolierte Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz wie in SEQ ID Nr: 3 gezeigt auf;
bevorzugt weist das mutierte ALS3-Protein eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr: 4 gezeigt, auf.

In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Expressionskassette, einen Vektor oder eine Zelle bereit, die/der die Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung umfasst. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine Verwendung der Nukleinsäure, der Expressionskassette, des Vektors oder der Zelle oder des mutierten Acetolactat-Synthase (ALS3)-Proteins der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze bereit, die gegen ein Pyrimidinylsalicylat-Herbizid resistent ist, bevorzugt ist die Pflanze Raps.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze bereit, die gegen ein Pyrimidinylsalicylat-Herbizid resistent ist, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:

Einführen der Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung in eine Pflanze, bevorzugt Einführen der Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung in eine Pflanze durch einen Schritt wie zum Beispiel Transgenese, Kreuzung, Rückkreuzung oder vegetative Vermehrung, wobei die Pflanze das mutierte Acetolactat-Synthase (ALS3)-Protein der vorliegenden Erfindung exprimiert und Resistenz gegen ein Pyrimidinylsalicylat-Herbizid aufweist.

In noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine nicht transgene Pflanze oder einen Teil davon bereit, die/der gegen ein Pyrimidinylsalicylat-Herbizid resistent ist, die/der eine isolierte Nukleinsäure umfasst, die für ein mutiertes Acetolactat-Synthase-Protein kodiert, wobei das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein die folgenden Mutationen umfasst:

Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an einer Position, die Position 556 von SEQ ID Nr: 2 entspricht und
Mutation von Serin (S) zu Asparagin (N), Threonin (T) oder Isoleucin (I) an einer Position, die Position 635 von SEQ ID Nr: 2 entspricht,
bevorzugt, wobei die Pflanze Raps ist; wobei der Teil ein Organ, ein Gewebe oder eine Zelle der Pflanze und bevorzugt ein Samen ist;
bevorzugt, wobei das Protein eine Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an einer Position, die Position 556 von SEQ ID Nr: 2 entspricht, und eine Mutation von Serin (S) zu Asparagin (N) an einer Position, die Position 635 von SEQ ID Nr: 2 entspricht, umfasst;
stärker bevorzugt, wobei das mutierte ALS3-Protein eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr: 4 gezeigt, aufweist.

In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Regulierung eines Unkrauts in einem Feld bereit, das eine Rapspflanze enthält, wobei das Verfahren umfasst: Anwenden einer wirksamen Menge eines Pyrimidinylsalicylat-Herbizids auf das Feld, das das Unkraut und die Rapspflanze enthält, wobei die Rapspflanze eine isolierte Nukleinsäure umfasst, die für ein mutiertes Acetolactat-Synthase-Protein kodiert, und wobei das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein die folgenden Mutationen umfasst:

Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an einer Position, die Position 556 von SEQ ID Nr: 2 entspricht und
Mutation von Serin (S) zu Asparagin (N), Threonin (T) oder Isoleucin (I) an einer Position, die Position 635 von SEQ ID Nr: 2 entspricht;
bevorzugt wobei das Protein eine Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an einer Position, die Position 556 von SEQ ID Nr: 2 entspricht, und eine Mutation von Serin (S) zu Asparagin (N) an einer Position, die Position 635 von SEQ ID Nr: 2 entspricht, umfasst;
stärker bevorzugt, wobei das mutierte ALS3-Protein eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr: 4 gezeigt, aufweist.

Figurenliste
1 zeigt die Alignment-Ergebnisse von Raps-ALS3-Aminosäure-Teilsequenzen aus unterschiedlichen Quellen.
ALS3, eine Referenzsequenz von Genbank (Zugangsnummer: Z11526); ALS3-Aminosäure-Teilsequenz von ALS3_N131-Wildtypstamm N131; ALS3-Aminosäure-Teilsequenz von ALS3_EM28 resistenter Stamm EM28; ALS3-Aminosäure-Teilsequenz von ALS3_Sh4 resistentes Material Sh4; ALS3-Aminosäure-Teilsequenz von ALS3_Sh5 resistentes Material Sh5; ALS3-Aminosäure-Teilsequenz von ALS3_Sh6- resistentes Material Sh6; ALS3-Aminosäure-Teilsequenz von ALS3_Sh7 resistentes Material Sh7. Pfeile zeigen mutierte Aminosäuren an.

2 zeigt die in vitro Aktivitätsinhibition von Wildtyp- und mutierten ALS-Enzymen durch Tribenuron-methyl bei unterschiedlichen Konzentrationen.
3 zeigt die in vitro Aktivitätsinhibition von Wildtyp- und mutierten ALS-Enzymen durch Imazethapyr bei unterschiedlichen Konzentrationen.
4 zeigt die in vitro Aktivitätsinhibition von Wildtyp- und mutierten ALS-Enzymen durch Bispyribac-Natrium bei unterschiedlichen Konzentrationen.
5 zeigt die Resistenzleistungen von Arabidopsis thaliana und Tabak, die mit dem Herbizidresistenzgen eingeführt wurden, nach dem Sprühen von Herbiziden (Col, Wildtyp-Arabidopsis thaliana, 3A-1 und 3A-2 Arabidopsis thaliana, eingeführt mit Herbizidresistenzgen; Tob, Wildtyp-Tabak, Y3A-1 und Y3A-2 Tabak, eingeführt mit Herbizidresistenzgen). + zeigt Sprühen mit 60 g a.i. ha^-1 Bispyribac-Natrium an und - zeigt keine Herbizidbehandlung an.

Detaillierte Beschreibung
Die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und ihre unterschiedlichen Merkmale und vorteilhaften Details werden durch Bezugnahme auf die nicht einschränkenden Ausführungsformen und Beispiele, die in den Zeichnungen beschrieben und/oder illustriert und in der folgenden Beschreibung ausführlich beschrieben sind, näher erklärt werden. Es ist zu beachten, dass die in den Zeichnungen beschriebenen Merkmale nicht notwendigerweise maßstabsgetreu gezeichnet sind, und die Merkmale einer Ausführungsform können mit anderen Ausführungsformen verwendet werden, wenn ein Fachmann sie erkennen kann, obwohl sie hier nicht eindeutig beschrieben sind.
Definitionen
Sofern nicht anders angegeben, sind die in den Ansprüchen und der Beschreibung verwendeten Begriffe wie unten aufgeführt definiert.
Der Begriff „nicht transgen“ bezieht sich darauf, dass einzelne Gene nicht über geeignete biologische Träger oder durch beliebige andere physikalische Mittel eingeführt werden. Ein mutiertes Gen kann jedoch durch Bestäubung (natürlich oder durch Zuchtverfahren) weitergegeben werden, um eine andere nicht transgene Pflanze herzustellen, die das jeweilige Gen enthält.
Der Begriff „endogenes“ Gen bezieht sich auf ein Gen in einer Pflanze, das nicht durch gentechnische Verfahren in die Pflanze eingeführt wird.
Die Begriffe „Nukleotidsequenz“, „Polynukleotid“, „Nukleinsäuresequenz“, „Nukleinsäure“ und „Nukleinsäuremolekül“ werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf Nukleotide, Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination aus beiden in Form eines unverzweigten Polymers von beliebiger Länge. Nukleinsäuresequenzen umfassen DNA, cDNA, genomische DNA, RNA, einschließlich synthetischer Formen und gemischter Polymere, einschließlich Sense- und Antisense-Stränge, oder können nicht natürliche oder abgeleitete Nukleotidbasen enthalten, wie der Fachmann diesen Punkt verstehen wird.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Polypeptid“ oder „Protein“ (beide Begriffe werden hierin austauschbar verwendet) auf ein Peptid, Protein oder Polypeptid, das eine Aminosäurekette einer gegebenen Länge umfasst, wobei die Aminosäurereste über kovalente Peptidbindungen verknüpft sind. Die vorliegende Erfindung umfasst jedoch auch Peptid-Imitationen des Proteins/Polypeptids (wobei die Aminosäuren und/oder Peptidbindungen durch funktionelle Analoga ersetzt wurden) sowie andere Aminosäuren als die von den 20 Genen kodierten Aminosäuren, wie zum Beispiel Selenocystin. Peptide, Oligopeptide und Proteine können als Polypeptide bezeichnet werden. Der Begriff Polypeptid bezieht sich auch auf (schließt nicht aus) eine Modifikation des Polypeptids, wie zum Beispiel Glykosylierung, Acetylierung, Phosphorylierung und dergleichen. Diese Modifikation ist in der Grundlagenliteratur und ausführlicher in den Monographien und in der Forschungsliteratur gut dokumentiert.
Aminosäuresubstitution umfasst eine Aminosäureänderung, bei der eine Aminosäure durch einen unterschiedlichen natürlich vorkommenden Aminosäurerest ersetzt wird. Eine solche Substitution kann als „konservativ“ klassifiziert werden, bei der ein Aminosäurerest, der im Wildtyp-ALS-Protein enthalten ist, durch eine zusätzliche natürlich vorkommende Aminosäure mit ähnlichen Eigenschaften ersetzt wird; die Substitution kann, zum Beispiel oder einschließlich in der vorliegenden Erfindung, auch „nicht konservativ“ sein, bei der ein Aminosäurerest, der im Wildtyp-ALS-Protein vorhanden ist, durch eine Aminosäure mit unterschiedlichen Eigenschaften substituiert wird, zum Beispiel durch eine natürlich vorkommende Aminosäure aus einer unterschiedlichen Gruppe (zum Beispiel wird eine geladene oder hydrophobe Aminosäure durch Alanin substituiert). Wie hierin verwendet, bezieht sich „ähnliche Aminosäure“ auf eine Aminosäure mit einer ähnlichen Aminosäureseitenkette, d.h. eine Aminosäure mit polarer, unpolarer oder nahezu neutraler Seitenkette. Wie hierin verwendet, bezieht sich „unähnliche Aminosäure“ auf eine Aminosäure mit einer unterschiedlichen Aminosäureseitenkette, zum Beispiel ist eine Aminosäure mit einer polaren Seitenkette nicht ähnlich zu einer Aminosäure mit einer unpolaren Seitenkette. Polare Seitenketten neigen im Allgemeinen dazu, auf der Oberfläche des Proteins zu existieren, wo sie mit der Wasserumgebung, die in der Zelle vorhanden ist, interagieren können („hydrophile“ Aminosäuren). Andererseits neigen „unpolare“ Aminosäuren dazu, im Zentrum des Proteins lokalisiert zu sein, wo sie mit ähnlichen unpolaren Nachbarmolekülen interagieren können („hydrophobe“ Aminosäuren). Beispiele von Aminosäuren mit polaren Seitenketten sind Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Histidin, Lysin, Serin und Threonin (alle sind hydrophile Aminosäuren, außer dass Cystein hydrophob ist). Beispiele von Aminosäuren mit unpolaren Seitenketten sind Alanin, Glycin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Phenylalanin, Prolin und Tryptophan (alle hydrophob, außer dass Glycin neutral ist).
Im Allgemeinen wird ein Fachmann wissen, dass sich die Begriffe ALS, ALSL, AHAS oder AHASL auf die Nukleotidsequenz oder Nukleinsäure bzw. die Aminosäuresequenz oder das Polypeptid beziehen, je nach seinem (ihrem) Allgemeinwissen und dem Kontext der Verwendung der Begriffe.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Gen“ auf Nukleotide (Ribonukleotide oder Desoxyribonukleoside) in Form von Polymeren beliebiger Länge. Der Begriff umfasst doppelsträngige und einzelsträngige DNA und RNA und umfasst weiterhin bekannte Arten von Modifikationen, wie zum Beispiel Methylierung, „Capping“, Substitution eines oder mehrerer natürlich vorkommender Nukleotide durch Analoga. Bevorzugt umfasst das Gen eine kodierende Sequenz, die für ein Polypeptid wie hierin definiert kodiert. „Kodierende Sequenz“ ist eine Nukleotidsequenz, die in mRNA transkribiert und/oder in ein Polypeptid translatiert werden kann, wenn sie einer geeigneten regulatorischen Sequenz unterworfen wird oder unter deren Kontrolle ist. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden durch das Translations-Startcodon am 5'-Ende und das Translations-Stoppcodon am 3'-Ende bestimmt. Die kodierende Sequenz kann mRNA, cDNA, rekombinante Nukleinsäuresequenz oder genomische DNA einschließen, ist aber nicht darauf beschränkt, in einigen Fällen kann aber auch ein Intron existieren.
Wenn hierin verwendet, kann der Begriff „Brassica napus“ als „B. napus“ abgekürzt werden. Zusätzlich wird hierin der Begriff „Raps“ verwendet. Die drei Begriffe werden austauschbar verwendet und sollten so verstanden werden, dass sie Rapspflanzen in kultivierter Form vollständig einschließen. In ähnlicher Weise kann zum Beispiel der Begriff „Arabidopsis thaliana“ als „A. thaliana“ abgekürzt werden. Diese beiden Begriffe werden hierin austauschbar verwendet.
Wenn in der vorliegenden Erfindung verwendet, bezieht sich der Begriff „Position“ auf eine Position einer Aminosäure in der hierin beschriebenen Aminosäuresequenz oder eine Position eines Nukleotids in der hierin beschriebenen Nukleotidsequenz, zum Beispiel eine Position in der kodierenden Sequenz des Wildtyp-Raps ALS3-Proteins, wie in SEQ ID Nr: 1 gezeigt, oder der Aminosäuresequenz des Wildtyp-Raps ALS3-Proteins, wie in SEQ ID Nr: 2 gezeigt, oder ihre entsprechende Position. Der Begriff „entsprechend“, wie hierin verwendet, bedeutet, dass die „Position“ auch eine Position zusätzlich zu der durch die oben genannte Nukleotid-/Aminosäurenummerierung bestimmten Position einschließt. Aufgrund der Deletion oder Insertion von Nukleotiden an anderen Positionen in der ALS 5'-untranslatierten Region (UTR) (einschließlich des Promotors und/oder beliebigen anderen regulatorischen Sequenzen) oder des Gens (einschließlich Exon und Intron) kann die Position eines bestimmten Nukleotids, das in der vorliegenden Erfindung substituiert werden kann, unterschiedlich sein. In ähnlicher Weise kann aufgrund der Deletion oder Insertion von Aminosäuren an anderen Positionen im ALS-Polypeptid die Position einer bestimmten Aminosäure, die in der vorliegenden Erfindung ersetzt werden kann, unterschiedlich sein. Daher sollte die „entsprechende Position“ in der vorliegenden Erfindung so verstanden werden, dass das Nukleotid/die Aminosäure an der angegebenen Nummer unterschiedlich sein kann, aber dennoch ein ähnliches Nukleotid/Aminosäure benachbart aufweisen kann. Das Nukleotid/die Aminosäure, das/die ausgetauscht, deletiert oder inseriert werden kann, ist ebenfalls in dem Begriff „entsprechende Position“ eingeschlossen. Um zu bestimmen, ob ein Nukleotidrest oder ein Aminosäurerest in einer bestimmten ALS-Nukleotid-/Aminosäuresequenz einer bestimmten Position in der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr: 1 oder der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr: 2 entspricht, kann der Fachmann im Fachgebiet bekannte Werkzeuge und Verfahren verwenden, wie zum Beispiel Alignment durch den Menschen oder durch die Verwendung von Computerprogrammen, wie zum Beispiel BLAST (Altschul et al. (1990), Journal of Molecular Biology, 215, 403 - 410) (das das Basic Local Alignment Search Tool darstellt) oder ClustalW (Thompson et al. (1994), Nucleic Acid Res., 22, 4673 - 4680) oder ein beliebiges anderes geeignetes Programm, das zur Erzeugung von Sequenzalignment geeignet ist.
Konkret stellt die vorliegende Erfindung eine Rapspflanze bereit, in der eine Tryptophan W → Leucin-L-Substitution an Position 556 des Polypeptids auftritt, das durch das endogene ALS-Gen der Rapspflanze kodiert wird, die auf die Mutation von einem „G“-Nukleotid zu einem „T“-Nukleotid an der Position zurückzuführen ist, die der Position 1667 der Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID Nr:1 gezeigt, entspricht. Weiterhin tritt eine Serin S → Asparagin N-Substitution an Position 635 des Polypeptids auf, das durch das endogene ALS-Gen der Rapspflanze kodiert wird, was auf die Mutation von einem „G“-Nukleotid zu einem „A“-Nukleotid an der Position zurückzuführen ist, die der Position 1904 der Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID Nr: 1 gezeigt, entspricht. In der am stärksten bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Rapspflanze bereit, in der das endogene ALS3-Gen der Rapspflanze die Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID Nr: 3 gezeigt, umfasst (oder aus ihr besteht), die für ein mutiertes ALS3-Polypeptid, wie in SEQ ID Nr: 4 gezeigt, kodiert.
Die ALS-Aktivität kann nach dem in Singh (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 4572 - 4576 beschriebenen Assay-Verfahren gemessen werden. Die ALS-Nukleotidsequenz, die für das hierin erwähnte ALS-Polypeptid kodiert, verleiht bevorzugt Toleranz gegenüber einem oder mehreren hierin beschriebenen Pyrimidinylsalicylat-Herbiziden (oder eine geringere Empfindlichkeit gegenüber den Pyrimidinylsalicylat-Herbiziden). Dies ist auf die hierin beschriebenen Punktmutationen zurückzuführen, die zu Aminosäuresubstitutionen führen. Daher kann die Toleranz gegenüber Pyrimidinylsalicylat-Herbiziden (oder eine geringere Empfindlichkeit gegenüber Pyrimidinylsalicylat-Herbiziden) gemessen werden, indem ALS-Proben aus Zellextrakten einer Pflanze mit einer mutierten ALS-Sequenz und einer Pflanze ohne eine mutierte ALS-Sequenz in Gegenwart der Pyrimidinylsalicylat-Herbizide erhalten werden und ihre Aktivitäten zum Beispiel durch das Verfahren, das in Singh et al (1988) [J. Chromatogr., 444, 251 - 261] beschrieben wird, verglichen werden. Bei der Verwendung von Pflanzen, bevorzugt in Gegenwart von Pyrimidinylsalicylat-Herbiziden in unterschiedlichen Konzentrationen, stärker bevorzugt in Gegenwart des Pyrimidinylsalicylat -Herbizids „Bispyribac-Natrium“ in unterschiedlichen Konzentrationen, wird der Assay der ALS-Aktivitäten im Wildtyp-Zellextrakt oder -Blattextrakt und im erhaltenen mutierten Rapszellextrakt oder Blattextrakt durchgeführt. Wenn hierin verwendet, gilt je geringer die Empfindlichkeit, „desto höher die Toleranz“ oder „desto höher die Resistenz“ und umgekehrt. In ähnlicher Weise gilt „je höher die Toleranz“ oder „je höher die Resistenz“, desto „niedriger die Empfindlichkeit“ und umgekehrt.
Der Begriff „Pyrimidinylsalicylat-Herbizid“ soll sich nicht auf ein einziges Herbizid beschränken, das die ALS-Enzymaktivität stören kann. Daher kann das „Pyrimidinylsalicylat-Herbizid“ ein einziges Herbizid oder eine Mischung aus zwei, drei, vier oder mehr im Fachgebiet bekannten Herbiziden sein, es sei denn, es ist anders angegeben oder aus dem Kontext offensichtlich. Die Herbizide sind bevorzugt die hierin aufgeführten, wie zum Beispiel Pyrithiobac-Natrium, Cloransulam-Methyl, Pyriftalid, Bispyribac-Natrium, Pyriminobac-Methyl, Pyribenzoxim, usw.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Rapspflanze mit einer endogenen Acetolactat-Synthase (ALS)-Genmutation bereit, die für ein Pyrimidinylsalicylat-Herbizid tolerierbar ist. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Pflanze“, sofern nicht ausdrücklich anders angegeben, eine Pflanze in einem beliebigen Entwicklungsstadium. Ein Teil der Pflanze kann mit der ganzen Pflanze verbunden sein oder kann von der ganzen Pflanze getrennt sein. Ein solcher Teil der Pflanze schließt ein, ist aber nicht beschränkt auf ein Organ, ein Gewebe und eine Zelle der Pflanze, bevorzugt einen Samen. Die Rapspflanze der vorliegenden Erfindung ist in Bezug auf das endogene ALS-Gen nicht transgen. Natürlich kann ein Fremdgen durch Gentechnik oder durch konventionelle Verfahren, wie zum Beispiel Hybridisierung, in die Pflanze übertragen werden.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden basierend auf Beispielen beschrieben, aber die vorliegende Erfindung ist nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Beispiel 1
In der früheren Patentanmeldung (Hu Maolong et al., chinesisches Patent: CN 107245480 A, Mutiertes Acetolactat-Synthase-Protein mit Herbizidresistenz und Verwendung davon) wurde der Wildtyp-Rapsstamm N131 (bekannt und öffentlich verwendet, siehe Pu Huiming, et al., Jiangsu Journal of Agricultural Science, 2010, 26 (6): 1432 - 1434) einer Mutagenesebehandlung mit Ethylmethansulfonat (EMS) unterzogen. In der mutagenisierten M2-Generation durchsuchten und identifizierten wir die Mutante EM28, die gegen Sulfonylharnstoff-Herbizide resistent war. Die EM28-Pflanzensamen wurden am 19. Juni 2017 beim China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC) des China Committee for Culture Collection of Microorganisms, Adresse: Nr. 3, Nr. 1, West Beichen Road, Chaoyang District, Beijing, 100101, hinterlegt, die Zugangsnummer war CGMCC Nr. 14299, und der Stamm wurde Brassica napus benannt. Nachfolgende genetische und Resistenz-Identifikationsstudien ergaben, dass es sich bei dem Resistenzmerkmal von EM28 um ein unvollständiges dominantes Merkmal handelte, das von einem Kerngen reguliert wurde, das gegen Imidazolinon- und Sulfonylharnstoff-Herbizide resistent, aber empfindlich gegenüber Pyrimidinylsalicylat-Herbizide war. Um ein Keimplasma oder eine Quelle von Raps zu erhalten, der gegen Pyrimidinylsalicylat-Herbizide resistent ist, um den Bedürfnissen der Züchtung Herbizid-resistenter Rapssorten gerecht zu werden, führten wir daher erneut eine EMS-Mutagenesebehandlung von EM28-Samen durch, und die EMS-Mutagenese wurde mit demselben Verfahren durchgeführt. Als die Sämlinge der M2-Generation bis zum 3-4-Blatt-Stadium wuchsen, wurden sie mit dem Pyrimidinylsalicylat-Herbizid Bispyribac-Natrium [Chemische Bezeichnung: Natrium-2,6-bis(4,6-dimethoxypyrimidin-2-oxyl)-benzoat, Molekulare Formel: C₁₉H₁₇N₄NaO₈. CAS-Nummer: 125401-92-5 (Natriumsalz)] besprüht, wobei das versprühte Bispyribac-Natrium eine Konzentration von 60 g a.i. ha^-1 aufwies, wie für die Unkrautregulierung empfohlen, wodurch das Durchsuchen auf Keimplasma durchgeführt wurde, das gegen das Pyrimidinylsalicylat-Herbizid resistent ist. Nach Behandlung für 3 Wochen waren fast alle Rapssämlinge dem Tod nahe, und nur 10 Sämlinge überlebten und wuchsen normal. Diese 10 Stämme standen im Verdacht, einzelne Rapspflanzen zu sein, die gegen das Pyrimidinylsalicylat-Herbizid resistent waren, und wurden als Sh1 bis Sh10 nummeriert. Nachdem diese Sämlinge zum 5-6-Blatt-Stadium wuchsen, wurden sie auf das Raps-Zuchtfeld verlagert, und die M3-Samen wurden durch Selbstkreuzung im Beutel während der Blütephase in diesem Jahr geerntet. Im hellen Anbauraum wurden die M3-Sämlinge mit Bispyribac-Natriumherbizid in der für die Unkrautregulierung empfohlenen Konzentration besprüht, um Resistenzwirkungen zu identifizieren. Ab der Woche 1 nach dem Sprühen wurden die Phytotoxizitätsreaktionen jeden Tag beobachtet. Die Ergebnisse zeigten, dass Phytotoxizitätsreaktionen in den 6 Stämmen mit den Nummern Sh1, Sh2, Sh3, Sh8, Sh9 und Sh10 und der Kontrolle in der Woche 1 nach dem Sprühen beobachtet wurden, bei denen die Herzblätter der Sämlinge anfingen, gelb zu werden und allmählich verfaulten und schließlich abstarben, und diese Sämlinge waren diejenigen, die beim Sprühen des Herbizids unter Dichtpflanzungs-Bedingungen verfehlt wurden; während die 4 Stämme mit den Nummern Sh4, Sh5, Sh6 und Sh7 eine starke Resistenz ohne beliebige Symptome von Phytotoxizität zeigten und normal wachsen konnten. Bislang erhielten wir 4 neue Keimplasmen von Brassica napus, die gegen das Pyrimidinylsalicylat-Herbizid Bispyribac-Natrium resistent waren. Später wurde durch klassische genetische Studien festgestellt, dass das Trennungsverhältnis der Überlebens- und Todesstämme in der Population der F2-Generation 3:1 in Bezug auf das Resistenzmerkmal betrug, was mit der genetischen Regel des einzelnen dominanten Gens übereinstimmte. Mit anderen Worten, das mutierte Gen war dominant und wurde von einem einzigen Gen kontrolliert.
Beispiel 2: Molekulares Klonieren eines Resistenzgens im neuen Keimplasma von Brassica napus, das gegen Pyrimidinylsalicylat-Herbizid resistent ist
Pyrimidinylsalicylat-Herbizide gehören zur allgemeinen Kategorie von ALS-Inhibitorherbiziden, und das Ziel dieser Herbizide ist die Acetolactat-Synthase. Im Genom von Brassica napus gibt es 3 funktionelle Acetolactat-Synthase-Gene, die an ALS2 und ALS3 (Genbank-Zugangsnummern: Z11525 und Z11526) des A-Genoms sowie ALS1 (Genbank-Zugangsnummer: Z11524) des C-Genoms lokalisiert sind. Basierend auf den drei ALS-Gensequenzen wurden jeweils drei PCR-Primer-Paare entworfen. ALS1 Primer 1: GTGGATCTAACTGTTCTTGA und Primer 2: AGAGATGAAGCTGGTGATC. ALS2 Primer 1: GAGTGTTGCGAGAAATTGCTT und Primer 2: TTGATTATTCTATGCTCTCTTCTG. ALS3 Primer 1: ATGGTTAGATGAGAGAGAGAGAG und Primer 2: GGTCGCACTAAGTACTGAGAG. Das CTAB-Verfahren wurde verwendet, um genomische DNA-Proben des Blattes von resistenten Stämmen Sh4, Sh5, Sh6, Sh7 und nicht resistenten Stämmen Sh1, Sh2, Sh3, Sh8, Sh9, Sh10 bzw. N131, EM28 zu extrahieren, und die Wildtyp- und mutierten ALS1 ALS2- und ALS3-Gene wurden PCR-Klonieren unterzogen. 50µl PCR-Reaktionssystem wurde nach den Anweisungen des High-Fidelity-DNA-Polymerase KOD-Plus-Kits von Toyobo (Shanghai) Biotechnology Co., Ltd. hergestellt. Die Amplifikation wurde auf einem MJ Research PTC-200 PCR-Instrument durchgeführt, wobei das Reaktionsprogramm 94°C Vordenaturierung für 5 min, 94°C Denaturierung für 30 s, 55°C Anlagerung für 30 s und 72°C Verlängerung für 2,5 min war, insgesamt für 35 Zyklen. Nach Zugabe von A zum stumpfen Ende wurde das Produkt durch 1,2% (v/w) Agarosegel-Elektrophorese getrennt, gereinigt und mit dem Agarosegel-DNA-Rückgewinnungskit (Katalognummer: DP209) der Beijing Tiangen Company zurückgewonnen, und das gereinigte PCR-Produkt wurde von Nanjing Jinsirui Biological Co., Ltd. sequenziert. Wie bei der Sequenzierung und dem Vergleich festgestellt wurde, zeigten die vier resistenten Stämme alle bei der Detektion die Punktmutationen an zwei Stellen auf dem ALS3-Gen. Das heißt, im ALS3-Gen trat eine Punktmutation an Position +1667 auf, wo sich das Nukleotid von G zu T änderte, was zur Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an der Position 556 des entsprechenden kodierten Proteins führte; eine Punktmutation trat an Position +1904 auf, wo sich das Nukleotid von G zu A änderte, was zur Mutation von Serin (S) zu Asparagin (N) an der Position 635 des entsprechenden kodierten Proteins führte (1). Daher wies das ALS3-Gen in den resistenten Stämmen im Vergleich zur Mutante EM28 eine neu hinzugefügte Mutationsstelle (S635N) auf, deren Nukleotide in SEQ ID Nr: 3 gezeigt wurden und deren Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr: 4 gezeigt wurde. Die Mutationen an doppelter Stelle (W556L und S635N) des ALS3-Gens verstärkten die Resistenz der resistenten Mutante gegen das Pyrimidinylsalicylat-Herbizid.
Beispiel 3: Bewertung und Identifizierung der Wirkungen von Herbizidresistenz von resistenten Stämmen
Sh7 mit starkem Wachstumspotential und guter Pflanzenart wurde ausgewählt, vorläufig als RP-1 bezeichnet, und als ein Vertreter der resistenten Stämme verwendet. N131 und EM28 wurden als Kontrollmaterialien verwendet, die Identifizierung und Bewertung der Resistenzwirkungen von RP-1 wurde mit zwei Verfahren durchgeführt, d.h. mit einem Feld-Identifikationstest und einem Gewächshaus-Topf-Inkubationstest. Der Feld-Identifikationstest von Raps wurde im isolierten Zuchtbereich für Raps in der Jiangsu Academy of Agricultural Sciences durchgeführt, und der Gewächshaus-Topf-Inkubationstest wurde in einem hellen Anbauraum mit konstanter Temperatur durchgeführt. Nachdem alle Behandlungsmaterialien ausgesät und bis zum Alter von 3-4 Blattsämlingen gewachsen waren, wurden drei Arten von in China weit verbreitet verwendeten ALS-Inhibitor-Herbiziden gesprüht, wobei das Pyrimidinylsalicylat-Herbizid Bispyribac-Natrium [Natrium-2,6-bis-(4,6-dimethoxypyrimidin-2-oxy)-benzoat] war, das SU-Herbizid Tribenuron-methyl (Methyl-2-[N-(4-methoxy-6-methyl-1,3,5-triazin-2-yl)-N-methylaminoformamidosulfonyl]-benzoat) war und das IMI-Herbizid Imazethapyr [(RS)-5-Ethyl-2-(4-isopropyl-4-methyl-5-oxo-1H-imidazolin-2-yl)-nicotinsäure] war. Drei Wochen nach dem Sprühen der Herbizide wurden die Resistenzwirkungen von Sämlingen bei unterschiedlichen Herbizidkonzentrationen entsprechend der Wachstumsleistung der Sämlinge bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, dass das Material RP-1 mit Mutationen an doppelter Stelle (W556L und S635N) des ALS3-Gens eine erhöhte Resistenz gegen das Pyrimidinylsalicylat-Herbizid zeigte.
Tabelle 1: Resistenzleistungen von drei Rapsen nach Behandlung mit ALS-Inhibitor-Herbiziden in unterschiedlichen Konzentrationen

Material Bispyribac-Natrium (g a.i. ha^-1) Tribenuron-methyl (g a.i. ha^-1) Imazethapyr (g a.i. ha^-1)

60 120 22,5 45 45 90

RP-1 R R R R R R

EM28 S S R R R R

N131 S S S S S S
Anmerkung: R gibt an, dass die Rapspflanzen nach der Herbizidbehandlung gut wuchsen und es keine Phytotoxizität gab; S gibt an, dass das Wachstum der Rapspflanzen nach der Herbizidbehandlung stark inhibiert war, die Phytotoxizitätsleistung offensichtlich war und die Sämlinge schließlich abstarben (dasselbe unten).
Beispiel 4: Inhibitionstest von Herbiziden auf die ALS-Enzymaktivität
Entsprechend den Ergebnissen der Resistenzphänotyp-Identifizierung wurde ein in vitro Enzymaktivitätstest durchgeführt, um die Inhibitionswirkungen von drei Herbizidarten, d. h. Bispyribac-Natrium (PB-Art), Tribenuron-methyl (SU-Art) und Imazethapyr (IMI-Art), auf das ALS-Enzym in RP-1, EM28 und dem ursprünglichen Wildtyp N131 zu vergleichen, und die Unterschiede zwischen den drei Materialien wurden verglichen. Für die Messung der ALS-Enzymaktivität wurde auf das Verfahren von Singh et al. verwiesen (Singh BK, et al., Analytical Biochemistry, 1988, 171: 173 - 179). Konkret wurden 0,2 g Blattprobe entnommen, gemahlen und mit flüssigem Stickstoff in einem Mörser pulverisiert, und die gemahlene Probe wurde in 4,5 ml der anfänglichen Enzymextraktlösung [100 mM K₂HPO₄, 0,5 mM MgCl₂, 0,5 mM Thiaminpyrophosphat (TPP), 10 µM Flavinadenindinucleotid (FAD), 10 mM Natriumpyruvat, 10% (v/v) Glycerin, 1 mM Dithiothreitol, 1 mM Benzylsulfonylfluorid (PMSF), 0,5% (w/v) Polyvinylpyrrolidon] zugegeben, bei 4°C und 12000 rpm für 20 min zentrifugiert. Der Überstand wurde entnommen, mit einem gleichen Volumen an gesättigtem (NH₄)₂SO₄ versetzt, für 30 min auf Eis platziert, bei 4°C und 12000 rpm für 20 min zentrifugiert, der Überstand verworfen, mit 1 ml des anfänglichen Enzymextrakts versetzt und zur Auflösung geschüttelt, um ALS-Enzymlösung für jede Probe zu erhalten. 200µl der extrahierten ALS-Enzymlösung wurden entnommen und separat mit 360µl 50mM Hepes-NaOH-Enzymreaktionspuffer (pH = 7,5), 80µl 20 mM TPP, 80µl 200µM FAD, 80µl 2M Natriumpyruvat + 200mM MgCl₂ und ALS-Herbizid in unterschiedlichen Konzentrationen versetzt, gut gemischt, für 1h bei 37°C umgesetzt, dann mit 160µl 3M H₂SO₄ versetzt, um die Reaktion zu stoppen, und für 15 min bei 60°C einer Decarboxylierung unterzogen; dann mit 780µl 5,5% α-Naphthol-Lösung und 780µl 0,55% Kreatin versetzt, für 15 min einer Farbentwicklung bei 65°C und Farbabstimmung bei 530nm unterzogen, der Lichtabsorptionswert wurde abgelesen und die Enzymaktivität wurde gemäß der Standardkurve berechnet. Die ALS-Enzymaktivität der herbizidfreien Kontrolle wurde als 100% dokumentiert und die Wirkungen von Bispyribac-Natrium (PB-Art), Tribenuron-methyl (SU-Art) und Imazethapyr (IMI-Art) auf die ALS-Enzymaktivität in RP-1, EM28 und dem ursprünglichen Wildtyp N131 wurden berechnet.
Wie aus den 2 und 3 ersichtlich ist, wurde mit dem Anstieg der Konzentrationen des SU-Herbizids Tribenuron-methyl und des IMI-Herbizids Imazethapyr die ALS-Enzymaktivität im Wildtyp N131, EM28 und RP-1 alle inhibiert, während die mutierten Enzyme in EM28 und RP-1 alle eine gewisse Resistenz gegen die Herbizide zeigten, weil im Vergleich zum Wildtyp N131 mit dem Anstieg der Konzentration von Tribenuron-methyl der Inhibitionsverlauf der ALS-Enzymaktivität in EM28 und RP-1 langsam abnahm, und die Beiden zeigten den gleichen Änderungsverlauf.
Aus 4 ist ersichtlich, dass das mutierte Enzym in RP-1 eine starke Resistenz gegen das Pyrimidinylsalicylat-Herbizid Bispyribac-Natrium aufwies, da im Vergleich zu N131 und EM28 mit dem Anstieg der Konzentration von Bispyribac-Natrium die ALS-Enzymaktivität in N131 und EM28 rasch abnahm und den gleichen Änderungsverlauf zeigte, während die mutierte Enzymaktivität in RP-1 durch das Herbizid weniger inhibiert wurde, d.h. selbst unter der Bedingung einer hohen Konzentration (250µmol l^-1) von Bispyribac-Natrium lag die mutierte Enzymaktivität in RP-1 bei etwa 51% der Kontrolle. Zu diesem Zeitpunkt waren die Inhibitionsraten der Enzymaktivität in N131 und EM28 jedoch nahe bei 100%, d.h. die ALS in N131 und EM28 wies im Grunde keine Aktivität auf, wobei sie nur 4% bzw. 10% der Kontrolle war. Zusammenfassend war die Empfindlichkeit des ALS-Enzyms in der Mutante RP-1 gegenüber dem Pyrimidinylsalicylat-Herbizid Bispyribac-Natrium signifikant geringer als die der ALS-Enzyme in N131 und EM28. Dies deutet weiterhin darauf hin, dass die Mutationen an doppelter Stelle des ALS-Gens (W556L und S635N) RP-1 eine Resistenz gegen Pyrimidinylsalicylat-Herbizide verleihen.
Beispiel 5: Funktionelle Verifizierung des Resistenzgens in Arabidopsis thaliana
Ein Pflanzenexpressionsvektor wurde konstruiert und das Resistenzgen wurde mit dem konventionellen Agrobacterium-vermittelten Transformationsverfahren in eine Arabidopsis thaliana-Pflanze übertragen und positive homozygote transgene Linien wurden in der Nachkommenschaft von Transgenen mittels PCR auf die Herbizidphänotyp-Identifizierung durchsucht. Kurz gesagt, es wurden spezifische Primer entsprechend der ALS3-Gensequenz entworfen, ALS3-Primer 3: 5'CGCGGTACCCTCTCTCTCTCTCATCTAACCAT3' und ALS3-Primer 4: 5'CGCACTAGTCTCTCTCAGTACTTAGTGCGACC3', Kpnl und Spel-Enzymmodifikationsstellen wurden am 5'-Ende zugefügt und die unterstrichenen Sequenzen waren Enzymverdauungsstellen. Unter Verwendung der genomischen DNA der Mutante RP-1 als eine Matrize wurde das Resistenzgen durch PCR-Amplifikation erhalten, dessen Nukleotide wurden in SEQ ID NR: 3 gezeigt und dessen Aminosäuresequenz wurde in SEQ ID NR: 4 gezeigt. Das PCR-Produkt wurde zurückgewonnen, kloniert und nach dem Verfahren von Beispiel 2 sequenziert, um einen rekombinanten T-Vektor zu erhalten, der das Gen trägt, das für das mutierte Enzym kodiert. Die Fragmente, die das Gen von Interesse enthielten, wurden durch Doppelverdau des T-Vektors mit Kpnl und Spel zurückgewonnen und in den pCAMBIA1390-Vektor (erworben von CAMBI, Australien) ligiert, der ebenfalls doppelt verdaut wurde, um einen rekombinanten Pflanzenexpressionsvektor zu erhalten. Der konstruierte rekombinante Vektor wurde in E. coli DH5α transformiert und das Plasmid wurde für den Enzymverdau und die Sequenzierungsdetektion extrahiert. Der rekombinante Vektor, der durch Detektion bestätigt wurde, das Zielgen korrekt zu enthalten, wurde in den Agrobacterium-Stamm EHA105 transformiert und das Plasmid wurde für PCR und die Identifizierung durch Enzymverdau extrahiert. Der erhaltene rekombinante Stamm wurde kultiviert und mittels Agrobacterium-Infektion-Blüten-Eintauchverfahren in Arabidopsis thaliana transformiert. Nachdem die T0-Generation auf Medium mit Antibiotika durchsucht worden war, wurden die erhaltenen Pflanzen der T1-Generation in Töpfe transplantiert und in einen künstlichen Inkubator zum Wachstum platziert und die homozygoten transgenen Linien der T3-Generation wurden durch PCR-Screening und Vermehrung erhalten. Im transgenen Sämlingsstadium der T3-Generation wurden 60 g a.i. ha^-1 Bispyribac-Natrium zur Resistenzidentifikation gesprüht. Nach 3 Wochen Sprühbehandlung wuchsen alle transgenen Arabidopsis thaliana-Sämlinge gut, während nicht transgene Arabidopsis thaliana-Sämlinge (Col) alle vergilbten und abstarben (5), was darauf hinweist, dass die Expression von Nukleotiden in RP-1 wie zum Beispiel das mutierte Acetolactat-Synthase-Gen, wie in SEQ ID Nr: 3 gezeigt, in Arabidopsis thaliana die Funktion aufwies, gegen das Pyrimidinylsalicylat-Herbizid resistent zu sein.
Beispiel 6: Funktionelle Verifizierung des Resistenzgens in Tabak
Gemäß dem Verfahren von Beispiel 5 wurden die Nukleotide in RP-1, wie zum Beispiel das mutierte Acetolactat-Synthase-Gen, wie in SEQ ID NR: 3 gezeigt, in den Pflanzenexpressionsvektor pCAMBIA1390-Plasmid (erworben von CAMBI, Australien) kloniert. Die positiven Klone wurden ausgewählt und in Agrobacterium EHA105 transformiert, und die Blattscheibe von Nicotiana benthamiana wurde mit dem konventionellen Agrobacterium-vermittelten Transformationsverfahren transformiert. Nachdem die transgenen Tabakpflanzen geerntet worden waren, wurden sie mittels PCR identifiziert und mit 60 g a.i. ha^-1 Bispyribac-Natrium im T3-Sämlingsstadium des transgenen Tabaks besprüht, um eine Resistenz zu identifizieren. Nach 3 Wochen Sprühbehandlung wuchsen alle transgenen Tabaksämlinge gut, während die nicht transgenen Tabak-Sämlinge (Tob) alle vergilbten und abstarben (5), was darauf hinweist, dass die Expression von Nukleotiden in RP-1, wie zum Beispiel das mutierte Acetolactat-Synthase-Gen, wie in SEQ ID NR: 3 gezeigt, auch im Tabak die Funktion aufwies, gegen das Pyrimidinylsalicylat-Herbizid resistent zu sein.
Beispiel 7: Funktionelle Verifizierung des Resistenzgens in gewöhnlichem Raps
Die Nukleotide in RP-1, wie zum Beispiel das mutierte Acetolactat-Synthase-Gen, wie in SEQ ID Nr: 3 gezeigt, wurden unter Verwendung eines Hybridisierungsverfahrens in andere gewöhnliche Rapssorten oder -stämme eingeführt, die nicht gegen Pyrimidinylsalicylat-Herbizide resistent waren. Kurz gesagt wurde RP-1 zur Herstellung von Hybridkombinationen mit den Wiederherstellungslinien 3075R (Pu Huiming et al., 2002, Jiangsu Agricultural Sciences, 4: 33 - 34) und 3018R (Pu Huiming et al, 1999, Jiangsu Agricultural Science, 6: 32 - 33) von gewöhnlichen Rapssorten verwendet, zwei F1-Samen wurden im selben Jahr geerntet und für die zusätzliche Anpflanzung in einem Raps-Vernalisations-Anbauraum verwendet, einzelne Pflanzen mit gleichmäßigem Wachstum wurden im Blühstadium einer Selbstbestäubung im Beutel unterzogen, die F2-Samen wurden geerntet und in der Lishui Plant Science Base der Academy of Agricultural Sciences der Provinz Jiangsu in Nanjing ausgesät, wobei jede F2-Population mit 20 Reihen ausgesät wurde. Einzelne Pflanzenblätter der F2-Population wurden im Sämlingsstadium entnommen, DNA wurde extrahiert, das ALS3-Gen wurde durch PCR amplifiziert und das Produkt wurde Reinigung, Rückgewinnung und Sequenzierung gemäß den Schritten aus Beispiel 2 unterzogen. Gemäß den Sequenzierungsergebnissen wurde eine homozygote F2-Einzelpflanze, die die Nukleotide in RP-1 aufweist, wie zum Beispiel das mutierte Acetolactat-Synthase-Gen, wie in SEQ ID Nr: 3 gezeigt, durchsucht. Im Blühstadium von Raps wurde jede ausgewählte F2-Einzelpflanze zur Selbstkreuzung in einen Beutel überführt und die F3-Samen wurden geerntet. Im Sämlingsstadium der F3-Generation wurden 60g a.i. ha^-1 Bispyribac-Natrium zur Resistenzidentifikation versprüht. Nach 3 Wochen Sprühbehandlung befanden sich alle ausgewählten Rapssämlinge, in die das Resistenzgen eingeführt wurde, in einem guten Wachstumszustand, während alle Rapssämlinge ohne Resistenzgen vergilbten und abstarben, was darauf hinweist, dass die Expression von Nukleotiden in RP-1 wie zum Beispiel das mutierte Acetolactat-Synthase-Gen, wie in SEQ ID Nr: 3 gezeigt, auch im Raps die Funktion aufwies, gegen das Pyrimidinylsalicylat-Herbizid resistent zu sein.
Beispiel 8: Studie zur Resistenzfunktion von Substitutionen mit unterschiedlichen Aminosäuren an Resistenzmutationsstellen
Um die Resistenzfunktion zu klären, die durch ALS3 hergestellt wird wenn zwei Stellen Trp556 und Ser635 zu anderen Aminosäuren mutiert sind, haben wir eine große Anzahl relevanter Literaturen konsultiert und 5 Aminosäuremutationskombinationen entworfen (Tabelle 2), die manuell in Punktmutationsstellen eingeführt und zur Konstruktion von Pflanzenexpressionsvektoren davon verwendet wurden, und deren Resistenzfunktionen wurden durch Transformieren von Arabidopsis thaliana verifiziert. Kurz gesagt, das mutierte RP-1-Genom wurde als eine Matrize verwendet, um orts-spezifische Mutagenese unter Verwendung der PCR-Technologie durchzuführen, die durch die Beauftragung von Nanjing Zhongding Biotechnology Co., Ltd. durchgeführt wurde. Als Ergebnis wurden 5 mutierte Gene erhalten: LT, in dem sich das Nukleotid an Position +1667 des ALS3-Gens von G nach T änderte und sich das Nukleotid an Position +1904 von G nach C änderte, was zur Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an Position 556 und zur Mutation von Serin (S) zu Threonin (T) an Position 635 des entsprechenden kodierten Proteins führte; LI, in dem sich das Nukleotid an Position +1667 des ALS3-Gens von G nach T änderte und sich das Nukleotid an Position +1904 von G nach T änderte, was zur Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an Position 556 und zur Mutation von Serin (S) zu Isoleucin (I) an Position 635 des entsprechenden kodierten Proteins führte; GN, in dem sich das Nukleotid an Position +1666 des ALS3-Gens von T nach G änderte und das Nukleotid an Position +1904 von G nach A änderte, was zur Mutation von Tryptophan (W) zu Glycin (G) an Position 556 und zur Mutation von Serin (S) zu Asparagin (N) an Position 635 des entsprechenden kodierten Proteins führte; GT, in dem sich das Nukleotid an Position +1666 des ALS3-Gens von T nach G änderte und das Nukleotid an Position +1904 von G nach C änderte, was zur Mutation von Tryptophan (W) zu Glycin (G) an Position 556 und zur Mutation von Serin (S) zu Threonin (T) an Position 635 des entsprechenden kodierten Proteins führte; Gl, in dem sich das Nukleotid an Position +1666 des ALS3-Gens von T nach G änderte und das Nukleotid an Position +1904 von G nach T änderte, was zur Mutation von Tryptophan (W) zu Glycin (G) an Position 556 und zur Mutation von Serin (S) zu Isoleucin (I) an Position 635 des entsprechenden kodierten Proteins führte (Tabelle 2).
Gemäß dem Verfahren von Beispiel 5 wurden die obigen fünf mutierten Sequenzen in den Pflanzenexpressionsvektor pCAMBIA1390 Plasmid (erworben von CAMBI, Australien) konstruiert und in Arabidopsis thaliana transformiert. Nach dem Erhalt positiver transgener Sämlinge wurden 60 g a.i. ha^-1 Bispyribac-Natrium im Sämlingsstadium zur Resistenzidentifizierung gesprüht. Nach 3 Wochen Sprühbehandlung wuchsen alle transgenen Arabidopsis thaliana-Sämlinge von LT und LI gut, während die transgenen Arabidopsis thaliana-Sämlinge von GN, GT und GI und die nicht transgenen Arabidopsis thaliana-Sämlinge alle vergilbten und abstarben (Tabelle 2), was darauf hinweist, dass die Expression von Sequenzen von LT- und LI-Aminosäuremutationskombinationen in Arabidopsis thaliana die Funktion aufwies, gegen das Pyrimidinylsalicylat-Herbizid resistent zu sein.

Tabelle 2: Resistenzleistung unterschiedlicher Sequenzen von Aminosäuremutationskombinationen in Arabidopsis thaliana

Mutantenname	DNA-Mutationsstellen	entsprechende Aminosäurestellen-Substitutionen	Resistenzleistung
LT	+1667: TGG/TTG;	W556L; S635T	R
	+1904: AGT/ACT
LI	+1667: TGG/TTG^-,	W556L, S635I	R
	+1904: AGT/ATT
GN	+1666: TGG/GGG;	W556G; S635N	S
	+1904: AGT/AAT
GT	+1666: TGG/GGG;	W556G; S635T	S
	+1904: AGT/ACT
GI	+1666: TGG/GGG;	W556G; S6351	S
	+1904: AGT/ATT

Anmerkung: dickgedruckte Buchstaben in Kursivschrift zeigen mutierte Basen an; R gibt an, dass die transgenen Pflanzen nach der Herbizidbehandlung gut wuchsen und keine Phytotoxizität auftrat; S gibt an, dass das Wachstum der Rapspflanzen nach der Herbizidbehandlung stark inhibiert war, was eine offensichtliche Phytotoxizität anzeigt und die Raps-Sämlinge schließlich abstarben.
Obwohl die spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung oben beschrieben worden sind, sollte der Fachmann verstehen, dass es sich hierbei lediglich um Beispiele handelt und der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung durch die beigefügten Ansprüche definiert wird. Der Fachmann kann an diesen Ausführungsformen verschiedene Änderungen oder Modifikationen vornehmen, ohne vom Prinzip und Wesen der vorliegenden Erfindung abzuweichen, aber diese Änderungen und Modifikationen fallen in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

(Yu Q, Han HP, Martin M, Vila-Aiub, Powles SB. AHAS herbicide resistance endowing mutations: effect on AHAS functionality and plant growth. J Exp Botany, 2010, 61: 3925 - 3934) [0005]
(Altschul et al. (1990), Journal of Molecular Biology, 215, 403 - 410) (das das Basic Local Alignment Search Tool darstellt) oder ClustalW (Thompson et al. (1994), Nucleic Acid Res., 22, 4673 - 4680 [0025]
Die ALS-Aktivität kann nach dem in Singh (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 4572 - 4576 [0027]
Singh et al (1988) [J. Chromatogr., 444, 251 - 261 [0027]
(Hu Maolong et al., chinesisches Patent: CN 107245480 A, Mutiertes Acetolactat-Synthase-Protein mit Herbizidresistenz und Verwendung davon) wurde der Wildtyp-Rapsstamm N131 (bekannt und öffentlich verwendet, siehe Pu Huiming, et al., Jiangsu Journal of Agricultural Science, 2010, 26 (6): 1432 - 1434 [0031]
Singh et al. verwiesen (Singh BK, et al., Analytical Biochemistry, 1988, 171: 173 - 179 [0036]
(Pu Huiming et al., 2002, Jiangsu Agricultural Sciences, 4: 33 - 34) und 3018R (Pu Huiming et al, 1999, Jiangsu Agricultural Science, 6: 32 - 33 [0041]

Claims

Isolierte Nukleinsäure, die für ein mutiertes Acetolactat-Synthase-Protein kodiert, wobei das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein die folgenden Mutationen umfasst: Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an einer Position, die Position 556 von SEQ ID Nr: 2 entspricht und Mutation von Serin (S) zu Asparagin (N), Threonin (T) oder Isoleucin (I) an einer Position, die Position 635 von SEQ ID Nr: 2 entspricht; bevorzugt weist die isolierte Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz wie in SEQ ID Nr: 3 gezeigt, auf; bevorzugt weist das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr: 4 gezeigt, auf;
Expressionskassette, Vektor oder Zelle, die/der die Nukleinsäure nach Anspruch 1 umfasst.
Mutiertes Acetolactat-Synthase-Protein, das die folgenden Mutationen umfasst: Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an einer Position, die Position 556 von SEQ ID Nr: 2 entspricht und Mutation von Serin (S) zu Asparagin (N), Threonin (T) oder Isoleucin (I) an einer Position, die Position 635 von SEQ ID Nr: 2 entspricht; bevorzugt, wobei das Protein eine Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an einer Position, die Position 556 von SEQ ID Nr: 2 entspricht und eine Mutation von Serin (S) zu Asparagin (N) an einer Position, die Position 635 von SEQ ID Nr: 2 entspricht, umfasst; stärker bevorzugt, wobei das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr: 4 gezeigt, aufweist.
Verwendung der Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder der Expressionskassette, des Vektors oder der Zelle nach Anspruch 2 oder des mutierten Acetolactat-Synthase-Proteins nach Anspruch 3 bei der Herstellung einer Pflanze, die gegen ein Pyrimidinylsalicylat-Herbizid resistent ist; bevorzugt ist die Pflanze Raps, und die Nukleinsäure kodiert für das ALS3-Protein von Brassica napus.
Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, die resistent gegen ein Pyrimidinylsalicylat-Herbizid ist, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: Einführen der Nukleinsäure nach Anspruch 1 in eine Pflanze, bevorzugt Einführen der Nukleinsäure nach Anspruch 1 in eine Pflanze durch Schritte wie zum Beispiel Transgenese, Kreuzung, Rückkreuzung oder vegetative Vermehrung, wobei die Pflanze das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein nach Anspruch 3 exprimiert und Resistenz gegen ein Pyrimidinylsalicylat-Herbizid aufweist.
Nicht transgene Pflanze, die resistent gegen ein Pyrimidinylsalicylat-Herbizid ist, oder ein Teil davon, die/der eine isolierte Nukleinsäure umfasst, die für ein mutiertes Acetolactat-Synthase-Protein kodiert, wobei das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein die folgenden Mutationen umfasst: Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an einer Position, die Position 556 von SEQ ID Nr: 2 entspricht und Mutation von Serin (S) zu Asparagin (N), Threonin (T) oder Isoleucin (I) an einer Position, die Position 635 von SEQ ID Nr: 2 entspricht; bevorzugt, wobei die Pflanze ein Raps ist; wobei der Teil ein Organ, ein Gewebe und eine Zelle der Pflanze ist und bevorzugt ein Samen; bevorzugt, wobei das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein eine Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an einer Position, die Position 556 von SEQ ID Nr: 2 entspricht und eine Mutation von Serin (S) zu Asparagin (N) an einer Position, die Position 635 von SEQ ID Nr: 2 entspricht, umfasst; stärker bevorzugt, wobei das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr: 4 gezeigt aufweist.
Verfahren zur Regulierung eines Unkrauts in einem Feld, das eine Rapspflanze enthält, wobei das Verfahren Anwenden einer wirksamen Menge eines Pyrimidinylsalicylat-Herbizids auf das Feld umfasst, das das Unkraut und die Rapspflanze enthält, wobei die Rapspflanze eine isolierte Nukleinsäure umfasst, die für ein mutiertes Acetolactat-Synthase-Protein kodiert, wobei das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein die folgenden Mutationen umfasst: Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an einer Position, die Position 556 von SEQ ID Nr: 2 entspricht und Mutation von Serin (S) zu Asparagin (N), Threonin (T) oder Isoleucin (I) an einer Position, die Position 635 von SEQ ID Nr: 2 entspricht; bevorzugt, wobei das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein eine Mutation von Tryptophan (W) zu Leucin (L) an einer Position, die Position 556 von SEQ ID Nr: 2 entspricht und eine Mutation von Serin (S) zu Asparagin (N) an einer Position, die Position 635 von SEQ ID Nr: 2 entspricht, umfasst; stärker bevorzugt, wobei das mutierte Acetolactat-Synthase-Protein eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr: 4 gezeigt, aufweist.