CN111373035B - 油菜抗三唑嘧啶磺酰胺类除草剂基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了油菜抗三唑嘧啶磺酰胺类除草剂基因及其应用。更具体地，本发明提供了耐受三唑嘧啶磺酰胺类除草剂的油菜植物及其部分、抗性基因、突变蛋白及其应用。

Description

油菜抗三唑嘧啶磺酰胺类除草剂基因及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地，涉及油菜抗三唑嘧啶磺酰胺类除草剂基因及其应用。更具体地，本发明涉及耐受三唑嘧啶磺酰胺类除草剂的油菜植物及其部分、抗性基因、突变蛋白及其应用。

背景技术

油菜是我国播种面积最大，地区分布最广的油料作物。我国是世界上生产油菜籽最多的国家。油菜生产过程中一类重要的生物危害是农田杂草，其不但与油菜作物争水争肥争光，而且改变油菜作物田间小气候，甚至有些杂草还是油菜作物病虫害的中间寄主，加快病虫害的蔓延，严重影响了油菜作物产量和品质。然而，人工除草费时、费力，增加生产成本。因此，应用除草剂防治田间杂草成为人们的必然选择。

除草剂主要是通过抑制或干扰植物关键的代谢过程而抑制植物生长或杀死植物。以氨基酸生物合成过程中的关键酶为靶标，是研发新型高效除草剂的一个重要方向和热点。以乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase，ALS；EC2.2..16)为靶酶开发的除草剂，己经成为新型高效除草剂的主流产品。ALS是催化支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)生物合成第一步的酶。ALS抑制剂类除草剂能抑制植物细胞内的ALS酶活性，阻碍支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)生物合成，从而抑制植物细胞的分裂和生长。已研制开发的乙酰乳酸合酶抑制剂主要有磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸类、三唑嘧啶磺酰胺类(triazolopyrimidines，TP)等除草剂。

在众多的乙酰乳酸合酶抑制剂中，三唑嘧啶磺酰胺类除草剂自20世纪90年代开发成功以来发展非常迅速，已报道了近10个商品化的品种，主要有双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、双氯磺草胺、五氟磺草胺等。三唑嘧啶磺酰胺类除草剂的作用机制与磺酰脲类除草剂类似，是典型的乙酰乳酸合酶抑制剂。三唑嘧啶磺酰胺类除草剂使植物体内ALS活力降低，缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸的合成受到抑制，影响蛋白质的合成从而导致植物生长停止而死亡。植物根与叶均吸收药剂，在体内周身传导，积累于分生组织，抑制细胞分裂。杂草受害的典型症状是：叶片中脉失绿，叶脉褪色，叶片白化或紫化，节间变短，顶芽死亡，最终全株死亡而起到杀死杂草的目的。

研究发现，ALS上氨基酸替换发生的位点及其位点处替换氨基酸不同产生的抗性功能存在显著差异(Yu Q,Han HP,Martin M,Vila-Aiub,Powles SB.AHAS herbicideresistance endowing mutations:effect on AHAS functionality and plant growth.JExp Botany,2010,61:3925-3934)。不同位点氨基酸替换产生的ALS抑制剂除草剂抗性效应存在显著差异，同时不同位点突变对其它ALS抑制剂除草剂存在比较复杂的交互抗性关系。

本领域需要获得相对于强生命力的杂草具有生长优势的油菜植物，需要获得可耐受三唑嘧啶磺酰胺类除草剂的非转基因油菜植物。

发明概述

本发明解决了这种需要，并提供了突变的乙酰乳酸合酶(ALS)核酸和这些突变的核酸编码的蛋白。本发明还涉及包含这些突变核酸和蛋白的油菜植物、细胞和种子，所述突变赋予油菜植物对于三唑嘧啶磺酰胺类除草剂的耐受，其中所述ALS基因编码的ALS多肽在其位置556处含有不同于色氨酸的氨基酸并且在其位置179处含有不同于脯氨酸的氨基酸。在优选的实施方式中，所述ALS基因编码的ALS多肽具有选自下列的双重突变：W556L和P179S；W556L和P179T；W556L和P179L；W556L和P179A。在最优选的实施方式中，所述ALS基因编码的ALS多肽具有下列突变：W556L和P179S。

在一个实施方式中，本发明提供了编码突变的乙酰乳酸合酶(ALS3)的分离的核酸，所述突变的乙酰乳酸合酶(ALS3)蛋白包含如下的突变：

在对应于SEQ ID NO:2的位置556的位置处色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)；和

在对应于SEQ ID NO:2的位置179的位置处脯氨酸(P)突变为丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、亮氨酸(L)或丙氨酸(A)；

优选地，所述的分离的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

优选地，其中所述突变的ALS3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在一个方面，本发明提供了表达盒、载体或细胞，其含有本发明所述的核酸。相应地，本发明提供了本发明的核酸、表达盒、载体或细胞或突变的乙酰乳酸合酶(ALS3)蛋白用于产生抗除草剂植物的用途，优选地，所述植物为油菜。

在另一个方面，本发明提供了产生具有除草剂抗性的植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将本发明所述的核酸导入植物，优选地通过转基因、杂交、回交或无性繁殖等步骤将本发明所述的核酸导入植物，其中所述植物表达本发明所述的突变的乙酰乳酸合酶(ALS3)蛋白并具有三唑嘧啶磺酰胺类除草剂抗性。

在又一个方面，本发明提供了抗三唑嘧啶磺酰胺类除草剂的非转基因植物或其部分，其包含编码突变的乙酰乳酸合酶蛋白的分离的核酸，所述突变的乙酰乳酸合酶蛋白包含如下的突变：

在对应于SEQ ID NO:2的位置556的位置处色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)；和

在对应于SEQ ID NO:2的位置179的位置处脯氨酸(P)突变为丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、亮氨酸(L)或丙氨酸(A)，

优选地，其中所述植物是油菜；其中所述部分为植物的器官、组织和细胞，并且优选种子；

优选地，其中所述突变的乙酰乳酸合酶蛋白包含在对应于SEQ ID NO:2的位置556的位置处色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)和在对应于SEQ ID NO:2的位置179的位置处脯氨酸(P)突变为丝氨酸(S)；

更优选地，其中所述突变的ALS3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在另一个方面，本发明提供了在含有油菜植物的田地中控制杂草的方法，所述方法包括施用有效量的三唑嘧啶磺酰胺类除草剂至含有所述杂草和油菜植物的所述田地，所述油菜植物包含编码突变的乙酰乳酸合酶蛋白的分离的核酸，所述突变的乙酰乳酸合酶蛋白包含如下的突变：

在对应于SEQ ID NO:2的位置556的位置处色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)；和

在对应于SEQ ID NO:2的位置179的位置处脯氨酸(P)突变为丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、亮氨酸(L)或丙氨酸(A)；

优选地，其中所述突变的乙酰乳酸合酶蛋白包含在对应于SEQ ID NO:2的位置556的位置处色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)和在对应于SEQ ID NO:2的位置179的位置处脯氨酸(P)突变为丝氨酸(S)；

更优选地，其中所述突变的ALS3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

附图说明

图1显示了不同来源的油菜ALS3氨基酸部分序列比对结果。

ALS3，Genbank上参考序列(登录号：Z11526)；ALS3_N131野生型品系N131的ALS3氨基酸部分序列；ALS3_EM28抗性材料EM28的ALS3氨基酸部分序列；ALS3_DS6抗性材料DS6的ALS3氨基酸部分序列。箭头表示突变氨基酸。

图2显示了不同浓度的苯磺隆对野生型和突变体的ALS酶活性体外抑制。

图3显示了不同浓度的咪唑乙烟酸对野生型和突变体的ALS酶活性体外抑制。

图4显示了不同浓度的双氟磺草胺对野生型和突变体的ALS酶活性体外抑制。

发明详述

通过参考在附图中描述和/或说明的并且在下面说明书中详细说明的非限制性实施方案以及实例将更全面地说明本发明的实施方案以及它们的不同特征以及有利的细节。应当注意的是在附图中所述的特征不必按比例绘制，并且当本领域技术人员可以认可时，一个实施方案的特征可以与其他实施方案一起使用，尽管在此没有清楚地说明。

定义

除非另外说明，权利要求以及说明书中所使用的术语是如下面列出定义的。

术语“非转基因”是指没有通过适当的生物载体或通过任何其他物理方式引入各个基因。但是，突变的基因可通过授粉(自然地或通过育种方法)被传递，以产生另一种含有该特定基因的非转基因植物。

“内源”基因意指植物中不是通过基因工程技术引入到所述植物中的基因。

术语“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换使用，其是指任意长度的聚合无支链形式的核苷酸，核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸或其二者组合。核酸序列包括DNA、cDNA、基因组DNA、RNA，包括合成形式以及混合的聚合物，包括正义链和反义链，或可以含有非天然的或衍生的核苷酸碱基，本领域技术人员可理解这点。

当用于本文时，术语“多肽”或“蛋白质”(本文中这两个术语可互换地使用)意指包含给定长度的氨基酸链的肽、蛋白质或多肽，其中所述氨基酸残基通过共价的肽键连接。但是，本发明也包括所述蛋白质/多肽的肽模拟物(其中氨基酸和/或肽键已经被功能性类似物替换)，以及除了所述20种基因编码的氨基酸之外的氨基酸例如硒代半胱氨酸。肽、寡肽和蛋白质可被称为多肽。所述术语多肽还指(不排除)多肽的修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。这种修饰很好地记载于基础文献中，并更详细地记载于专著以及研究文献中。

氨基酸取代包括氨基酸改变，其中氨基酸被不同的天然存在的氨基酸残基代替。这种取代可被分类为“保守的”，其中野生型ALS蛋白质中含有的氨基酸残基被另外的天然存在且特性相似的氨基酸替换，例如或本发明中包括的取代还可能是“非保守的”，其中存在于野生型ALS蛋白质中的氨基酸残基被具有不同性质的氨基酸取代，例如来自于不同组的天然存在的氨基酸(例如用丙氨酸取代带电荷的或疏水的氨基酸)。本文使用的“相似的氨基酸”是指具有相似的氨基酸侧链的氨基酸，即具有极性、非极性或接近中性的侧链的氨基酸。本文使用的“不相似氨基酸”是指具有不同氨基酸侧链的氨基酸，例如具有极性侧链的氨基酸与具有非极性侧链的氨基酸是不相似的。极性侧链通常趋向存在于蛋白质的表面，在此它们可以与细胞中存在的水环境相互作用(“亲水性”氨基酸)。另一方面，“非极性”氨基酸趋向于位于蛋白质内的中心，在此它们可以与相似的非极性相邻分子相互作用(“疏水性”氨基酸)。具有极性侧链的氨基酸的实例为精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸(全部为亲水性氨基酸，除了半胱氨酸为疏水性的)。具有非极性侧链的氨基酸的实例为丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和色氨酸(全部为疏水性的，除了甘氨酸为中性的)。

通常，本领域技术人员根据其通常的常识和使用术语ALS、ALSL、AHAS或AHASL的上下文即可知晓分别是指所述核苷酸序列或核酸，或者是指所述氨基酸序列或多肽。

当用于本文时，术语“基因”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷的聚合形式。该术语包括双链和单链的DNA和RNA。其还包括已知类型的修饰，例如甲基化、“加帽”、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸。优选地，基因包括编码本文所定义的多肽的编码序列。“编码序列”是当被置于或在适当调节序列的控制下可被转录为mRNA和/或被翻译为多肽的核苷酸序列。所述编码序列的界限是由5'末端的翻译起始密码子和3'末端的翻译终止密码子确定的。编码序列可以包括但不限于mRNA、cDNA、重组核酸序列或基因组DNA，但是某些情况下也可能存在内含子。

当用于本文时，术语“甘蓝型油菜(Brassica napus)”可缩写为“油菜(B.napus)”。此外，本文中使用了术语“油菜”。所述三个术语可互换使用并且应被理解为完全包括栽培形式的油菜。相似地，例如术语“拟南芥(Arabidopsis thaliana)”可缩写为“拟南芥(A.thaliana)”。在本文中这两个术语可互换地使用。

当用于本发明时，术语“位置”意指氨基酸在本文描述的氨基酸序列中的位置或核苷酸在本文描述的核苷酸序列中的位置，例如SEQ ID NO:1所示的野生型油菜ALS3蛋白的编码序列或SEQ ID NO:2所示的野生型油菜ALS3蛋白的氨基酸序列中的位置或其对应位置。本文使用的术语“对应的”还包括不仅由前述核苷酸/氨基酸的编号所确定的位置。由于在ALS 5'非翻译区(UTR)(包括启动子和/或任何其他的调节序列)或基因(包括外显子和内含子)中其他位置处核苷酸的缺失或插入，本发明中可被取代的给定核苷酸的位置可以不同。相似地，由于在ALS多肽中其他位置氨基酸的缺失或插入，本发明中可被替换的给定氨基酸的位置可以不同。因此，本发明中“对应位置”应被理解为在所指示编号处的核苷酸/氨基酸可以不同，但仍然可具有相似的相邻核苷酸/氨基酸。所述可被交换、缺失或插入的核苷酸/氨基酸也被术语“对应位置”所包括。为了确定在给定的ALS核苷酸/氨基酸序列中核苷酸残基或氨基酸残基是否对应于核苷酸序列SEQ ID NO:1或氨基酸序列SEQ ID NO:2中的某些位置，本领域技术人员可使用本领域中公知的工具和方法，例如人工地或通过使用计算机程序的比对，例如BLAST(Altschul et al.(1990),Journal of MolecularBiology,215,403-410)(其代表基本局部比对搜索工具)或ClustalW(Thompson et al.(1994),Nucleic Acid Res.,22,4673-4680)或任何其他适合于产生序列比对的适合程序。

具体地，本发明提供了一种油菜植物，在所述油菜植物的内源ALS基因编码的多肽位置556处发生色氨酸W→亮氨酸L取代，这是由于在对应于SEQ ID NO:1中示出的核苷酸序列位置1667的位置处"G"核苷酸突变为"T"核苷酸。并且，在所述油菜植物的内源ALS基因编码的多肽位置179处发生脯氨酸P→丝氨酸S取代，这是由于在对应于SEQID NO:1中示出的核苷酸序列位置535的位置处"C"核苷酸突变为"T"核苷酸。在最优选的实施方案中，本发明提供了一种油菜植物，在所述油菜植物的内源ALS基因包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列(或由其组成)，其编码SEQ ID NO:4所示的突变的ALS多肽。

可根据Singh(1991),Proc.Natl.Acad.Sci.88:4572-4576中描述的测定法来测量ALS活性。本文提到的编码ALS多肽的ALS核苷酸序列优选地可赋予对本文所述的一种或多种三唑嘧啶磺酰胺类除草剂的耐受性(或者，对三唑嘧啶磺酰胺类除草剂更低的敏感度)。这是由于本文所述的导致氨基酸取代的点突变。因此，对三唑嘧啶磺酰胺类除草剂的耐受性(或者，对三唑嘧啶磺酰胺类除草剂更低的敏感度)可通过在存在三唑嘧啶磺酰胺类除草剂的情况下，从来自含有突变ALS序列的植物和没有突变ALS序列的植物的细胞提取物中获得ALS并比较其活性来测量，例如Singh et al(1988)[J.Chromatogr.,444,251-261]中描述的方法。当使用植物时，优选地在存在多种浓度的三唑嘧啶磺酰胺类除草剂的情况下，更优选在存在多种浓度的三唑嘧啶磺酰胺类除草剂"双氟磺草胺的情况下，在野生型的细胞提取物或叶提取物以及在所获得突变体的油菜细胞提取物或叶提取物中测定ALS活性。相似地，“耐受性更高”或“抗性更高”，反之亦然，可被看作是“敏感度更低”。

术语“三唑嘧啶磺酰胺类除草剂”不意图受限于可干扰ALS酶活性的单一除草剂。因此，除非另有说明或可从上下文中明显看出，否则“三唑嘧啶磺酰胺类除草剂”可以是本领域中已知的一种除草剂或者两种、三种、四种或多种除草剂的混合物，所述除草剂优选为本文所列出的那些，例如双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、双氯磺草胺、五氟磺草胺等。

本发明提供了具有内源性乙酰乳酸合酶(ALS)基因突变的可耐受三唑嘧啶磺酰胺类除草剂的油菜植物。用于本文时，除非另有明确说明，否则术语“植物”意指处在任何发育阶段的植物。植物的部分可被连接到整个完整植物或者可从整个完整植物分离。这样的植物的部分包括但不限于植物的器官、组织和细胞，优选种子。本发明的油菜植物在内源ALS基因方面是非转基因的。当然，可通过基因工程或通过常规方法例如杂交来将外源基因转移到所述植物中。

以下基于实施例对本发明进行描述，但是本发明并不仅仅限于这些实施例。

实施例1

在之前申请的专利(胡茂龙等，中国专利：CN 107245480A，具有除草剂抗性的乙酰乳酸合酶突变蛋白及其应用)中，通过对野生型油菜品系N131(公知公用，见浦惠明等，江苏农业学报，2010，26(6)：1432-1434)进行甲磺酸乙酯(EMS)诱变处理，在诱变的M2代，我们筛选并鉴定获得了抗磺酰脲类除草剂突变体EM28。EM28植株种子于2017年06月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.14299，该菌株的分类命名为：甘蓝型油菜(Brassica napus)。为期望获得抗三唑嘧啶磺酰胺类除草剂油菜种质或资源满足抗除草剂油菜品种选育的需求，我们再次对EM28种子进行EMS诱变处理，EMS诱变方法同前。待M2代菜苗长至3-4叶期时，喷施三唑嘧啶磺酰胺类除草剂双氟磺草胺[化学名称：2',6'-二氟-5-甲氧基-8-氟[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶-2-磺酰苯胺。分子式：C12H8F3N5O3S。CAS号：145701-23-1]，喷施杂草防治推荐使用浓度3.75g a.i.ha^–1的双氟磺草胺，进行抗三唑嘧啶磺酰胺类除草剂种质的筛选。处理3周后，油菜幼苗几乎全部接近死亡，只有20多株菜苗存活并正常生长。待菜苗生长至5-6叶期后，将20多株疑似为抗三唑嘧啶磺酰胺类除草剂油菜移至油菜育种大田，当年花期套袋自交收获得到M3种子。在光照培养室内，对M3种子苗期喷施3.75g a.i.ha^–1的双氟磺草胺，进行抗性效应鉴定。从喷药1周开始，每天观察药害反应。结果发现，其中编号为DS6的株系表现出较强抗性，无任何药害症状，能正常生长，而其它株系和对照在喷药后1周就有药害反应，菜苗心叶开始变黄，并渐渐腐烂，最后死亡。至此，我们获得了抗三唑嘧啶磺酰胺类除草剂甘蓝型油菜新种质DS6，暂命名为RT-1。后期通过经典遗传学研究发现，RT-1的抗性性状在F₂代群体中的成活株和死亡株的分离比例为3：1，符合单显性基因的遗传规律。也就是说，突变性状位由1个显性核基因控制。

实施例2：抗三唑嘧啶磺酰胺类除草剂甘蓝型油菜新种质中抗性基因的分子克隆

三唑嘧啶磺酰胺类除草剂属于ALS抑制剂类除草剂，除草剂的靶标是乙酰乳酸合酶。在甘蓝型油菜基因组内共有3个具有功能的乙酰乳酸合酶基因，分别是位于A基因组ALS2和ALS3(Genebank登录号：Z11525和Z11526)，C基因组的ALS1(Genebank登录号：Z11524)。根据这3个ALS基因序列，分别设计3对PCR引物。ALS1引物1：GTGGATCTAACTGTTCTTGA和引物2：AGAGATGAAGCTGGTGATC。ALS2引物1：GAGTGTTGCGAGAAATTGCTT和引物2：TTGATTATTCTATGCTCTCTTCTG。ALS3引物1：ATGGTTAGATGAGAGAGAGAGAG和引物2：GGTCGCACTAAGTACTGAGAG。采用CTAB法分别提取抗性株系RT-1和N131、EM28的叶片基因组DNA，PCR克隆野生型与突变体ALS1、ALS2和ALS3基因。按东洋纺(上海)生物科技有限公司高保真性DNA聚合酶KOD-Plus试剂盒说明书配制50μL PCR反应体系。在MJ Research PTC-200型PCR仪上进行扩增，反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2.5min，共35个循环。产物经平末端加A后，在1.2％(V/W)琼脂糖凝胶电泳分离后，用北京Tiangen公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209)纯化回收，纯化的PCR产物委托南京金斯瑞生物有限公司测序。测序比对发现，抗性株系RT-1在ALS3基因上检测到两个位点发生了点突变。即，第+535处发生点突变，核苷酸由C变为T，导致相应编码蛋白的第179位由脯氨酸(P)突变为丝氨酸(S)；ALS3基因的第+1667处发生点突变，核苷酸由G变为T，导致相应编码蛋白的第556位由色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)；(图1)。因此，与突变体EM28相比，抗性株系中的ALS3基因增加了1个新的突变位点(P179S)，其核苷酸如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。ALS3基因的双位点突变(P179S和W556L)增加了抗性突变体对三唑嘧啶磺酰胺类除草剂的抗性。

实施例3：抗性株系的除草剂抗性效应评价与鉴定

原始材料EM28对磺酰脲类、咪唑啉酮类除草剂具有抗性而对三唑嘧啶磺酰胺类除草剂敏感。因此以N131和EM28作为对照材料，鉴定评价抗性突变体RT-1对磺酰脲类、咪唑啉酮类和三唑嘧啶磺酰胺类除草剂的抗性效应。鉴定方法采用田间鉴定和温室盆栽试验两种方法进行。油菜田间鉴定试验在江苏省农业科学院油菜隔离繁殖区进行，温室盆栽试验在恒温光照培养室中进行。待所有处理材料播种出苗生长至3-4叶苗龄，分别喷施三唑嘧啶磺酰胺类除草剂双氟磺草胺[化学名称：2',6'-二氟-5-甲氧基-8-氟[1,2,4]三唑[1,5-c]嘧啶-2-磺酰苯胺、SU类除草剂苯磺隆(2-[N-(4-甲氧基-6-甲基-1,3,5-三嗪-2-基)-N-甲基氨基甲酰胺基磺酰基]苯甲酸甲酯)、IMI类除草剂为咪唑乙烟酸[(RS)-5-乙基-2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-1H-咪唑啉-2-基)烟酸]。喷药3周后，根据菜苗的生长表现确定它们的在不同用药浓度下的抗性效应，结果如表1所示。从表1可以看出，突变抗性材料RT-1增加了对三唑嘧啶磺酰胺类除草剂的抗性。

表1不同浓度的ALS抑制剂除草剂处理3个油菜后的抗性表现

表注：R代表除草剂处理后油菜植株生长良好，无药害表现；S代表除草剂处理后油菜植株生长受到严重抑制，表现明显药害，最终菜苗死亡(以下同)。

实施例4：除草剂对ALS酶活性的抑制性试验

根据抗性表型鉴定结果，在体外进行酶活性离体测定试验，比较RT-1、EM28和野生型N131的中ALS酶被3种类型除草剂双氟磺草胺(TP类)、苯磺隆(SU类)和咪唑乙烟酸(IMI类)的抑制影响，比较3个材料间的差异。ALS酶活性测定参照Singh等的方法(Singh BK,etal.,Analytical Biochemistry,1988,171:173-179)。具体的，分别取0.2g叶片样品，在研钵中用液氮研磨粉碎，将磨好的样品加入含有4.5ml的初酶提取液[100mM K2HPO4、0.5mMMgCl2、0.5mM硫胺素焦磷酸(TPP)、10μM黄素腺嘌呤双核苷酸(FAD)、10mM丙酮酸钠、10％(v/v)丙三醇、1mM二硫苏糖醇、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、0.5％(w/v)聚乙烯基吡咯烷酮]中，于4℃、12000rpm离心20min。取上清液，加入等体积的饱和(NH4)2SO4，于冰上放置30min后，4℃、12000rpm离心20min，弃上清液，加入1mL初酶提取液，振荡溶解，获得每个样品的ALS酶液。取200μL提取好的ALS酶液，分别加入360μL 50mMHepes-NaOH(PH＝7.5)酶反应缓冲液、80μL 20mM TPP、80μL200μMFAD、80μL2M丙酮酸钠+200mM MgCl2和不同浓度的ALS类除草剂，混匀、放入37℃反应1h后，加入160μL 3M H2SO4终止反应，60℃脱羧15min。然后加入780μL5.5％α-萘酚溶液和780μL0.55％肌酸，65℃显色15min，在530nm比色，读取吸光值，根据标准曲线计算酶活性。将未加入除草剂对照的ALS酶活性分别记为100％，计算双氟磺草胺(TP类)、苯磺隆(SU类)和咪唑乙烟酸(IMI类)除草剂对RT-1、EM28和原始野生型N131的ALS酶活性的影响。

从图2和3可以看出，随着SU类除草剂苯磺隆和IMI类除草剂咪唑乙烟酸浓度的增加，野生型N131、EM28和RT-1的ALS酶活性均受到抑制，但EM28和RT-1中的突变酶都表现对除草剂具有一定抗性，因为与野生型N131相比，随苯磺隆和咪唑乙烟酸浓度的增加，EM28和RT-1中的ALS酶活性抑制下降趋势较缓，表明EM28和RT-1中的ALS突变酶对这2种除草剂具有抗性。同时，EM28和RT-1的下降变化趋势基本相同，表明RT-1和EM28对SU类、IMI类除草剂抗性效应基本相当，与表型鉴定结果一致。

从图4可以看出，RT-1中的突变酶表现对TP类除草剂双氟磺草胺具有较强抗性，因为与N131和EM28相比，随双氟磺草胺浓度增加，N131和EM28中的ALS酶活性快速下降，且变化趋势相同，而RT-1中的突变酶活性受到除草剂抑制程度较轻，即使在高浓度(250μmol L-1)双氟磺草胺条件下，RT-1中的突变酶活性是对照的47.3％左右。然而此时N131和EM28中的ALS突变酶基本没有了活性，分别仅为对照的8.98％和19.6％。综上，突变体RT-1中的ALS酶对TP类除草剂双氟磺草胺的敏感性显著低于N131和EM28中ALS酶，从而进一步说明，RT-1的ALS3基因双突变位点赋予了RT-1对TP类除草剂双氟磺草胺抗性。

实施例5：抗性基因在拟南芥中的功能验证

构建植物表达载体，通过常规的农杆菌介导法将抗性基因转入拟南芥植株，在转基因后代中PCR筛选阳性纯合转基因株系进行除草剂表型鉴定。过程简言之，根据ALS3基因序列设计特异引物，ALS3引物3：5'CGCGGTACCCTCTCTCTCTCTCATCTAACCAT3'和ALS3引物4：5'CGCACTAGTCTCTCAGTACTTAGTGCGACC3'，其5'分别加入KpnI和SpeI酶切修饰位点，下划线序列为酶切位点。以突变体RT-1的基因组DNA为模板，PCR扩增获得抗性基因，其核苷酸如SEQID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。PCR产物按实施例2方法经回收、克隆、测序，获得带有突变酶编码基因的重组T载体。用KpnI和SpeI双酶切T载体获得含目的基因的片段回收、连接到同样经双酶切的pCAMBIA1390载体上(购自澳大利亚CAMBI公司)，得到重组的植物表达载体。将构建好的重组载体转化大肠杆菌DH5α，提取质粒用于酶切和测序检测。将检测表明正确的含有目的基因的重组载体转化农杆菌EHA105菌株，提取质粒进行PCR和酶切鉴定。培养获得的重组菌株，利用农杆菌侵染花序法(flower dipping)转化拟南芥。T0代中在培养基上经抗生素筛选后，获得T1代植株移栽到盆钵中，置于人工培养箱中生长，PCR筛选、扩繁获得T3代的纯合转基因株系。在T3代转基因苗期，喷施3.75g a.i.ha^–1双氟磺草胺进行抗性鉴定。喷药处理3周后，所有转基因拟南芥幼苗生长状态良好，而野生型拟南芥(Col)幼苗全部黄化死亡(表2)，表明RT-1中核苷酸如SEQ ID NO：3所示的乙酰乳酸合酶突变基因在拟南芥中表达具有抗TP类除草剂的功能。

表2抗性基因在拟南芥和烟草中表达的抗性表现

表注：R代表除草剂处理后植株生长良好，无药害表现；S代表除草剂处理后植株生长受到严重抑制，表现明显药害，最终菜苗死亡。

实施例6：抗性基因在烟草中的功能验证

按照实施例5的方法，将RT-1中核苷酸如SEQ ID NO：3所示的乙酰乳酸合酶突变基因克隆至植物表达载体pCAMBIA1390质粒(购自澳大利亚CAMBI公司)中。挑选阳性克隆转化农杆菌EHA105，采用常规的农杆菌介导法转化本氏烟叶盘，获得转基因植株烟草收种后，经PCR鉴定，在T3代转基因烟草苗期，喷施3.75g a.i.ha^–1双氟磺草胺进行抗性鉴定。喷药处理3周后，所有转基因烟草幼苗生长状态良好，而野生型烟草(Tob)幼苗全部黄化死亡(表2)，表明RT-1中核苷酸如SEQ ID NO：3所示的乙酰乳酸合酶突变基因在烟草中表达也具有抗TP类除草剂的功能。

实施例7：抗性基因在普通油菜中的功能验证

采用杂交转育方法将RT-1中核苷酸如SEQ ID NO：3所示的乙酰乳酸合酶突变基因导入其它对TP类除草剂无抗性的普通油菜品种或品系。过程简言之，用RT-1分别与无抗性的普通油菜品种恢复系3075R(浦惠明等，2002，江苏农业科学，4：33-34)和3018R(浦惠明等，1999，江苏农业科学，6：32-33)配制杂交组合，当年收获2个F1种子在油菜春化培养室进行加代种植，花期选生长一致的单株套袋自交，收获F2种子在江苏省农科院溧水植物科学基地播种，每个F2群体播种20行，苗期取F2群体单株叶片，提取DNA，PCR扩增ALS3突变基因，产物按实例2步骤纯化、回收、测序。根据测序结果，筛选具有RT-1中核苷酸如SEQ ID NO：1所示的乙酰乳酸合酶突变基因的纯合型F2单株。于油菜开花期对每个入选的F2单株套袋自交，收获F3种子。在F3代苗期，喷施3.75g a.i.ha^–1双氟磺草胺进行抗性鉴定。喷药处理3周后，所有入选的导入抗性基因的油菜幼苗生长状态良好，而未含抗性基因的油菜幼苗全部黄化死亡，表明RT-1中核苷酸如SEQ ID NO：3所示的乙酰乳酸合酶突变基因在油菜中表达也具有抗TP类除草剂的功能(表3)。

表3抗性基因转育到普通油菜中的抗性表现

表注：R代表除草剂处理后植株生长良好，无药害表现；S代表除草剂处理后植株生长受到严重抑制，表现明显药害，最终菜苗死亡。

实施例8：抗性突变位点不同氨基酸替换的抗性功能研究

为明确本发明中ALS3在Pro179和Trp556的两个位点突变成其他氨基酸后产生的抗性功能，我们通过查阅大量相关文献，设计了3种氨基酸突变组合(表4)，通过人工引入点突变位点并构建其植物表达载体，转化拟南芥验证其抗性功能。过程简言之，以突变体RT-1基因组为模板，利用PCR技术进行定点突变操作，实验委托南京钟鼎生物技术有限公司完成。结果获得了3个突变基因分别为：4T，ALS3基因的第+535处核苷酸由C变为A，第+1667处核苷酸由G变为T，分别导致相应编码蛋白的第179位由脯氨酸(P)突变为苏氨酸(T)，第556位由色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)；4L，ALS3基因的第+536处核苷酸由C变为T，第+1667处核苷酸由G变为T，分别导致相应编码蛋白的第179位由脯氨酸(P)突变为亮氨酸(L)，第556位由色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)；4A，ALS3基因的第+535处核苷酸由C变为G，第+1667处核苷酸由G变为T，分别导致相应编码蛋白的第179位由脯氨酸(P)突变为丙氨酸(A)，第556位由色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)(表4)。

按照实施例5的方法，将上述3个突变序列构建至植物表达载体pCAMBIA1390质粒(购自澳大利亚CAMBI公司)中，转化拟南芥，获得阳性苗后，在苗期喷施3.75g a.i.ha^–1的双氟磺草胺进行抗性鉴定。喷药处理3周后，所有转基因拟南芥幼苗生长状态良好，而未转基因的拟南芥幼苗全部黄化死亡(表4)，表明以上3种氨基酸突变组合的序列在拟南芥中表达具有抗TP类除草剂的功能。

表4不同氨基酸突变组合序列在拟南芥中的抗性表现

注：斜体加粗字母表示突变的碱基，R代表除草剂处理后，转基因植株生长良好，无药害表现。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式作出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 油菜抗三唑嘧啶磺酰胺类除草剂基因及其应用

<130> IDC200083

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1959

<212> DNA

<213> Brassica napus

<400> 1

atggcggcgg caacatcgtc ttctccgatc tccttaaccg ctaaaccttc ttccaaatcc 60

cctctaccca tttccagatt ctcccttccc ttctccttaa ccccacagaa accctcctcc 120

cgtctccacc gtccactcgc catctccgcc gttctcaact cacccgtcaa tgtcgcacct 180

gaaaaaaccg acaagatcaa gactttcatc tcccgctacg ctcccgacga gccccgcaag 240

ggtgctgata tcctcgtgga agccctcgag cgtcaaggcg tcgaaaccgt cttcgcttat 300

cccggaggtg cctccatgga gatccaccaa gccttgactc gctcctccac catccgtaac 360

gtcctccccc gtcacgaaca aggaggagtc ttcgccgccg agggttacgc tcgttcctcc 420

ggcaaaccgg gaatctgcat agccacttcg ggtcccggag ctaccaacct cgtcagcggg 480

ttagccgacg cgatgcttga cagtgttcct ctcgtcgcca tcacaggaca ggtccctcgc 540

cggatgatcg gtactgacgc gttccaagag acgccaatcg ttgaggtaac gaggtctatt 600

acgaaacata actatctggt gatggatgtt gatgacatac ctaggatcgt tcaagaagca 660

ttctttctag ctacttccgg tagacccgga ccggttttgg ttgatgttcc taaggatatt 720

cagcagcagc ttgcgattcc taactgggat caacctatgc gcttgcctgg ctacatgtct 780

aggctgcctc agccaccgga agtttctcag ttaggccaga tcgttaggtt gatctcggag 840

tctaagaggc ctgttttgta cgttggtggt ggaagcttga actcgagtga agaactgggg 900

agatttgtcg agcttactgg gatccctgtt gcgagtacgt tgatggggct tggctcttat 960

ccttgtaacg atgagttgtc cctgcagatg cttggcatgc acgggactgt gtatgctaac 1020

tacgctgtgg agcatagtga tttgttgctg gcgtttggtg ttaggtttga tgaccgtgtc 1080

acgggaaagc tcgaggcgtt tgcgagcagg gctaagattg tgcacataga cattgattct 1140

gctgagattg ggaagaataa gacacctcac gtgtctgtgt gtggtgatgt aaagctggct 1200

ttgcaaggga tgaacaaggt tcttgagaac cgggcggagg agctcaagct tgatttcggt 1260

gtttggagga gtgagttgag cgagcagaaa cagaagttcc cgttgagctt caaaacgttt 1320

ggagaagcca ttcctccgca gtacgcgatt caggtcctag acgagctaac ccaagggaag 1380

gcaattatca gtactggtgt tggacagcat cagatgtggg cggcgcagtt ttacaagtac 1440

aggaagccga ggcagtggct gtcgtcctca ggactcggag ctatgggttt cggacttcct 1500

gctgcgattg gagcgtctgt ggcgaaccct gatgcgattg ttgtggacat tgacggtgat 1560

ggaagcttca taatgaacgt tcaagagctg gccacaatcc gtgtagagaa tcttcctgtg 1620

aagatactct tgttaaacaa ccagcatctt gggatggtca tgcaatggga agatcggttc 1680

tacaaagcta acagagctca cacttatctc ggggacccgg caagggagaa cgagatcttc 1740

cctaacatgc tgcagtttgc aggagcttgc gggattccag ctgcgagagt gacgaagaaa 1800

gaagaactcc gagaagctat tcagacaatg ctggatacac ctggaccgta cctgttggat 1860

gtcatctgtc cgcaccaaga acatgtgtta ccgatgatcc caagtggtgg cactttcaaa 1920

gatgtaataa ccgaagggga tggtcgcact aagtactga 1959

<210> 2

<211> 652

<212> PRT

<213> Brassica napus

<400> 2

Met Ala Ala Ala Thr Ser Ser Ser Pro Ile Ser Leu Thr Ala Lys Pro

1 5 10 15

Ser Ser Lys Ser Pro Leu Pro Ile Ser Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser

20 25 30

Leu Thr Pro Gln Lys Pro Ser Ser Arg Leu His Arg Pro Leu Ala Ile

35 40 45

Ser Ala Val Leu Asn Ser Pro Val Asn Val Ala Pro Glu Lys Thr Asp

50 55 60

Lys Ile Lys Thr Phe Ile Ser Arg Tyr Ala Pro Asp Glu Pro Arg Lys

65 70 75 80

Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gln Gly Val Glu Thr

85 90 95

Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu

100 105 110

Thr Arg Ser Ser Thr Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His Glu Gln Gly

115 120 125

Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Lys Pro Gly

130 135 140

Ile Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly

145 150 155 160

Leu Ala Asp Ala Met Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala Ile Thr Gly

165 170 175

Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro

180 185 190

Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Met

195 200 205

Asp Val Asp Asp Ile Pro Arg Ile Val Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala

210 215 220

Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro Lys Asp Ile

225 230 235 240

Gln Gln Gln Leu Ala Ile Pro Asn Trp Asp Gln Pro Met Arg Leu Pro

245 250 255

Gly Tyr Met Ser Arg Leu Pro Gln Pro Pro Glu Val Ser Gln Leu Gly

260 265 270

Gln Ile Val Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Arg Pro Val Leu Tyr Val

275 280 285

Gly Gly Gly Ser Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Gly Arg Phe Val Glu

290 295 300

Leu Thr Gly Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ser Tyr

305 310 315 320

Pro Cys Asn Asp Glu Leu Ser Leu Gln Met Leu Gly Met His Gly Thr

325 330 335

Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu Leu Ala Phe

340 345 350

Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala

355 360 365

Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu Ile Gly

370 375 380

Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val Lys Leu Ala

385 390 395 400

Leu Gln Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu Glu Leu Lys

405 410 415

Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Ser Glu Leu Ser Glu Gln Lys Gln Lys

420 425 430

Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro Pro Gln Tyr

435 440 445

Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu Thr Gln Gly Lys Ala Ile Ile Ser

450 455 460

Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Tyr Lys Tyr

465 470 475 480

Arg Lys Pro Arg Gln Trp Leu Ser Ser Ser Gly Leu Gly Ala Met Gly

485 490 495

Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro Asp Ala

500 505 510

Ile Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn Val Gln

515 520 525

Glu Leu Ala Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys Ile Leu Leu

530 535 540

Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Met Gln Trp Glu Asp Arg Phe

545 550 555 560

Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asp Pro Ala Arg Glu

565 570 575

Asn Glu Ile Phe Pro Asn Met Leu Gln Phe Ala Gly Ala Cys Gly Ile

580 585 590

Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Glu Glu Leu Arg Glu Ala Ile Gln

595 600 605

Thr Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile Cys Pro

610 615 620

His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Gly Gly Thr Phe Lys

625 630 635 640

Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr

645 650

<210> 3

<211> 1959

<212> DNA

<213> Brassica napus

<400> 3

atggcggcgg caacatcgtc ttctccgatc tccttaaccg ctaaaccttc ttccaaatcc 60

cctctaccca tttccagatt ctcccttccc ttctccttaa ccccacagaa accctcctcc 120

cgtctccacc gtccactcgc catctccgcc gttctcaact cacccgtcaa tgtcgcacct 180

gaaaaaaccg acaagatcaa gactttcatc tcccgctacg ctcccgacga gccccgcaag 240

ggtgctgata tcctcgtgga agccctcgag cgtcaaggcg tcgaaaccgt cttcgcttat 300

cccggaggtg cctccatgga gatccaccaa gccttgactc gctcctccac catccgtaac 360

gtcctccccc gtcacgaaca aggaggagtc ttcgccgccg agggttacgc tcgttcctcc 420

ggcaaaccgg gaatctgcat agccacttcg ggtcccggag ctaccaacct cgtcagcggg 480

ttagccgacg cgatgcttga cagtgttcct ctcgtcgcca tcacaggaca ggtctctcgc 540

cggatgatcg gtactgacgc gttccaagag acgccaatcg ttgaggtaac gaggtctatt 600

acgaaacata actatctggt gatggatgtt gatgacatac ctaggatcgt tcaagaagca 660

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cagcagcagc ttgcgattcc taactgggat caacctatgc gcttgcctgg ctacatgtct 780

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agatttgtcg agcttactgg gatccctgtt gcgagtacgt tgatggggct tggctcttat 960

ccttgtaacg atgagttgtc cctgcagatg cttggcatgc acgggactgt gtatgctaac 1020

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gcaattatca gtactggtgt tggacagcat cagatgtggg cggcgcagtt ttacaagtac 1440

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tacaaagcta acagagctca cacttatctc ggggacccgg caagggagaa cgagatcttc 1740

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<210> 4

<211> 652

<212> PRT

<213> Brassica napus

<400> 4

Met Ala Ala Ala Thr Ser Ser Ser Pro Ile Ser Leu Thr Ala Lys Pro

1 5 10 15

Ser Ser Lys Ser Pro Leu Pro Ile Ser Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser

20 25 30

Leu Thr Pro Gln Lys Pro Ser Ser Arg Leu His Arg Pro Leu Ala Ile

35 40 45

Ser Ala Val Leu Asn Ser Pro Val Asn Val Ala Pro Glu Lys Thr Asp

50 55 60

Lys Ile Lys Thr Phe Ile Ser Arg Tyr Ala Pro Asp Glu Pro Arg Lys

65 70 75 80

Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gln Gly Val Glu Thr

85 90 95

Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu

100 105 110

Thr Arg Ser Ser Thr Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His Glu Gln Gly

115 120 125

Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Lys Pro Gly

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Ile Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly

145 150 155 160

Leu Ala Asp Ala Met Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala Ile Thr Gly

165 170 175

Gln Val Ser Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro

180 185 190

Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Met

195 200 205

Asp Val Asp Asp Ile Pro Arg Ile Val Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala

210 215 220

Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro Lys Asp Ile

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Gln Gln Gln Leu Ala Ile Pro Asn Trp Asp Gln Pro Met Arg Leu Pro

245 250 255

Gly Tyr Met Ser Arg Leu Pro Gln Pro Pro Glu Val Ser Gln Leu Gly

260 265 270

Gln Ile Val Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Arg Pro Val Leu Tyr Val

275 280 285

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290 295 300

Leu Thr Gly Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ser Tyr

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Pro Cys Asn Asp Glu Leu Ser Leu Gln Met Leu Gly Met His Gly Thr

325 330 335

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340 345 350

Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala

355 360 365

Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu Ile Gly

370 375 380

Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val Lys Leu Ala

385 390 395 400

Leu Gln Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu Glu Leu Lys

405 410 415

Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Ser Glu Leu Ser Glu Gln Lys Gln Lys

420 425 430

Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro Pro Gln Tyr

435 440 445

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450 455 460

Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Tyr Lys Tyr

465 470 475 480

Arg Lys Pro Arg Gln Trp Leu Ser Ser Ser Gly Leu Gly Ala Met Gly

485 490 495

Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro Asp Ala

500 505 510

Ile Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn Val Gln

515 520 525

Glu Leu Ala Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys Ile Leu Leu

530 535 540

Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Met Gln Leu Glu Asp Arg Phe

545 550 555 560

Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asp Pro Ala Arg Glu

565 570 575

Asn Glu Ile Phe Pro Asn Met Leu Gln Phe Ala Gly Ala Cys Gly Ile

580 585 590

Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Glu Glu Leu Arg Glu Ala Ile Gln

595 600 605

Thr Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile Cys Pro

610 615 620

His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Gly Gly Thr Phe Lys

625 630 635 640

Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr

645 650

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ALS1 primer 1

<400> 5

gtggatctaa ctgttcttga 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ALS1 primer 2

<400> 6

agagatgaag ctggtgatc 19

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ALS2 primer 1

<400> 7

gagtgttgcg agaaattgct t 21

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ALS2 primer 2

<400> 8

ttgattattc tatgctctct tctg 24

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ALS3 primer 1

<400> 9

atggttagat gagagagaga gag 23

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ALS3 primer 2

<400> 10

ggtcgcacta agtactgaga g 21

Claims (7)

1.编码突变的乙酰乳酸合酶蛋白的分离的核酸，所述突变的乙酰乳酸合酶蛋白包含如下的突变：

在对应于SEQ ID NO:2的位置556的位置处色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)；和

在对应于SEQ ID NO:2的位置179的位置处脯氨酸(P)突变为丝氨酸(S)，其中所述突变的乙酰乳酸合酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

2.根据权利要求1所述的分离的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

3.表达盒或载体，其包含权利要求1或2所述的核酸。

4.突变的乙酰乳酸合酶蛋白，其包含如下的突变：

在对应于SEQ ID NO:2的位置556的位置处色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)；和

在对应于SEQ ID NO:2的位置179的位置处脯氨酸(P)突变为丝氨酸(S)，其中所述突变的乙酰乳酸合酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

5.权利要求1或2所述的核酸或权利要求3所述的表达盒或载体或权利要求4所述的突变的乙酰乳酸合酶蛋白用于产生抗三唑嘧啶磺酰胺类除草剂植物的用途，其中所述植物为油菜。

6.产生具有三唑嘧啶磺酰胺类除草剂抗性的植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

通过转基因、杂交、回交或无性繁殖将权利要求1或2所述的核酸导入植物，其中所述植物表达权利要求4所述的突变的乙酰乳酸合酶蛋白并具有三唑嘧啶磺酰胺类除草剂抗性，其中所述植物为油菜。

7.在含有油菜植物的田地中控制杂草的方法，所述方法包括施用有效量的三唑嘧啶磺酰胺类除草剂至含有所述杂草和油菜植物的所述田地，所述油菜植物包含编码突变的乙酰乳酸合酶蛋白的分离的核酸，所述突变的乙酰乳酸合酶蛋白包含如下的突变：

在对应于SEQ ID NO:2的位置556的位置处色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)；和

在对应于SEQ ID NO:2的位置179的位置处脯氨酸(P)突变为丝氨酸(S)，其中所述突变的乙酰乳酸合酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

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