WO1997025346A1 - Dna-sequenz kodierend einen phosphoenolpyruvat-phosphat-translokator, plasmide, bakterien, hefen und pflanzen enthaltend diesen transporter - Google Patents

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Ulf-Ingo FLÜGGE
Andreas Weber
Karsten Fischer
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Basf Aktiengesellschaft
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    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the present invention relates to a DNA sequence from Brassica oleracea var. Botrytis (cauliflower) which contains the coding region of a phosphoenolpyruvate-phosphate transporter, the introduction of which into a plant genome involves the formation and transfer of basic carbon skeletons for the synthesis of phenolic compounds in transgenic Plants modified, plasmids, yeasts and bacteria containing this DNA sequence, as well as transgenic plants in which, by introducing the DNA sequence, changes in the activity of the phosphoenolpyruvate-phosphate transporter and thus changes in the content of phenolic compounds, especially aromatic amino acids and Flavonoids. Furthermore, the invention relates to transgenic plants by increasing the content of phenolic compounds.
  • the invention also relates to the use of the described sequence of the phosphoenolpyruvate-phosphate translocator for identifying related translocators from other plants by hybridization with low stringency or by PCR techniques, and to the use of the phosphoenolpyruvate-phosphate translocator as a target. for herbicides.
  • Terpenes basic building block: isoprene
  • nitrogen-containing compounds such as alkaloids, basic building block: amino acids
  • phenolic compounds which are synthesized via the Shikimate pathway and the Mevalonate / Malonate pathway.
  • the phenolic compounds in particular form a large, very heterogeneous group of substances with different functions in the plant (review article: Herrmann, 1995, Plant Cell 7, 907-919; Schmid and Amrhein, 1995, Phytochemistry 39, 737-749). These include the following substance classes:
  • aromatic amino acids phenylalanine, tryptophan and tyrosine, the first two amino acids being essential for humans and animals, i.e. cannot be synthesized by them and must therefore be ingested with food.
  • auxin is synthesized, which is involved in the regulation of a number of growth processes in the plant.
  • Phenolic carboxylic acids such as cinnamic acid, which in turn are the starting compounds for the synthesis of other classes of phenolic compounds such as:
  • Lignin a very complex polymer of various phenolic carboxylic acids, which is stored in the plant cell walls and leads to their lignification (wood pulp), a process that gives the cells a high tensile and compressive strength.
  • the proportion of lignin in the cell wall material can be up to 35%, i.e. Lignin makes up a significant proportion of the total biomass.
  • V. Saücylic acid which plays an important role in the induction of defense against pathogens.
  • Tanning agents simple and polymeric phenols, the name of which derives from their use in tanning leather.
  • tannins together with other substances, protect against the attack by microorganisms, in particular through storage in the cell walls.
  • Flavonoids a large group of substances with one
  • Flavan scaffolding which are increasingly formed under stress, for example to ward off pathogens and predators and to Protection against UV radiation.
  • flavonoids have been identified as signaling substances in the formation of root lumps in legumes, which play an important role in the nitrogen supply to these plants.
  • This group also includes anthocyanidins, which are responsible for the coloring of flowers and fruits in numerous plants.
  • the phenolic compounds are synthesized in plants essentially via the Shikimat route, the importance of which can already be seen from the fact that, seen globally, 20% of the carbon fixed in the chloroplast can flow into this pathway (Haslam, 1993, in Shikimic Acid: Metabolism and Metabolites. (Chichester, John Willey and Sons)).
  • the Shikimate pathway begins with the synthesis of 3-deoxy-arabinoheptulosonic acid 7-phosphate, a condensation product of erythrose-4-phosphate and phosphoenol pyruvate.
  • the corresponding enzyme, the DAHP synthase is induced by pathogen attack or mechanical wounding of the plant, which leads to an increased provision of chorismate (the end product of the Shikimate pathway) as a precursor to the biosynthesis of lignin.
  • the lignification of cell walls includes a strategy of plants to ward off pathogens. Transgenic plants, in which the activity of the DAHP synthase was reduced by an anti-sense approach, had defects in lignin biosynthesis (Jones et al., 1995, Plant Physiol., In press).
  • the first substrate of the DAHP synthase reaction is an intermediate of the oxidative or reductive pentose phosphate pathway taking place in the plastid.
  • Phosphoenol pyruvate is the substrate of this and a second reaction within the Shikimate pathway.
  • 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase EPP synthase
  • 3-enolpyruvyl-shikimate-5-phosphate is formed from shikimate-3-phosphate and phosphoenolpyruvate.
  • EPSP synthase is the best-studied enzyme of the entire Shikimate route and the target for the frequently used herbicide glyphosate (Round-up, Monsanto). Overexpression of the EPSP synthase in transgenic plants or the introduction of a bacterial and glyphosate-insensitive EPSP synthase causes (extensive) herbicide resistance / tolerance (Stalker et al., 1985, J. Biol. Chem. 260, 4724 -4728; Smart et al., 1985, J. Biol. Chem. 260, 16338-16346). Interestingly, the inhibition caused by glyphosate can be eliminated by phosphoenolpyruvate, which is used here as a competitor in the reaction.
  • Eukaryotic cells and their metabolism are highly compartmentalized, the individual compartments each performing different functions in the cell.
  • the enzymes of the Shiki mat path are located in the chloroplast.
  • These organelles are enclosed by two lipid bilayer membranes, the outer molecular sieve character of which allows compounds up to a size of about 10 kDa to pass freely (Flügge and Benz, 1984, FEBS Lett. 169, 85-89).
  • the inner membrane is permeable to some smaller compounds such as water, carbon dioxide, oxygen and nitrite, but not to larger charged molecules such as phosphoenolpyruvate.
  • Phosphoenolpyruvate can be in the cell by various metabolic reactions expge ⁇ provides. On the one hand, it is formed in glycolysis from 3-phosphoglycerate (phosphoglycerate mutase / enolase) and, on the other hand, it can be formed from oxaloacetate via the phosphoenol pyruvate carboxy-kinase in the anabolic metabolic pathway.
  • PPDK phosphate eikinase
  • CAM plants and C 4 plants have a chloroplast plastid PPDK, while in C 3 plants the PPDK, like the phosphoenolpyruvate carboxykinase, only occurs in the cytosol. Phosphoenolpyruvate cannot, at least not in sufficient quantities, be provided by the plastids themselves. One reason for this is the cytosolic localization.
  • ie plastids do not have any of the metabolic pathways responsible for phosphoenolpyruvate synthesis, at least not in sufficient activity.
  • the chloroplastic phosphate translocator from C 3 plants located in the inner envelope membrane catalyzes the exchange of phosphate, triose phosphates and 3-phosphoglycerate, but has only a very low affinity for the substrate phosphoenolpyruvate (Fliege et al., 1978, Biochim. Biophys. Acta 502, 232-247; diegge and Heldt, 1991, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42, 129-144). Since all substrates compete for the same binding site on the translocator, it also appears questionable whether under the given cellular metabolite levels phosphoenolpyruvate can be bound by the translocator at all. The question is whether the plastids have a special transporter for the transport of phosphoenol pyruvate.
  • this transporter is an exchange system for phosphoenolpyruvate and inorganic phosphate.
  • This translocator has only a low affinity for the substrates of the chloroplastic phosphate translocator (triophosphate and 3-phosphoglycerate), which seems sensible if this transporter should serve the transport of phosphoenol pyruvate.
  • Fig. 1 Determination of the substrate affinities of recombinant
  • Phosphate translocators made from chloroplasts and non-green
  • Ni ⁇ + ⁇ affinity column purified from yeast cells and reconstituted ir. Liposomes which had been preloaded with the specified substrates. The uptake of radioactively labeled [ 32 P] phosphate was measured. (Unpublished data).
  • the phosphoenolpyruvate-phosphate translocator of the plastid envelope membrane plays a key role in the supply of the plastid with the starting compound of the Shikimate pathway. It should therefore be possible to use the sequence obtained to increase the activity of the translocator in plants and thereby to increase the concentration of phosphoenolpyruvate in the plastids. If necessary, this should lead to an increased flow of fixed carbon into the Shikimate path and thus to an increased
  • phenolic compounds Since, as stated above, these compounds play a decisive role in the defense against plant pathogens such as bacteria and fungi and such infections lead to large crop failures annually, a higher capacity for the synthesis of such compounds should result in improved protection of the plants. On the other hand, these phenolic compounds are involved in protecting plants against harmful UV radiation, a mechanism which, in view of the constantly increasing UV radiation as a result of ozone depletion in the atmosphere, could become increasingly important.
  • the present invention now provides DNA sequences which come from a plant genome and code for a plastic phosphoenolpyruvate-phosphate translocator, the information contained in the nucleotide sequence being introduced and expressed in plant cells to form a ribonucleic acid leads and via this ribonucleic acid a phosphoenolpyruvate-phosphate translocator activity can be introduced into the cells or an endogenous phosphoenolpyruvate-phosphate Translocator activity can be suppressed.
  • the invention relates in particular to a DNA sequence from Brassica ol eracea with the following nucleotide sequence (Seq ID No. 1):
  • GCA TAC CAG CAG GTG TCG TAC ATG ATA TTG GCG AGA
  • GTA TCA CCC 1048 Ala Tyr Gin Gin Val Ser Tyr Met Ile Leu Ala Arg Val Ser Pro
  • the invention further relates to DNA sequences which are identified by the sequence shown in SEQ ID NO. 1 mentioned DNA sequence or parts thereof or derivatives which are derived from these sequences by insertion, deletion or substitution, hybridize and code for a plastid protein which has the biological activity of a phosphoenolpyruvate-phosphate translocator.
  • the present invention relates to the use of the DNA sequences according to the invention or parts thereof or derivatives which are derived from these sequences by insertion, deletion or substitution, for the transformation of pro- and eukaryotic cells.
  • DNA sequence according to the invention can be introduced into plasmids and combined with control elements for expression in prokaryotic or eukaryotic cells (see exemplary embodiments 3, 5).
  • control elements are, on the one hand, transcription promoters and, on the other hand, transcription terminators.
  • the plasmids can be used to transform eukaryotic cells with the aim of expressing a translatable messenger ribonucleic acid (RNA) which allows the synthesis of a plastid phosphoenolpyruvate-Phosp ' hat translocator in the transformed cells, or with the aim of expressing a non-translatable, inversely oriented ("anti-sense"), messenger ribonucleic acid, which prevents the synthesis of the endogenous phosphoenolpyruvate-phosphate translocators.
  • RNA messenger ribonucleic acid
  • anti-sense inversely oriented
  • RNA corresponding to the sequence of a plant phosphoenolpyruvate-phosphate translocator according to the invention enables a change in the plant secondary metabolism, in this case the synthesis of phenolic compounds which are produced via the Shikimate pathway, the economic importance of which lies in that an improvement in the forwarding of phosphoenol pyruvate from the cytosol to the plastids leads to an increase in the content of these phenolic compounds.
  • Plants can thus be produced which have a higher resistance to attack by pathogens and an increased tolerance to UV radiation. This modification reduces the loss of harvest and thus increases its economic value.
  • the heterologous expression of the sequence described in split yeasts enables structural-functional studies of the phosphoenol pyruvate phosphate Translocators that could ultimately lead to the development of a specific inhibitor for this protein.
  • herbicide development should be considered here, since the inhibition of a protein with a key function in the metabolic process would inevitably be lethal for the plant.
  • the transcriptional start region can be both Native or homologous as well as foreign or heterologous to the host plant. Termination regions can be interchanged with one another as desired.
  • the DNA sequence of the transcription start and termination regions can be produced synthetically or obtained naturally or a mixture of synthetic and natural DNA
  • a large number of cloning vectors which contain a replication signal for E. coli and a marker which allows selection of the transformed cells are available in preparation for the introduction of foreign 3s into higher plants. Examples of vectors are pBR322, pUC series , M13 mp series, pACYC 184 etc. Depending on the method of introduction desired Genes in the plant may require additional DNA sequences. Z.3.
  • T-DNA for the transformation of plant cells
  • the use of T-DNA for the transformation of plant cells has been intensively investigated and described sufficiently (Hoekema, in: The Binary Plant Vector System, Offset-drukkerij Kanters BV. Ablasserdam, 1985, Chapter V; Fraley et al., Critic. Rev. Plant Sci. 4, 1-46; An et al., 1985, EMBO J. 4, 277-287).
  • the introduced DNA is integrated in the genome, it is generally stable there and is also retained in the offspring of the originally transformed cell. It usually contains a selection marker that gives the transformed plant cells resistance to biocides or antibiotics such as kanamycin, bleomycin or hygromycin. The individually introduced marker will therefore allow the selection of transformed cells from cells that lack the inserted DNA.
  • agrobacteria In addition to transformation using agrobacteria, many other techniques are available for introducing DNA into a plant host cell. These techniques include the transformation of protoplasts, the microinjection of DNA, electroporation and ballistic methods. Whole plants can then be regenerated from the transformed plant material in a suitable selection medium. The plants obtained in this way can then be tested for the presence of the introduced DNA using conventional molecular biological methods. These plants can be grown normally and with plants that are the same possess transformed hereditary system or other hereditary systems, be crossed. The resulting hybrid individuals have the corresponding phenotypic properties.
  • the DNA sequences according to the invention can also be introduced into plasmids and thereby provided with control elements for the expression in cells of fission yeast (see working example 3).
  • the introduction of the phosphoenolpyruvate-phosphate translocator leads to a considerable increase in the activity of the phosphoenolpyruvate-phosphate translocator, which can be measured by reconstitution in artificial liposomes, in the recombinant yeast cells.
  • This translocator expressed in yeast cells can be used for the investigation of structure-function relationships and for the development of specific inhibitors which can be used as herbicides.
  • DNA sequences according to the invention can also be introduced into plasmids which permit mutagenesis or a sequence change by recombining DNA sequences in prokaryotic or eukaryotic systems.
  • the specificity of the phosphoenol pyruvate-phosphate translocator can thereby be changed. Insensitivity to herbicides specific for the phosphoenolpyruvate-phosphate translocator could also be achieved.
  • standard procedures Standard procedures (Sambrock et al., 1989, Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor
  • base exchanges and / or base deletions can be carried out and / or synthetic or natural sequences can be added.
  • Adapters or links can be used to connect the DNA fragments to one another. Manipulations which provide suitable restriction sites or which remove unnecessary DNA can also be used. Where insertions, deletions or substitutions such as, for example, transitions or transversions are possible, in vitro mutagenesis, "primer repair", restriction or ligation can be used.
  • Sequence analysis, restriction analysis and other biochemical-molecular-biological methods such as, for example, the expression of the modified protein in fission yeast and the measurement of the modified transport properties in artificial liposomes (see embodiment 4 and Loddenspringtter et al., 1993, Proc.) are generally used as the analysis method. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2155-2159 ;. and Fischer et al., 1994, Plant Journal 5, 215-226) or the measurement of the modified transport properties of the protein expressed in transgenic plants with the help of a recently from us to this Purpose developed method (Flügge and Weber, 1994, Planta, 194, 181-185) applied.
  • the DNA sequence according to the invention (or parts or derivatives of this sequence) can be used according to standard procedures (in particular hybridization screening of cDNA libraries with low stringency using the DNA sequence according to the invention or parts of the DNA sequence as Probe or the creation of probes for stringent and low-stringent screening strategies by deriving degenerate and / or non-degenerate primers from the DNA sequence according to the invention for PCR experiments with DNA or cDNA from spinach or other plants) from the genome of Isolate plants-like sequences that also transport phosphoenol pyruvate.
  • the phage lambda gtlO and the vector pBluescript II KS (pBSC) (Short et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 7583-7600) were used for cloning.
  • the vector pEVPll (Radorel and Nurse, 1986, Cell 45, 145-153) was used for the transformation of yeasts.
  • the transfer of the DNA into the agrobacteria was carried out by direct transformation according to the method of Höfgen and Will'user (1988, Nucl. Acids Res. 16, 9877).
  • the plasmid DNA of transformed agrobacteria was determined by the method of Birn-boim and Doly (1979, Nucl. Acids Res. 7, 1513-1523) isolated and, after suitable restriction cleavage, analyze by gel electrophoresis for correctness and orientation.
  • Figure 1 Reconstitution of the transport activity of the recombinant phosphoenolpyruvate translocator expressed in yeast
  • Embodiment 1 Isolation of peptide fragments of the translocator and creation of probes for the hybridization screening of cDNA libraries
  • Purified phosphoenolpyruvate-phosphate translocator protein was separated from remaining impurities in preparative SDS-polyacrylamide gels (Laemmli, 1970, Nature 227, 680-685) and after detection of the protein by staining with copper sulfate (Lee at al., 1987, Anal. Biochem. 166 , 308-312) cut out of the gel and digested in the gel matrix with endoproteinase LysC (Eckerskorn and Lottirri, 1989, Chromatographia 28, 92-94). The resulting peptides were eluted from the gel and separated by HPLC.
  • the amino acid sequence of the purified Peptide fractions were determined by automated Edman degradation in the gas phase (Eckerskorn et al., 1988, Eur. J. Biochem. 176, 509-519). Degenerate oligonucleotide sequences encoding these amino acid sequences were derived from the amino acid sequence of three peptides and the respective oligonucleotides were prepared by in vitro DNA synthesis. For use as a probe, the oligonucleotides were radiolabelled by attaching a 32 P phosphate group to the 5 'end using an oligonucleotide kinase.
  • Poly-A + RNA was isolated from cauliflower heads and a cDNA library in the vector Lambda gtlO was created from this. Approximately 300,000 clones of this library were probed with synthetic oligonucleotides modeled according to endoproteinase LysC peptide fragments of the purified phosphoenol pyruvate phosphate translocator (see exemplary embodiment 1).
  • Clones which reacted positively were purified by standard methods and, after preparation of the amplified phage DNA from the purified plaques, the insert coding for the phosphoenolpyruvate-phosphate translocator was obtained by EcoRI restriction digest and by Southern blot analysis using the above-mentioned ones Oligonucleotides as a probe, verified. After cloning the inserts of the phage DNA into the vector pBluescript (pBSC), the clones were analyzed by determining the DNA sequence (dideoxy method: Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the insert including the 6x His day was recovered by linearizing the vector pQE32 containing the insert with EcoRI, smoothing the ends with T4-DNA polymerase and then cleaving with HindIII.
  • the fragment thus obtained was inserted into the yeast expression vector pEVPll, which had been digested with 5 Sacl, smoothed with T4-DNA polymerase and digested with HindIII, and after amplification of the construct in E. coli in LiCl / PEG made competent ( Ito et al., 1983, J. Bact. 153, 163-168) transformed leucine synthesis deficient 5th pombe cells. Transformants were selected by selection on minimal medium without leucine, since the pEVPll-PEP construct gives the yeast cells the ability to grow on leucine-free medium.
  • Exemplary embodiment 4 15 Measurement of the phosphoenolpyruvate-phosphate transport activity in recombinant yeast lines
  • Yeast cells transformed with the pEVPll-PEP plasmid were grown in minimal medium to an optical density at 600 nm of 1.0
  • Liposomes are added and the resulting proteoliposomes are immediately frozen in liquid nitrogen.
  • the liposomes were previously sonicated with soybean phospholipid (20 mg / ml) for 10 min at 4 ° C. in the presence of 100 mM tricine-NaOH (pH 7.6),
  • proteoliposomes After thawing the proteoliposomes and sonicating the suspension again with 10 pulses, the proteoliposomes were removed from the surrounding medium by size exclusion chromatography on Sephadex G-25, which had previously been treated with 10 mM tricine-NaOH (pH 7.6), 100 mM sodium 5 gluconate and 50 mM potassium gluconate had been equilibrated, separated. The eluted proteoliposomes were used to measure the phosphoenolpyruvate-phosphate transport activity. The measurement was carried out according to the "inhibitor stop" method 0 described by Menzlaff and die (1993, Biochim. Biophys. Acta 1147, 13-18).
  • the phosphoenolpyruvate-phosphate transport activity in the pEVPll-PEP transformants was compared with the phosphoenolpyruvate-phosphate transport activity of transformants which were 5 only transformed with the vector pEVPll. It was shown that the phosphoenoipyruvate-phosphate transport activity in the pEVPll-PEP transformants (measured in pmol transported 97/25346 F CT / EP97 / 00044
  • the insertion was isolated by restriction digestion with Sal and Smal and converted into the vector pBinAR (Höfgen et al Willmitzer, 1990, Plant Sei. 66, 221-230), which had previously been cut with the enzymes Sall and Smal, was cloned. After amplification of the resulting construct pBinAR-PEP in E. coli, the construct was transformed into agrobacteria and these were then used to infect leaf segments of tobacco and potato.
  • the transformants obtained were examined with the aid of Southern blot analyzes for the presence of the intact, non-rearranged chimeric gene. With the help of the "total leaf reconstitution method" (Flügge and Weber, 1994, Planta, 194, 181-184) the phosphoenolpyruvate-phosphate transport activity was examined in comparison to control transformants (transformed with vector pBinAR without insertion), as well as the photosynthesis rate, perspiration and growth.
  • Organism Brassica oleracea
  • ATG CAG AGC TCC GCC GTC TTC TCC GCC TCT CCC TCC CTC CCT CTC 58 MET Gin Ser Ser Ala Val Phe Ser Ala Ser Pro Ser Leu Pro Leu 1 5 10 15 CTG AAA CCA GGC CGC CTC TCC CTT CGC CAT CCC GTC ACC GCC TCC 103 Leu Lys Pro Gly Arg Leu Ser Leu Arg His Pro Val Thr Ala Ser
  • GGCCTT TTTTTTTT GGGGAA AACCCC GGGGAA AATTCC GGCCCC CCTTAA GGCCGG GGGGAA GGTTTT TTTTCC TTTTAA TTAACC TTCCCC 1183

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz aus Brassica oleracea var. botrytis (Blumenkohl), die die Kodierregion eines Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Transporters enthält, deren Einführung in ein pflanzliches Genom die Bildung und Weiterleitung von Kohlenstoffgrundgerüsten für die Synthese phenolischer Verbindungen in transgenen Pflanzen verändert, Plasmide, Hefen und Bakterien enthaltend diese DNA-Sequenz, sowie transgene Pflanzen, bei denen durch Einführung der DNA-Sequenz Veränderungen der Aktivität des Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Transporters und somit Änderungen im Gehalt phenolischer Verbindungen, vor allem aromatischer Aminosäuren und Flavonoiden, hervorgerufen werden. Weiterhin betrifft die Erfindung transgene Pflanzen, die durch die Erhöhung des Gehaltes an phenolischen Verbindungen in ihrer Fähigkeit der Abwehr von pflanzlichen Pathogenen und der Toleranz gegenüber UV-Strahlung beeinflußt sind. Ebenso betrifft die Erfindung die Benutzung der beschriebenen Sequenz des Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators zur Identifizierung verwandter Translokatoren aus anderen Pflanzen durch Hybridisierung mit niedriger Stringenz oder durch PCR-Techniken, sowie die Nutzung des Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators als Ziel ('Target') für Herbizide.

Description

DNA-Sequenz kodierend einen Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Trans- lokator, Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen enthaltend diesen Transporter
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz aus Brassica oleracea var. botrytis (Blumenkohl), die die Kodierregion eines Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Transporters enthält, deren Ein¬ führung in ein pflanzliches Genom die Bildung und Weiterleitung von Kohlenstoffgrundgerüsten für die Synthese phenolischer Verbindungen in transgenen Pflanzen verändert, Plasmide, Hefen und Bakterien enthaltend diese DNA-Sequenz, sowie transgene Pflanzen, bei denen durch Einführung der DNA-Sequenz Veränderun¬ gen der Aktivität des Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Transporters und somit Änderungen im Gehalt phenolischer Verbindungen, vor allem aromatischer Aminosäuren und Flavonoiden, hervorgerufen werden. Weiter-hin betrifft die Erfindung transgene Pflanzen, die durch die Erhöhung des Gehaltes an phenolischen Verbindunger. in ihrer Fähigkeit der Abwehr von pflanzlichen Pathogenen und der Toleranz gegenüber UV-Strahlung beeinflußt sind. Ebenso betrifft die Erfindung die Benutzung der beschriebenen Sequenz des Phosphoenolpyruvat-Phosphat Translokators zur Identifizierung verwandter Translokatoren aus anderen Pflanzen durch Hybridi¬ sierung mit niedriger Stringenz oder durch PCR-Techniken, sowie die Nutzung des Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators als Ziel ("Target") für Herbizide.
Neben den primären Metaboliten wie Zuckern, Aminosäuren etc. produzieren Pflanzen eine Fülle sogenannter sekundärer Meta- bolite, die zunächst keinen direkten Bezug zum Wachstum und zur Entwicklung der Pflanze zu besitzen scheinen. Obwohl erst für einige wenige Stoffklassen die Funktion dieser Metabolite bekannt ist, sind diese für die Pflanzen ohne Zweifel von außerordent¬ licher Bedeutung. Angeführt seien die Produktion von Blütenfarb¬ stoffen, Duftstoffen, Alkaloiden und Giftstoffen (Phytoalexine) , die der Pflanze eine Schutz gegen Tierfraß und Pathogenbefall verleihen. Gemäß ihrer Biosynthesewege lassen sich die sekundären Metabolite in drei Gruppen einteilen:
• Terpene (Grundbaustein: Isopren) ,
• stickstoffhaltige Verbindungen (wie Alkaloide, Grundbaustein: Aminosäuren) , • phenolische Verbindungen, die über den Shikimat-Weg und den Mevalonat/Malonat Stoffwechselweg synthetisiert werden.
BKTÄTIGUNGSKOPJE 97/25346 F CT/EP97/00044
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Gerade die phenolischen Verbindungen bilden eine große, sehr he¬ terogene Gruppe von Substanzen mit unterschiedlichen Aufgaben in der Pflanze (Übersichtsartikel: Herrmann, 1995, Plant Cell 7, 907-919; Schmid und Amrhein, 1995, Phytochemistry 39, 737-749). Hierzu zählen die folgenden Substanzklassen:
I. Die aromatischen Aminosäuren Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin, wobei die beiden erstgenannten Aminosäuren für Menschen und Tiere essentiell sind, d.h. von diesen nicht synthetisiert werden können und deshalb mit der Nahrung auf¬ genommen werden müssen.
II. Ausgehend von Tryptophan wird das Pflanzenhormon Auxin synthetisiert, welches an der Regulation einer Reihe von Wachstumsprozessen in der Pflanze beteiligt ist.
III. Phenolcarbonsäuren wie die Zimtsäure, die wiederum die Ausgangsverbindungen für die Synthese weiterer Klassen von phenolischen Verbindungen sind wie z.B.:
IV. Lignin, ein sehr komplexes Polymer verschiedener Phenol- carbonsäuren, welches in die pflanzlichen Zellwände ein¬ gelagert wird und zu deren Verholzung führt (Holzstoff), ein Vorgang, der den Zellen eine hohe Zug- und Druckfestigkeit verleiht. Der Anteil von Lignin am Zellwandmaterial kann bis zu 35 % betragen, d.h. Lignin macht einen signifikanten Anteil der gesamten Biomasse aus.
V. Saücylsäure, welche eine wichtige Rolle bei der Induktion der Abwehr gegen Pathogene spielt.
VI. Cumarine, welche den charakteristischen Geruch einiger Pflanzenarten bedingen (Waldmeister) .
VII. Chinone, deren Bedeutung vor allem in ihrer Funktion als Elektronenüberträger in den Elektronentransportketten von Mitochondrien und Chloroplasten liegt.
VIII . Gerbstoffe, einfache und polymere Phenole, deren Name sich von ihrer Verwendung beim Gerben von Leder herleitet. In der Pflanze schützen Gerbstoffe zusammen mit anderen Substanzen gegen den Befall von Mikroorganismen, insbesondere durch Einlagerung in die Zellwände.
IX. Flavonoide, eine große Gruppe von Substanzen mit einem
Flavan-Gerüst, welche unter Streß vermehrt gebildet werden, z.B. zur Abwehr von Pathogenen und Freßfeinden und zum Schutz gegen UV-Strahlung. Zudem sind Flavonoide als Signal- Stoffe bei der Bildung von Wurzelkriöllchen in Leguminosen identifiziert worden, welche eine wichtige Rolle bei der StickstoffVersorgung dieser Pflanzen spielen. Zu dieser Gruppe gehören auch die Anthocyanidine, welche für die Färbung von Blüten und Früchten in zahlreichen Pflanzen verantwortlich sind.
Die phenolischen Verbindungen werden in Pflanzen im wesentlichen über den Shikimat-Weg synthetisiert, dessen Bedeutung schon dadurch ersichtlich wird, daß, global gesehen, 20 % des im Chloroplasten fixierten Kohlenstoffs in diesen Stoffwechselweg einfließen können (Haslam, 1993, in Shikimic Acid: Metabolism and Metabolites. (Chichester, John Willey and Sons)) .
Der Shikimat-Syntheseweg beginnt mit der Synthese von 3-Desoxy- arabinoheptulosonsäure-7-phosphat, einem Kondensationsprodukt aus Erythrose-4-phosphat und Phosphoenolpyruvat. Das entsprechende Enzym, die DAHP-Synthase, wird durch Pathogenbefall oder auch mechanische Verwundungen der Pflanze induziert, was zu einer er¬ höhten Bereitstellung von Chorismat (dem Endprodukt des Shikimat- Weges) als Vorläufer der Biosynthese von Lignin führt. Die Ligni- fizierung von Zellwänden ist u.a. eine Strategie der Pflanzen zur Pathogenabwehr. Transgene Pflanzen, in denen die Aktivität der DAHP-Synthase über einen anti-sense Ansatz reduziert wurde, wiesen Defekte in der Ligninbiosynthese auf (Jones et al., 1995, Plant Physiol., im Druck) .
Das erste Substrat der DAHP-Synthase-Reaktion, Erythrose-4- phosphat, ist ein Zwischenprodukt des im Piastiden stattfindenden oxidativen bzw. reduktiven Pentosephosphatweges. Phosphoenol¬ pyruvat ist Substrat dieser und einer zweiten Reaktion innerhalb des Shikimat-Weges. In der von der 5-Enolpyruvylshikimat-3- phosphat Synthase (EPSP-Synthase) katalysierten Reaktion wird 3-Enolpyruvyl-shikimat-5-phosphat aus Shikimat-3-phosphat und Phosphoenolpyruvat gebildet. Die EPSP-Synthase ist das am besten untersuchte Enzym des gesamtem Shikimat-Weges und das Target für das häufig eingesetzte Herbizid Glyphosat (Round-up, Monsanto) . Überexpression der EPSP-Synthase in transgenen Pflanzen bzw. das Ein-bringen einer bakteriellen und Glyphosat-unempfindlichen EPSP-Synthase bewirkt eine (weitgehende) Herbizid-Resistenz/ Toleranz (Stalker et al., 1985, J. Biol. Chem. 260, 4724-4728; Smart et al., 1985, J. Biol. Chem. 260, 16338-16346). Die durch Glyphosat bewirkte Hemmung kann interessanterweise durch Phos- phoenolpyruvat aufgehoben werden, das hier als Kompetitor in die Reaktion eingeht. Eukaryontische- Zellen und deren Stoffwechsel sind stark komparti- mentiert, wobei die einzelnen Kompartimente jeweils unterschied¬ liche Funktionen in der Zelle über-nehmen. Die Enzyme des Shiki¬ mat-Weges sind im Chloroplasten lokalisiert. Diese Organelle sind von zwei Lipiddoppelschichtmembranen umschlossen, deren äußere Molekularsiebcharakter hat und Verbindungen bis zu einer Größe von ca. 10 kDa frei passieren läßt (Flügge und Benz, 1984, FEBS Lett. 169, 85-89) . Die innere Membran ist permeabel für einige kleinere Verbindungen wie Wasser, Kohlendioxid, Sauerstoff und Nitrit, nicht jedoch für größere geladene Moleküle wie zum Bei¬ spiel Phosphoenolpyruvat.
Ob der Shikimat-Weg auch in anderen Kompartimenten wie dem Cytosol vorkommt, ist bislang unklar. Die chloroplastidäre Lokalisation zeigt sich auch daran, daß alle bislang klonierten Enzyme des Shikimat-Weges N-terminale und für Piastiden charak¬ teristische Präsequenzen aufweisen, welche die Informationen für den Eintransport der im Zellkern kodierten Proteine enthalten. Gleichwohl kann das Vorhandensein cytosolischer Isoformen nicht völlig ausgeschlossen werden (Mousdale und Coggins, 1985, Planta 163, 241-249; Schmid und Amrhein, 1995, Phytochemistry 39, 737-749) .
Die Herkunft des in den Piastiden benötigten Phosphoenolpyruvates ist bis heute nicht eindeutig geklärt. Phosphoenolpyruvat kann in der Zelle durch verschiedene Stoffwechselreaktionen bereitge¬ stellt werden. Zum einen wird es in der Glykolyse aus 3-Phospho- glycerat gebildet (Phosphoglycerat-Mutase/Enolase) und kann andererseits, im anabolen Stoffwechselweg, über die Phosphoenol- pyruvat-Carboxy-kinase aus Oxalacetat gebildet werden. In Pflanzen existiert noch eine dritte Möglichkeit, die Synthese ausgehend von Pyruvat durch die Pyruvat, Phosphat-Eikinase (PPDK) . CAM-Pflanzen und C4-Pflanzen besitzen eine chloro¬ plastidäre PPDK, während in C3-Pflanzen die PPDK, ebenso wie die Phosphoenolpyruvat-Carboxy-kinase, nur im Cytosol vorkommt. Phosphoenolpyruvat kann nicht, jedenfalls nicht in genügender Menge, von den Piastiden selbst bereitgestellt werden. Ursache hierfür ist zum einen die cytosolische Lokalisatior. von Phospho- enolpyruvat-Carboxykinase und PPDK, zum anderen die offenbar nicht ausreichende Aktivität von Phosphoglyceratmut.ase, die die Umwandlung von 3-Phosphoglycerat in 2-Phosphoglycerat katalysiert (Stitt und apRees, 1979, Phytochemistry 18, 1905-1S11) , d.h. Piastiden besitzen keinen der für die Phosphoenolpyruvat-Synthese verantwortlichen Stoffwechselwege, zumindest nicht in ausreichen¬ der Aktivität. Dieser Tatbestand wird durch Untersuchungen an intakten (belichteten) Chloroplasten bestätigt, die zeigten, daß die Synthese aromatischer Aminosäuren durch extern zugesetztes Phosphoenolpyruvat deutlich stimuliert wurde, was bedeutet, daß der Shikimat-Weg auf Phosphoenolpyruvat angewiesen ist, das im Cytosol bereitgestellt und in die Plasti'den importiert werden muß (Schulze-Siebert et al., 1984, Plant Physiol. 76, 465-471) . Es war bislang eine offene Frage, auf welche Weise Phosphoenol - pyruvat in die Piastiden transportiert werden kann. Der in der inneren Hüllmembran lokalisierte chloroplastidäre Phosphattrans- lokator aus C3-Pflanzen katalysiert den Austausch von Phosphat, Triosephosphaten und 3-Phosphoglycerat, hat aber nur eine sehr geringe Affinität gegenüber dem Substrat Phosphoenolpyruvat (Fliege et al. , 1978, Biochim. Biophys. Acta 502, 232-247; Flügge und Heldt, 1991, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42, 129-144) . Da alle Substrate um die gleiche Bindungsstelle am Translokator kompetitieren, erscheint es zudem fraglich, ob unter den gegebenen zellulären Metabolitspiegeln Phosphoenolpyruvat überhaupt von dem Translokator gebunden werden kann. Die Frage besteht, ob die Piastiden für den Transport von Phosphoenolpyru¬ vat einen speziellen Transporter besitzen.
Zur Klärung dieser Frage wurde daher zunächst der bei Membran- proteinen außer-ordentlich schwierige Weg der biochemischen Charakterisierung, Reinigung und Isolation einer Phosphoenol- pyruvat-Phosphat-Transportaktivität beschritten, da es nicht gelang, einen entsprechenden Klon mittels Hybridisierung mit der DNA für den chloroplastidären Phosphattranslokator zu isolieren. Es ist nun gelungen, das Translokator-Protein als Komponente der inneren Hüllmembran von Amyloplasten aus Blumenkohl mit einer apparenten molekularen Masse von 30 000 Dalton zu identifizieren. Die beschriebene Reinigungsprozedur ist jedoch nicht geeignet, für eine Proteinsequenzierung ausreichende Mengen Protein zu präparieren, zumal sich ergab, daß der N-Terminus des Proteins blockiert und somit einer N-terminalen Proteinsequenzierung durch automatisierten Edman-Abbau nicht zugänglich war. Daher war es nötig, das Protein durch präparative SDS-Polyacrylamidgelelektro- phorese in ausreichender Menge zu isolieren, enzymatisch zu spalten und interne Peptidsequenzen zu erhalten (siehe Aus¬ führungsbeispiel 1) .
Es konnten auf diese Weise drei Peptidsequenzen von 10, 12 und 15 Aminosäuren erhalten werden. Dadurch gelang es, durch Durch- musterung einer cDNA-Bibliothek mit nach den erhaltenen Peptiden modellierten synthetischen Oligonukleotiden das Gen für den plastidären Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator zu isolie¬ ren. Es zeigte sich nach Sequenzierung des Klones, daß dieser nur eine ca. 30%ige Homologie zum chloroplastidären Phosphat- translokator aufweist. Es gelang, diesen Transporter in einem heterologen System (Hefezellen) zu exprimieren und seine Trans- Porteigenschaften im rekonstituierten System (an künstlichen 97/25346 FCT/EP97/00044
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Membranen) zu .charakterisieren. Wie aus der Abbildung 1 ersichc- lich, handelt es sich bei diesem Transporter um ein Gegentausch- system für Phosphoenolpyruvat und anorganisches Phosphat. Dieser Translokator besitzt nur eine geringe Affinität gegenüber den Substraten des chloroplastidären Phosphattranslokators (Triose- phosphate und 3-Phosphoglycerat) , was sinnvoll erscheint, sollte dieser Transporter bevorzugt dem Transport von Phosphoenolpyruvat dienen.
Abb. 1: Bestimmung der Substrataffinitäten rekombinanter
Phosphattranslokatoren aus Chloroplasten und nicht-grünem
Gewebe.
Messung rekonstituierter Phosphattransporta.-ttivitäten.
Die rekombinanten Translokatoren wurden über eine
Ni-^+~Affinitätssäule aus Hefezellen gereinigt und ir. Liposomen rekonstituiert, die mit den angegebenen Substraten vorbeladen worden waren. Gemessen wurde die Aufnahme von radioaktiv markier¬ tem [32P] Phosphat. (Unveröffentlichte Daten) .
Aus S. pombe Zellen gereinigte rekombinante (His-tagged) Translokatoren aus
S pinat - Chloroplasten Blumenkohl-Plastiden
Liposomen beladen mit = 100 = 100
Phosphat Triosephosphat 80 27
3-Phosphoglycerat 100 22 Gl ukose - 6 - p ho sphat 4 8 Phosphoenolpyruvat 14 68
Klone für den entsprechenden Transporter wurden dann mittels der Blumenkohlsonde aus Mais-Wurzeln und Mais-Endosperm isoliert. Mittlerweile konnten wir zeigen, daß der Phosphoenolpyruvat- (PEP)-Phosphat-Transporter auch in grünen Geweben exprimiert wird und es gelang, den entsprechenden cDNA-Klon aus Arabidopsis thaliana und Tabak (Nicotiana tabacum) zu isolieren. Damit verfügen wir aus mehreren Pflanzen über den Transporter, der Phosphoenolpyruvat als Substrat für den Shikimat-Weg (DAHP- Synthase und EPSP-Synthase) in die Piastiden zu transportieren vermag. Transportprozasse sind in vielen Fällen der für einen Stoff- wechselweg begrenzende Faktor. In neueren Publikationen wurde gezeigt (Riesmeier et al . , 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 6160-6164; Heineke et al., 1994, Planta 193, 174-180), daß die Effektivität der photosynthetischen Kohlenstoffreduktion (Licht- reaktion und Calvin-Zyklus) ganz wesentlich durch die Verfüg¬ barkeit eines Substrats der Lichtreaktion, des anorganischen Phosphats, und dem Abtransport des in der Reaktionsfolge ent¬ standenen reduzierten, organisch gebundenen Kohlenstoffs (Triose- phosphat) beeinflußt werden kann. Auch diese Reaktionen finden in den Chloroplasten der Pflanze statt und der Ein- bzw. Austrans¬ port der Substrate über die innere Chloroplastenhüllmembran wird durch das oben erwähnte spezifische Translokatorprotein kataly¬ siert (Triosephosphat/Phosphat-Translokator, Flügge et al., 1989, EMBO J. 8, 39-46; Flügge et al., 1991, Nature 353, 364-367) und limitiert. Dieses Translokatorprotein stellt demzufolge eine Engstelle im Kohlenstoffstoffwechsel dar. Wie oben beschrieben, nimmt der Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator der Piastiden- hüllmembran eine Schlüsselstellung bei der Versorgung des Plasti- den mit der Ausgangsverbindung des Shikimat-Weges ein. Es sollte also möglich sein, mit Hilfe der erhaltenen Sequenz die Aktivität des Translokators in Pflanzen zu steigern und dadurch die Konzen¬ tration von Phosphoenolpyruvat in den Piastiden zu erhöhen. Dies sollte bei Bedarf zu einem erhöhten Fluß von fixiertem Kohlen- stoff in den Shikimatweg führen und damit zu einem erhöhten
Gehalt an phenolischen Verbindungen. Da diese Verbindungen, wie oben ausgeführt, eine entscheidende Rolle bei der Abwehr pflanz¬ licher Pathogene wie Bakterien und Pilzen spielen und solche Infektionen jährlich zu großen Ernteausfällen führen, sollte eine höhere Kapazität zur Synthese solcher Verbindung einen ver¬ besserten Schutz der Pflanzen bewirken. Zum anderen sind diese phenolischen Verbindungen an dem Schutz der Pflanzen gegen schäd¬ liche UV-Strahlung beteiligt, ein Mechanismus, der angesichts ständig ansteigender UV-Strahlung infolge des Ozon-Abbaues in der Atmosphäre immer wichtiger werden könnte.
An Pflanzen mit derart verbesserten Schutzmechanismen besteht dringender Bedarf, denn der überwiegende Teil der Menschen auf der Erde ist auf pflanzliche Er-nährung angewiesen.
Bislang sind aus anderen, nicht pflanzlichen Organismen keine Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokatoren isoliert worden, die für diesen Zweck eingesetzt werden könnten. Zudem müßten diese Translokatoren einen Gegentausch mit Phosphat durchführen, um das im Shikimatweg freigesetzte Phosphat aus dem Chloroplasten zu ex- portieren. Die zweite auftretende Schwierigkeit wäre der korrekte Einbau dieser Fremdproteine in die innere Plastidenhüllmembran, da die authentischen Proteine dieser Membran neben der für die 97/25346 ϊ'CT/EP97/00044
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"Plastiden-Adr.essierung" nötigen Präsequenz im reifen Teil (der Teil des Proteins, der nach der Abspaltung der Präsequenz durch eine spezifische Protease verbleibt) noch weitere Informationen für die Integration in die Membran besitzen (eigene, unveröffent- lichte Beobachtungen; Li at al., 1992, J. Biol. Chem. 267,
1899919004). Die genaue Lokalisation dieser Informationen im rei¬ fen Teil der bisher bekannten Proteine der inneren Hüllmembran (37 kDa-Protein: Dreses-Werringloer et al., 1991, Eur. J. Biochem. 195: 361-368; Triosephosphat-Phosphat-Tran∑;lokator: Flügge et al. , 1989, EMBO J. 8: 39-46; Willey et al., 1991, Planta 183, 451-461; Fischer et al. , 1994, Plant J. 5(2), 215-226; Ca2+-ATPase: Huang et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 10066-10070) gelang bisher nicht. Eigene Untersuchungen am Beispiel eines mitochondrialen Carriers, des ADP/ATP-Trans- porters zeigten, daß dieses Protein nicht oder nur mit einer sehr geringen Effizienz zu den Chloroplasten dirigiert und dort in die Hüllmembran eingebaut werden. Selbst ein Hybridprotein, bestehend aus einer chloroplastidären Präsequenz (die Information für die Chloroplasten-Adressierung enthaltend) und diesem mitochondrialen Carrier, zeigte gegenüber dem authentischen Protein einen kaum erhöhten Einbau in die Chloroplasten-Hüllmembran (unveröffent¬ lichte Beobachtungen) . Da für eine korrekte Insertion die Pro- tein/Lipid-Wechselwirkung von Bedeutung ist und sich die chloro- plastidäre Hüllmembran in ihrer Lipidzusammensetzung grundlegend von der anderer Membranen unterscheidet (Joyard et al., 1991,
Eur. J. Biochem. 199, 489-509), ist es sehr unwahrscheinlich, daß eine, wenn auch geringfügige Insertion, eines fremden Proteins, dann auch funktioneil ist, d.h. daß ein Transporter aus anderen Organellen überhaupt in einer seiner Funktion entsprechenden Kon- formation und Orientierung in die Chloroplasten-Hüi:.membran ein¬ gebaut werden kann.
Somit ist es nach gegenwärtigem Stand der Technik n:.cht möglich, mit Hilfe bekannter Plastiden-"Targeting"-Sequenzen nicht-plasti- däre Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Transporter, so diese denn existieren, funktioneil in die innere Plastidenhüllnembran zu integrieren. Beim gegenwärtigen Stand der Technik ist es erfolg¬ versprechender, für die Konstruktion der oben geschilderten Pflanzen auf die pflanzeneigenen Translokatoren zurückzugreifen.
Die vorliegende Erfindung stellt nun DNA-Sequenzen zur Verfügung, die aus einem pflanzlichen Genom stammen und für einen plasti- dären Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator kodieren, wobei die in der Nukleotidabfolge enthaltene Information bei Einführung und Expression in pflanzlichen Zellen zur Bildung einer Ribo- nukleinsäure führt und über diese Ribonukleinsäure eine Phospho- enolpyruvat-Phosphat-Translokator Aktivität in die Zellen einge¬ führt werden kann oder eine endogene Phosphoenolpyruvat-Phosphat- Translokator Aktivität unterdrückt werden kann. Gegenstand der Erfindung ist insbesondere eine DNA-Seqüenz aus Brassica ol eracea mit der folgenden Nukleotidabfolge (Seq ID No. 1) :
CAGATCTCCC ACG 13
ATG CAG AGC TCC GCC GTC TTC TCC GCC TCT CCC TCC CTC CCT CTC 58
MET Gin Ser Ser Ala Val Phe Ser Ala Ser Pro Ser Leu Pro Leu 1 5 10 15
CTG AAA CCA GGC CGC CTC TCC CTT CGC CAT CCC GTC ACC GCC TCC 103 Leu Lys Pro Gly Arg Leu Ser Leu Arg His Pro Val Thr Ala Ser 20 25 30
TCG AAT CTC AGC GTC TCT CCT CCG AAT GTC GTC TCT GTT CCT CCT 148 Ser Asn Leu Ser Val Ser Pro Pro Asn Val Val Ser Val Pro Pro
35 40 45
CTA CCT CGC CGA TCT TGG CGT CTC GCC TCT TCC GAC TCG CCG CTT 193 Leu Pro Arg Arg Ser Trp Arg Leu Ala Ser Ser Asp Ser Pro Leu 50 55 60
CGC GCC TGG TCC GGT CTC CCT TCC GTA TCC TCC CCT TCC CTC GAC 238 Arg Ala Trp Ser Gly Leu Pro Ser Val Ser Ser Pro Ser Leu Asp
65 70 75
ACT AAC CGC TTC AAA ACT GCA GCT ACG GCA GTT CCG GAG GAA GGA 283 Thr Asn Arg Phe Lys Thr Ala Ala Thr Ala Val Pro Glu Glu Gly
80 85 90
GAA GGA AGT GGA AAG ATG ACT AAG GTT CTG GAG CTC GGC TTG CTG 328 Glu Gly Ser Gly Lys Met Thr Lys Val Leu Glu Leu Gly Leu Leu
95 100 105
TTT GCG ATG TGG TAC CTT TTC AAT ATC TAC TTC AAC ATC TAC AAC 373 Phe Ala Met Trp Tyr Leu Phe Asn Ile Tyr Phe Asn Ile Tyr Asn
110 115 120
AAG CAG GTT TTG AAA GCT CTT CAC GCC CCA ATG ACT GTC ACT TTA 418 Lys Gin Val Leu Lys Ala Leu His Ala Pro Met Thr Val Thr Leu
125 130 135
GTT CAG TTT GCC GTC GGT AGT GTC CTC ATT ACC TTC ATG TGG GCT 463 Val Gin Phe Ala Val Gly Ser Val Leu Ile Thr Phe Met Trp Ala
140 145 150
CTT AAC CTT TAC AAG AGG CCC AAG ATC TCT GCT GCT CAG CTT GCG 508 Leu Asn Leu Tyr Lys Arg Pro Lys Ile Ser Ala Ala Gin Leu Ala
155 160 165
GCC ATC TTG CCA CTT GCA GTT GTG CAC ACT CTT GGT AAT CTC TTT 553 Ala Ile Leu Pro Leu Ala Val Val His Thr Leu Gly Asn Leu Phe
170 175 180
ACT AAC ATG AGC CTC GGG AAA GTC TCT GTT TCC TTT ACT CAC ACC 598 Thr Asn Met Ser Leu Gly Lys Val Ser Val Ser Phe Thr His Thr
185 190 195
ATT AAA GCC ATG GAG CCT TTC TTC TCC GTT GTC TTG TCT GCT ATG 643 Ile Lys Ala Met Glu Pro Phe Phe Ser Val Val Leu Ser Ala Met
200 205 210
TTT CTC GGC GAG GTG CCT ACT CCA TGG GTC ATC GGT TCC ATT ATT 688 Phe Leu Gly Glu Val Pro Thr Pro Trp Val Ile Gly Ser Ile Ile
215 220 225
CCA ATC GTT GGT GGA GTT GCA CTT GCT TCA GTG ACA GAG GTC TCA 733 pro ile Val Gly Gly Val Ala Leu Ala Ser Val Thr Glu Val Ser
230 235 240
TTC AAC TGG GCT GGC TTT TTG AGT GCA ATG GCT TCA AAC TTG ACT 778 Phe Asn Trp.Ala Gly Phe Leu Ser Ala Met Ala Ser Asn Leu Thr
245 ' 250 255
AAC CAA TCC CGT AAC GTG CTT AGC AAA AAA GTC ATG GTC AAG AAA 823 Asn Gin Ser Arg Asn Val Leu Ser Lys Lys Val Met Val Lys Lys
260 265 270 GAT GAT TCT TTG GAC AAC ATC ACC CTC TTC TCT ATA ATA ACG TTG 868 Asp Asp Ser Leu Asp Asn Ile Thr Leu Phe Ser Ile Ile Thr Leu
275 280 285
ATG TCT CTC TTT CTG ATG GCC CCT GTG ACT TTC TTC TCC GAA GGA 913 Met Ser Leu Phe Leu Met Ala Pro Val Thr Phe Phe Ser Glu Gly 290 295 300
ATC AAG TTC ACT CCG TCA TAC ATC CAA TCA GCT GGT GTG AAT GTT 958 Ile Lys Phe Thr Pro Ser Tyr Ile Gin Ser Ala Gly Val Asn Val
305 310 315
CAA CAA ATC TAC ACG AAG TCT CTT ATT GCT GCA CTC TGC TTC CAC 1003 Gin Gin Ile Tyr Thr Lys Ser Leu Ile Ala Ala Leu Cys Phe His 320 325 330
GCA TAC CAG CAG GTG TCG TAC ATG ATA TTG GCG AGA GTA TCA CCC 1048 Ala Tyr Gin Gin Val Ser Tyr Met Ile Leu Ala Arg Val Ser Pro
335 340 345
GTA ACA CAT TCT GTA GGA AAC TGT GTG AAG CGT GTG GTG GTC ATC 1093 Val Thr His Ser Val Gly Asn Cys Val Lys Arg Val Val Val Ile 350 355 360
GTG AGC TCT GTC ATC TTC TTC AAG ACA CCG GTC TCG CCT GTT AAT 1138 Val Ser Ser Val Ile Phe Phe Lys Thr Pro Val Ser Pro Val Asn
365 370 375
GCT TTT GGA ACC GGA ATC GCC CTA GCG GGA GTT TTC TTA TAC TCC 1183 Ala Phe Gly Thr Gly Ile Ala Leu Ala Gly Val Phe Leu Tyr Ser 380 385 390
AGA GTG AAG CGT ATC AAG CCA AAG CCT AAG ACT GCC TΛA 1222
Arg Val Lys Arg Ile Lys Pro Lys Pro Lys Thr Ala
395 400
GCAAACTATC TGCTACTGCT TTTATATGTA ATACAATTTT CTTGAGCTGA AGTTTTCTTT1282 CAGATAGATG GTTTTATTTT TCCGCGGATT CTTGATACGT TTCTTCTCTT TATTATGTGT1342 TCTCTTTGCT GACTTACTCT TTGAAATATT TTACAGTTTT TTCAACAΛAA AAAAAAAAAA1402
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind DNA-Sequenzen, die mit der unter Seq.-ID No. 1 genannten DNA-Sequenz oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, hybridisieren und für ein plastidäres Protein kodieren, das die biologische Aktivität eines Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators besitzt.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, zur Transformation pro- und eukaryontischer Zellen. Um die Expression des Phosp/ioenolpyruvat- Phosphat-Translokators in transformierten Zellen zu gewährlei- sten, kann die. erfindungsgemäße DNA-Sequenz in Plasmide einge¬ bracht werden und dabei mit Steuerelementen für die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen kombiniert werden (siehe Ausführungsbeispiele 3,5). Derartige Steuerelemente sind einerseits Transkriptions-Promotoren und andererseits Tran¬ skriptions-Terminatoren. Mit den Plasmiden können eukaryontische Zellen transformiert werden mit dem Ziel der Expression einer übersetzbaren Botenribonukleinsäure (RNA) , die die Synthese eines plastidären Phosphoenolpyruvat-Phosp'hat-Translokators in den transformierten Zellen erlaubt, oder mit dem Ziel der Expression einer nicht übersetzbaren, invers orientierten ("anti-sense" ) , Botenribonukleinsäure, die die Synthese der endogenen Phospho- enolpyruvat-Phosphat-Translokatoren verhindert. Zu diesem Zweck könnten auch kürzere Fragmente der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder DNA-Sequenzen mit einem relativ hohen Grad an Homologie (mehr als ca. 65 % Homologie) verwendet werden. Ebenso kann die Expression von endogenen Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Trans- lokatoren durch die Expression eines für diesen Zweck konstruier¬ ten Ribozyms unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen inhibiert werden. Durch die Expression einer RNA entsprechend der erfindungsgemäßen Sequenz eines pflanzlichen Phosphoenolpyruvat- Phosphat-Translokators wird eine Veränderung des pflanzlichen Sekundärstoffwechsels, in diesem Falle der Synthese phenolischer Verbindungen, die über den Shikimat-Weg hergestellt werden, er- möglicht, deren wirtschaftliche Bedeutung darin liegt, daß eine Verbesserung der Weiterleitung von Phosphoenolpyruvat aus dem Cytosol in die Piastiden zu einer Erhöhung des Gehaltes an diesen phenolischen Verbindungen führt. Es können somit Pflanzen erzeugt werden, die eine höhere Resistenz gegen Befall von Pathogenen und eine gesteigerte Toleranz gegen UV-Bestrahlung aufweisen. Diese Modifikation senkt den Ernteausfall und steigert damit deren wirtschaftlichen Wert. Weiterhin ermöglicht die heterologe Expression der beschriebenen Sequenz in Spalthefen (Ausführungs- beispiele 3,4 und Loddenkötter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 2155-2159) Struktur-Funktionsstudien des Phospho- enolpyruvat-Phosphat-Translokators, die letztendlich zur Ent¬ wicklung eines spezifischen Hemmstoffs für dieses Protein führen könnten. Insbesondere ist hier an die Herbizidentwicklung zu denken, da die Hemmung eines Proteins mit Schlüsselfunktion im Stoffwechselgeschehen zwangsweise letal für die Pflanze wäre.
Es sind bereits Verfahren zur genetischen Modifikation dikotyler und monokotyler Pflanzen bekannt (Gasser und Fraley, 1989, Science 244, 1293-1299; Potrykus, 1991, Ann. Rev. Plant Mol. Biol. Plant Physiol. 42, 205-225). Zur Expression von kodierenden Sequenzen in Pflanzen müssen diese mit transkriptioneil regulato¬ rischen Elementen verknüpft werden. Solche Elemente, Promotoren genannt, sind-Jbekannt (u.a. Koster-Topfer et al., 1989, Mol. Gen. Genet. 219, 390-396). Ferner müssen die "Kodierregionen mit einem Transkriptionsterminations-Signal versehen werden, damit sie korrekt transkribiert werden können. Solche Elements sind eben- falls beschrieben (Gielen et al. , 1989, EMBO J. 8, 23-29) . Der transkriptioneile Startbereich kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirts-pflanzs sein. Termi - nationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar. Die DNA-Sequenz der Transkriptionsstart- und -terminationsregionen kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten. Zur Vorbereitung der Einführung fremder 3ene in höhere Pflanzen sind eine große Anzahl Klonierungsvektoren verfügbar, die ein Replikationssignal für E. coli und einen Marker bein- halten, der eine Selektion der transformierten Zellen erlaubt. Beispiele für Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13 mp-Serien, pACYC 184 usw. Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanze können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z.3. für die Transformation der Pflanze das Ti oder Ri-PIasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti und Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich den einzuführenden Genen angefügt werden. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend beschrieben (Hoekema, in: The Binary Plant Vector System, Offset-drukkerij Kanters B-V. Ablasserdam, 1985, Chapter V; Fraley et al. , Critic. Rev. Plant Sei. 4, 1-46; An et al., 1985, EMBO J. 4, 277-287). Ist die ein¬ geführte DNA einmal im Genom integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen einen Resistenz gegenüber Bioziden oder Antibiotika wie Kanamycin, Bleomycin oder Hygromycin verleiht. Der individuell eingeführte Marker wird daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen neben der Transformation mit Hilfe von Agrobakterien viele andere Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transfor- mation von Protoplasten, die Mikroinjektion von DNA, die Elektro¬ poration sowie ballistische Methoden. Aus dem transformierten Pflanzenmaterial können dann in einem geeigneten Selektionsmedium ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann mit gängigen molekularbiologischen Methoden auf die Anwesenheit der eingeführten DNA getestet werden. Diese Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformiertθ- Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, ge¬ kreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften. Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen (oder Teile dieser Sequenz oder Derivate dieser Sequenz) können auch in Plasmide eingebracht und dabei mit Steuerelementen für die Expression in Zellen von Spalthefen versehen werden (siehe Ausführungsbeispiel 3) . Die Einführung des Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators führt zu einer erheblichen Zunahme der durch Rekonstitution in künstliche Liposomen meßbaren Aktivität des Phosphoenolpyruvat-Phosphat- Translokators in den rekombinanten Hefezellen. Dieser in Hefe¬ zellen exprimierte Translokator kann zur Untersuchung von Struktur-Funktionsbeziehungen und zur Entwicklung von spezi¬ fischen Hemmstoffen, welche als Herbizide zur Anwendung kommen können, verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen (oder Derivate oder Teile dieser Sequenz) können auch in Plasmide eingebracht werden, die eine Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-Sequenzen in prokaryontischen oder eukaryontischen Systemen erlauben. Dadurch kann die Spezifität des Phosphoenol- pyruvat-Phosphat-Translokators verändert werden. Ebenso könnte eine Unempfindlichkeit gegenüber für den Phosphoenolpyruvat- Phosphat-Translokator spezifischer Herbizide erreicht werden. Mit Hilfe von Standardverfahren (Sambrock et al. , 1989, Molecular cloning: A laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, NY, USA) können Basenaustausche und/oder Basen- deletionen vorgenommen und/oder synthetische oder natürliche Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Frag¬ mente untereinander können Adapter oder linker angesetzt werden. Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnitt¬ stellen bereitstellen oder die nicht benötigte DNA entfernen, eingesetzt werden. Dort wo Insertionen, Deletionen oder Substitu¬ tionen wie z.B. Transitionen oder Transversionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerrepair" , Restriktion oder Ligation verwendet werden. Als Analysemethode werden im allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse und weitere biochemisch-molekular-biologische Methoden wie z.B. die Expression des modifizierten Proteins in Spalthefe und die Messung der modifizierten Transporteigenschaften in artifiziellen Liposomen (siehe Ausführungsbeispiel 4 und Loddenkötter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 2155-2159;. sowie Fischer et al., 1994, Plant Journal 5, 215-226) oder die Messung der modifizierten Transporteigenschaften am in transgenen Pflanzen exprimierten Protein mit Hilfe einer kürzlich von uns zu diesem Zweck entwickelten Methode (Flügge und Weber, 1994, Planta, 194, 181-185) angewandt. Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz (oder Teile oder Derivate dieser Sequenz) kann dazu genutzt werden, nach Standardveriiahren (ins¬ besondere Hybridisierungs-Durchmusterung von cDNA-Bibliotheken mit niedriger Stringenz unter Verwen-dung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder Teilen der DNA-Sequenz als Sonde oder die Erstellung von Sonden für stringente und niedrig stringente Durchmusterungs-Strategien durch Ableitung von degenerierten und/oder nicht degene-rierten Primern aus der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz für PCR-Experimente mit DNA oder cDNA von Spinat oder anderen Pflanzen) aus dem Genom von Pflanzen ähnliche Sequenzen zu isolieren, die ebenfalls Phosphoenolpyruvat transportieren.
Zum besseren Verständnis der dieser Erfindung zugrundeliegenden Ausführungsbeispiele werden die wichtigsten eingesetzten Ver- fahren im folgenden erläutert.
1. Klonierungsverfahren
Zur Klonierung wurden der Phage Lambda gtlO sowie der Vektor pBluescript II KS (pBSC) (Short et al., 1988, Nucl . Acids Res. 16, 7583-7600) verwendet.
Für die Transformation von Hefen wurde der Vektor pEVPll (Rüssel und Nurse, 1986, Cell 45, 145-153) verwendet.
Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor pBinAR (Höfgen und Willmi;zer, 1990, Plant Sei. 66, 221-230) kloniert.
2. Bakterien- und Hefestämme
Für den pBluescriptKS (pBSC) Vektor sowie für pΞVPll- und pBinAR-Konstrukte wurden die E. coli Stämme DH5α (Hanahan et al., 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580) und TG1 (Gibson, 1984, Ph.D. Thesis, Cambridge University, England) verwendet.
Die Transformation der pBinAR-Konstrukte in Tabakpflanzen wurde mit Hilfe des Agrobacfcerium tumefaciens-Stammes LBA4404 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res. 12, 8711-8720) durchgeführt.
Transformation von Agroba ct er i um tumefaciens
Der Transfer der DNA in die Agrobakterien erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen und Will' nutzer (1988, Nucl. Acids Res. 16, 9877). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birn-boim und Doly (1979, Nucl. Acids Res. 7, 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektro- phoretisch auf Richtigkeit und Orientierung analysiere.
4. Pflanzentransformation
Pro Transformation wurden 15 kleine mit Schmirgelpapier und Skalpell verwundete Blätter einer Tabak-Sterilkultur in 10 ml MS-Medium mit 2 % Saccharose gelegt, welches 100 μl einer unter strenger Selektion gewachsenen, transformierten Agro - bacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 15 minü- tigem leichtem Schütteln wurden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6 % Glukose, 2 mg/l Zeatinribose, 0,02 mg/l Naphthylessig- säure, 0,02 mg Giberellinsäure, 500 mg/l Betabactyl1, 15 mg/l Hygromycin und 0,8 % Bacto-Agar ausgelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3.000 Lux Beleuchtungsstärke wurde die Betabactylkonzentration im Medium um die Hälfte redu¬ ziert.
Hinterlegungen:
Am 14.11.1995 wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganis¬ men (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, folgende Plasmide in Form von E. coli Stämmen, enthaltend diese Plasmide, hinterlegt:
Plasmid pEVPll-PEP (DSM 10326) Plasmid pBinAR-PEP (DSM 10327)
Abbildungen:
1.) Abbildung 1: Rekonstitution der Transportaktivität des in Hefe exprimierten rekombinanten Phosphoenolpyruvat Translokators
Ausführungsbeispiel 1 Isolation von Peptidfragmenten des Translokators und Erstellung von Sonden für die Hybridisationsdurchmusterung von cDNA Biblio¬ theken
Gereinigtes Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokatorprotein wurde in präparativen SDS-Polyacrylamidgelen (Laemmli, 1970, Nature 227, 680-685) von verbleibenden Verunreinigungen getrennt und nach Detektion des Proteins durch Anfärbung mit Kupfersulfat (Lee at al., 1987, Anal. Biochem. 166, 308-312) aus dem Gel ausgeschnitten und in der Gelmatrix mit Endoproteinase LysC verdaut (Eckerskorn und Lottspeich, 1989, Chromatographia 28, 92-94) . Die resultierenden Peptide wurden aus dem Gel eluiert und mittels HPLC getrennt. Die Aminosäuresequenz der gereinigten Peptidfraktionen wurde durch automatisierten Edman-Abbau in der Gasphase bestimmt (Eckerskorn et al., 1988, Eur. j. Biochem. 176, 509-519) . Aus der Aminosäuresequenz von drei Peptiden wurden degenerierte Oligonukleotidsequenzen, kodierend diese Aminosäure- sequenzen, abgeleitet und die respektiven Oligonukleotide durch in vi tro DNA-Synthese hergestellt. Für den Einsatz als Sonde wurden die Oligonukleotide durch Anhängen einer 32P-Phosphatgruppe an das 5'-Ende mittels einer Oligonukleotidkinase radioaktiv markiert.
Ausführungsbeispiel 2
Klonierung des Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators aus
Blumenkohl
Aus Blumenkohlköpfen wurde poly-A+-RNA isoliert und ausgehend hiervon eine cDNA-Bibliothek im Vektor Lambda gtlO angelegt. Ca. 300.000 Klone dieser Bibliothek wurden mit nach Endo- proteinase LysC-Peptidfragmenten des gereinigten Phosphoenol- pyruvat-Phosphat-Translokators modellierten synthetischen Oligo- nukleotiden sondiert (siehe Ausführungsbeispiel 1) . Positiv reagierende Klone wurden nach Standardverfahren gereinigt und nach Präparation der amplifizierten Phagen-DNA aus den gereinig¬ ten Plaques wurde durch EcoRI-Restriktionsverdau die Insertion kodierend für den Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator er- halten und durch Southern-Blot Analyse, mit den oben erwähnten Oligonukleotiden als Sonde, verifiziert. Nach Umklonierung der Insertionen der Phagen-DNA in den Vektor pBluescript (pBSC) wurden die Klone durch Bestimmung der DNA-Sequenz εnalysiert (Didesoxymethode: Sanger et al. , 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467) und aus dieser DNA-Sequenz die Primέ.rstruktur des Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators abgeleitet. Die Sequenz der zum Sondieren der cDNA-Bibliothek benutzten Oligonukleotide bzw. Peptide konnte wiedergefunden werden.
Ausführungsbeispiel 3
Expression des Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators aus Blumenkohl in der Spalthefe Schizosaccharomyces por.rbe
Die Insertion in dem oben erwähnten Plasmid pBluescript (pBSC) , kodierend für den Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator, wurde mit den Endonucleasen PstI und Sspl herausgeschnitten und durch Elektrophorese isoliert. Die Überhänge des so erhaltenen Frag¬ mentes wurden mit Hilfe des Enzyms T4-DNA Polymerase geglättet. Das Insert, kodierend für den Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Trans- lokator, wurde dann in den Vektor pQE32 (Quiagen) , der mit BamHI linearisiert und dessen Überhänge mit T4-DNA-Polymerase geglättet wurden, kloniert. Das Insert inklusive des 6x His-tags wurde wiedergewonnen, indem der Vektor pQE32, enthaltend das Insert, mit EcoRI linearisiert, die Enden mit T4-DNA-Polymerase geglättet und anschließend mit Hindlll gespalten wurde. Das so gewonnene Fragment wurde in den Hefe-Expressionsvektor pEVPll, der mit 5 Sacl gespalten, mit T4-DNA-Polymerase geglättet und mit Hindlll gespalten wurde, gerichtet eingesetzt und nach Amplifikation des Konstrukts in E. coli in durch LiCl/PEG kompetent gemachte (Ito et al., 1983, J. Bact. 153, 163-168) Leucinsynthese- defiziente 5. pombe Zellen transformiert. Transformanten wurden 10 durch Selektion auf Minimalmedium ohne Leucin selektiert, da das pEVPll-PEP Konstrukt den Hefezellen die Fähigkeit zum Wachstum auf leucinfreiem Medium verleiht.
Ausführungsbeispiel 4 15 Messung der Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Transportaktivität in rekombinanten Hefelinien
Mit dem pEVPll-PEP Plasmid transformierte Hefezellen wurden in Minimalmedium bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm von 1.0
20 angezogen und durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 5 min ge¬ erntet. Anschließend wurden die Zellen durch kräftiges Schütteln mit 1/2 vol (bezogen auf die Zellen) Glasperlen aufgebrochen und Glasperlen und Zellbruchstücke durch Zentrifugation (600 g für 1 min) abgetrennt. Der Überstand wurde auf eine Konzentration
25 von 0.5 % Triton X-100 eingestellt, mit dem gleichen Volumen
Liposomen versetzt und die resultierenden Proteoliposomen sofort in flussigem Stickstoff eingefroren. Die Liposomen wurden zuvor durch Beschallen von Sojabohnen-Phospholipid (20 mg/ml) für 10 min bei 4°C in Gegenwart von 100 mM Tricine-NaOH (pH 7,6),
30 20 mM Phosphoenolpyruvat und 30 mM Kaliumglukonat hergestellt. Nach dem Auftauen der Proteoliposomen und erneutem Beschallen der Suspension mit 10 Pulsen a l s wurden die Proteoliposomen vom um¬ gebendem Medium durch Grόßenausschlußchromatographie auf Sephadex G-25, das zuvor mit 10 mM Tricine-NaOH (pH 7,6), 100 mM Natrium- 5 glukonat und 50 mM Kaliumglukonat äquilibriert worden war, abge¬ trennt. Die eluierten Proteoliposomen wurden für die Messung der Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Transportaktivität eingesetzt. Die Messung wurde nach der von Menzlaff und Flügge (1993, Biochim. Biophys. Acta 1147, 13-18) beschriebenen "Inhibitor-Stop" Methode 0 durchgeführt.
Die Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Transportaktivität in den pEVPll-PEP Transformanten wurde mit der Phosphoenolpyruvat- Phosphat-Transportaktivität von Transformanten verglichen, die 5 lediglich mit dem Vektor pEVPll transformiert waren. Es zeigte sich, daß die Phosphoenoipyruvat-Phosphat-Transportaktivität in den pEVPll-PEP Transformanten (gemessen in pmol transportiertes 97/25346 F CT/EP97/00044
18
32P-Phosphat/mg Protein x Stunde) 100-fach höher war als in pEVPll Kontroll-Transformanten. Zudem konnte gezeigt werden, daß das rekombinante Translokatorprotein im Vergleich zu dem authenti¬ schen Protein der Piastidenmembran identische Transport- charakteristika aufweist.
Ausführungsbeispiel 5
Transformation von Pflanzen mit einer Konstruktion zur Über- expression der Kodierregion des Phosphoenolpyruvat-Phosphat- Translokators
Aus dem Vektor pBluescript- (pBSC-) , der als Insertion die cDNA für den Phospho-enolpyruvat-Phosphat-Translokator aus Blumenkohl enthielt (siehe Ausführungsbeispiel 2) wurde die Insertion durch Restriktionsverdau mit Sall und Smal isoliert und in den Vektor pBinAR (Höfgen u. Willmitzer, 1990, Plant Sei. 66, 221-230) der zuvor mit den Enzymen Sall und Smal geschnitten worden war, kloniert. Nach Amplifikation des resultierenden Konstrukts pBinAR-PEP in E. coli wurden das Konstrukt in Agrobakterien transformiert und diese dann zur Infektion von Blattsegmenten von Tabak und Kartoffel eingesetzt.
Die erhaltenen Transformanten wurden mit Hilfe von Southern-Blot Analysen auf die Präsenz des intakten, nicht rearrangierten Chimären Gens untersucht. Mit Hilfe der "Gesamtblatt-Rekon- stitutionsmethode" (Flügge und Weber, 1994, Planta, 194, 181-184) wurde die Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Transportaktivität im Ver¬ gleich zu Kontrolltransformanten (transformiert mit Vektor pBinAR ohne Insertion) unter-sucht, ebenso die Photosyntheserate, Transpiration und Wachstum.
SEQ ID NO. : 1
Art der Sequenz: Nukleotid mit entsprechendem Protein
Sequenzlänge: 1402 Basenpaare
Strangform: Einzelstrang
Topologie: linear
Art des Moleküls: cDNA
Ursprüngliche Herkunft
Organismus: Brassica oleracea
Herkunft: cDNA-Bibliothek in Phage Lambda gtlO
Merkmale: von Nukleotid 14 bis 1219 kodierende Region
Eigenschaften: Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator CAGATCTCCC ACG 13
ATG CAG AGC TCC GCC GTC TTC TCC GCC TCT CCC TCC CTC CCT CTC 58 MET Gin Ser Ser Ala Val Phe Ser Ala Ser Pro Ser Leu Pro Leu 1 5 10 15 CTG AAA CCA GGC CGC CTC TCC CTT CGC CAT CCC GTC ACC GCC TCC 103 Leu Lys Pro Gly Arg Leu Ser Leu Arg His Pro Val Thr Ala Ser
20 25 30
TCG AAT CTC AGC GTC TCT CCT CCG AAT GTC GTC TCT GTT CCT CCT 148 Ser Asn Leu Ser Val Ser Pro Pro Asn Val Val Ser Val Pro Pro
35 40 45
CTA CCT CGC CGA TCT TGG CGT CTC GCC TCT TCC GAC TCG CCG CTT 193 Leu Pro Arg Arg Ser Trp Arg Leu Ala Ser Ser Asp Ser Pro Leu
50 55 60
CGC GCC TGG TCC GGT CTC CCT TCC GTA TCC TCC CCT TCC CTC GAC 238 Arg Ala Trp Ser Gly Leu Pro Ser Val Ser Ser Pro Ser Leu Asp
65 70 75
ACT AAC CGC TTC AAA ACT GCA GCT ACG GCA GTT CCG GAG GAA GGA 283 Thr Asn Arg Phe Lys Thr Ala Ala Thr Ala Val Pro Glu Glu Gly
80 85 90
GAA GGA AGT GGA AAG ATG ACT AAG GTT CTG GAG CTC GGC TTG CTG 328 Glu Gly Ser Gly Lys Met Thr Lys Val Leu Glu Leu Gly Leu Leu 95 100 105
TTT GCG ATG TGG TAC CTT TTC AAT ATC TAC TTC AAC ATC TAC AAC 373 Phe Ala Met Trp Tyr Leu Phe Asn Ile Tyr Phe Asn Ile Tyr Asn 110 115 120
AAG CAG GTT TTG AAA GCT CTT CAC GCC CCA ATG ACT GTC ACT TTA 418 Lys Gin Val Leu Lys Ala Leu His Ala Pro Met Thr Val Thr Leu 125 130 135
GTT CAG TTT GCC GTC GGT AGT GTC CTC ATT ACC TTC ATG TGG GCT 463 Val Gin Phe Ala Val Gly Ser Val Leu Ile Thr Phe Met Trp Ala 140 145 150
CTT AAC CTT TAC AAG AGG CCC AAG ATC TCT GCT GCT CAG CTT GCG 508 Leu Asn Leu Tyr Lys Arg Pro Lys Ile Ser Ala Ala Gin Leu Ala 155 160 165
GCC ATC TTG CCA CTT GCA GTT GTG CAC ACT CTT GGT AAT CTC TTT 553 Ala Ile Leu Pro Leu Ala Val Val His Thr Leu Gly Asn Leu Phe 170 175 180
ACT AAC ATG AGC CTC GGG AAA GTC TCT GTT TCC TTT ACT CAC ACC 598 Thr Asn Met Ser Leu Gly Lys Val Ser Val Ser Phe Thr His Thr
185 190 195
ATT AAA GCC ATG GAG CCT TTC TTC TCC GTT GTC TTG TCT GCT ATG 643
Ile Lys Ala Met Glu Pro Phe Phe Ser Val Val Leu Ser Ala Met
200 205 210
TTT CTC GGC GAG GTG CCT ACT CCA TGG GTC ATC GGT TCC ATT ATT 688 Phe Leu Gly Glu Val Pro Thr Pro Trp Val Ile Gly Ser Ile Ile 215 220 225
CCA ATC GTT GGT GGA GTT GCA CTT GCT TCA GTG ACA GAG GTC TCA 733 Pro Ile Val Gly Gly Val Ala Leu Ala Ser Val Thr Glu Val Ser 230 235 240
TTC AAC TGG GCT GGC TTT TTG AGT GCA ATG GCT TCA AAC TTG ACT 778 Phe Asn Trp Ala Gly Phe Leu Ser Ala Met Ala Ser Asn Leu Thr
245 250 255
AAC CAA TCC CGT AAC GTG CTT AGC AAA AAA GTC ATG GTC AAG AAA 823 Asn Gin Ser Arg Asn Val Leu Ser Lys Lys Val Met Val Lys Lys - 260 265 270
GAT GAT TCT TTG GAC AÄC ATC ACC CTC TTC TCT ATA ATA ACG TTG 868
Asp Asp Ser Leu Asp Asn Ile Thr Leu Phe Ser Ile Ile Thr Leu
275 280 285
ATG TCT CTC TTT CTG ATG GCC CCT GTG ACT TTC TTC TCC GAA GGA 913
Met Ser Leu Phe Leu Met Ala Pro Val Thr Phe Phe Ser Glu Gly 290 295 300
A ATTCC A AAAGG T TTTCC ACT CCG TCA TAC ATC CAA TCA GCT GGT GTG AAT GTT 958
I Illee L Lyyss P Phhee Thr Pro Ser Tyr Ile Gin Ser Ala Gly Val Asn Val 305 310 315
C CAAAA C CAAAA A ATTCC TAC ACG AAG TCT CTT ATT GCT GCA CTC TGC TTC CAC 1003
G Giinn G Giinn I Illee Tyr Thr Lys Ser Leu Ile Ala Ala Leu Cys Phe His 320 325 330
GCA TAC CAG CAG GTG TCG TAC ATG ATA TTG GCG AGA GTA TCA CCC 1048
Ala Tyr Gin Gin Val Ser Tyr Met Ile Leu Ala Arg Val Ser Pro 335 340 345
G GTTAA A ACCAA C CAATT TCT GTA GGA AAC TGT GTG AAG CGT GTG GTG GTC ATC 1093
V Vaall T Thhrr H Hiiss Ser Val Gly Asn Cys Val Lys Arg Val Val Val Ile 350 355 360
G GTTGG A AGGCC T TCCTT GTC ATC TTC TTC AAG ACA CCG GTC TCG CCT GTT AAT 1138
V Vaall S Seerr S Seerr Val Ile Phe Phe Lys Thr Pro Val Ser Pro Val Asn 365 370 375
GGCCTT TTTTTT GGGGAA AACCCC GGGGAA AATTCC GGCCCC CCTTAA GGCCGG GGGGAA GGTTTT TTTTCC TTTTAA TTAACC TTCCCC 1183
Ala Phe Gly Thr Gly Ile Ala Leu Ala Gly Val Phe Leu Tyr Ser 380 385 390
AGA GTG AAG CGT ATC AAG CCA AAG CCT AAG ACT GCC TAA 1222
Arg Val Lys Arg Ile Lys Pro Lys Pro Lys Thr Ala ——— 395 400
GCAAACTATC TGCTACTGCT TTTATATGTA ATACAATTTT CTTGAGCTGA AGTTTTCTTT1282 CAGATAGATG GTTTTATTTT TCCGCGGATT CTTGATACGT TTCTTCTCTT TATTATGTGT1342 TCTCTTTGCT GACTTACTCT TTGAAATATT TTACAGTTTT TTCAACAAAA AAAAAAAAAA1402

Claims

Patentansprüche
1. DNA-Sequenzen, die die Kodierregion eines Phosphoenolpyruvat- Phosphat-Translokators enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß diese DNA-Sequenzen die folgende Nukleotidabfolge aufweisen (Seq-ID No. :1) :
CAGATCTCCC ACG 13
ATG CAG AGC TCC GCC GTC TTC TCC GCC TCT CCC TCC CTC CCT CTC 58 MET Gin Ser Ser Ala Val Phe Ser Ala Ser Pro Ser Leu Pro Leu 1 5 10 15
CTG AAA CCA GGC CGC CTC TCC CTT CGC CAT CCC GTC ACC GCC TCC 103 Leu Lys Pro Gly Arg Leu Ser Leu Arg His Pro Val Thr Ala Ser
20 25 30
TCG AAT CTC AGC GTC TCT CCT CCG AAT GTC GTC TCT GTT CCT CCT 148
Ser Asn Leu Ser Val Ser Pro Pro Asn Val Val Ser Val Pro Pro
35 40 45
CTA CCT CGC CGA TCT TGG CGT CTC GCC TCT TCC GAC TCG CCG CTT 193
Leu Pro Arg Arg Ser Trp Arg Leu Ala Ser Ser Asp Ser Pro Leu 50 55 60
CGC GCC TGG TCC GGT CTC CCT TCC GTA TCC TCC CCT TCC CTC GAC 238
Arg Ala Trp Ser Gly Leu Pro Ser Val Ser Ser Pro Ser Leu Asp 65 70 75
ACT AAC CGC TTC AAA ACT GCA GCT ACG GCA GTT CCG GAG GAA GGA 283
Thr Asn Arg Phe Lys Thr Ala Ala Thr Ala Val Pro Glu Glu Gly 80 85 90
GAA GGA AGT GGA AAG ATG ACT AAG GTT CTG GAG CTC GGC TTG CTG 328
Glu Gly Ser Gly Lys Met Thr Lys Val Leu Glu Leu Gly Leu Leu 95 100 1 10055
TTT GCG ATG TGG TAC CTT TTC AAT ATC TAC TTC AAC A ATTCC T TAACC A AAACC 373
Phe Ala Met Trp Tyr Leu Phe Asn Ile Tyr Phe Asn I Illee T Tyyrr A Assnn 110 115 112200
AAG CAG GTT TTG AAA GCT CTT CAC GCC CCA ATG ACT G GTTCC A ACCTT T TTTAA 418
Lys Gin Val Leu Lys Ala Leu His Ala Pro Met Thr V Vaall T Thhrr L Leeuu 125 130 113355
GTT CAG TTT GCC GTC GGT AGT GTC CTC ATT ACC TTC A ATTGG T TGGGG G GCCTT 463
Val Gin Phe Ala Val Gly Ser Val Leu Ile Thr Phe Met Trp Ala 140 145 150
CTT AAC CTT TAC AAG AGG CCC AAG ATC TCT GCT GCT CAG CTT GCG 508
Leu Asn Leu Tyr Lys Arg Pro Lys Ile Ser Ala Ala Gin Leu Ala
155 160 165
GCC ATC TTG CCA CTT GCA GTT GTG CAC ACT CTT GGT AAT CTC TTT 553
Ala Ile Leu Pro Leu Ala val Val His Thr Leu Gly Asn Leu Phe 170 1 17755 1 18800
ACT AAC ATG AGC CTC GGG AAA GTC T TCCTT G GTTTT T TCCCC T TTTTT A ACCTT C CAACC A ACCCC 598
Thr Asn Met Ser Leu Gly Lys Val S Seerr V Vaall S Seerr P Phhee T Thhrr H Hiiss T Thhrr 185 119900 119955
ATT AAA GCC ATG GAG CCT TTC TTC T TCCCC G GTTTT G GTTCC T TTTGG T TCCTT G GCCTT A ATTGG 643
Ile Lys Ala Met Glu Pro Phe Phe S Seerr V Vaall V Vaall L Leeuu S Seerr A Allaa M Meett 200 220055 221100
TTT CTC GGC GAG GTG CCT ACT CCA TGG GTC ATC GGT TCC ATT ATT 688 22
Phe Leu Gly -Glu Val Pro Thr Pro Trp Val Ile Gly Ser Ile Ile
215 220 225
CCA ATC GTT GGT GGA GTT GCA CTT GCT TCA GTG ACA GAG GTC TCA 733
Pro Ile Val Gly Gly Val Ala Leu Ala Ser Val Thr Glu Val Ser 230 235 240
5 ττc AAC TGG GCT GGC TTT TTG AGT GCA ATG GCT TCA AAC TTG ACT 778
Phe Asn Trp Ala Gly Phe Leu Ser Ala Met Ala Ser Asn Leu Thr 245 250 255
AAC CAA TCC CGT AAC GTG CTT AGC AAA AAA GTC ATG GTC AAG AAA 823
Asn Gin Ser Arg Asn Val Leu Ser Lys Lys Val Met Val Lys Lys 1o 260 265 270
GAT GAT TCT TTG GAC AAC ATC ACC CTC TTC TCT ATA ATA ACG TTG 868
Asp Asp Ser Leu Asp Asn Ile Thr Leu Phe Ser Ile ile Thr Leu 275 280 285
ATG TCT CTC TTT CTG ATG GCC CCT GTG ACT TTC TTC TCC GAA GGA 913
Met Ser Leu Phe Leu Met Ala Pro Val Thr Phe Phe Ser Glu Gly L5 290 295 300
ATC AAG TTC ACT CCG TCA TAC ATC CAA TCA GCT GGT GTG AAT GTT 958
Ile Lys Phe Thr Pro Ser Tyr Ile Gin Ser Ala Gly Val Asn Val 305 310 315
CAA CAA ATC TAC ACG AAG TCT CTT ATT GCT GCA CTC TGC TTC CAC 1003
Gin Gin Ile Tyr Thr Lys Ser Leu Ile Ala Ala Leu Cys Phe His
20 320 325 330
GCA TAC CAG CAG GTG TCG TAC ATG ATA TTG GCG AGA GTA TCA CCC 1048
Ala Tyr Gin Gin Val Ser Tyr Met ile Leu Ala Arg Val Ser Pro 335 340 345
GTA ACA CAT TCT GTA GGA AAC TGT GTG AAG CGT GTG GTG GTC ATC 1093
Val Thr His Ser Val Gly Asn Cys Val Lys Arg Val Val Val Ile 25 350 355 360
GTG AGC TCT GTC ATC TTC TTC AAG ACA CCG GTC TCG CCT GTT AAT 1138
Val Ser Ser Val Ile Phe Phe Lys Thr Pro Val Ser Pro Val Asn 365 370 375
GCT TTT GGA ACC GGA ATC GCC CTA GCG GGA GTT TTC TTA TAC TCC 1183
Ala Phe Gly Thr Gly Ile Ala Leu Ala Gly Val Phe Leu Tyr Ser so 380 385 390
AGA GTG AAG CGT ATC AAG CCA AAG CCT AAG ACT GCC TΛA 1222
Arg Val Lys Arg Ile Lys Pro Lys Pro Lys Thr Ala "~*"— 395 400
GCAAACTATC TGCTACTGCT TTTATATGTA ATACAATTTT CTTGAGCTGA AGTTTTCTTT1282 5 CAGATAGATG GTTTTATTTT TCCGCGGATT CTTGATACGT TTCTTCTCTT TATTATGTGT1342 TCTCTTTGCT GACTTACTCT TTGAAATATT TTACAGTTTT TTCAACAilAA AAAAAAAAAA1402
0
5
2. DNA-Sequenzen, die mit der DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Se-quenzen abgeleitet sind, hybridisieren und für ein plastidäres Protein kodieren, das die biologische Aktivität eines Phosphoenolpyruvat-Phosphat- Translokators besitzt.
3. Plasmide enthaltend DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von dieser Sequenz abgeleitet sind.
4. Plasmid pEVPll-PEP hinterlegt als E. col i Stamm TG 1 pEVPll-PEP unter der DSM-Nummer DSM 10326 enthaltend dieses Plasmid.
5. Plasmid pBinAR-PEP hinterlegt als E. col i Stamm TG 1 pBinAR- PEP unter der DSM-Nummer DSM 10327 enthaltend dieses Plasmid.
6. Bakterien, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2 oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind.
7. Hefen, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2 oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind.
8. Bakterien enthaltend Plasmide gemäß den Ansprüchen 3 bis 6.
9. Hefen enthaltend Plasmide gemäß den Ansprüchen 3 oder 4.
10. Pflanzenzellen enthaltend Plasmide gemäß den Ansprüchen 3 oder 5.
11. Transformierte Pflanzenzellen und aus diesen regenerierte transgene Pflanzen enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei diese Sequenz als Bestandteil eines rekombinanten DNA-Moleküls in die Pflanzenzellen eingeführt wurde.
12. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 oder Teilen oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, zur
Einführung in pro- oder eukaryontische Zellen, wobei diese Sequenzen gegebenenfalls mit Steuerelementen, die die Transkription und Translation in den Zellen gewährleisten, verknüpft sind und zur Expression einer translatierbaren mRNA, die die Synthese eines Phosphoenolpyruvat-Phosphat- Translokators bewirkt, führen.
13. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 oder
Teilen oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, zur Expression einer nicht translatierbaren RNA, die mittels eines "anti-sense"-Effektes oder einer Ribozymsktivität die Synthese eines oder mehrerer endogener Phosphoenolpyruvat- Phosphat-Translokatoren in den Zellen verhindert.
14. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 oder Teilen oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder
Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, zur Herstellung von DNA-Sequenzen, die für einen pflanzlichen plastidären Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator mit einer veränderten Spezifität kodieren.
15. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 oder Teilen oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, zur Isolierung von DNA-Sequenzen, die für ein Polypeptid kodieren, das die biologische Aktivität eines Phosphoenol- pyruvat-Phosphat-Translokators besitzt.
16. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 oder Teilen oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet s:.nd, zur
Identifizierung von Substanzen, die eine inhibierende Wirkung auf den Transport von Phosphoenolpyruvat über die innere Plastidenhüllmembran haben.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19732926C2 (de) * 1997-07-31 1999-11-18 Fluegge Ulf Ingo DNA-Sequenzen, kodierend einen Glukose-6-phosphat-Phosphat-Translokator, sowie Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen, enthaltend diesen Transporter

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994010320A1 (en) * 1992-11-02 1994-05-11 Mogen International N.V. Plants with reduced susceptibility to plant-parasitic nematodes
DE4420782C1 (de) * 1994-06-15 1995-08-17 Fluegge Ulf Ingo Prof Dr DNA-Sequenz, kodierend einen 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator, Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen enthaltend diesen Transporter

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994010320A1 (en) * 1992-11-02 1994-05-11 Mogen International N.V. Plants with reduced susceptibility to plant-parasitic nematodes
DE4420782C1 (de) * 1994-06-15 1995-08-17 Fluegge Ulf Ingo Prof Dr DNA-Sequenz, kodierend einen 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator, Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen enthaltend diesen Transporter

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EMBL DATA LIBRARY, HEIDELBERG, DE Acc.Nr.: U13632, 02-01-1996, K. Fischer et al.,"A triose-phosphate translocator from Cauliflower bud non- green plastids which transports phospho- enol-pyruvate with high affinity". *
K. FISCHER ET AL.: "Cloning and in vivo expression of functional triose phosphate-phosphate translocators from C-3- and C-4-plants: Evidence for the putative participation of specific amino acid residues in the recognition of phosphoenolpyruvate", PLANT JOURNAL, vol. 5, no. 2, 1994, OXFORD GB, pages 215 - 226, XP000674328 *
M.E. RUMPHO ET AL.: "Identification of the phosphate-phosphoenolpyruvate translocator in 3-carbon and 4-carbon chloroplasts", PLANT PHYSIOLOGY, vol. 83, no. sup.4, 1987, LANCASTER US, pages 12, XP000197536 *
U-I. FLUEGGE ET AL.: "Molecular characterization of plastid transporters", COMPTES RENDUS DES SEANCES DE L'ACADEMIE DES SCIENCES SERIE III: SCIENCES DE LA VIE., vol. 319, no. 9, 1996, MONTREUIL FR, pages 849 - 852, XP000674340 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8022272B2 (en) 2001-07-13 2011-09-20 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Expression cassettes for transgenic expression of nucleic acids
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