DE60035972T2

DE60035972T2 - Verfahren zur vermittlung von bnyvv-resistenz in zuckerrübenpflanzen

Info

Publication number: DE60035972T2
Application number: DE60035972T
Authority: DE
Inventors: Kenneth Richards; Gerard Jonard; Hubert Guilley; Cornelis Maria Van Dun
Original assignee: SES Europe NV SA
Current assignee: SES Europe NV SA
Priority date: 1999-01-27
Filing date: 2000-01-26
Publication date: 2008-05-08
Anticipated expiration: 2020-01-27
Also published as: AU3150500A; SK286440B6; HU228104B1; PL202048B1; HUP0105157A3; EA006701B1; HUP0105157A2; US6956149B1; SK10572001A3; UA79731C2; EE04856B1; DE60035972D1; EP1169463B1; EP1169463A1; ES2291208T3; EP1029923A1; EA200100820A1; DK1169463T3; EA011687B1; EA200501578A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, um einer Zuckerrübenpflanze Resistenz gegen das Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYVV; Aderngelbfleckigkeitsvirus der Rübe) zu verleihen. Darüber hinaus betrifft die Erfindung virusresistente Pflanzen, die nach diesem Verfahren erhalten werden, sowie Samen und davon abstammende Nachkommen.
Pflanzenviren sind für viele der wichtigen landwirtschaftlichen Kulturpflanzen ein ernstes Problem. BNYVV, das durch den in der Erde lebenden Plasmodiophoromyzeten-Pilz Polymyxa betae übertragen wird, ist die Ursache dieser wirtschaftlich bedeutenden Krankheit der Zuckerrübe (Beta vulgaris), die als Rhizomanie bezeichnet wird. Diese Krankheit wurde in den 1950er Jahren erstmals in Italien berichtet und ist inzwischen zu einer bedeutenden Bedrohung für Zuckerrüben in den meisten Anbaugebieten der Welt geworden.
Unter Feldbedingungen ist BNYVV in der Regel auf die unterirdischen Anteile der Pflanze beschränkt. Infizierte Zuckerrübenwurzeln weisen eine erhöhte Proliferation und Nekrose der lateralen Wurzeln auf, einen Rückgang der Gesamtmasse der Hauptwurzel und eine daraus folgende Verringerung des Zuckerertrags. Einer Infektion kann auch der Tod der Pflanze folgen, insbesondere, wenn die Pflanze früh in der Saison infiziert wird. Gelegentlich steigt das Virus bis zu den Blättern auf, wo es invasive venenassoziierte chlorotische und nekrotische Läsionen bewirkt.
BNYVV gehört zur Familie der Benyviren, bei denen es sich um durch Pilze übertragene, stäbchenförmige Viren handelt, die ein geteiltes Genom besitzen, welches aus zwei oder mehr Komponenten einzelsträngiger (single stranded, ss) RNA zusammengesetzt ist. Vier verschiedene Plus-Sense-ssRNA-Arten von BNYVV sind identifiziert worden, die in absteigender Reihenfolge der Größe als RNA 1 bis 4 bezeichnet werden (RNA 1: 6,8 kb; RNA 2: 4,7 kb; RNA 3: 1,8 kb; RNA 4: 1,5 kb). Einige Japaner isolierten außerdem eine fünfte RNA-Komponente (RNA 5: 1,45 kb). Alle RNAs sind kloniert und sequenziert worden. Die Genkarte der viralen RNAs ist in 1 gezeigt.
Alle fünf RNAs enden in 3'-Poly-A-Schwänzen und RNA 1-4 weisen Cap-Strukturen an ihren 5'-Enden auf. RNA 1 und 2 kodieren grundlegende, Wirt-unabhängige „Haushalts (Housekeeping)"-Funktionen, während die kleineren RNAs spezifisch in den natürlichen Infektionsprozess eingreifen, einschließlich vektorvermittelte Infektion von Zuckerrübenwurzeln, Proliferation innerhalb des Wurzelsystems und Hervorrufen von Rhizomanie-Symptomen. Es wurde gezeigt, dass RNA 1 virale RNA-Polymeraseaktivität kodiert, und RNA 2 das virale Hüllprotein mit 21 kD kodiert. Die 3'-proximale Hälfte von RNA 2 trägt eine als Triele-Gen-Block (TGB3) bezeichnete Gruppe von drei aufeinanderfolgenden, leicht überlappenden viralen Genen, die einer Gruppe (Cluster) von drei Genen in anderen stäbchenförmigen Pflanzenviren sehr ähnlich sind und an der Bewegung des Virus von Zelle von Zelle beteiligt sind. RNA 3 ist mit einer massiven Proliferation der feinen Wurzelchen bei der Zuckerrübe assoziiert und ermöglicht die Ausbreitung des Virus in Wurzelgewebe, während RNA 4 die Effizienz der Transmission des Virus durch den Pilz erhöht.
Durch Pilze übertragene Viren wie beispielsweise BNYVV können in ruhenden Sporen jahrelang in der Erde bleiben, wenn ein Feld einmal befallen ist. Da es keine effektiven chemischen oder physikalischen Verfahren zur Beseitigung des Virus gibt, weder in den Pflanzen noch in der Erde, besteht die einzige Möglichkeit für den Zuckerrübenbauer in der Verwendung genetisch resistenter Sorten. Mehrere Unternehmen haben eine Reihe von toleranten, teilweise sogar resistenten Sorten bereitgestellt, indem Wildtyp-Toleranzgene durch Züchtung in kommerzielle Sorten übertragen wurden. Dabei handelt es sich allerdings um einen sehr mühsamen und zeitaufwändigen Prozess, der im Allgemeinen eine lange Zeit benötigt, bevor geeignete resistente Pflanzen erhalten werden. Darüber hinaus entwickeln tolerante oder teilweise resistente Pflanzen unter hohem Krankheitsdruck Krankheitssymptome, da der Resistenzgrad zu niedrig ist. Ein anderes Problem mit toleranten bzw. nur teilweise resistenten Pflanzen liegt in der Tatsache, dass Viruspopulationen weiter wachsen, was zum Auftreten eines BNYVV-Stammes führen könnte, der die Resistenz-/Toleranzgene ausschaltet.
Die schnelle Revolution auf dem Gebiet der gentechnischen Pflanzenzüchtung hat zur Entwicklung neuer Strategien geführt, um genetische Resistenz gegen Viren zu verleihen. Resistenz gegen virale Krankheiten durch Einführen von Anteilen viraler Genomsequenzen ist zu einer neuen Resistenzquelle geworden. Die virale Sequenz (Konstrukt) wird in eine Pflanze transformiert, indem die Verwendung geeigneter Zell- oder Gewebekulturtechniken und ein DNA-Verabreichungssystem wie beispielsweise das gut bekannte Agrobacterium-tumefaciens-Transformationssystem oder der direkte DNA-Transfer, vermittelt durch Chemikalien wie Polyethylenglykol (PEG), kombiniert werden.
Bekannte Verfahren zum Einführen von Pathogenabwehrmechanismen in Pflanzen sind beispielsweise in EP 9687106.0 beschrieben, welche ein Verfahren zum Einführen der Resistenz gegen ein Virus umfassend eine TGB3-Sequenz betrifft. Die Veröffentlichung beschreibt, dass es möglich war, BNYVV-Resistenz durch ein Verfahren zu induzieren, das aus der Transformation von Pflanzenzellen mit einem DNA-Konstrukt besteht, welches einem Fragment der Nukleinsäuresequenz der genomischen oder subgenomischen RNA 2 des BNYVV entspricht. Der Nachteil dieses Verfahrens ist allerdings, dass nur Toleranz und keine Resistenz erhalten werden. In toleranten Wirtspflanzen kann dennoch ein normales Maß an Pflanzenvirusreplikation vorliegen, aber die Pflanze zeigt wenig oder keine sichtbaren Anzeichen einer Infektion, wohingegen die Virusreplikation in resistenten Wirten niedrig oder sogar nicht vorhanden ist.
In WO 93/25068 wird virale Resistenz bei Pflanzen durch Transformation der Pflanze mit einem Replikase-Anteil (RNA 1) eines Pflanzenvirusgenoms induziert. Diese Veröffentlichung betrifft weder Zuckerrüben noch BNYVV.
Zuckerrüben sind bekannt dafür, eine in Bezug auf gentechnische Veränderungen problematische Art zu sein, was eine erfolgreiche Induktion einer BNYVV-Resistenz verkompliziert. Aufgrund des Ausmaßes und der Folgen der viralen BNYVV-Krankheit besteht dennoch ein großes Interesse daran, die Quellen genetischer Resistenz bei Zuckerrübenpflanzen zu verbessern.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Mittel zum Erhalten von Zuckerrübenpflanzen bereit zu stellen, die Resistenz gegen BNYVV aufweisen. Vorzugsweise weisen sie eine vollständige Resistenz bzw. Immunität auf, indem verschiedene Ansätze kombiniert und indem Verfahren verwendet werden, die es dem Virus nicht gestatten, sich zu replizieren.
Dies wird von der Erfindung erreicht, indem ein Verfahren bereitgestellt wird, um einer Zuckerrübenpflanze Resistenz gegen das Beet Necrotic Yellow Vein Virus (Aderngelbfleckigkeitsvirus der Rübe) zu verleihen, welches folgende Schritte umfasst

(a) Herstellen eines DNA-Fragmentes aus mindestens 15 Nukleotiden in einer Sequenz, die im Wesentlichen homolog zu der entsprechenden Nukleotidsequenz der genomischen RNA 1 des Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYVV) ist,
(b) Einführen des DNA-Fragmentes, das funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, der in Zuckerrübenpflanzen aktiv ist, in eine Zuckerrübenpflanzenzelle, um eine transformierte Zuckerrübenzelle zu erhalten; und
(c) Regenerieren einer transgenen Zuckerrübenpflanze aus der transformierten Zuckerrübenpflanzenzelle.

Damit wird eine Zuckerrübenpflanze erhalten, die eine dauerhafte Resistenz aufweist und bei der das Virus nicht repliziert. Dies ist ein besonderer Aspekt des erfindungsgemäßen Transformanden und ist zuvor nicht beschrieben worden.
Nach der Erfindung handelt es sich bei der erforderlichen Sequenzhomologie des Fragmentes um eine Homologie von mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, mehr bevorzugt mindestens 90%, am meisten bevorzugt mindestens 95%.
Die Homologie bzw. der „Ähnlichkeitsgrad" wird verwendet, um Nukleotidsequenzen zu bezeichnen, die, wenn sie ausgerichtet sind, ähnliche (identische oder konservativ ersetzte) Nukleotide an gleichen Positionen oder in gleichen Regionen aufweisen. Beispielsweise haben zwei Nukleotidsequenzen mit einer Homologie von mindestens 85% zueinander mindestens 85% Homologe (identische oder konservativ ersetzte Nukleotide) an einer gleichen Position, wenn sie optimal ausgerichtet sind, was bis zu 3 Lücken zulässt, vorausgesetzt, dass hinsichtlich der Lücken insgesamt höchstens 15 Aminosäurereste betroffen sind. Der Ähnlichkeitsgrad kann mithilfe von aus dem Stand der Technik gut bekannten Verfahren bestimmt werden (siehe beispielsweise Wilbur, W.J. and Lipman, D.J. „Rapid Similarity Searches of Nucleic Acid and Protein Data Banks". Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80, 726-730 (1983) und Myers E. and Miller W. „Optimal Alignments in Linear Space". Comput. Appl. Biosci. 4:11-17(1988)). Ein Programm, das zur Bestimmung des Ähnlichkeitsgrades verwendet werden kann, ist das MegAlign Lipman-Pearson-Einpaar-Verfahren (das Standardparameter verwendet), das von DNAstar Inc, 1228, Selfpark Street, Madison, Wisconsin, 53715, USA als Teil des Lasergene-Systems erhältlich ist. Der Test auf Homologie der Sequenz beruht auf der prozentualen Identität, die von Fast DB auf Basis der folgenden Parameter berechnet wird: Fehlpaarungs-Strafe (mismatch penalty) 1.0, Lücken-Strafe (gap penalty) (1.00), Lückengrößen-Strafe (gap size penalty) 0.33 und Verbindungs-Strafe (joining penalty) 30.0.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung verwenden verschiedene Fragmente mit Nukleinsäuresequenzen, die der angezeigten Homologie oder vollständig Nukleotid 153 bis 3258, 169 bis 539, 1226 bis 1683, 2754 bis 3192 oder allen 6746 Nukleotiden von RNA 1 entsprechen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch DNA, die mit der DNA der vorliegenden Erfindung hybridisiert und die RNA1 kodiert. Vorzugsweise findet eine solche Hybridisierung bei oder zwischen Bedingungen niedriger und hoher Stringenz statt. Allgemein ausgedrückt, können Bedingungen niedriger Stringenz als 3 × SSC bei etwa Umgebungstemperatur bis etwa 65°C und Bedingungen hoher Stringenz als 0,1 × SSC bei etwa 65°C definiert werden. SSC ist der Name eines Puffers aus 0,15 M NaCl, 0,015 M Trinatriumcitrat. 3 × SSC ist dreimal stärker als SSC und so weiter.
Das Fragment kann mittels eines DNA-Vektors in eine regenerierbare Pflanzenzelle eingeführt werden, der das Fragment und transkriptions- und translationsregulierende Sequenzen aufweist, die damit funktionell verknüpft sind, wobei Standardverfahren zur Transformation von Pflanzen verwendet werden, wie beispielsweise die Agrobacterium-vermittelte Transformation von in Pflanzengeweben wie beispielsweise Keimblätter eingebetteten Zellen (Krens et al., Plant Science 116: 97-106; 1996) oder polyethylenglycolvermittelte DNA-Aufnahme einzelner Zellen wie beispielsweise Schließzellenprotoplasten (Hall et al., Nature Biotechnology 14: 1133-1138; 1996). Der DNA-Vektor, welcher das Fragment enthält, ist ebenfalls Teil der Erfindung.
Die Verwendung von Konstrukten, die derart konstruiert sind, dass die Gensequenz die Genexpression hemmt oder begünstigt, ist relativ gut bekannt. Eine vollständige Gensequenz unter der Kontrolle eines Promotors, der in der Pflanze wirksam arbeitet, bewirkt im Allgemeinen eine Überexpression des Genkonstruktes, was zu einer Amplifikation des Effektes des so produzierten Proteins führt. Bisweilen ist das Genprodukt reduziert: dieses Phänomen wird als „Co-Suppression” bezeichnet. Dieses Gen kann anhand mehrerer Verfahren herunterreguliert werden. Dies kann durch „dominant-negative" Konstrukte erfolgen. Diese enthalten die spezifischen DNA-Bindungsdomänen sowie mögliche Dimerisierungsdomänen, sind aber transkriptionell inaktiv. Sie „sitzen" auf den Promotoren der Zielgene und verhindern dadurch die Bindung des endogenen Proteins. Darüber hinaus kann die Reduzierung des Genproduktes auch erhalten werden, indem eine solche dominant-negative Mutation verwendet wird oder indem die Ausrichtung der Gensequenz in Bezug auf den Promotor derart umgekehrt wird, dass sie eine Art von Genprodukt produziert, die als „Antisense"-Boten-RNA bezeichnet wird.
Ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt kann ein „Antisense"-Konstrukt sein, das eine „Antisense"-RNA erzeugt, oder ein „Sense"-Konstrukt (das zumindest einen Teil des funktionellen Proteins kodiert), das eine „Sense"-RNA erzeugt.
„Antisense"-RNA ist eine RNA-Sequenz, die zu einer Sequenz von Basen in der entsprechenden mRNA komplementär ist; komplementär bedeutet, dass jede Base (bzw. die Mehrzahl von Basen) in der Antisense-Sequenz (gelesen von 3' nach 5') in der Lage ist, eine Paarung mit der entsprechenden Base (G mit C, A mit U) in der in von 5' nach 3' gelesenen mRNA-Sequenz einzugehen. Eine solche Antisense-RNA kann in der Zelle durch Transformation mit einem geeigneten DNA-Konstrukt produziert werden, das angeordnet ist, um ein Transkript zu erzeugen, dessen Sequenz zumindest zum Teil zu mindestens einem Teil des kodierenden Stranges des relevanten Gens (oder einer DNA-Sequenz, die eine wesentliche Homologie dazu aufweist) komplementär ist.
„Sense-RNA” ist eine RNA-Sequenz, die zu mindestens einem Teil der entsprechenden mRNA-Sequenz im Wesentlichen homolog ist.
Eine solche Sense-RNA kann in der Zelle durch Transformation mit einem geeigneten DNA-Konstrukt produziert werden, das in normaler Ausrichtung angeordnet ist, um ein Transkript zu erzeugen, dessen Sequenz mit mindestens einem Teil des kodierenden Stranges des relevanten Gens (oder einer DNA-Sequenz, die eine wesentliche Homologie dazu aufweist) identisch ist. Geeignete Sense-Konstrukte können verwendet werden, um Genexpression zu hemmen (wie beschrieben in der Internationalen Patentveröffentlichung WO 91/08299 ).
Erfindungsgemäße DNA-Konstrukte können eine Basensequenz mit einer Länge von mindestens 10 Basen (vorzugsweise mindestens 35 Basen) für die Transkription zu RNA aufweisen. Es gibt keine theoretische Obergrenze der Basensequenz – sie kann so lang sein wie die von der Zelle produzierte relevante mRNA –, aber aus praktischen Gründen erweist es sich im Allgemeinen als geeignet, Sequenzen mit einer Länge zwischen 100 und 1000 Basen zu verwenden. Die Herstellung solcher Konstrukte ist unten ausführlicher beschrieben.
Als eine Quelle der DNA-Basensequenz für die Transkription kann eine geeignete cDNA oder eine genomische DNA, RNA oder ein synthetisches Polynukleotid verwendet werden. Die in Pflanzen funktionelle Transkriptionsstartregion (bzw. der Promotor) kann, je nachdem, wie es die Umstände erfordern, ein konstitutiver Promotor (wie beispielsweise der 35S-Blumenkohlmosaikviruspromotor) oder ein induzierbarer oder entwicklungsspezifisch regulierter Promotor sein. Geeignete DNA-Sequenzen zur Kontrolle der Expression der von der Pflanze exprimierbaren Gene (einschließlich der Markergene), wie beispielsweise Transkriptionsstartregionen, Verstärker (Enhancer), Leader-Sequenzen, nicht transkribierte Leader und dergleichen, können von jedem Gen abstammen, das in einer Pflanzenzelle exprimierbar ist. Es können auch Hybridpromotoren, die funktionelle Anteile verschiedener Promotoren kombinieren, oder synthetische Äquivalente davon verwendet werden. Abgesehen von konstitutiven Promotoren, können induzierbare Promotoren oder Promotoren, deren Expressionsmuster anders reguliert wird, z. B. entwicklungs- oder zelltypspezifisch, verwendet werden, um die Expression der exprimierbaren erfindungsgemäßen Gene zu kontrollieren. Beispielsweise kann es wünschenswert ein, Proteinaktivität in bestimmten Stufen der Entwicklung der Pflanze zu modifizieren. Bei Verwendung eines konstitutiven Promotors besteht die Tendenz, die Proteinmengen und -funktionen in allen Teilen der Pflanze zu beeinflussen, während die Verwendung eines gewebespezifischen Promotors eine selektivere Kontrolle der Genexpression und der beeinflussten Funktionen gestattet.
Eine andere Option nach dieser Erfindung ist die Verwendung induzierbarer Promotoren. Es sind Promotoren bekannt, die durch Pathogene, durch Stress, durch Chemikalien und durch Umweltsignale induzierbar sind. Die Induktion der Genaktivität durch interne oder externe Induktion liegt im Umfang der vorliegenden Erfindung. Promotoren dieses Typs ermöglichen die Induzierbarkeit der Genaktivität auf kontrollierte Weise, so dass sich die Pflanze normal ohne unabgebrachten Einfluss des Transgens entwickeln kann. Promotoren, bei denen es sich um induzierbare Promotoren handelt, umfassen die in DE 4446342 (durch Pilze und Auxin induzierbarer PRP-1), WO 96/28561 (durch Pilze induzierbarer PRP-1), EP 0 712 273 (durch Nematoden induzierbar), EP 0 330 479 und US 5,510,474 (durch Stress induzierbar), WO/96/12814 (durch Kälte induzierbar) Beschriebenen und Zenecas alkoholinduzierbaren Promotor. Andere induzierbare Promotoren sind in EP 0 494 724 , EP 0 619 844 , WO 92/19724 beschrieben. Das Genprodukt, sei es Antisense- oder Sense-RNA oder das Peptid, wird also in dem Gewebe nur dann exprimiert, wenn seine Aktion erforderlich ist.
Wie oben erwähnt, umfasst der Begriff „induzierbarer Promotor" Promotoren, die chemisch induzierbar sind. Die Verwendung einer Promotorsequenz, die durch die Anwendung eines externen chemischen Reizes kontrolliert wird, ist insbesondere am meisten bevorzugt. Der externe chemische Reiz ist vorzugsweise eine landwirtschaftlich annehmbare Chemikalie, deren Verwendung mit der landwirtschaftlichen Praxis kompatibel ist und für Pflanzen oder Säuger unschädlich ist. Die induzierbare Promotorregion umfasst am meisten bevorzugt ein induzierbares Umschalt-Promotorsystem, wie beispielsweise ein Zweikomponentensystem wie das alcA/alcR-Gen-Umschalt-Promotorsystem, das in der veröffentlichten Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 93/21334 beschrieben ist, das Ecdyson-Umschaltsystem, wie beschrieben in der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 96/37609 , oder den GST-Promotor wie beschrieben in der veröffentlichten Internationalen Patentanmeldung Nr. WO 90/08826 und WO 93/031294 , deren Lehren hierin durch Bezugnahme enthalten sind. Solche Promotorsysteme werden hierin als „Umschalt-Promotoren (Switch-Promotoren)" bezeichnet. Die in Verbindung mit den Umschalt-Promotoren verwendeten Umschaltchemikalien sind landwirtschaftlich annehmbare Chemikalien, was dieses System in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung besonders nützlich macht.
Der Fachmann kann einen DNA-Vektor zur Verwendung in diesen Verfahren auswählen. Ein Beispiel eines geeigneten Vektors für die Agrobacterium-vermittelte Transformation ist pBIN19. Geeignete Vektoren für die PEG-vermittelte Transformation umfassen den pBluescript-Vektor oder pIGPD7 (Hall et al., Nature Biotechnology 14: 1133-2138; 1996). Das Einführen des Fragments in diese Vektoren kann mittels molekularbiologischer Standardtechniken erreicht werden, wie beispielsweise beschrieben in Sambrook et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual II", Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.
Mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltene transformierte Pflanzen zeigen absolute Resistenz oder Immunität gegenüber BNYVV. Dagegen waren vorherige Versuche, Pflanzen Resistenz gegen BNYVV (Kallerhof et al., Plant Cell Reports 9: 224-228, 1990; und Mannerlof et al., Euphytica 90: 293-299, 1996) oder andere Viren wie beispielsweise das Tabakmosaikvirus (TMV) (Donson et al., Mol. Plant-Microbe Interact. 6: 635-642; 1993) zu verleihen, indem die Pflanzen mit Anteilen des viralen Genoms transformiert wurden, weniger erfolgreich. Inokulierte Blätter zeigten noch immer Symptomanzeichen, was darauf hinweist, dass die Resistenz nicht absolut ist. Es ist daher überraschend, dass das erfindungsgemäße Verfahren Zuckerrübenpflanzen absolute Resistenz gegen BNYVV verleihen kann.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung eine transformierte Pflanzenzelle und eine gegen BNYVV resistente, transgene Pflanze sowie reproduzierbare Strukturen wie beispielsweise Samen, Kalli, Knospen, Embryonen, die von den transgenen Pflanzen erhalten werden, sowie davon abstammende Nachkommen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die hierin beschriebene Resistenz mit anderen Arten der Resistenz oder der Toleranz gegen BNYVV kombiniert werden.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen und Figuren weiter veranschaulicht, ist aber nicht darauf beschränkt.
1 zeigt eine Diagrammdarstellung der genomischen Organisation des Beet Necrotic Yellow Vein Virus (basierend auf Jupin et al., Seminars in Virology Band 2.2: 112-129; 1991).
2 zeigt die physikalische Karte von pVDH239 and pVDH240. LB=Linke Grenze, RB=Rechte Grenze, P35S=CaMV-35S-Promotor, NPTII= Neomycinphosphotransferase II, T35S=CaMV-35S-Polyadenylierungssignal, GUSINT=Beta-Glucuronidasegen, BNYVVpolTRUNC=BNYVV-cDNAl-Fragment, Tnos=Vom Nopalinsynthasegen abstammendes Polyadenylierungssignal. Die Positionen der wichtigsten Restriktionsenzymerkennungsstellen sind angezeigt.
3 zeigt eine Southern-Blot-Analyse, mit der die Anzahl von T-DNA-Insertionen, die in das Genom des primären Zuckerrübentransformanden T157-01 integriert sind, bestimmt wurde. Oben ist der Umriss der T-DNA-Struktur des binären Vektors pVDH239 gezeigt.
4 zeigt Diagramme der einzelnen ELISA-Werte der Wurzelextrakte von Zuckerrübenpflanzen der Populationen Cadyx (anfällige Kontrolle), Rifle (Rhizomanie-tolerante Sorte), Rhizor (Rhizomanie-tolerante Sorte) und T157-01 (GUS-positive F1-Individuen) nach Inokulierung mit BNYVV-befallener Erde. Jede Zahl auf der waagrechten Achse gibt eine einzelne Pflanze wieder.
5B zeigt eine Southern-Blot-Analyse, mit der die Anzahl der T-DNA-Insertionen, die in das Genom der F1-Pflanzennachkommen von T157-01 integriert sind, bestimmt wurde, sowie ein Diagramm der einzelnen ELISA-Werte der Wurzelextrakte der F1-Pflanzennachkommen von T157-01 nach Inokulierung mit BNYVV-befallener Erde (5A). Die Zahlen über den Southern Blots geben die Laborcodes der einzelnen F1-Pflanzennachkommen wieder. Die ELISA-Werte, die mit „Genotyp 1" in der unteren Tafel angegeben sind, entsprechen den Individuen, die eine einzelne Bande im Southern Blot zeigen (2012, 2019, 2021, 2029, 2030, 2031, 2034, 2035, 2038, 2042, 2044, 2046, 2051, 2052, 2061, 2066, 2068, 2069), wohingegen die ELISA-Werte, angezeigt mit „Genotyp 2 + 3" in der unteren Tafel, den Individuen entsprechen, die im Southern Blot 2 oder 3 Banden zeigen (1999, 2000, 2001, 2007, 2008, 2011, 2013, 2014, 2015, 2016, 2017, 2018, 2020, 2022, 2023, 2024, 2025, 2026, 2027, 2028, 2032, 2033, 2036, 2037, 2039, 2040, 2041, 2043, 2045, 2047, 2048, 2049, 2050, 2053, 2054, 2055, 2056, 2057, 2058, 2059, 2060, 2062, 2063, 2064, 2065, 2067, 2070). Die ELISA-Werte, die mit „GUS(–)-Segreganten" in der unteren Tafel angezeigt sind, entsprechen den einzelnen F1-Pflanzennachkommen, die GUS-negativ sind (1997, 1998, 2002, 2004, 2005, 2006, 2009, Rest nicht gezeigt).
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Herstellung eines Konstruktes mit einer trunkierten BNYVV-Replikasesequenz
Es wurden zwei Primerkombinationen verwendet, um die cDNA-Klone von BNYVV zur Klonierung in den Transformationsvektor zu erhalten (Bouzoubaa et al. J. Gen. Virol. 68:615-626; 1987).
Die Primer für das 5'-Ende waren:
P1: 5'-CGCGGATCCACCATGGCAGATTCGTTC-3' (mit einer BamHI- und NcoI-Restriktionsschnittstelle und Nukleotiden, die zu Nukleotid 153-168 identisch sind) und
P2: 5'-GACGAATTCAAGTCGTCTTTC-3' (EcoRI-Restriktionsschnittstelle und Nukleotide, die Nukleotid 288-301 komplementär sind).
Die Primer für das 3'-Ende waren:
P3: 5'-GACGAATTCGAAAGATGAGTCTA-3' (EcoRI-Restriktionsschnittstelle und Nukleotide, die zu Nukleotid 2799-2812 identisch sind) und
P4: 5'-CGCAGATCTTTAACTGCTCATCACCAAC-3' (BglII-Restriktionsschnittstelle und Nukleotide, die zu Nukleotid 3244-3258 komplementär sind, und ein Stoppkodon).
Vor dem Klonieren der Fragmente in Bluescript-Vektor (Stratagene, La Jolla, CA, USA) wurde die Salb/HincII/AccI-Schnittstelle durch eine BglII-Schnittstelle ersetzt. Nach Amplifikation der BNYVV-DNA anhand von P1 und P2 wurde ein DNA-Fragment erhalten, das mit BamHI und EcoRI verdaut und in den modifizierten BamHI/EcoRI-geschnittenen pBluescript-Vektor eingesetzt wurde, um pKSNBPoll zu erhalten. Anschließend wurde BNYVV-cDNA1 mithilfe von P3 und P4 amplifiziert. Das resultierende DNA-Fragment wurde mit EcoRI und BglII geschnitten und in den mit EcoRI und BglII geschnittenen pKSBNPoll eingefügt, was pKSNBPpol2 ergab.
Danach wurde das AccI-Fragment der BNYVV-cDNA1, das zu Nukleotid 250-2815 identisch war, in den mit AccI geschnittenen pKSBNPol2 kloniert. So wurde ein pKSBNPoltrunc erhalten, welches das BNYVV-cDNA1-Fragment (poltrunc) enthielt, welches zu Nukleotid 153-3258 identisch ist, flankiert von einer BamHI-Schnittstelle am 5'-Ende und von einem BglII-Fragment am 3'-Ende. Das poltrunc-Fragment wurde als BamHI-BglII-Fragment in die BamHI-Schnittstelle von pVDH4 kloniert, so dass ein funktionelles poltrunc-Sense-Fragment hinter dem CaMV-35S-Promotor und vor der Nopalin-Terminatorsequenz platziert war. Das komplette Konstrukt, das den CaMV-35S-Promotor, das poltrunc-Fragment und die Nopalin-Terminatorsequenz trug, wurde mit ClaI aus dem Plasmid ausgeschnitten und in den binären Transformationsvektor pVDH212 kloniert, in dem die BamHI-Schnittstelle durch Einsetzen eines molekularen Linkers in eine ClaI-Schnittstelle umgewandelt worden war.
pVDH212 ist ein von pBIN19 abstammender binärer Transformationsvektor, der 35S-NPTII (Neomycinphosphotransferase unter der Kontrolle des CaMV-35S Promotors als selektierbares Markergen, das Resistenz gegen Kanamycin verleiht) sowie 35S-GUSi (Gen, das Betaglucuronidase kodiert) enthält (Vancanneyt et al., Mol. Gen. Genet. 220: 245-250; 1990). Es wurden daher zwei verschiedene Transformationsvektoren erhalten, die das poltrunc-Konstrukt enthalten: einer, pVDH239, mit dem poltrunc-Konstrukt in der gleichen Transkriptionsrichtung wie das NPTII- und das GUS-Gen, und ein anderer, pVDH240, in dem das poltrunc-Konstrukt eine entgegen gesetzte Transkriptionsrichtung aufweist. Die binären Transformationsvektoren pVDH239 und 240 (2) wurden konjugiert und in Agrobacterium tumefaciens-LBA4404 übertragen (Phabagen Collection, Utrecht, Niederlande), was die Stämme HAT1239 (für pVDH239) und HAT1240 (für pVDH240) ergab. HAT1239 und HAT1240 wurden zur Transformation von Zuckerrüben verwendet.
BEISPIEL 2
Transformation von Zuckerrüben
Verfahren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation mithilfe binärer Vektoren sind gut etabliert und einem Fachmann bekannt.
Zum Erhalt transformierter Zuckerrübenpflanzen wurden B8M5.9-Pflanzen vom O-Typ nach Krens et al. Plant Science 116: 97-106; 1996, transformiert. Die Transformation mit Agrobacterium HAT1239 ergab 8 Transformanden: T156-03, T156-06, T156-09, T156-10, T156-13, T156-20, T150-30 und T157-0I, und mit Agrobacterium HAT1240 wurden 12 Transformanden erhalten: T183-01, T183-02, T183-06, T183-10, T18316, T183-19, T183-21, T183-23, T183-26, T184-02, T184-03 und T184-04. Die Transformanden wurden durch Vernalisierung zum Blühen gebracht und verwendet, um entweder durch Selbstbestäubung (Selfing oder S1-Samen) oder durch Fremdbestäubung auf männlichen sterilen Pflanzen (Hybrid oder F1-Samen) Samen zu produzieren. Die Bestäubung wurde in geschlossenen Pollenkammern durchgeführt, um eine Bestäubung durch Zuckerrübenpollen anderer Herkunft zu verhindern.
Die F1-Samen wurden als Ausgangsmaterial verwendet, um einen Bioassay auf BNYVV-Resistenz durchzuführen. Die Keimlinge wurden zunächst auf GUS-Aktivität getestet, welche das Vorhandensein der T-DNA anzeigt. GUS-negative Segreganten wurden als negative Kontrolle in dem Bioassay verwendet. Je nach der Gesamtanzahl an T-DNA-Inserts kann die Resistenz, falls vorhanden, in der GUS-positiven Population mendeln. Nur von T157-01 abstammende Nachkommen zeigten BNYVV-Resistenz.
Anschließend wurde der primäre Transformand T157-01 ausführlicher auf einem Southern Blot analysiert. Aus Blättern wurde genomische DNA isoliert, separat mit EcoRI, BamHI und SacI verdaut und verwendet, um einen Southern Blot herzustellen, der anschließend mit GUS als Sonde untersucht wurde. Aus diesem Experiment wurde gefolgert, dass der primäre Transformand drei T-DNA-Inserts enthielt (3).
BEISPIEL 3
Bioassay
Es wurde ein Seitenwurzel-Bioassay als ein Einzelpflanzentest für die Auswahl von Rhizomanie-resistenten Zuckerrübenpflanzen entwickelt. Eine Woche alte Pflänzchen wurden in ein Standardgemisch aus 10% Rhizomanie-infizierter Erde transplantiert und weitere 4 Wochen inkubiert. Die Infektionsbedingungen wurden auf der Ebene des Infektionsdrucks und des Wachstums von Wurzelchen optimiert und standardisiert (nur Bildung von Haarwurzeln). Die Inkubationsbedingungen waren: 18,9-19°C Tag/Nacht, 70% relative Feuchtigkeit, 10.000 Lux Weißlicht, Töpfe befinden sich 32,5 cm entfernt von den Lampen.
Die Menge an Virus in den Wurzelchen, die direkt mit dem Resistenzmechanismus in der Pflanze korrelierte, wurde mit einem ELISA-Verfahren gemessen. Der Ausschlusswert für resistente Pflanzen wurde bei einem OD-Wert von 0,2 gesetzt (Clark et al. J. Virol. Meth. 15:213-222; 1987). Vier Wochen nach der Transplantation wurde der untere Teil der Wurzeln für den ELISA verwendet. Das Wurzelstück wurde auf Filterpapier getrocknet und in einen Mörser überführt. Es wurde Extraktionspuffer in einem Verhältnis von 10 Volumenäquivalenten des Wurzelgewichts (Verdünnung 1/10) zugegeben. Wurzelsaft wurde durch Zerquetschen per Hand extrahiert. Der Saft wurde in 1,5-ml-Röhrchen überführt und zentrifugiert (300 Umdrehungen pro Minute, 10 Minuten), die Überstände wurde auf Eis aufbewahrt und getestet. Folgende Populationen wurden getestet:

Population Anzahl der Pflanzen Bemerkungen

T157-01 (F1) 73 GUS(+)-Individuen

Cadyx F 052 26 Anfällige Kontrolle

Rhizor F 202 27 Tolerante Kontrolle

Rifle 28 Tolerante Kontrolle
In der Gruppe der T157-01-GUS(+)-Pflanzen können zwei Kategorien beobachtet werden (4). Eine Kategorie zeigt Immunität gegenüber BNYVV (ELISA-Ausschlusswert 0,2) mit einem mittleren ELISA-Wert von 0,006, welches dem Hintergrundwert des experimentellen Systems entspricht. Die andere Kategorie zeigt eine normale Anfälligkeit mit einem mittleren ELISA-Wert im Bereich der anfälligen Kontrolle.
Der Infektionsdruck in diesem Bioassay war aufgrund der Temperaturerhöhung während eines Teils des Infektionszeitraumes hoch. Entsprechend gab es keine klare Unterscheidung zwischen Cadyx und Rhizor/Rifle (4). Andererseits können die unter den T157-01-F1-Nachkommen ausgewählten resistenten Pflanzen als vollständig resistent betrachtet werden, unabhängig von dem Rhizomanie-Infektionsdruck (4).
Demnach bewirkte das eingeführte Konstrukt, welches das BNYVV-cDNA1-Fragment enthielt, einen dramatischen negativen Effekt auf die Multiplikation von BNYVV in den Seitenwurzeln der inokulierten transgenen Zuckerrübenpflanzen, was die Pflanzen gegenüber Rhizomanie vollständig resistent machte.
Um die Segregation der GU(+)-Population in eine resistente und eine anfällige Kategorie zu erklären, wurden die einzelnen Pflanzen in einem separaten Experiment auf Resistenz gegen BNYVV und gleichzeitig auf Vorhandensein der T-DNAs durch Southern-Blot-Analyse analysiert, wobei SacI als Restriktionsenzym und GUS als Sonde verwendet wurde.. Die Ergebnisse, wie in 5A und 5B dargestellt, weisen darauf hin, dass die GUS(+)-Pflanzen in dieser Population, die eine einzelne Bande auf dem Southern Blot ergaben, alle anfällig waren (mittlerer ELISA-Wert 0,63), während die GUS(+)-Pflanzen, die entweder 2 oder 3 Banden auf dem Southern Blot ergaben, alle resistent waren (mittlerer ELISA-Wert: 0,21). Die GUS(–)-Segreganten waren alle anfällig (mittlerer ELISA-Wert: 0,80). Der Resistenz-Phänotyp ist offensichtlich mit dem Vorhandensein der oberen und unteren Bande dieses bestimmten im Southern Blot erhaltenen Bandenmusters verknüpft, während das Vorhandensein der mittleren Bande nicht mit dem Resistenz-Phänotyp verknüpft ist. Es wird daher gefolgert, dass die Segregation der GUS(+)-Population in eine anfällige und eine resistente Kategorie durch die Tatsache erklärbar ist, dass eine der T-DNAs, die zu einem GUS(+)-Phänotyp führt, nicht zu der Resistenz gegen BNYVV beiträgt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren, um einer Zuckerrübenpflanze Resistenz gegen das Beet Necrotic Yellow Vein Virus (Aderngelbfleckigkeitsvirus der Rübe) zu verleihen, welches folgende Schritte umfasst: (a) Herstellen eines DNA-Fragmentes aus mindestens 15 Nukleotiden in einer Sequenz, die zu mindestens 70% homolog zu der entsprechenden Nukleotidsequenz der genomischen RNA 1 des Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYVV) ist, (b) Einführen des DNA-Fragmentes, das funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, der in Zuckerrüben pflanzen aktiv ist, in eine Zuckerrübenpflanzenzelle, um eine transformierte Zuckerrübenzelle zu erhalten; und (c) Regenerieren einer transgenen Zuckerrübenpflanze aus der transformierten Zuckerrübenpflanzenzelle.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das DNA-Fragment zu mindestens 80%, vorzugsweise zu mindestens 90%, mehr bevorzugt zu mindestens 95% homolog zu der entsprechenden Nukleotidsequenz der genomischen RNA 1 des Virus ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet; dass das DNA-Fragment eine Länge von mindestens 35 Basen aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die der in Anspruch 1 und 2 angegebenen Homologie zu Nukleotid 153 bis 3258 der RNA 1 des Virus entspricht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment eine Länge zwischen 100 und 1000 Basen hat.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die der in Anspruch 1 und 2 angegebenen Homologie zu Nukleotid 169 bis 539 der RNA 1 des Virus entspricht.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die der in Anspruch 1 und 2 angegebenen Homologie zu Nukleotid 1226 bis 1683 der RNA 1 des Virus entspricht.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die der in Anspruch 1 und 2 angegebenen Homologie zu Nukleotid 2754 bis 3192 der RNA 1 des Virus entspricht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, das das Fragment aus 6746 Nukleotiden besteht.
Verfahren nach Anspruch 1-9, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment in die Zelle mittels eines DNA-Vektors eingeführt wird, welcher das Fragment und transkriptions- und translationsregulierende Sequenzen aufweist, die damit funktionell verknüpft sind.
Transformationsvektor, um einer Pflanze Resistenz gegen BNYVV zu verleihen, welcher ein Fragment von mindestens 15 Nukleotiden in einer Sequenz aufweist, die zu der entsprechenden Nukleotidsequenz der genomischen RNA 1 des Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYVV) zu mindestens 70% homolog ist, welches funkti onell mit einem Promotor verknüpft ist, der in Zuckerrübenpflanzen aktiv ist.
Vektor nach Anspruch 11, wobei das Fragment zu mindestens 80%, vorzugsweise zu mindestens 90%, mehr bevorzugt zu mindestens 95% homolog zu der entsprechenden Nukleotidsequenz der genomischen RNA 1 des Virus ist.
Vektor nach Anspruch 11 oder 12, wobei das Fragment eine Länge von mindestens 35 Basen aufweist.
Vektor nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die der in Anspruch 11 und 12 angegebenen Homologie zu Nukleotid 153 bis 3528 der RNA 1 des Virus entspricht.
Vektor nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei das Fragment eine Länge zwischen 100 und 1000 Basen aufweist.
Vektor nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die der in Anspruch 11 und 12 angegebenen Homologie zu Nukleotid 169 bis 539 der RNA 1 des Virus entspricht.
Vektor nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die der in Anspruch 11 und 12 angegebenen Homologie zu Nukleotid 1226 bis 1683 der RNA 1 des Virus entspricht.
Vektor nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die der in Anspruch 11 und 12 angegebenen Homologie zu Nukleotid 2754 bis 3192 der RNA 1 des Virus entspricht.
Vektor nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment aus 6746 Nukleotiden besteht.
Verwendung eines Vektors wie in Anspruch 11 bis 19 beansprucht für die Transformation einer Pflanzenzelle.
Pflanzenzelle, die eine Resistenz gegen BNVYY aufweist, welche in ihrem Genom ein DNA-Fragment von mindestens 15 Nukleotiden in einer Sequenz aufweist, die zu mindestens 70% zu der entsprechenden Nukleotidsequenz der genomischen RNA 1 des Virus homolog ist.
Pflanzenzelle wie in Anspruch 21 beansprucht, wobei das Fragment zu mindestens 80%, vorzugsweise zu mindestens 90%, mehr bevorzugt zu mindestens 95% homolog zu der entsprechenden Nukleotidsequenz der genomischen RNA 1 des Virus ist.
Pflanzenzelle wie in Anspruch 21 oder 22 beansprucht, wobei das Fragment eine Länge von mindestens 35 Basen aufweist.
Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die der in Anspruch 21 und 22 angegebenen Homologie zu Nukleotid 153 bis 3258 der RNA 1 des Virus entspricht.
Pflanzenzelle wie in einem der Ansprüche 21 bis 23 beansprucht, wobei das Fragment eine Länge zwischen 100 und 1000 Basen aufweist.
Pflanzenzelle nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment eine Nukleinsäuresequenz auf weist, die der in Anspruch 21 und 22 angegebenen Homologie zu Nukleotid 169 bis 539 der RNA 1 des Virus entspricht.
Pflanzenzelle nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die der in Anspruch 21 und 22 angegebenen Homologie zu Nukleotid 1226 bis 1683 der RNA 1 des Virus entspricht.
Pflanzenzelle nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die der in Anspruch 21 und 22 angegebenen Homologie zu Nukleotid 2754 bis 3192 der RNA 1 des Virus entspricht.
Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment aus 6746 Nukleotiden besteht.
Pflanzenzelle wie in Anspruch 21-29 beansprucht, die Teil einer gegen BNYVV resistenten Zuckerrübenpflanze ist.
Verwendung einer Pflanzenzelle, wie in Anspruch 21 bis 29 beansprucht, für ihre Regeneration aus einer gegen BNYVV resistenten Zuckerrübenpflanze.
Zuckerrübenpflanze, die eine Resistenz gegen BNYVV aufweist, die zumindest teilweise aus Pflanzenzellen wie in Anspruch 21-29 beansprucht besteht.
BNYVV-resistente Nachkommen einer Zuckerrübenpflanze wie in Anspruch 32 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachkommen zumindest teilweise aus Pflanzenzellen nach Anspruch 21-29 bestehen.
Samen einer Zuckerrübenpflanze wie in Anspruch 32 beansprucht oder von Nachkommen nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Samen zumindest teilweise aus Zellen nach Anspruch 21-29 bestehen und zu einer Pflanze regeneriert werden können, die Resistenz gegen BNYVV aufweist.
Vegetativ reproduzierbare Strukturen, wie beispielsweise Kalli, Knospen, Embryonen, die aus einer Pflanze nach Anspruch 32 oder Nachkommen nach Anspruch 33 erhalten wurden, dadurch gekennzeichnet, dass die Strukturen zumindest teilweise aus Zellen nach Anspruch 21-29 bestehen, und zu einer Pflanze regeneriert werden können, die Resistenz gegen BNYVV aufweist.