SK10572001A3 - Spôsob na poskytnutie odolnosti proti bnyvv rastlinám cukrovej repy, transformačný vektor a jeho použitie, rastlinná bunka majúca odolnosť proti bnyvv a jej použitie, rastlina cukrovej repy majúca odolnosť proti bnyvv, jej potomstvo a semená - Google Patents

Description

-1 Spôsob na poskytnutie odolnosti voči BNYW rastlinám cukrovej repy, transformačný vektor a jeho použitie, rastlinná bunka vykazujúca odolnosť voči BNYW a jej použitie, rastlina cukrovej repy vykazujúca odolnosť voči BNYW, jej potomstvo a semená

Oblasť vynálezu

Predložený vynález sa týka spôsobu na poskytnutie vírusovej odolnosti voči repovému nekrotickému žltému cievnemu vírusu (BNYW) rastline cukrovej repy. Okrem toho sa vynález týka rastlín odolných voči vírusu získaných týmto spôsobom, ako aj semien a z nich odvodeného potomstva.

Doterajší stav techniky

Rastlinné vírusy sú vážnym problémom mnohých hlavných poľnohospodárskych plodín. Takže BNYW, ktorý je prenášaný pôdnou plesňou z čeľade Plasmodiophoromycete, Polymyxa betae, je príčinou ekonomicky dôležitého ochorenia cukrovej repy (Beta vulgaris), známeho ako rizománia. Táto choroba bola po prvý krát opísaná v Taliansku v 50-tych rokoch a odvtedy sa stala hlavnou hrozbou cukrovej repy vo väčšine pestovateľských oblastí sveta.

V pôdnych podmienkach je BNYW vo všeobecnosti obmedzený na podzemné časti rastliny. Infikované korene cukrovej repy vykazujú zníženú proliferáciu a nekrózu bočných koreňov a zníženú celkovú hmotnosť hlavného koreňa a z toho vyplývajúce zníženie výťažku cukru. Po infekcii môže nastať aj uhynutie rastliny, najmä ak bola plodina infikovaná v skorej fáze sezóny. Občas vírus vystúpi do listov, kde spôsobuje chlorotické a nekrotické lézie asociované so žilami.

BNYW je typový člen benyvírusovej rodiny, čo sú vírusy prenášané plesňami, majúce bičíkovitý tvar a rozdelený genóm, ktorý je zložený z dvoch alebo viacerých komponentov jednovláknovej (ss) RNA. Boli identifikované štyri rozličné plus sense ssRNA druhy BNYW, ktoré sú označované ako RNA 1 až 4 v

-2zostupnom poradí podľa veľkosti (RNA 1: 6,8 kb; RNA 2: 4,7 kb, RNA 3. 1,8 kb; RNA 4: 1,5 kb). Niektoré japonské izoláty obsahujú aj piaty RNA komponent (RNA 5: 1,45 kb). Všetky RNA boli klonované a sekvenované. Genetická mapa vírusových RNA je znázornená na obrázku 1.

Všetkých päť RNA je na 3’ konci ukončených poly-A chvostami a RNA 1 až 4 majú na svojom 5’ konci Čiapočkové štruktúry. RNA 1 a 2 kódujú základné na hostiteľovi nezávislé udržiavacie funkcie, zatiaľ čo menšie RNA špecificky sprostredkúvajú prirodzený infekčný proces zahŕňajúci vektorom sprostredkovanú infekciu koreňov cukrovej repy, proliferáciu vo vnútri koreňového systému a vytváranie symptómov rhizománie. Takže sa ukázalo, že RNA 1 kóduje vírusovú RNA polymerázovú aktivitu a RNA 2 kóduje 21-kd vírusový obalový protein 3’proximálna polovica RNA 2 nesie skupiny troch za sebou idúcich mierne sa prekrývajúcich vírusových génov, ktoré sú známe ako trojitý génový blok (TGB3), ktoré sú veľmi podobné s klastrom troch génov v iných bičíkovitých rastlinných vírusoch, a podieľajú sa na premiestňovaní vírusu z bunky do bunky. RNA 3 je spojená s masívnou proliferáciou jemných korienkov v cukrovej repe a s uľahčovaním rozširovania vírusu v koreňovom tkanive, zatiaľ čo RNA 4 zvyšuje účinnosť prenosu vírusu plesňami.

Pokiaľ bola už raz pôda infikovaná, môžu plesňami prenášané vírusy, ako napríklad BNYW, zotrvávať v pôde mnoho rokov v odpočívajúcich spórach. Keďže neexistujú žiadne účinné chemické alebo fyzikálne spôsoby eliminácie vírusu am z rastlín, ani z pôdy, jedinou možnosťou pestovateľov cukrovej repy je použitie geneticky rezistentných kultivarov. Niekoľko spoločností poskytlo určité množstvo tolerantných, aj čiastočne rezistentných odrôd prenosom divého typu tolerančných génov do komerčných odrôd prostredníctvom kríženia. Je to však veľmi únavný a časovo náročný proces, ktorý vo všeobecnosti trvá veľmi dlho pokiaľ sa získajú užitočné odolné rastliny. Okrem toho pri vysokom tlaku ochorenia sa u tolerantných alebo čiastočne odolných rastlín vyvinú symptómy ochorenia, pretože úroveň odolnosti je veľmi nízka. Ďalší problém s tolerantnými alebo len čiastočne rezistentnými rastlinami spočíva v skutočnosti, že vírusové populácie pokračujú v

-3raste, čo vedie k možnému objaveniu sa BNYW kmeňa, ktorý môže zlomiť rezistenčné/tolerančné gény.

Rýchla revolúcia v oblastiach rastlinného inžinierstva viedla v vývoju nových stratégii na poskytnutie genetickej odolnosti voči vírusom. Rezistencia voči vírusovým chorobám prostredníctvom zavedenia častí vírusových genómových sekvencií sa stala novým zdrojom odolnosti. Vírusová sekvencia (konštrukt) sa transformuje do rastliny kombinovaným použitím vhodnej bunkovej alebo tkanivovej kultivačnej techniky a DNA dodávacieho systému, ako napríklad veľmi dobre známeho Agrobacterium tumefaciens transformačného systému, alebo priamym DNA transferom sprostredkovaným chemickými látkami, ako napríklad polyetylénglykolom (PEG).

Známe spôsoby indukcie patogénnych obranných mechanizmov v rastlinách sú opísané napríklad v EP 9687106.0, ktorý sa týka spôsobu indukcie odolnosti voči vírusu obsahujúcemu TGB3 sekvenciu. Publikácia opisuje, že bolo možné indukovať BNYW rezistenciu spôsobom, ktorý pozostáva z transformovania rastlinných buniek DNA konštruktom zodpovedajúcim fragmentu nukleokyselinovej sekvencie genomickej alebo subgenomickej RNA 2 vírusu BNYW. Avšak nevýhodou tohto spôsobu je, že sa získa len tolerancia, a nie odolnosť. V tolerantných hostiteľských rastlinách môžu byť ešte normálne úrovne replikácie rastlinného vírusu, ale rastlina vykazuje len málo alebo žiadne viditeľné známky infekcie, zatiaľ v odolných hostiteľoch je vírusová replikácia nízka alebo aj žiadna.

Vo WO 93/25068 sa vírusová odolnosť v rastlinách indukuje transformáciou rastlín s replikázovou časťou (RNA 1) rastlinného vírusového genómu Táto publikácia neopisuje ani cukrovú repu, ani BNYW.

Cukrová repa je v genetickom inžinierstve známa ako nepoddajný druh, čo komplikuje úspešnú indukciu BNYW odolnosti. Avšak kvôli rozsahu a vplyvu vírusového ochorenia BNYW, existuje veľký záujem zlepšiť zdroje genetickej rezistencie v rastlinách cukrovej repy.

Podstata vynálezu

Predmetom predloženého vynálezu je preto poskytnutie prostriedku na získanie rastlín cukrovej repy, ktoré vykazujú odolnosť voči BNYW. Výhodne vykazujú celkovú odolnosť alebo imunitu kombinovaním odlišných prístupov a použitím spôsobov, ktoré neumožňujú vírusu sa replikovať.

To je dosiahnuté týmto vynálezom prostredníctvom spôsobu na poskytnutie odolnosti voči repnému nekrotickému žltému žilovému vírusu (BNYW) rastline cukrovej repy, ktorý zahŕňa nasledujúce kroky:

a) prípravu DNA fragmentu so sekvenciou najmenej 15 nukleotidov, ktorá je v podstate homologická so zodpovedajúcou nukleotidovou sekvenciou genomickej RNA 1 repného nekrotického žltého žilového vírusu (BNYW),

b) zavedenie uvedeného DNA fragmentu, ktorý je operatívne spojený s promótorom, ktorý je aktívny v rastlinách cukrovej repy, do rastlinnej bunky cukrovej repy, aby sa získala transformovaná bunka cukrovej repy; a

c) regeneráciu transgénnej rastliny cukrovej repy z transformovanej rastlinnej bunky cukrovej repy.

Tak sa získa rastlina cukrovej repy, ktorá vykazuje trvalú odolnosť, a v ktorej sa vírus nereplikuje. To je unikátny aspekt transformantu podľa vynálezu a doteraz nebol opísaný.

Podľa vynálezu je esenciálnou sekvenčnou homológiou fragmentu najmenej 70% homológia, výhodne najmenej 80% homológia, výhodnejšie najmenej 90% homológia a najvýhodnejšie najmenej 95% homológia.

Tak ako sa používajú tu, znamenajú výrazy homológia alebo stupeň podobnosti nukleotidové sekvencie, ktoré keď sa zosúladia, majú podobné (rovnaké alebo konzervatívne nahradené) nukleotidy v podobných polohách alebo oblastiach. Napríklad dve nukleotidové sekvencie, ktoré majú najmenej 85% vzájomnú homológiu majú najmenej 85 % homologických (rovnakých alebo konzervatívne nahradených) nukleotidov v podobnej polohe, keď sa optimálne zosúladia, pričom sú možné až 3 medzery, s tou podmienkou, že v medzerách nie je celkovo viac ako 15 aminokyselinových zvyškov. Stupeň podobnosti je možné

-5···· ·· ·· ·· ·· ··· stanoviť použitím metód, ktoré sú v oblasti dobre známe (pozri napr. Wilbur, W.J a Lipman, D.J. Rapid Similarity Searches of Nucleic Acid and Proteín Data Banks. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80, 726-730 (1983) a Myers E. a Miller W. Optimal Alignments in Linear Space. Comput. Appl. Biosci. 4:11-17 (1988)). Jedným programom, ktorý môže byť použitý na stanovenie stupňa podobnosti, je MegAlign Lipman-Pearson jednopárová metóda (použitím parametrov medzier), ktorú je možné získať od DNAstar Inc, 1228, Selfpark Street, Madison, Wisconsin, 53715, USA, ako časť Lasergene systému. Test homológie sekvencií je založený na percente zhody, ktoré sa vypočítava prostredníctvom Fast DB na základe nasledujúcich parametrov: penalta nespárovaných báz 1,0, penalta medzery (1,00), penalta veľkosti medzery 0,33 a spojovacia penalta 30,0.

Výhodné uskutočnenia vynálezu používajú rôzne fragmenty s nukleokyselinovými sekvenciami, ktoré zodpovedajú uvedenej homológii alebo sú úplne zhodné s nukleotidmi 153 až 3258, 169 až 539, 1226 až 1683, 2754 až 3192 alebo so všetkými 6746 nukleotidmi RNA 1.

Predložený vynález zahŕňa aj DNA, ktorá hybridizuje s DNA podľa predloženého vynálezu, a ktorá kóduje RNA 1. Výhodne takáto hybridizácia nastáva v podmienkach, ktoré sú medzi málo a veľmi prísnymi podmienkami, alebo v týchto podmienkach. Všeobecne môžu byť málo prísne podmienky definované ako 3xSSC pri približne teplote okolia až približne 65 °C, a veľmi prísne podmienky ako 0,1xSSC pri približne 65 °C. SSC je označenie tlmivého roztoku 0,15M NaCI a 0,015M citrátu sodného. 3xSSC je trojnásobne silnejšie ako SSC a podobne.

Fragment sa môže zavádzať do regenerovateľnej rastlinnej bunky prostredníctvom DNA vektora, ktorý obsahuje fragment a s ním operatívne spojené transkripčné a translačné regulačné sekvencie, použitím štandardných rastlinných transformačných metód, ako napríklad Agrobacŕer/m-sprostredkovanej transformácie buniek upevnených v rastlinných tkanivách, ako napríklad v kotyledónoch (Krens a ďalší, Plánt Science 116: 97-106; 1996) alebo použitím polyetylénglykolom sprostredkovaného príjmu DNA jednotlivými bunkami, ako napríklad strážnymi bunkovými protoplastami (Halí a ďalší, Náture Biotechnology ·· ·· ·· ·· ·· • · · · · · · · « · · • ·· · · ·· · · ·· · · · · · · 9 · · • 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 99 99 9

-614: 1133-1138; 1996). Aj DNA vektor obsahujúci fragment je časťou predloženého vynálezu.

Použitie konštruktov skonštruovaných tak, že génová sekvencia inhibuje alebo napomáha expresii génu, je celkom dobre zvládnuté. Úplná génová sekvencia riadená promótorom, ktorý účinne funguje v rastlinách, bude nadexprimovať génový produkt, čo vedie k amplifikácii účinku takto produkovaného proteínu. Niekedy je génový produkt redukovaný: tento fenomén sa nazýva kosupresia. Regulácia spôsobujúca zníženie expresie tohto génu sa môže uskutočňovať niekoľkými technikami. Môže sa uskutočniť prostredníctvom dominantne negatívnych konštruktov. Tieto konštrukty obsahujú špecifickú DNA viažucu doménu, ako aj možné dimerizačné domény, ale sú transkripčne inaktívne. Nasadajú na promótory cieľových génov, a tým zabraňujú viazaniu endogénneho proteínu. Okrem toho sa redukcia génového produktu môže získať aj použitím takejto dominantne negatívnej mutácie alebo obrátením orientácie génovej sekvencie vzhľadom k promótoru tak, že je produkovaný typ génového produktu označovaný ako antisense mRNA.

DNA konštrukt podľa vynálezu môže byť antisense konštrukt generujúci antisense RNA alebo sense konštrukt (kódujúci aspoň časť funkčného proteínu) generujúci sense RNA.

Antisense RNA je RNA sekvencia, ktorá je komplementárna so sekvenciou báz v zodpovedajúcej mRNA: komplementárna v tom zmysle, že každá báza (alebo väčšina báz) v antisense sekvencii (čítaná v smere od 3’ po 5’) je schopná párovať sa so zodpovedajúcou bázou (G s C, A s U) v mRNA sekvencii čítanej v smere od 5’ po 3’ Takáto antisense RNA môže byť produkovaná bunkou transformovanou s príslušným DNA konštruktom zostaveným tak, že generuje transkript, ktorý má aspoň časť svojej sekvencie komplementárnu s aspoň časťou kódujúceho vlákna relevantného génu (alebo DNA sekvenciou, ktorá s ním je v podstatne homologická).

Sense RNA je RNA sekvencia, ktorá je v podstate homologická s aspoň časťou zodpovedajúcej mRNA sekvencie. Takáto sense RNA sa v bunke môže produkovať prostredníctvom transformácie s príslušným DNA konštruktom

-7• ··

zostaveným v normálnej orientácii, tak aby sa generoval transkript, ktorého sekvencia je zhodná s aspoň časťou kódujúceho reťazca relevantného génu (alebo DNA sekvenciou, ktorá je s ním v podstate homologická). Vhodné sense konštrukty môžu byť použité na inhibíciu génovej expresie (ako je opísané v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu WO 91/08299).

DNA konštrukty podľa vynálezu môžu obsahovať sekvenciu báz s dĺžkou najmenej 10 báz (výhodne najmenej 35 báz) na transkripciu do RNA. Teoretický neexistuje horná hranica dĺžky bázovej sekvencie - môže mať dĺžku relevantnej mRNA produkovanej bunkou - ale kvôli pohodlnosti sa vo všeobecnosti môže ukázať ako vhodné používať sekvencie s dĺžkou 100 až 1000 báz. Príprava takýchto konštruktov je podrobnejšie opísaná nižšie.

Ako zdroj DNA bázovej sekvencie na transkripciu sa môže použiť vhodná cDNA alebo genomická DNA, RNA alebo syntetický polynukleotid. Transkripčnou iniciačnou oblasťou (alebo promótorom) fungujúcou v rastlinách môže byť konštitutívny promótor (ako napríklad 35S promótor vírusu mozaiky karfiolu) alebo indukovateľný alebo vývojovo regulovaný promótor, podľa toho ako to vyžadujú okolnosti. Vhodné DNA sekvencie na riadenie expresie rastlinných exprimovateľných génov (vrátane markerových génov), ako napríklad transkripčné iniciačné oblasti, zosiľovače, vedúce sekvencie, netranskribované vedúce sekvencie a podobne, sa môžu derivovať od akéhokoľvek génu, ktorý je exprimovateľný v rastlinnej bunke. Využité môžu byť aj hybridné promótory s kombináciou funkčných časti rôznych promótorov alebo ich syntetické ekvivalenty. Na riadenie expresie exprimovateľných génov podľa vynálezu môžu byť okrem konštitutívnych promótorov použité aj indukovateľné promótory alebo promótory, ktoré sú regulované iným spôsobom, napr. promótory závislé na vývojovom štádiu alebo promótory špecifické pre určité typy buniek. Môže byť napríklad želateľné modifikovať aktivitu proteínu v určitých štádiách vývoja rastliny. Použitie konštitutívneho promótora bude mať tendenciu ovplyvniť hladiny a funkcie proteínu vo všetkých častiach rastliny, zatiaľ čo použitie tkanivovo špecifického promótora umožňuje selektívne riadenie génovej expresie a ovplyvňovaných funkcií.

-8•· ·· ·· ·· • ·· · · ··

Inou možnosťou podľa tohto vynálezu je použiť indukovateľné promótory. Sú známe promótory, ktoré sú indukovateľné patogénmi, stresom, chemickými látkami a environmentálnymi signálmi. Do rozsahu predloženého vynálezu spadá indukcia génovej aktivity vnútornou alebo externou indukciou. Promótory tohto typu umožňujú indukovateľnosť génovej aktivity kontrolovaným spôsobom, takže rastlina sa môže normálne vyvíjať bez zbytočného vplyvu transgénneho génu. Promótory, ktoré sú indukovateľnými promótormi zahŕňajú tie, ktoré sú opísané v DE 4446342 (plesňami a auxínom indukovateľný PRP-1), WO 96/28561 (plesňami indukovateľný PRP-1), EP0712273 (indukovateľný nematódami), EP0330479 a US 5510474 (indukovateľný stresom), WO 96/12814 (indukovateľný chladom) a alkoholom indukovateľný promótor firmy Zeneca. Iné indukovateľné promótory sú opísané v EP1494724, EP0619844, WO 92/19724. Takže génový produkt, či už antisense alebo sense RNA alebo peptid, sa v tkanive produkuje len vtedy, keď je potrebný jeho účinok.

Ako bolo uvedené vyššie zahŕňa výraz indukovateľný promótor promótory, ktoré môžu byť indukované chemicky. Najvýhodnejšie je použitie promótorovej sekvencie, ktorá je riadená aplikáciou externého chemického stimulu. Externým chemickým stimulom je výhodne poľnohospodársky prijateľná látka, ktorej použitie je kompatibilné s poľnohospodárskou praxou a nepoškodzuje rastliny alebo cicavce. Indukovateľné promótorová oblasť najvýhodnejšie obsahuje indukovateľný zapínací promótorový systém, ako napríklad alcA/alcR génový zapínací promótorový systém opísaný vo zverejnenej medzinárodnej prihláške vynálezu č. WO93/21334, ekdyzónový zapínací systém ako je opísaný vo zverejnenej medzinárodnej prihláške vynálezu č. WO 96/37609 alebo GST promótor ako je opísaný vo zverejnených medzinárodných prihláškach vynálezu č. WO 90/08826 a WO 93/031294, ktorých opisy sú tu zahrnuté ich citáciou. Takéto promótorové systémy sú tu označované ako zapínacie promótory. Zapínacie chemické látky používané v spojitosti so zapínacími promótormi sú poľnohospodársky prijateľné chemické látky, ktoré robia tento systém veľmi užitočným v spôsobe podľa predloženého vynálezu.

·· ·· ·· ·· ·· • · · ···· ··· • ·· · · ·· · ·

9 9 ···· «·

-9Priemerný odborník v oblasti bude schopný vybrať DNA vektor na použitie v týchto spôsoboch. Príkladom vhodného vektora na Agraôacŕer/um-sprostredkovanú transformáciu je pBIN19. Vhodné vektory na PEG-sprostredkovanú transformáciu zahŕňajú pBluescript vektor alebo pIGPDľ (Halí a ďalší, Náture Biotechnology 14: 1133-1138; 1996). Zavedenie fragmentu to týchto vektorov sa môže uskutočniť prostredníctvom štandardných molekulárnych biologických techník opísaných napríklad v Sambrook a další, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.

Transformované rastliny získané spôsobom podľa predloženého vynálezu vykazujú absolútnu odolnosť alebo imunitu voči BNYW. Na rozdiel od toho, predchádzajúce snahy poskytnúť rastlinám odolnosť voči BNYW (Kallerhof a ďalší, Plánt Celí Reports 9: 224-228, 1990; a Mannerlof a ďalší, Euphytica 90: 293-299, 1996) alebo iným vírusom, ako napríklad vírusu tabakovej mozaiky (TMV) (Donson a ďalší, Mol. Plant-Microbe Interact. 6: 635-642; 1993), prostredníctvom transformácie rastlín časťami vírusového genómu boli menej úspešné. Inokulované listy stále vykazovali symptómy infekcie, z čoho vyplývalo, že odolnosť nie je absolútna. Je preto prekvapujúce, že spôsob podľa vynálezu je schopný rastlinám cukrovej repy poskytnúť absolútnu odolnosť voči BNYW.

Okrem toho sa vynález týka transformovaných rastlinných buniek a transgénnych rastlín odolných voči BNYW, ako aj reprodukovateľných štruktúr, ako napríklad semien, kalusov, pukov, embryí, získaných z transgénnych rastlín a z nich odvodeného potomstva.

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu môže byť tu opísaná odolnosť kombinovaná s inými typmi odolnosti alebo tolerancie voči BNYW.

Vynález bude ďalej ilustrovaný nasledujúcimi príkladmi a obrázkami, ale nie je nimi obmedzený.

- 10·· ··

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 znázorňuje diagram organizácie genómu repného nekrotického žltého žilového vírusu (podľa Jupin a ďalší, Seminars in Virology, zv. 2.2' 112-129; 1991).

Obrázok 2 znázorňuje fyzikálnu mapu pVDH239 a pVDH240. LB = ľavá hranica, RB = prvá hranica, P35S - CaMV 35S promótor, NPTII = neomycín fosfotransferáza II, T35S = CaMV 35S polyadenylačný signál, GUSINT = betaglukuronidázový gén, BNYWpolTRUNC = BNYW cDNA1 fragment, Tnos = polyadenylačný signál odvodený od nopalín syntetázového génu. Vyznačené sú polohy miest rozoznávaných hlavnými reštrikčnými enzýmami.

Obrázok 3 znázorňuje analýzu transformantu cukrovej repy T 157-01 (pVDH239). Konkrétne znázorňuje analýzu Southern blotom, prostredníctvom ktorej sa stanovil počet T-DNA inzertov integrovaných do genómu primárneho transformantu cukrovej repy T157-01. Navrchu je znázornená schéma T-DNA štruktúry binárneho vektora pVDH239.

Obrázok 4 znázorňuje biologický test odolností T157-1 voči rizománii. Konkrétne znázorňuje diagramy jednotlivých ELISA hodnôt koreňových extraktov rastlín cukrovej repy populácie Cadyx (vnímavá kontrola), Rifle (odroda tolerujúca rhizomániu), Rhizor (odroda tolerujúca rhizomániu) a T157-01 (GUS-pozitívne F1 jedinci) po inokulácii s BNYW-infikovanou pôdou. Každé číslo na horizontálnej osi reprezentuje jednotlivú rastlinu.

Obrázok 5A znázorňuje rezistenciu T157-01 F1 voči rizománii a obrázok 5B znázorňuje rezistenciu voči rizománii u T157-01 F1 potomstva. Obrázok 5B konkrétne znázorňuje analýzu Southern blotom, prostredníctvom ktorej sa stanovovalo množstvo T-DNA inzertov integrovaných do genómu F1 rastlinného potomstva T157-01, ako aj diagram jednotlivých ELISA hodnôt koreňových extraktov F1 rastlinného potomstva T157-01 po inokulácii s BNYW-infikovanou pôdou (obrázok 5A). Čísla na vrchu Southern blotov predstavujú laboratórne kódy jednotlivých rastlín F1 generácie. ELISA hodnoty uvedené pod nápisom Genotyp 1 na obrázku 5A zodpovedajú jedincom vykazujúcim v Southern blote len jeden • ·· ·· ·· • · · · ·· · · pás (2012, 2019, 2021, 2029, 2030, 2031, 2034, 2035, 2038, 2042, 2044, 2046, 2051, 2052, 2061, 2066, 2068, 2069), zatiaľ čo ELISA hodnoty uvedené pod nápisom Genotyp 2 + 3 na obrázku 5A zodpovedajú jedincom, ktoré v Southern blote vykazujú 2 alebo 3 pásy (1999, 2000, 2001, 2007, 2008, 2011, 2013, 2014,

2015, 2016, 2017, 2018, 2020, 2022, 2023, 2024, 2025, 2026, 2027, 2028, 2032,

2033, 2036, 2027, 2039, 2040, 2041, 2043, 2045, 2047, 2048, 2049, 2050, 2053,

2054, 2055, 2056, 2057, 2058, 2059, 2060, 2062, 2063, 2064, 2065, 2067, 2070).

ELISA hodnoty uvedené pod nápisom GUS(-) segreganty na obrázku 5A zodpovedajú rastlinám F1 potomstva, ktoré sú GlS-negatívne (1997, 1998, 2002, 2004, 2005, 2006, 2009, zvyšok nie je znázornený

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava konštruktu so skrátenou BNYW replikázovou sekvenciou

Na získanie cDNA kionov BNYW na klonovanie v transformačnom vektore boli použité dve primerové kombinácie (Bouzoubaa a ďalší, J. Gen. Virol. 68:615626; 1987).

Pre 5’ koniec boli použité primery:

P1: 5’-CGCGGATCCACCATGGCAGATTCGTTC-3’ (obsahujúci BamHI a Ncol reštrikčné miesto a nukleotidy identické s nukleotidmi 153-168) a P2: 5’-GACGAATTCAAGTCGTCTTTC-3’ (EcoRI reštrikčné miesto a nukleotidy komplementárne s nukleotidmi 288-301).

Pre 3’ koniec boli použité primery:

P3: 5’-GACGAATTCGAAAGATGAGTCTA-3’ (EcoRI miesto a nukleotidy identické s nukleotidmi 2799-2812) a

P4: 5’-CGCAGATCTTTAACTGCTCATCACCAAC-3’ (Bglll miesto a nukleotidy komplementárne s nukleotidmi 3244-3258 a stop kodón.

Pred klonovaním fragmentov do Bluescript vektora (Stratagene, La Jolla, CA, USA) sa Sall/Hincll/Accl miesto nahradilo Bglll miestom. Po amplifikácii BNYW

-12·· ·· ·· ·· ·· • · · · ···· ··· • ·· ···· ·· • · · · · ·· ··· · * · · ···· · · ······ · · · · ·· · cDNA použitím P1 a P2 sa získal DNA fragment, ktorý sa poštiepil s BamHI a EcoRI a vložil sa do modifikovaného pBluescript vektora, ktorý bol poštiepený s BamHI a EcoRI, čím vznikol pKDNBPoll. Následne sa BNYW cDNA1 amphfikovala použitím P3 a P4. Výsledný DNA fragment sa poštiepil s EcoRI a Bglll a včlenil sa do pKSBNPoll poštiepeného s EcoRI a Bglll, čím vznikol pKSNBPpol2.

Potom sa Accl fragment BNYW cDNA1 identický s nukleotidmi 250-2815 klonoval do pKSBNPol2 poštiepeného s Accl. Tak sa získal pKSBNPoltrunc, ktorý obsahoval BNYW cDNA1 fragment (poltrunc) identický s nukleotidmi 153-3258, ohraničený BamHI miestom na 5’-konci a Bglll miestom na 3’-konci Poltrunc fragment sa klonoval ako BamHl-BglII fragment do BamHI miesta pVDH4 tak, že funkčný sense poltrunc fragment sa umiestnil za CaMV 35S promótor a pred nopalínovú terminátorovú sekvenciu. Kompletný konštrukt, nesúci CaMV35S promótor, poltrunc fragment a nopalínovú terminátorovú sekvenciu sa vystrihol z plazmidu s Clal a klonoval sa do binárneho transformačného vektora pVDH212, v ktorom sa BamHI miesto konvertovalo na Clal miesto prostredníctvom zavedenia molekulárneho linkera pVDH212 je od pBIN19 odvodený binárny transformačný vektor, ktorý obsahuje 35S-NPTII (neomycín fosfotransferáza pod kontrolou CaMV 35S promótora ako selektovateľný markerový gén poskytujúci rezistenciu voči kanamycínu), ako aj 35S-GUSÍ (gén kódujúci beta-glukuronidázu) (Vancanneyt a ďalší, Mol. Gen. Genet. 220: 245-250; 1990). Takže sa získali dva odlišné transformačné vektory obsahujúce poltrunc konštrukt: jedným bol pVDH239 s poltrunc konštruktom v rovnakej transkripčnej orientácii ako NPTII a GUS gén, a druhým bol pVDH240, v ktorom mal poltrunc konštrukt opačnú transkripčnú orientáciu. Binárne transformačné vektory pVDH239 a 240 (obrázok 2) boli konjugované a prenesené do Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Phabagen Collection, Utrect, Holandsko), čoho výsledkom boli kmene HAT1239 (pre pVDH239) a HAT1240 (pre pVDH240). HAT1239 a HAT1240 sa použili na transformáciu cukrovej repy.

- 13·· • · · 9

99

99

9 9 9

9 99

9 9

9999 99

9 9 9

99 • · ·· 9

Príklad 2

Transformácia cukrovej repy

Spôsoby Agrobacter/um-sprostredkovanej transformácie použitím binárnych vektorov sú dobre zavedené a známe priemernému odborníkovi v oblasti.

Na získanie transformovaných rastlín cukrovej repy sa transformoval O-typ B8M5.9 rastlín podľa Krensa a ďalších (Plánt Science 116: 97-106; 1996). Výsledkom transformácie s Agrobacterium HAT1239 bolo 8 transformantov: T15603, T156-06, T156-09, T156-10, T156-13, T156-20, T150-30 a T157-01, a s Agrobacterium HAT1240 sa získalo 12 transformantov: T183-01, T183-02, T18306, T183-10, T183-16, T183-19, T183-21, T183-23, T183-26, T184-02, T184-03 a T184-04. Indukovalo sa kvitnutie transformantov vernalizáciou a transformanty sa použili na produkciu semien buď prostredníctvom samoopelenia (samoopelené alebo S1 semeno), alebo krížovým opelením na samčích sterilných rastlinách (hybridné alebo F1 semeno). Opeľovanie sa uskutočňovalo v uzatvorených opeľovacích komorách, aby sa zabránilo opeleniu peľom cukrovej repy z iného zdroja.

F1 semená sa použili ako východiskový materiál na uskutočňovanie biologického testu na BNYW odolnosť. Sadenice sa najprv skrínovali z hľadiska GUS aktivity, ktorá indikuje prítomnosť T-DNA. GUS-negatívne segreganty sa použili ako negatívna kontrola v biologickom teste. V závislosti na celkovom počte T-DNA inzertov môže odolnosť, ak je prítomná, segregovať vrámci GUS-pozitívnej populácie. Len od T157-01 odvodené potomstvo vykazovalo BNYW odolnosť

Následne sa primárne transformanty T157-01 podrobnejšie analyzovali Southern blotom. Z listov sa izolovala genomická DNA, poštiepila sa oddelene s EcoRI, BamHI a Sad a použila sa na prípravu Southern blotu, ktorý sa následne analyzoval so sondou GUS. Z tohto experimentu sa odvodilo, že primárny transformant obsahoval tri T-DNA inzerty (obrázok 3).

Príklad 3 Biologický test

14• ·· • ··

Na selekciu rastlín cukrovej repy, ktoré sú odolné voči rhizománii, sa vyvinul biologicky test bočných koreňov ako jednorastlinový test. Jednotýždňové sadenice sa presadili do 10% rizomániou infikovanej pôdy a ďalej sa inkubovali 4 týždne. Podmienky infekcie sa optimalizovali a štandardizovali na úroveň infekčného tlaku a tak, aby rástli korienky (len vytváranie vlasovitých koreňov). Inkubačné podmienky boli: 18,9 až 19 °C deň/noc, 70% relatívna vlhkosť, 10000 luxov bieleho svetla, kvetináče 32,5 cm od lámp.

Množstvo vírusu v korienkoch, ktoré bolo priamo korelované s mechanizmom odolnosti v rastline, sa meralo metódou ELISA. Hraničná hodnota pre rezistentné rastliny sa udala ako hodnota OD 0,2 (Clark a ďalší, J. Virol. Meth. 15:213-222, 1987). Štyri týždne po presadení sa spodná časť koreňov použila na ELISA. Kúsky koreňov sa vysušili na filtračnom papieri a preniesli sa trecej misky. Pridal sa extrakčný tlmivý roztok v pomere 10 objemových ekvivalentov hmotnosti koreňov (riedenie 1/10). Koreňová šťava sa extrahovala ručným roztlačením. Šťava sa preniesla do 1,5ml skúmaviek a supernatanty po centrifugácii (300 ot./min., 10 minút) sa udržiavali na ľade a testovali sa. Testovanými populáciami boli:

Populácia	Počet rastlín	Poznámky
T 157-01 (F1)	73	GUS(+) jedinci
Cadyx F 052	26	citlivá kontrola
Rhizor F 202	27	tolerantná kontrola
Rifle	28	tolerantná kontrola

V rámci skupiny T157-01 GUS(+) rastlín bolo možné pozorovať dve kategórie (obrázok 4). Jedna kategória vykazuje imunitu voči BNYW (ELISA hraničná hodnota 0,2) s priemernou ELISA hodnotou 0,006, čo je úroveň pozadia experimentálneho systému. Druhá kategória vykazuje normálnu náchylnosť s priemernou ELISA hodnotou v rozsahu vnímavej kontroly.

- 15V dôsledku zvýšenia teploty počas časti infekčnej periódy bol infekčný tlak v tomto biologickom teste vysoký. Následkom toho nebol zrejmý rozdiel medzi Cadyx a Rhizor/Rifle (obrázok 4). Na druhej strane odolné rastliny vybrané v T157-01 F1 potomstve mohli byť považované za úplne odolné nezávisle na rizománia infekčnom tlaku (obrázok 4) Záverom možno zhrnúť, že výsledkom zavedenia konštruktu obsahujúceho BNYW cDNA1 fragment bol dramaticky negatívny účinok na množenie BNYW v bočných koreňoch inokulovaných transgénnych rastlinách cukrovej repy, ktorý účinne poskytuje rastlinám úplnú odolnosť voči rhizomámi.

Aby sa vysvetlila segregácia GUS(+) populácie v rezistentnej a vnímavej kategórii, analyzovali sa jednotlivé rastliny v oddelenom experimente z hľadiska odolnosti voči BNYW a zároveň z hľadiska prítomnosti T-DNAs Southern analýzou použitím Sad reštrikčného enzýmu a GUS ako sondy Výsledky, ako sú znázornené na obrázku 5A a 5B, poukazujú na to, že GUS(+) rastliny v rámci tejto populácie, ktorá obsahovala jeden pás na Southern blote, boli všetky vnímavé (priemerná ELISA hodnota 0,63), zatiaľ čo GUS(+) rastliny, ktoré obsahovali buď 2, alebo 3 pásy na Southern blote, boli všetky odolné (priemerná ELISA hodnota: 0,21). GUS(-) segreganty boli všetky vnímavé (priemerná ELISA hodnota 0,80). Zjavne je rezistentný fenotyp spojený s prítomnosťou horného a dolného pása v tomto konkrétnom vzore pásov získanom na Southern blote, zatiaľ čo prítomnosť stredného pásu nie je spojená s rezistentným fenotypom. Takže na základe vyššie uvedeného sa odvodilo, že segregácia GUS(+) populácie na vnímavú a rezistentnú kategóriu môže byť vysvetlená skutočnosťou, že jedna z T-DNA, ktoré môžu viesť ku GUS(+) fenotypu, sa nepodieľa na odolnosti voči BNYW.

Zoznam sekvencií <110> SES Európe N.V./S.A.

<120> Spôsob na poskytnutie odolnosti voči BNYW rastlinám cukrovej repy <130> seseurope4seqlist <140> PCT/EP00/00609 <141> 2000-01-26 <150> EP 992002360 <151 >1999-01-27 <160> 4 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: primer P1 <400> 1 cgcggatcca ccatggcaga ttcgttc 27 <210> 2 <211> 21 • · · · · · ·· · · • · · ···· ··· • ·· · · ·· · ·

- 17<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: primér P2 <400 2 gacgaattca agtcgtcttt c 21 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: primér P3 <400> 3 gacgaattcg aaagatgagt cta 23 <210 4 <211> 28 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: primér P4 <400> 4 cgcagatctt taactgctca tcaccaac

Claims (28)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob na poskytnutie odolnosti rastline cukrovej repy voči repnému nekrotickému žltému žilovému vírusu - BNYW, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledujúce kroky:

   a) prípravu DNA fragmentu so sekvenciou najmenej 15 nukleotidov, ktorá je najmenej na 70 % homologická so zodpovedajúcou nukleotidovou sekvenciou genomickej RNA 1 repného nekrotického žltého žilového vírusu - BNYW,

   b) zavedenie uvedeného DNA fragmentu, ktorý je operatívne spojený s promótorom, ktorý je aktívny v rastlinách cukrovej repy, do rastlinnej bunky cukrovej repy na získanie transformovanej bunky cukrovej repy; a

   c) regeneráciu transgénnej rastliny cukrovej repy z transformovanej rastlinnej bunky cukrovej repy.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že DNA fragment je najmenej na 80 %, výhodne najmenej na 90 %, výhodnejšie najmenej na 95 % homologický so zodpovedajúcou nukleotidovou sekvenciou genomickej RNA 1 uvedeného vírusu.
3. 3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že fragment má nukleokyselinovú sekvenciu, ktorá zodpovedá, s homológiou uvedenou v nárokoch 1 a 2, nukleotidom 153 až 3258 RNA 1 uvedeného vírusu.
4. 4 Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že fragment má nukleokyselinovú sekvenciu, ktorá zodpovedá, s homológiou uvedenou v nárokoch 1 a 2, nukleotidom 169 až 539 RNA 1 uvedeného vírusu.
5. 5. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že fragment má nukleokyselinovú sekvenciu, ktorá zodpovedá, s homológiou uvedenou v nárokoch 1 a 2, nukleotidom 1226 až 1683 RNA 1 uvedeného vírusu.

   -196. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že fragment má nukleokyselinovú sekvenciu, ktorá zodpovedá, s homológiou uvedenou v nárokoch 1 a 2, nukleotidom 2754 až 3192 RNA 1 uvedeného vírusu.
6. 7. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že fragment pozostáva z 6746 nukleotidov.
7. 8. Spôsob podľa nároku 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že fragment sa zavádza do bunky prostredníctvom DNA vektora nesúceho fragment a s ním operatívne spojené transkripčné a translačné regulačné sekvencie.
8. 9. Transformačný vektor na poskytnutie odolnosti voči BNYW rastline, ktorý nesie fragment s dĺžkou najmenej 15 nukleotidov v sekvencii, ktorá je najmenej na 70 % homologická so zodpovedajúcou nukleotidovou sekvenciou genomickej RNA 1 uvedeného vírusu, a s ním operatívne spojené transkripčné a translačné regulačné sekvencie.
9. 10. Vektor podľa nároku 9, v ktorom je fragment najmenej na 80 %, výhodne najmenej na 90 %, výhodnejšie najmenej na 95 % homologický so zodpovedajúcou nukleotidovou sekvenciou genomickej RNA 1 uvedeného vírusu.
10. 11. Vektor podľa nároku 9 alebo 10, v ktorom má fragment nukleokyselinovú sekvenciu, ktorá zodpovedá, s homológiou uvedenou v nárokoch 9 a 10, nukleotidom 153 až 3258 RNA 1 uvedeného vírusu.
11. 12. Vektor podľa nároku 9 alebo 10, v ktorom má fragment nukleokyselinovú sekvenciu, ktorá zodpovedá, s homológiou uvedenou v nárokoch 9 a 10, nukleotidom 169 až 539 RNA 1 uvedeného vírusu.

    ·· ·· ·· ·· ·· ···· · · · · · · · • ·· e · ·· · ·

    -20• ·· · · · · · · · ···· ·· ·· ·· ·· ···
12. 13. Vektor podľa nároku 9 alebo 10, v ktorom má fragment nukleokyselinovú sekvenciu, ktorá zodpovedá, s homológiou uvedenou v nárokoch 9 a 10, nukleotidom 1226 až 1683 RNA 1 uvedeného vírusu.
13. 14. Vektor podľa nároku 9 alebo 10, v ktorom má fragment nukleokyselinovú sekvenciu, ktorá zodpovedá, s homológiou uvedenou v nárokoch 9 a 10, nukleotidom 2754 až 3192 RNA 1 uvedeného vírusu.
14. 15. Vektor podľa nároku 9 alebo 10, v ktorom fragment pozostáva z 6746 nukleotidov.
15. 16. Použitie vektora podľa nárokov 9 až 15 na transformáciu rastlinnej bunky.
16. 17. Rastlinná bunka vykazujúca odolnosť voči BNYW, ktorá obsahuje vo svojom genóme DNA fragment s dĺžkou najmenej 15 nukleotidov v sekvencií, ktorá je najmenej na 70 % homologická so zodpovedajúcou nukleotidovou sekvenciou genomickej RNA 1 uvedeného vírusu.
17. 18. Rastlinná bunka podľa nároku 17, pričom fragment je najmenej na 80 %, výhodne najmenej na 90 %, výhodnejšie najmenej na 95 % homologický so zodpovedajúcou nukleotidovou sekvenciou genomickej RNA 1 uvedeného vírusu.
18. 19. Rastlinná bunka podľa nároku 17 alebo 18, pričom fragment má nukleokyselinovú sekvenciu, ktorá zodpovedá, s homológiou uvedenou v nárokoch 17 a 18, nukleotidom 153 až 3258 RNA 1 uvedeného vírusu.
19. 20. Rastlinná bunka podľa nároku 17 alebo 18, pričom fragment má nukleokyselinovú sekvenciu, ktorá zodpovedá, s homológiou uvedenou v nárokoch 17 a 18, nukleotidom 169 až 539 RNA 1 uvedeného vírusu.

    -21 • · · · > · · I > · ··
20. 21. Rastlinná bunka podľa nároku 17 alebo 18, pričom fragment má nukleokyselinovú sekvenciu, ktorá zodpovedá, s homológiou uvedenou v nárokoch 17 a 18, nukleotidom 1226 až 1683 RNA 1 uvedeného vírusu.
21. 22. Rastlinná bunka podľa nároku 17 alebo 18, pričom fragment má nukleokyselinovú sekvenciu, ktorá zodpovedá, s homológiou uvedenou v nárokoch 17 a 18, nukleotidom 2754 až 3192 RNA 1 uvedeného vírusu.
22. 23. Rastlinná bunka podľa nároku 17 alebo 18, pričom fragment pozostáva z 6746 nukleotidov.
23. 24. Rastlinná bunka podľa nárokov 17 až 23, ktorá je časťou rastliny cukrovej repy, ktorá je odolná voči BNYW.
24. 25. Použitie rastlinnej bunky podľa nárokov 17 až 23 na regeneráciu rastliny cukrovej repy, ktorá je odolná voči BNYW.
25. 26. Rastlina cukrovej repy vykazujúca odolnosť voči BNYW, ktorá pozostáva aspoň čiastočne z rastlinných buniek podľa nárokov 17 až 23.
26. 27. Potomstvo rastliny cukrovej repy podľa nároku 26.
27. 28. Semená rastliny cukrovej repy podľa nároku 26.
28. 29. Vegetatívne rozmnožovateľné štruktúry, ako kalusy, puky, embryá, z rastliny podľa nároku 26 alebo potomstva podľa nároku 27.