KR100406666B1 - 토마토점무늬시들음병바이러스 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 토마토 점무늬 시들음병 바이러스(TSW) 뉴클레오캡시드의 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 또한, 본 발명은 TSWV 단리물로부터 얻은 뉴클레오캡시드 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물이 상이한 세로그룹으로부터 유래된 토스포바이러스에 대해 내성을 제공한다는 것에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 TSWV의 양상치 단리물로부터 얻은 뉴클레오캡시드 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물을 생산하고, (소량의 뉴클레오캡시드 단백질을 생산하는 식물에서) 상동성인 바이러스 단리물 및 밀접한 관련이 있는 바이러스 단리물에 대해 내성을 제공하는 반면, 다량의 뉴클레오캡시드 단백질을 생산하는 식물은 상동성 단리물 및 거의 관련이 없는 봉선화 회사 점무의 바이러스(INSV)의 단리물들에 대해 중간 수준의 보호를 제공한다.
Description
토스포바이러스(Tospovirus)속에 속하는 바이러스는 폭넓고 다양한 종의 식물들, 특히 담배 나무, 낙화생, 채소 및 관상용 식물을 감염시킨다. 두 종류의 바이러스, 즉 토마토 점무늬 시들음병 바이러스(tomato spotted wilt virus: TSWV) 및 봉선화 회사 점무늬 바이러스(impatiens necrotic spot virus: INSV)가 토스포바이러스속에 속하는 것으로 알려져 있다.
토마토 점무늬 시들음병 바이러스(TSWV)는 핵산-단백질 복합체가 지방단백질 엔벨로프로 덮혀있고 유일하게 삽주 벌레에 의해 전달되는 바이러스라는 점에서 식물 바이러스 중에서도 독특하다. 최근, 이 바이러스는 부니아비리다에(Bunyaviridae)과의 토스포바이러스속으로 분류되었다. TSWV 비리온은 1개의 29K 뉴클레오캡시드 단백질 ("NP" 또는 "N"), 두개의 멤브레인에 결합된 당단백질(58K 및 78K) 및 1개의 큰 200K 단백질(바이러스의 전사 효소라고 추정됨) [참조 : J. Gen. Virol. 71:2207 (1991); Virol. 56:12(1973); 및 J. Gen. Virol 36:267(1977)]을 포함한다. 바이러스 게놈은 각각 NP로 캡슐화되어 있는 L RNA(8900개의 뉴클레오티드), M RNA(5400개의 뉴클레오티드) 및 S RNA(2900개의 뉴클레오티드)로 표시되는 세개의 네가티브 스트랜드 (-) RNA로 구성된다.[참조 : J. Gen. Virol. 36:81(1977); J. Gen. Virol. 53:12(1981); 및 J. Gen. Virol. 70:3469(1989)] 세개의 TSWV 단리물로부터 유래된 S RNA의 부분 또는 완전 길이 서열은 앰비센스(ambisense) 유전자 배열을 갖는 두개의 전사 해독 프레임(Open Reading Frame)이 존재하는 것으로 드러났다. [J. Gen Virol. 71:1(1990) 및 J. Gen. Virol. 72:461(1991)] 큰 전사 해독 프레임이 바이러스의 RNA 스트랜드 상에 존재하고, 52K 비구조 단백질을 코딩하는 능력을 갖는다. 작은 ORF는 바이러스의 상보적 RNA 스트랜드 상에 존재하고, 서브게놈 RNA를 통해 29K NP로 번역된다.
또한, 앰비센스 코딩 방법은 TSWV M RNA의 특징으로서, 전사 해독 프레임이 58K 및 78K의 멤브레인 결합 당단백질을 코딩한다. TSWV L RNA는 바이러스의 전사 효소를 위한 것이라고 추정되는 큰 200K 단백질을 코딩하는 것으로 서열이 판독되었다.
두개의 TSWV 세로그룹(serogroup), 즉 "L" 및 "l"가 구조 단백질의 혈청학적 분석 및 세포 변성 구조의 형태학을 토대로 하여 확인 및 특성화되었다. [참조 : J. Gen. Virol. 71:933(1990) 및 Phytopathology 81:525(1991)] 이들은 혈청학적으로 보존된 G1 및 G2 당단백질을 가지고 있지만, "l" 세로그룹의 NP는 "L" 세로그룹의 NP와는 혈청학적으로 다르다 "L"과 "l" 세로그룹의 NP를 비교한 결과, 뉴클레오티드 수준에서 62%, 아미노산 수준에서 67%가 동일한 것으로 나타났다.[참조 : J. Gen. Virol. 72:2597(1991)]
TSWV는 50개 과의 360종 이상의 식물을 감염시키는 넓은 숙주 범위를 가지므로, 전세계적으로 채소 및 관상용 식물에 대해 상당한 경제적 손실을 야기시킨다. "L" 세로그룹은 채소 및 잡초와 같은 밭작물에서 광범위하게 발견되는 반면, "l" 세로그룹은 주로 관상용 작물에 제한되어 있다. 최근 들어, 어떤 호리병박 단리물이, 수박 및 다른 호리병박을 전신 감염시키는데 그의 NP가 이 두 세로그룹의 NP와 혈청학적으로 관련이 없기 때문에, 독특한 단리물인 것으로 확인되었다.[참조 : Plant Disease 68:1006(1984)] 내성 식물을 번식시키거나 또는 비유전적 방법을 이용함으로써도 TSWV 질병의 확산이 이따금 감소될 수 있지만, 일반적으로, 이와 같은 종래 방법에 의해서는 상기 질병을 완전히 억제하기가 어렵다는 것이 입증되었다.[참조 : Plant Disease 73:375(1989)]
1986년 이후, 바이러스의 코트 단백질(coat protein) 유전자를 갖는 트랜스제닉(transgenic) 식물이 TSWV에 의한 감염에 대해 내성을 갖는 경우가 있다는 수많은 보고서에 발표되었다. 이러한 현상을 통상 코트 단백질 매개 보호(CPMP)라고 부른다. 보호의 정도는 증상 발현의 지연에서부터 질병 증상 및 바이러스 축적의 부재에까지 미친다. 최근, 별개의 두 보고서[참조 : Biol. Technology 9:1363(1991) 및 Mol. Plant. Microbe Interact. 5:34(1992)]에서는 TSWV의 뉴클레오캡시드 단백질(NP) 유전자를 발현하는 트랜스제닉 담배 식물이 상동성 단리물에 의한 감염에 대해 내성이 있는 것으로 보고되었다. 그러나, TSWV는 생물학적으로 다양한 많은 단리물로 퍼져 있기 때문에, 트랜스제닉 식물이 다른 TSWV 단리물들에 의한 감염에 대해 내성 효과가 있는지를 시험하는 것이 매우 중요하다. 본 발명자들은 본 발명에 따른 트랜스제닉 식물이 "L" 세로그룹의 두개의 이형성 단리물 및 "l" 세로그룹의 한개의 단리물에 대해 내성을 갖는다는 것을 입증함으로써 종전의 보고서에 기재된 보고 내용보다 더 발전시켰다. 또한, 본 발명자들은 "L" 세로그룹의 두개의 이형성 단리물에 대한 내성은 (만일 축적한다면) 매우 낮은 수준의 NP를축적하는 식물에서 주로 발견되는 반면, "l" 세로그룹의 단리물에 대한 내성은 높은 수준의 NP를 축적하는 식물에서 발견된다는 것을 알았다.
그러나, 높은 수준의 N 단백질을 축적하는 식물들이 증상 발현을 지연시키긴 하지만, 브라질리안(Brazilian) 단리물에 대해서는 내성을 갖지 않는 것으로 관찰되었다. 브라질리안 단리를(TSWV-B)은 "L" 및 "l" 세로그룹과는 혈청학적으로 다른 N 단백질을 갖고, 또한 TSWV-B가 메론 또는 호박류를 전신 감염시키지 않는다는 점에서 호리병박 단리물과는 생물학적으로 다르다. 따라서, 본 발명의 한 특징은 TSWV-B의 S RNA를 클로닝 및 서열 결정하고, 다른 TSWV 단리물의 공지 서열과 비교함으로써 TSWV-B의 특성을 결정하는 것이다.
본 발명의 여러가지 다른 특징은 하기 실시예, 도면 및 데이타를 포함하여 본 발명의 상세한 설명으로부터 쉽게 명백해질 것이다.
제1도는 본 발명에 따라 바이러스의 RNA로부터 NP 유전자를 클로닝하는 방법을 나타낸다.
제2도는 담배 나무 원형질체에서 본 발명에 따라 토마토 점무늬 시들음병 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질(NP) 유전자의 생체내 일시(transient) 발현을 나타낸다.
제3도는 본 발명에 따른 TSWV-B S RNA에서 서열화된 cDNA 클론의 위치를 나타낸다.
제4도는 본 발명에 따른 TSWV 단리물들 간의 관계를 보여주는 계통수를 나타낸다.
제5도는 본 명세서에 기재된 TSWV 단리물의 혈청학적 관계를 나타낸다.
제6도는 트렌스제닉 식물 중의 뉴틀레오캡시드 단백질(NP) 축적 수준과 TSWV 단리물에 대한 내성 정도 사이의 관계를 나타낸다.
제7도는 본 발명의 한 특징에 따른 트랜스제닉 식물에 도입된 TSWV-BL N코딩 서열을 나타낸다.
제8도는 본 발명의 한 특징에 따른 식물에 도입된 TSWV-BL 하프(half) N 유전자 단편을 나타낸다.
더 구체적으로 말하자면, 제2도는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 이용하여 담배나무 엽육(mesophyⅡ) 원형질체 내로 작제물을 옮겨 넣은 NP 유전자의 일시 발현을 나타낸다. 이어서, 형질전환된 원형질체를 NP 유전자 발현을 위해 2일 동안 배양시켰다. 원형질체로부터 단백질을 추출하고, TSWV NP에 대한 항체를 사용하여 이중 항체 샌드위치 효소 면역 흡착 분석법(DAS-ELISA)에 의해 NP에 대해 시험하였다. NP-및 NP+는 각각 플라스미드 pB1525-NP-및 pB1525-NP+로 형질전환된 원형질체를 나타낸다. 코팅을 위한 항체의 농도는 5 μg/ml이고, 효소 복합체의 희석률은 1:250이다. 기질 첨가 후 30분, 60분 및 90분 경과시에 데이타를 기록하였다.
제3도는 중첩하는 5개의 cDNA 클론을 TSWV-B의 S RNA 지도 밑에 일정한 비율로 나타낸 것이다. 이 클론들은 TSWV-B로 감염된 엔. 벤타미아나(N. Benthamiana) 식물로부터 단리된 이중 스트랜드 RNA로부터 랜덤 프라이머를 사용하여 합성하였다.
제4도는 GCG 시퀀스 분석 소프트웨어 패키지의 파일업 프로그램을 이용하여 서열을 비교한 것을 나타낸 것이다. 수평선은 유전적 거리에 비례하는 것이지만, 수직선은 전혀 의미가 없는 것으로서 그 길이도 임의적인 것이다.
더 구체적으로 말하자면, 제5도에서, 엔. 벤타미아나 도민(N. Benthamiana Domin)을 TSWV 단리물[TSWV-BL (양상치 단리물), 아르칸사스(Arkansas), 10W 팩코이(TSWV-10W), 베고니아 및 브라질(TSWV-B)]로 감염시켰다. 감염된 잎 디스크(0.05g)을 12ml의 효소 복합체 완충제 중에서 분쇄하고, TSWV-BL 비리온(BL 비리온), 또는 TSWV-BL의 NP(BL-NP), 또는 TSWV-I의 NP(I-NP)에 대한 항체를 사용하여 DAS-ELISA에 의해 분석하였다. 코팅을 위한 항체의 농도는 1 μg/ml이고, 복합체의 희석률은 BL 비리온의 경우에는 1:2000, BL-NP의 경우에는 1:250, I-NP의 경우에는 1:1000이다. 기질 첨가 후, BL의 경우에는 10분 경과시, BL-NP의 경우에는 50분 경과시, I-NP 경우에는 30분 경과시에 데이타를 측정하였다.
제6도에 있어서, TSWV-BL의 NP에 대한 항체를 이용하여 NP 축적에 대해 DAS-ELISA로 트랜스제닉 식물을 분석하였다. 식물들은 기질 첨가 후 150분 경과시에 관찰하고, 트랜스제닉 식물들을 4개의 그룹으로 분류하였다: OD405nm가 0.050 미만, OD405nm가 0.050 내지 0.200, OD405nm가 0.200 내지 0.400, OD405nm가 0.400 초과, 대조 NP(-) 식물의 OD405nm값은 0 내지 0.05이었다. 동일 식물을 아르칸사스(Ark) 및 10W 팩코이(10W) 단리물로 처리하거나 또는 베고니아 단리물로 감염시키고, 각 식물의 감염성을 접종 후 약 12일 경과시에 기록하였다. 그 결과를 아르칸사스 및 10W 팩코이 단리물로 접종된 51개의 R1NP(+) 식물 및 베고니아 단리물로 접종된 130개의 R1NP(+) 식물로부터 모았다. 막대 위에 있는 수치는 시험된 R1NP(+) 식물의 총 갯수를 나타낸다.
실시예 I
TSWV-BL RNA의 단리
다투라 스트라모니움 엘(Datura stramonium L.)로부터 TSWV-BL 단리물을 다음과 같이 정제하였다: 감염된 조직을 워링 블렌더 중에서 3 부피의 완충제(0.033M KH2PO4, 0.067M K2HPO4, 0.01M Na2SO3)와 함께 45초 동안 분쇄시켰다. 상기 완충제로 습윤화시킨 4 층의 치즈클로드(cheesecloth)를 통해 균질물을 여과하고, 7,000rpm으로 15분 동안 원심분리시켰다. 펠릿을 조직의 원래 중량과 동일한 양의 0.01M Na2SO3중에 재현탁시키고, 8,000rpm으로 15분동안 원심분리시켰다. 이어서, 상등액을 원래의 조직 중량의 1/10과 동일한 양의 0.01M Na2SO3중에 재현탁시켰다. 바이러스 추출물을 9,000rpm으로 15분 동안 원심분리시키고, 상등액을 0.01M Na2SO3중에 단계적 구배로 조제한 10-40% 수크로스 위에 조심스럽게 로딩하였다. 23,000rpm으로 35분 동안 원심분리시킨 후, 바이러스 대역(메니스커스 밑 약 3cm 지점의 영역)을 모으고, 2배 부피의 0.01M Na2SO3으로 희석시켰다. 반정제된(semi-purified) 바이러스를 27,000rpm으로 55분동안 펠릿화시켰다.
실시예 Ⅱ
TSWV 및 바이러스 RNA의 정제
실시예 I에 기재된 바와 같이 다투라 스트라모니움 엘(Datura stramonium L.)로부터 TSWV-BL 단리물[참조 : Plant Disease 74:154(1990)]을 정제하였다. 정제된 바이러스를 0.04%의 벤토나이트, 10μg/ml의 프로테인아제 K, 0.1M 탄산암모늄, 0.1%(w/v)의 디에틸디티오카르반산나트륨, 1mM EDTA 및 1%(w/v)의 도데실황산나트륨(SDS)의 용액 중에 재현탁시키고, 65℃에서 5분 동안 배양시키고, 즉시 H2O로 포화된 페놀로부터 추출시킨 후, 다시 클로로포름/이소아밀 알콜(24:1)로 추출시켰다. 바이러스 RNA를 2.5배 부피의 에탄올 중에서 침전시키고, 증류된 H2O 중에 용해시켰다.
실시예 Ⅲ
cDNA 및 PCR을 이용한 NP 유전자 클로닝
거블러(Gubler) 및 호프만(Hoffman)[참조 : Gene 25:263(1983)]에 의해 기재된 방법에 따라 랜덤 프라이머를 사용하여 정제된 TSWV-BL RNA로부터 제1 스트랜드 cDNA를 합성하였다. 이 샘플을 RNase H/DNA 폴리머라제로 처리하여 제2 스트랜드를 제조하였다. 얻어진 이중 스트랜드 cDNA 샘플을 수크로스 구배 원심분리법에 의해 크기를 분류하고, EcoRI 메틸라제에 의해 메틸화시키고, EcoRI 링커를 첨가하였다. EcoRI로 절단시킨 후, cDNA 샘플을 소의 장 알칼리성 포스포타제로 처리하여 5'-말단 포스페이트기를 제거시킨 pUC18의 EcoRI 부위에 라이게이션시켰다. E. coli DH5 α컴피턴트(competent) 세포(Bethesda Research Laboratories)를 형질전환시키고,50 μg/ml의 암피실린, IPTG 및 X-gal을 함유하는 아가 플레이트 상에 플레이팅시킴으로써 TSWV cDNA 삽입물을 포함하는 클론을 먼저 선별하였다. 선별된 클론으로부터 플라스미드 DNA를 알칼리성 용해법[참조 : BRL Focus 11:7 (1989)]을 이용하여 단리시키고, EcoRI 제한 효소 절단 및 이어서 진스크린 플러스 나일론 필터(GeneScreen Plus nylon filter; Du Pont 제품) 상으로의 DNA 전달에 의해 삽입물 크기를 결정하였다. TSWV-BL S RNA cDNA 삽입물을 포함하는 플라스미드 클론을 TSWV-CPNH1 S RNA[참조 : J. Gen. Virol. 71:001(1990)]
로써 하기하는 바와 같이 확인하였다. 수개의 클론을 확인하고, 아가로스 겔 상에서 분석하여 삽입물 크기를 결정하였다. 클론 pTSWVS-23이 가장 큰 cDNA 삽입물(길이: 약 1.7kb)를 포함하는 것으로 밝혀졌다.
폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 완전 길이의 NP 유전자를 얻었다. 제 1 스트랜드 cDNA 합성은 TSWV NP 유전자의 5' 말단의 S RNA(TSWV-CPNH1의 뉴클레오티드 위치 2751 내지 2773)에 대해 상보적인 올리고머 프라이머(JLS
뉴클레오캡시드 유전자를 합성하는데도 사용됨)를 사용하여 20μl 반응 혼합물 중에서 37℃에서 30분동안 수행하였다. 반응 혼합물은 1.5 μg의 바이러스 RNA, 1 μg의 올리고머 프라이머, 0.2 mM의 각 dNPT, 1XPCR 완충제(the GeneAmp Kit; Perkin-Elmer-Cetus), 리보뉴클레아제 억제제(Promega) 중의 20U의 RNA, 2.5 mM의MgCl2및 25U의 AMV 역전사효소(Promega Corporation)를 함유하였다. 95℃에서 5분동안 가열시킴으로써 반응을 종결시키고, 얼음 위에서 냉각시켰다. 이어서, 10 μl의 cDNA/RNA 하이브리드를, 올리고머 프라이머 JLS90-46 및 JLS90-47
레오티드 유전자를 합성하는데도 사용됨)을 각각 1 μg씩 사용하여 제조업자의 지시(Perkin-Elmer-Cetus)에 따라서 NP 유전자를 PCR 증폭시키는데 사용하였다. 후자의 올리고머는 그 유전자의 3' 비코딩 영역의 S RNA(TSWV-CPNH1의 뉴클레오티드 위치 1919 내지 1938)와 동일하다. 대표적인 PCR 사이클은 92 ℃(변성 단계)에서 1 분, 50 ℃(어닐링 단계)에서 1분, 72 ℃(중합 단계)에서 2분이었다. 샘플을 직접 1.2% 아가로스 겔 위에 로딩시켜 분리시켰다. 분리된 NP 유전자 단편을 아가 로스 겔로부터 추출시키고, 에탄올로 침전시키고, 20 μl의 증류된 H2O 중에 용해시켰다.
실시예 IV
식물 발현 및 형질 전환 백터의 제작
실시예Ⅲ으로부터 겔에 의해 단리된 NP 유전자 단편을 37 ℃에서 3시간 동안 반응 완충제[50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM MgCl2, 0.1 M NaCl] 50 μl 중에서 제한 효소 NcoI로 절단시키고, NcoI에 의해 절단된 식물 발현 벡터 pB1525 내로 직접 클로닝시켰다. 얻어진 플라스미드를 확인하고 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터를 기준으로 하여 센스 방향을 pB1525-NP+로 표시하고, 그 반대 방향을 pB1525-NP-로 표시하였다. 이 발현 카세트가 NP를 생산할 수 있는 능력은 팡(Pang) 등의 문헌[참조 : Gene 112:229(1992)]에 기재된 바와 같이 니코티아나 토바쿰(Nicotiana tobacum) 원형질체 중에서 NP 유전자의 일시적 발현에 의해 결정되었다. 이어서, NP 유전자를 포함하는 발현 카세트를 (NP 유전자가 HindⅢ 및 EcoRI 부위를 포함하고 있기 때문에) HindⅢ/EcoRI을 이용한 부분 절단에 의해 pB1525-NP+로부터 잘라내고, 동일 효소에 의해 절단된 식물 형질전환 벡터 pBIN19(Clontech Laboratories, Inc.)내로 라이게이션시켰다. 얻어진 벡터 pBIN19-NP+및 대조 플라스미드 pBIN19를 홀스터(Holsters) 등의 문헌[참조 : Mol. Gen. Genet. 163:181(1978)]에 기재된 방법을 이용하여 에이. 투메파시엔스(A. Tumefaciens) 균주 LBA4404에 옮겨넣었다.
클론 pTSWV-23 및 Pb1525-NP+중의 삽입물의 뉴클레오티드 서열 분석은 디데옥시리보뉴클레오티드법, T7 폴리머라제(U.S. Biochemicals, SequenaseTM), 및 시에미에니아크(Siemieniak) 등의 문헌[참조 : Analyt. Biochem. 192:441(1991)]에 기재된 이중 스트랜드 서열화법을 이용하여 수행하였다. 2개의 DNA 스트랜드로부터 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 이 정보를 컴퓨터 프로그램(Genetics Computer Group(GCG; 미합중국 위스콘신주 매디슨 소재)으로부터 입수가능함)을 이용하여 TSWV 단리물 CPNH1의 공지 서열과 비교하였다.
담배 나무 원형질체 중의 NP 유전자의 일시적 발현체도 제조하였다. 클론pTSWVS-23 및 pUC18cpphas TSWV-NP (PCR에 의해 엔지니어링된 NP 유전자 삽입물을 포함함)을 위한 플라스미드 DNA를 대규모 알칼리성 방법을 이용하여 단리시켰다. 서열화를 위해 입수가능한 플랭킹 올리고머 프라이머를 이용하기 위하여 PCR에 의해 엔지니어링된 NP 유전자 삽입물을 클론 pBIS25-NP+로부터 NcoI 절단에 의해 잘라내었다. 발현 카세트 pUC18cpphas는 파세올러스 불가리스(Phaseouls vulgaris) 종자 저장 유전자 파세올린으로부터 유래된 폴리(A) 부가 신호를 이용한다는 것을 제외하고는 pUC18cpexp와 유사하다. 이 플라스미드 DNA에 대해 베크만(Beckman) Ti 70.1 고정각 회전자를 이용하여 2회의 CsCl-에티듐 브로마이드 구배 밴딩(banding)을 수행하였다. 디데옥시리보뉴클레오티드 및 상기한 바와 같은 이중 스트랜드 플라스미드 DNA 서열화법을 이용하여 DNA 서열을 얻었다. 뉴클레오티드 서열 반응물을 1m 길이의 항온 (55 ℃) 서열화 겔 위에서 전기 영동시키고, 평균 약 750bp의 뉴클레오티드 서열을 얻었다. 정확성을 기하기 위하여, 두개의 클로닝된 삽입물의 두개의 DNA 스트랜드로부터 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. TSWV-BL S RNA 단리물로부터 얻은 뉴클레오티드 서열 정보를 하기하는 바와 같이 컴퓨터 프로그램(GCG, 미합중국 위스콘신주 매디슨 소재)을 이용하여 TSWV 단리물 CPNH1 및 L3과 비교하였다.
TSWV-BL S RNA의 클로닝된 cDNA 및 PCR에 의해 엔지니어링된 삽입물의 뉴클레오티드 및 추정되는 아미노산 서열, 및 그와 TSWV-CPHN1 S RNA의 뉴클레오티드 서열과의 비교를 후술한다. 시에미에니아크의 이중 스트랜드 디데옥시뉴클레오티드서열화법을 이용하여 TSWV-BL S RNA 클론 pTSWVS-23(TSWV-23) 및 pB1525-NP+(TSWV-PCR)의 뉴클레오티드 서열을 얻고, 이 서열을 유전자 은행 (GeneBank) 수탁번호 D00645로 보고된 TSWV-CPNH1 S RNA의 뉴클레오티드 서열의 관련 영역과 비교하였다. TSWV-CPNH1 S RNA의 뉴클레오티드 서열은 드 한 (De Haan, 1990)에 의해 보고되었고, 다음 서열로 나타내어진다.
위치 1의 핵산부터 시작하여 위치 783의 핵산 코돈 종지부에서 끝나는 TSWV-CPNH1 S RNA에 대한 비구조적 단백질 유전자의 불완전한 추정 아미노산 서열은 다음과 같다.
하기 TSWV-23의 뉴클레오티드 서열을 상기 TSWV 서열과 자세히 비교한 결과,비구조적 유전자의 1/2 및 뉴클레오캡시드 단백질 유전자의 1/2을 포함한다는 것을 알 수 있다.
또한, 하기하는 바와 같은 본 발명의 TSWV-PCR의 핵산 서열을 상기 TSWV 서열과 자세히 비교하고, 전체 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 포함한다.
종합해보면, 클로닝된 TSWV-23 삽입물은 TSWV-PCR 삽입물과 중첩되고, 종합해보면 이들은 본 발명에 따른 TSWV-BL S RNA의 2028개의 뉴클레오티드를 가진다. 본 발명에 따른 2028개의 뉴클레오티드 서열은 비구조적 유전자의 일부 및 전체 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 포함한다. 조합한 서열은 다음과 같다:
이 비교로부터, 클론 pTSWVS-23의 cDNA 삽입물은 52K 단백질 바이러스 성분 유전자(약 760bp), 완전한 인터제닉(intergenic) 영역 (492 bp) 및 NP 유전자(450 bp; NP 유전자의 약 절반에 해당함)를 포함한다는 것을 알 수 있다. 이 클로닝된 삽입물은 그의 3' 말단이 정확하게 EcoRI 인지 부위에 위치하는데, 이것은 cDNA 클로닝 과정 동안에 불완전한 EcoRI 메틸화가 일어났다는 것을 암시한다. 이 클론은 완전한 TSWV-BL NP 유전자를 포함하지는 않지만, 450 bp가 PCR에 의해 엔지니어링된 NP 유전자의 서열과 중첩되기 때문에 상당히 중요하였다.(TSWV-BL S RNA의 총 2028 bp가 TSWV를 위한 뉴클레오티드 서열에 제공된다) TSWV-BL PCR에 의해 엔지니어링된 NP 유전자와 TSWV-CPNH1 NP 유전자의 서열을 비교한 결과, 총 21개(27%)의뉴클레오티드가 상이하고, 그 중 8개(3.1%)는 대체된 아미노산을 코딩한다. 이 PCR에 의해 엔지니어링된 NP 유전자가 돌연변이를 도입시키는 것으로 알려진 Taq 폴리머라제를 이용하여 얻어졌기 때문에, 이러한 차이 중 일부는 PCR 증폭 동안에 도입될 수가 있다. 그러나, 이들 상이한 뉴클레오티드 중의 15개는 TSWV-BL cDNA와 PCR 클론의 중첩 영역 내에 위치하고, 이들 상이한 뉴클레오티드 중의 1개(TSWV의 위치 1702; TSWV-PCR의 위치 485)를 제외한 전부는 두개의 TSWV-BL S RNA 유래 클론에 의해 공유된다. 이러한 비교로부터, PCR 증폭이 두개의 클로닝된 NP 유전자 영역의 뉴클레오티드 서열간의 차이 발생에 (기여했다 하더라도) 크게 기여하지는 않았다는 것을 명백히 알 수 있다. 위치 1702에서의 뉴클레오티드 차이 때문에, 아미노산이 Ile에서 Ser로 대체되고, 심지어 이러한 차이는 TSWV-BL 단리물 내부의 균질성의 결여에 기인할 수 있다.
실시예 V
아그로박테리움(Agrobacterium) 매개 형질 전환
니코티아나 타바쿰 바르 하바나 씨브이(Nicotiana tabacum var Havana cv)423의 잎 디스크를 벡터 pBIN19-NP+또는 대조 플라스미드 pBIN19를 함유하는 아그로박테리움 균주 LBA4404(ClonTech)의 액상 배양물 중에 철야 침지시킴으로써 아그로박테리움으로 접종시키고, 접종된 잎 디스크를 비선택성 MS 배지에서 3일동안 배양시켰다.[참조 : Science 227:1229(1985)] 형질전환된 세포를 선택하고, 새싹 재생을 위하여 300 μg/ml 카나마아신 및 500 μg/ml 카르베니실린을 함유하는 MS배지 중에서 재생시켰다. 묘목을 호르몬이 없는 배지로 옮긴 후 뿌리를 유발시켰다. 뿌리를 내린 형질전환체를 토양으로 옮기고, 온실 조건 하에서 성장시켰다. MS 배지는 충분한 강도의 MS 염(Sigma), 30g/l 수크로스, 1mg/l BA 및 1 ml의 B5비타민[1 mg/ml 니코틴산, 10 mg/ml 티아민(HCl), 1mg/ml 피리독신(HCl), 100mg/ml 미오-이노시톨]을 함유한다. 트랜스제닉 식물은 자기 수분되고, 종자는 카나마이신 배지 위에서 선택적으로 발아하였다.
실시예 VI
단백질의 혈청학적 검사
이중 항체 샌드위치 효소 면역 흡착 분석법(DAS-ELISA)를 이용하여 TSWV-BL NP에 대한 다클론 항체로 트랜스제닉 식물 중의 NP 유전자의 발현을 관찰하였다. 각 샘플은 식물의 상부 제2엽으로부터 얻은 잎 디스크(약 0.05 g)를 3 ml의 효소 복합체 완충제[포스페이트 완충 염수, 0.05% Tween 20, 2% 폴리비닐피롤리돈 40, 및 0.2% 오브알부민] 중에서 분쇄시켜서 제조하였다. 담배 나무 원형질체의 경우, 원심 분리 후 세포 추출물을 분석용으로 직접 사용하였다. 2개의 트랜스제닉 식물 및 담배 나무 원형질체로부터 얻은 샘플을 DAS-ELISA 직전에 10배 및 3배 희석하였다.
웨스턴 블롯을 위해, 잎 디스크(약 0.05g)를 0.25ml의 2xSDS/샘플 완충제(0.126M Tris 완충제, 20% 글리세롤, 2% SDS, 2% 2-메르캅토에탄올, 및 0.01 mg/ml 브롬페놀 블루) 중에서 분쇄시켰다. 균질물을 원심분리시키고, 상등액을 끓인 후 로딩하였다. 단백질(10-20 μl 샘플/레인)을 분리시키고, 멤브레인 상에 블롯팅시켰다. 이어서, 멤브레인을 제조자의 면역 선택 키트 지시 매뉴얼(Gibco BRL Life Technologies Inc.)에 따라서 처리하였다. 전체 비리온에 대한 항체를 건강한 담배 나무 식물[참조 : Plant Disease 70:501(1986)]로부터 얻은 세포 추출물로 미리 흡착시키고, 2μg/ml 농도로 웨스턴 블롯에 사용하였다.
TSWV 단리물(TSWV-BL, 아르칸사스, 10W 팩코이, 베고니아 또는 브라질)의 혈청학적 반응을 TSWV-BL 비리온, 또는 TSWV-BL 또는 TSWV-I의 NP에 대한 항체를 사용하여 DAS-ELISA로 분석하였다.
실시예 VⅡ
트랜스제닉 식물에 대한 TSWV 단리물 접종
니코티아나 벤타미아나 도민(Nicotiana bethamiana Domin)을 여러가지 TSWV 단리물로 감염시키고, 엔. 벤타미아나 식물의 감염된 잎을 (접종 후 1 내지 2주 경과시) 완충제(0.033M KH2PO4, 0.067M K2HPO4및 0.01M Na2SO3) 15ml 중에서 분쇄시켰다. 접종 추출물을 트랜스제닉 식물의 코런덤 가루가 뿌려진 잎 위에서 즉시 러빙시키고, 이어서 접종된 잎을 H2O로 세척하였다. TSWV는 분쇄 후 시험관내에서 매우 불안정하기 때문에, 접종물의 각 배취를 사용하여 NP 유전자를 포함하는 NP(+) 식물을 먼저 접종시키고, 특정 바이러스 접종물이 접종 종료시에도 여전히 감염성이 있다는 것을 보장하기 위하여, 각 접종물의 마지막으로 접종되는 식물은 항상 벡터 서열만을 함유하는 대조 NP(-) 식물이었다.
접종 후 7 내지 15일 경과시 국부 병변 및 전신 감염에 대한 데이타를 기록하고, 하기 표에 접종된 식물의 수에 대한 전신 감염된 식물의 수로서 나타내었다(표시가 있는 곳은 제외함). 이 표에서, "ELISA" 밑에 있는 데이타는 R1식물이 유래된 R0주에 대한 데이타이고, 베고니아는 R1식물에 대해 국부 병변을 유발시키고, 내성은 접종된 식물의 수에 대한 국부 병변이 생긴 식물의 수로서 나타내고, NT는 시험하지 않았음을 나타낸다.
상기한 바와 같이, TSWV의 S RNA 성분에 존재하는 TSWV-BL NP 유전자의 단리는 두가지 방법에 의해 수행되었다. cDNA 클로닝 방법은 TSWV-CPNH1 S RNA에 대한 상보적인 올리고머 프로브에 대한 혼성화에 의해 확인되는 바와 같이, TSWV-BL S RNA로부터 유래된 cDNA 삽입물을 포함하는 수개의 클론을 생산하였다. 클론 pTSWVS 23은 약 1.7kb 길이의 가장 긴 삽입물을 함유하였다. 두번째 방법은 TSWV-CPNH1 S RNA의 공지 서열 및 PCR을 이용하여 전체 TSWV-BL RNA로부터 직접 발현을 위한 NP 유전자를 증폭 및 엔지니어링하였다. 올리고머 프라이머 JLS90-46 및 -47을 합성하였다. JLS90-46은 NP 유전자의 5' 코딩 영역의 S RNA(TSWV-CPNH1의 위치 2051-2037)와 상보적이고, JLS90-47은 NP 유전자의 3' 비코딩 영역이다(TSWV-CPNH1의 위치 1218 내지 1237). 2개의 프라이머는 후속 클로닝을 위한 제한 효소 NcoI의 인지 부위를 포함하고, 프라이머 JLS90-46은 식물 컨센서스(consensus) 번역 개시 코든 서열(AAXXATGG)을 가지고 있으며, 이것은 증폭시 번역 개시 코돈을 NP 유전자의 제3 코돈(GTT)에 융합시키리라고 예상되었다. 번역 개시 코돈과 TSWV-BL NP 유전자의 3번째 코돈과의 융합은 아미노산 코돈을 도입시키지 않으면서 NcoI 인지 부위를 보존하기 위해 행해졌다. 따라서, PCR에 의해 엔지니어링된 TSWV NP 유전자의 발현은 N-말단에서 천연 NP보다 두개의 아미노산(Ser-Lys)이 더 짧은 TSWV-BL NP를 생산할 것이다.
약 850bp의 특수 증폭된 DNA 단편을 NcoI로 절단시키고, 식물 발현 벡터 pB1525 내에 클로닝시켰다. CaMV 35S 포로모터에 대한 TSWV-BL NP 유전자의 방향은 제한 효소 부위 지도화(EcoRI, HindⅢ, AvaI 및 AiwNI)에 의해 결정하였다. 적당한방향에 삽입물을 포함하는 수개의 클론(pB1525-NP+) 및 그 반대 방향에 삽입물을 포함하는 수개의 클론(pB1525-NP-)을 단리하였다. 또한, 이 제한 효소 부위 지도화 데이타로부터, 클론 pB1525-NP+의 삽입물이 TSWV-CPNH1 NP 유전자에서 발견되는 것과 동일한 제한 효소 부위를 포함한다는 것을 알 수 있다. 따라서, TSWV-BL NP 유전자의 발현은 발현 벡터 pB1525의 알프알파 모자이크 바이러스(ALMV)의 5' 비번역 리더 서열에 융합된 이중 CaMV 35S 프로모터에 의해 조절되었다. 스태킹된(stacked) 이중 CaMV 35S 프로모터 성분을 이용하는 발현 벡터는 단일 35S 프로모터 인자를 이용하는 유사한 벡터보다 높은 수준의 mRNA 전사를 생성하였다.
증폭된 DNA 단편이 NP를 코딩하는지를 확인하기 위하여 세개의 pB1525-NP+클론을 담배 나무 원형질체에서 일시 발현시켰다. 이것을 달성하기 위하여, PEG 방법에 의해 클론을 담배 나무 원형질체내에 옮겨 넣고, 접종 2일 후, 발현된 NP를 전체 TSWV-BL 비리온에 대한 항체를 이용하여 DAS-ELISA에 의해 검사하였다. 플라스미드 pB1525-NP+내에 NP 유전자를 고정시키는 담배 나무 원형질체에서는 높은 수준의 NP가 생산된 반면, 안티센스 NP 서열(pB1525-NP-)로 형질전환된 담배 나무 원형질체에서는 NP가 전혀 관찰되지 않았다.
상기한 바와 같이, 클론 pB1525-NP+의 PCR에 의해 엔지니어링된 삽입물 및 클론 pTSWV-23의 teh cDNA 삽입물에 대해 이중 스트랜드 서열화를 수행하였다.cDNA 및 PCR 클론의 서열 분석 결과, 각각 1.71kb 및 865bp의 삽입물인 것으로 밝혀졌고, 이것은 TSWV-CPNH1 S RNA 서열과 비교할 때 클론 pTSWV-23의 cDNA 삽입물이 약 760bp의 52K 단백질 바이러스 성분 유전자, 492bp의 완전 인터제닉 영역 및 450bP의 NP 유전자(NP 유전자의 약 1/2)을 포함한다는 것을 알 수 있다. 이 클로닝된 삽입물은 그의 3' 말단이 정확히 EcoRI 인지 부위에 위치하고, 이는 cDNA 클로닝 과정 동안에 불완전한 EcoRI 메틸화가 일어났음을 알려준다. 이 클론은 완전한 TSWV-BL NP 유전자를 포함하지는 않지만, 그의 서열은 450bp가 PCR에 의해 엔지니어링된 NP 유전자의 서열과 중첩하기 때문에 상당히 중요하다. 이 TSWV-BL의 PCR에 의해 엔지니어링된 NP 유전자와 TSWV-CPNH1 NP 유전자의 서열을 비교한 결과, 총 21개(2.7%)의 뉴클레오티드가 상이하고, 이중 8개(3.1%)는 대체된 아미노산을 코딩한다는 것을 알 수 있었다. PCR에 의해 엔지니어링된 NP 유전자는 돌연변이를 도입시키는 것으로 알려져 있는 Taq 폴리머라제를 이용하여 얻었기 때문에, 이러한 차이들 중 일부는 PCR 증폭 동안에 도입될 가능성이 있다. 그러나, 이러한 상이한 뉴클레오티드 중 15개는 TSWV-BL cDNA와 PCR 클론의 중첩 영역 내에 위치하고, 이들 상이한 것들 중 하나(위치 1702)를 제외한 전부는 두개의 TSWV-SL S RNA 유래 클론에 존재하였다. 이러한 비교로부터, PCR 증폭은 이들 2개의 NP 유전자의 뉴클레오티드 서열간의 차이에 (영향을 미쳤다 하더라도) 크게 영향을 미치지는 않았다는 것을 명백히 알 수 있다. 위치 1702의 뉴클레오티드 차이 때문에 아미노산이 Ile 에서 Ser로 대체되었고, 심지어 이러한 차이조차도 TSWV-BL 단리물 내의 균질성 결여에 기인할 수 있었다.
뉴클레오티드 차이가 TSWV 단리물 간의 상이함에 기인할 수 있다는 가능성은 또한 TSWV-CPNH1, TSWV-L3 및 TSWV-BI S RNA의 다른 서열화된 영역을 비교함으로써 지지된다. 이러한 비교를 하기 표에 나타내었다.
a : TSWV-BL의 특정 성분 영역으로부터 얻을 수 있는 서열 정보를 이용하여 비교하였다. TSWV-BL NP 유전자에 대한 비교는 cDNA 클론, pTSWVS-23 및 PCR에 의해 엔지니어링된 삽입물로부터 얻은 조합된 서열 정보를 포함한다.
b: 비교 수치는 전체 차이의 갯수(뉴클레오티드 또는 아미노산)를 비교된 위치의 전체 갯수(뉴클레오티드 또는 아미노산)로 나눈 것이다. 뉴클레오티드 및 아미노산에 있어서, 계산 차이는 길이와는 무관하게 하나의 미스매치(mismatch) 것으로 간주되었다.
c: 괄호안에 있는 숫자는 백분율(%)이다.
CPNH1 및 L3 단리물로부터 얻은 NP 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서로 3.1% 정도 상이하고, BL 단리물과도 거의 유사도가 2.5%인 정도로 상이하다. 그러나,CPNH1과 BL 단리물의 NP 아미노산 서열의 차이는 L3과 BL 또는 CPNH1과 L3 단리물의 차이보다 상당히 크다. 또한, 상기 표에 나타낸 결과로부터, 52K 단백질의 아미노산 서열의 차이가 7.9 내지 10.6%이므로(NP의 아미노산 서열에 대해서 발견된 것의 두배 이상), TSWV 단리물의 NP 유전자 영역은 52K 단백질보다 더 높은 정도의 선택 압력을 받는다는 것을 알 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 상이함은 인터제닉 영역에서가 가장 크고, 이는 이 영역이 어느 유전자 영역보다도 덜 선택적인 압력을 받는다는 것을 나타낸다.
트랜스제닉 식물에 NP 유전자 서열이 존재한다는 것은 PCR 분석에 의해 처음 확인되었다. 약 800bp의 NP DNA 단편은 NP 유전자의 측면에 접합 서열과 상동성인 프라이머를 사용하여 트랜스제닉 NP(+) 식물의 전체 DNA로부터 특이적으로 증폭되는 반면, 대조 NP(-) 식물에서는 대응하는 단편이 전혀 관찰되지 않았다. NP 유전자의 발현은 DAS-ELISA에 의해 각각의 R0트랜스제닉 식물에서 평가하였다. 그 결과를 하기 표에 나타낸다.
a: 트랜스제닉 식물에서 NP 생산은 이중 항체 샌드위치 효소 면역 흡착 분석(DAS-ELISA)에 의해 평가함. 코팅을 위한 비리온에 대한 항체의 농도는 1 μg/ml이고, 복합체: TSWV-BL NP의 희석률은 1:250이고; 결과는 기질 첨가 후 150분 경과시에 측정하고, 405nm로 기록함.
b: 접종된 잎 상에 발생된 국부 병변은 접종 후 7일 경과시에 계수함. 데이타는 3개의 접종된 잎의 평균치임. 괄호안의 데이타는 동일한 접종물로 접종된 대조 NP(-) 식물로부터 생긴 병변의 수.
c: pBIN19-NP+로 형질전환된 NP(+) 식물 상에 발생된 국부 병변 대 동일 접종물로 접종된 대조 NP(-) 식물 상에 발생된 국부 병변의 비.
23개의 NP(+) 클론 중에서, 10개는 높은 수준의 NP를 생산하고, 5개는 중간 수준의 NP를 축적하고, 나머지 8개는 낮은 수준의 NP를 생산하였다. 트랜스제닉 식물에서 발현된 NP의 크기는 웨스턴 블롯을 이용하여 분석하였다. 담배 나무 추출물로부터 얻은 많은 폴리펩타이드는, 전체 비리온에 대한 항체가 건강한 담배 나무식물로부터 얻은 추출물로 예비 흡착될지라도, 그 항체에 대해 반응성이 있다. 이들 중, 오직 하나의 밴드만이 NP 유전자로 형질전환된 담배 나무 식물로부터 얻은 폴리펩타이드의 패턴에 대해 유일하였다. 이 폴리펩타이드는 약 29kDa인 것으로 평가되고, 이는 천연 NP의 예상 크기와 가깝다. 벡터 pBIN19를 포함하는 트랜스제닉 식물로부터 얻은 추출물에서는 유사한 크기의 항체 반응성 단백질 밴드가 전혀 발견되지 않았다.
담배 나무 잎을 TSWV-BL 단리물로 접종하면, 기상 조건 및 식물의 생리학적 단계에 따라서 전신 감염 또는 회사성(necrotic) 국부 병변이 발생할 수 있을 것이다. 바이러스 내성 평가를 위해 R0식물을 TSWV-BL로 시험할 때, TSWV-BL은 접종 후 6 내지 8일 경과시에 대조 NP(-) 식물의 접종된 잎 상에 대표적인 회사성 병변을 유발시켰다. 그러나, 트랜스제닉 NP(+) 식물은 대조 NP(-) 식물에 비해, 바이러스에 대한 내성 스펙트럼을 가졌다. 23개의 NP(+) 식물 중 11개는 어떠한 국부 병변도 발생시키지 않거나, 또는 발생된 병변의 수는 대응하는 접종된 NP(-) 식물에서보다 20배 이상이나 적었다. 세개의 NP(+) 식물은 중간 반응(대조군보다 병변이 5 내지 19배 적음)을 보이는 반면, 나머지 9개의 식물은 내성이 낮거나 또는 전혀 없었다. 접종된 NP(+) 또는 NP(-) 식물 중 어느 것도 전신 감염을 나타내지 않았다. 증상이 없는 R0식물들을 그들의 생활 사이클이 종료될 때까지 모니터한 결과, 그들의 생활 사이클 전반에 걸쳐서 아무런 증상도 관찰되지 않았다. 증상이 없는 NP(+) 식물의 접종된 잎들을 씨. 퀴노아(C. quinoa) 식물의 잎에 바이러스가 존재하는지에 대해 검사하였다. 내성이 높은 NP(+) 식물의 TSWV-BL 침입을 받은 잎으로부터는 바이러스가 전혀 회수되지 않았으며, 이것은 바이러스가 이들 NP(+) 식물에서 복제 또는 확산할 수 없었다는 것을 제시한다.
선택된 R0식물로부터 얻은 잎 디스크를 서브클로닝하고, 재생 묘목에 바이러스를 침입시켰다. 모든 서브클로닝된 R0식물들은 그들의 대응하는 원래 R0식물과 유사한 수준의 내성을 보여주었다.
TSWV는 널리 퍼져있고, 많은 생물학적으로 상이한 균주들이 존재하기 때문에, 여러가지 상이한 TSWV 단리물에 의한 감염에 대해 트랜스제닉 식물이 내성 효과가 있는지도 시험하였다. 이 연구에서는 5개의 TSWV 단리물(TSWV-BL, 아르칸사스, 10W 팩코이, 베고니아 및 브라질)을 선택해서 카나마이신 함유 배지 위에서 발아된 R1 식물에 침입시켰다. 처음 세개의 단리물은 전체 비리온 및 TSWV-BL(흔히, TSWV "L" 세로그룹)의 NP에 대한 항체에 대해 반응성이 있었다(제5도 참조). 베고니아 단리물은 TSWV-I("l" 세로그룹)의 NP에 대한 항체에 대해 강한 반응성이 있지만, TSWV-BL NP에 대한 항체에 대해서는 반응성이 없으므로, "l" 세로그룹에 속한다. 브라질 단리물은 TSWV-BL 세로 그룹의 NP 및 TSWV-I 세로그룹의 NP에 대한 항체에 대해 관찰가능한 정도의 반응성이 없는 것으로 발견되었고, 브라질 단리물은 TSWV-BL의 전체 비리온에 대한 항체에 대해 약한 반응성이 있었다. 게다가, 이 단리물은 감염된 담배 나무 및 엔. 벤타미아나의 잎 위에 전신 반점 및 주름을 발생시켰지만, 스쿼시 또는 오이는 감염시키지 않았는데, 이는 이 단리물이 호리병박 단리물과는 상이한 것이라는 것을 알려준다. 이러한 결과는 이 단리물이 제3 세로그룹에 속한다는 것을 암시한다.
7개의 R0주로부터 유래된 종자를 카나마이신 배지 위에서 발아시키고, 상기 TSWV 단리물로 접종시켰다. 접종 후 7일째부터 시작하여 매일 감염도에 관한 데이타를 기록하였다. TSWV-BL, 아르칸사스, 10W 팩코이 또는 브라질 단리물로 접종된 식물에 대해서는, 비접종 식물에서 바이러스 증상이 관찰되면 감염되기 쉬운 것으로 판정하였다. 베고니아 단리물로 접종된 식물에 대해서는, 이 단리물이 담배 나무에서 전신 감염을 일으키지 않기 때문에, 접종된 잎 위에서 국부 병변이 관찰되면 감염되기 쉬운 것으로 판정하였다. 접종된 모든 대조 NP(-) R1식물들은 이들 5개의 단리물에 의한 감염에 대해 감염되기 쉬었다. 이들은 베고니아로 접종된 트랜스제닉 R1식물이 접종된 잎 위에서 국부 병변만을 일으킨다는 것을 제외하고는 접종 후 12일 경과시에 전신 감염되었다. 그러나, 상동성 단리물인 TSWV-BL에 대해서는 거의 모든 NP(+) R1식물들이 높은 내성을 갖는 반면, 이형성 단리물인 아르칸사스, 10W 팩코이 및 베고니아에 대해서는 그보다 훨씬 낮은 비율의 NP(+) R1식물들이 내성을 가졌다. 한편, NP(+)4 주로부터 유래된 높은 NP 발현 NP(+) R1식물 중 일부에서 증상 발현이 약간(1내지 2일 정도) 지연되었지만, 7개의 트랜스제닉 주로부터 유래된 모든 NP(+) R1식물들은 브라질 단리물에 대해 감염되기 쉬었다.
내성 R1식물은 그의 생활 사이클 전반에 걸쳐서 여전히 증상이 없었다. 체노포디움 퀴노아(Chenopodium quinoa) 식물의 잎 위에 재(back) 접종함으로써 17개의 증상이 없는 NP(+) 식물의 접종된 잎들에 대해 바이러스가 존재하는지를 검사하였다. 증상이 없는 NP(+) 식물의 접종된 잎으로부터는 바이러스가 전혀 회수되지 않았는데, 이것은 바이러스가 이들 NP(+) 식물에서 복제 또는 확산할 수 없었다는 것을 암시한다.
또한, 트랜스제닉 식물 중의 NP 축적의 수준과 이형성 TSWV 단리물에 대한내성 정도 사이의 관계도 연구하였다. 상기 데이타를 분석함으로써, 낮은 수준의 NP를 갖는 R0주로부터 유래된 R1식물은 "L" 세로그룹(아르칸사스 및 10W 팩코이)의 이형성 단리물에 대해서는 최적의 내성을 제공하는 반면, 높은 수준의 NP를 갖는 R0주로부터 유래된 R1은 "l" 세로그룹에 속하는 베고니아 단리물에 대해 내성이 있었다. 예를 들면, 낮은 NP 발현 주 NP(+) 2, 14 및 21로부터 유래된 접종된 R1식물의 평균 76%가 아르칸사스 및 10W 팩코이 단리물에 의한 감염에 대해 내성이 있는 반면, 높은 NP 발현 주 NP(+)4, 9 및 23으로부터 유래된 유사하게 접종된 식물에서는 불과 11%만이 이들 단리물에 대해 내성이 있었다. 한편, 베고니아 단리물은 낮은 NP 발현 주 NP(+) 2, 14 및 21로부터 유래된 R1식물의 79%를 감염시키지만, 높은 NP 발현 주 NP(+)4로부터 유래된 R1식물에 대해서는 19%만을 감염시켰다.
따라서, 결론적으로 말하자면, 낮은 수준의 NP 유전자를 발현하는 트랜스제닉 R1식물은 단리물 10W 팩코이("L" 세로그룹)에 의한 감염에 대해서는 높은 내성을 갖지만, 베고니아 단리물("l" 세로그룹)에 의한 감염에 대해서는 내성이 없었다. 반대로, 높은 NP 발현 R1식물은 베고니아 단리물에 의한 감염에 대해 매우 내성이 있지만, 10W 팩코이 단리물에 의한 감염에 대해서는 내성이 없었다.
따라서, 개별 식물에서의 NP 발현과 이형성 단리물에 대한 내성과의 관계를 정확하게 정량화하는 것이 중요하였다. 본 명세서에 기재된 많은 접종 실험에서는, 아르칸사스 및 10W 팩코이 단리물로 접종하기 전에 트랜스제닉 식물의 잎 샘플을채취하였다. 또한, NP 발현 수준과 내성 사이의 명확한 관계를 관찰한 후, 베고니아 단리물로 접종된 식물의 비접종 잎으로부터 샘플을 채취하였다. 후자의 샘플 추출 방법은 베고니아 단리물에 의한 감염으로부터 방해받지 않고 행할 수 있는데, 그 이유는 이 단리물이 담배 나무에서 전신 감염을 일으키지 않고 또한 TSWV-BL NP에 대한 항체와 반응하지도 않기 때문이다. 모든 샘플을 단리된 TSWV-BL의 NP에 대한 항체를 이용하여 DAS-ELISA에 의해 상대적인 NP 수준에 대해 분석하였다. 제5도 및 6도는 트랜스제닉 R1식물(그들이 유래된 R0주와는 무관함)의 NP 수준과 아르칸사스 및 10W 팩코이 단리물에 대한 내성 또는 베고니아 단리물에 대한 내성 사이의 관계를 보여준다. 매우 낮거나 또는 관찰할 수 없을 정도의 ELISA 반응(0-0.05 OD405nm)을 나타내는 거의 모든 트랜스제닉 R1식물들은 아르칸사스 및 10W 팩코이 단리물("L" 세로그룹)에 의한 감염에 대해서는 내성을 갖지만, 베고니아 단리물("l" 세로그룹)에 대해서는 감염되기 쉬었다. 이와는 반대로, 높은 ELISA 반응(0.4-1.0 OD405nm)을 나타내는 거의 모든 R1식물들은 베고니아 단리물에 대해서는 내성을 갖지만, 아르칸사스 및 10W 팩코이 단리물에 대해서는 감염되기 쉬었다.
포도나무 엽상로울 바이러스(grapevine leafroll virus)로 감염된 조직으로부터 dsRNA를 단리하는데 성공적으로 이용된 방법[참조 : Acta Horticulture 186:51(1986) 및 Can. Plant Dis Surv 68:93(1988)]들을 조합하여 TSWV-B로 감염된 엔. 벤투아미아나 식물로부터 이중 스트랜드(ds) RNA를 단리하였다. 상기 단리물로부터 바이러스 입자를 단리하는 것이 가능하지 않았기 때문에 cDNA 합성을 위하여dsRNA를 단리하였다.[참조 : Plant Disease 74:154(1990)] TSWV-B의 S RNA에 특이성인 cDNA 라이브러리를 제작하기 위하여, 이중 스트랜드 S RNA를 겔로 정제하고, 메틸-수은 처리로 변성시키고, 랜덤 프라이머를 사용하여 프로메가(Promega)에 의해 제공된 cDNA 합성법에 따라 합성을 수행하였다. 합성된 cDNA 단편들을 EcoRI 어댑터를 이용하여 EcoRI로 절단된 λZAPⅡ(Strategene) 내로 클로닝시키고, 양성 클론을 겔에 의해 정제된 S RNA의 역전사에 의해 제조된 cDNA 프로브를 이용하여 콜로니 혼성화에 의해 확인하였다. 수십개의 양성 클론을 아가로스 겔 상에서 분석하고, 거의 전체 TSWV-B S RNA를 함유하는, 가장 큰 삽입물을 포함하는 세개의 중첩 클론((L1, L22 및 L30)만이 선택되었다(제3도 참조).
클론 L1, L22 및 L30 중의 삽입물의 뉴클레오티드 서열을 두개의 DNA 스트랜드로부터 먼저 보편적인 역 프라이머(reverse primer)에 의해 이어서 TSWV-B의 S RNA를 서열화하기 위해 고안된 내부 프라이머에 의해 결정하였다. 서열화는 생거(Sanger) 디데옥시리보뉴클레오티드 방법, T7 폴리머라제(U.S. Biochemicals, SequenaseTM), 및 시에미에니아크[참조 : Analyt. Biochem. 192:441(1991)]에 의해 기재된 이중 스트랜드 서열화 방법을 이용하여 행하였다. 이 클론들의 서열 분석 결과, 각각 1.994kb, 2.368kb 및 1.576kb의 삽입물을 포함하고 있으며, 이 서열들은 S RNA 게놈의 93%를 나타낸다(제3도 참조)는 것을 알 수 있다. 조합된 서열을 GCG(Genetics Computer Group; 위스콘신주 매디슨 소재)로부터 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 TSWV 단리물 CONH1, L3, I 및 BL의 서열과 비교 분석하였다.
컴퓨터 분석으로부터, 2.842kb의 조합된 서열들은 완전한 52K 비구조 단백질 유전자, 완전 인터제닉 영역(629bP) 및 737bP의 NP 유전자(N 유전자의 39개의 N-말단 뉴클레오티드만이 나타나지 않음)을 포함하였다. 이러한 N 유전자의 소실 영역을 얻기 위하여, N 유전자의 개시 코돈으로부터 62개의 뉴클레오티드로 된 서열과 동일한 프라이머 TTCTGGTCTTCTTCAAACTCA의 말단을 폴리뉴클레오티드 키나제로 표지화시켜서 상기한 cDNA 라이브러리를 선별하였다. 5개의 추정 클론을 얻었다. 이 5개의 클론에 대한 서열 분석으로부터, 클론 S6 및 S7만이 N 유전자의 소실 뉴클레오티드 39개를 포함하고 있다는 것을 알 수 있었다. 또한, 후자의 클론은 S RNA의 3' 극말단을 포함하였다.
S RNA 의 5' 극말단은 5' 레이스 시스템(RACE System; GIBCO)을 이용하여 얻었다. TSWV-B의 ssRNA 및 TSWV-B로 감염된 담배 나무 식물로부터 단리된 전체 RNA를 사용하여 TSWV-B S RNA의 뉴클레오티드 위치 746-763에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드(5'-CTGTAGCCATGAGCAAAG)를 이용하여 제1 스트랜드 cDNA를 합성하였다. 말단 데옥시뉴클레오티딜 전사 효소를 이용하여 제1 스트랜드 cDNA의 3' 말단에 dCTP를 테일링(tailing)시켰다. 이어서, 테일링된 cDNA를 호모폴리머 테일(tail)에 어닐링(anealing)된 앵커 프라이머 및 TSWV-B S RNA의 뉴클레오티드 위치 512-529에 어닐링된 올리고뉴클레오티드(5'-TTATATCTTCTTCTTGGA)를 이용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR에 의해 증폭된 단편을 겔로 정제시키고, 서열 분석을 위하여 T-벡터 pT7Blue(Novagen)내로 직접 클로닝시켰다. 8개의 독립적인 클론들을 S RNA의 5' 영역 (TSWV-B S RNA의 뉴클레오티드 위치 40-57)에 인접한 올리고머 프라이머(5'-GTTCTGAGATTTGCTAGT)를 이용하여 서열화하였다. 얻어진 클론 중 6개는 S RNA의 5' 극말단을 포함하고, 이들 클론으로부터 얻은 5' 말단 뉴클레오티드 서열은 동일하였다. 따라서, TSWV-B S RNA의 완전한 뉴클레오티드 서열의 길이는 3049개의 뉴클레오티드로 이루졌다.
따라서, 위에서 서열화된 세개의 클론과 함께 이들 두개의 클론(L1, L22, L30, S6 및 S7)은 상기 3032개의 뉴클레오티드를 포함하였다. TSWV-CPNH1과 TSWV-I의 말단 서열을 비교함으로써, 조합된 서열에서는 18개의 뉴클레오티드를 갖는 5' 극말단이 나타나지 않지만, TSWV-B S RNA의 3' 극말단은 TSWV-I S RNA의 3' 극말단과 동일하고, 15개의 뉴클레오티드 중 겨우 1개만이 TSWV-CPNH1의 3' 극말단과 달랐다. TSWV 단리물 중에서 말단 서열의 보존은 부니아비리다에(Bunyaviridae) 속에 속하는 다른 식물에서 관찰된 것과 일치하였으며, 이러한 사실로부터, 말단 서열이 복제 및 캡슐화와 관련이 있을 수 있는 안정한 염기쌍 구조를 형성할 수 있다는 가설이 지지된다.
본 발명에 따른 TSWV-B(상기한 바 있는 브라질리안 단리물)의 S RNA 게놈의완전한 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
본 발명에 따른 비구조(밑줄 친 부분) 및 뉴클레오캡시드 단백질의 추정된 아미노산 서열은 다음과 같다:
및
상기 뉴클레오캡시드 단백질 유전자는 바이러스의 상보 스트랜드이기 때문에, TSWV-B의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자는 다음과 같다:
TSWV-B의 S RNA의 길이는 3049개 뉴클레오티드로서 TSWV-CPNH1의 S RNA 보다 134개 뉴클레오티드가 더 길다. 이 차이는 주로 TSWV-B S RNA의 연장된 인터제닉 영역에 기인하였다. TSWV-B S RNA의 서열화 영역의 분석으로, 상기된 다른 TSWV 단리물과 유사하게 두개의 전사 해독 프레임이 밝혀졌다. 이중 보다 큰 ORF는 뉴클레오티드 88에서 기원하여 뉴클레오티드 1491에서 종결되는 바이러스의 RNA 스트랜드 상에 위치하였다. 바이러스의 상보성 스트랜드 상의 보다 작은 ORF는 개시 코돈인 뉴클레오티드 2898과 종결 코돈인 뉴클레오티드 2122에 의해 한정되었다. 두개의 전사 해독 프레임은 629개 뉴클레오티드의 인터제닉 영역에 의해 분리되었다. 하기 표는 서열화된 전체 TSWV-B S RNA를 다른 단리물의 S RNA 영역과 비교한 것이며,다른 단리물의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열과 비교한 TSWV-B S RNA의 정렬된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 상동성(%)을 나타내었다.
a. 단리물 TSWV-CPNH1(2.916 kb), TSWV-L3(2.837 kb), TSWV-BL(2.037 kb) 및 TSWV-I(1.144 kb)의 부분 또는 완전 S RNA 서열을 TSWV-B(3.049 kb)의 S RNA 서열과 비교하는데에 사용함.
b. 유사성(%)은 GCG 서열 분석 소프트웨어 패키지의 BESTFIT 프로그램을 사용하여 그들의 뉴클레오티드 또는 예상 아미노산 서열을 비교하여 산출함.
c. 동일성(%)을 괄호 안에 기재함.
상기한 바와 같이, 가장 큰 뉴클레오티드 서열 유사성(75.8 % 내지 76.4 %)은 L-형 단리물(CHNH1, L3 및 BL)과의 비교에서 나타났다. 이 보다 작은 정도로, 뉴클레오티드 서열 유사성(63%)이 TSWV-B S RNA와 I 세로그룹으로 표시된 TSWV-I의S RNA 사이에 존재한다. 비교한 결과, L-형 단리물(CHPN1, L3 및 BL)의 서열화된 S RNA 영역들 사이에는 94.8 % 내지 96.4 %의 뉴클레오티드 서열 유사성을 공유하였다.
777개 뉴클레오티드의 전사 해독 프레임은 예상 분자량이 28700 Da인 258개 아미노산의 N 단백질을 코딩한다. TSWV 단리물의 N 전사 해독 프레임의 서열을 비교한 결과, 단리물 CPNH1, L3 및 BL에서 유래한 N 유전자의 뉴클레오티드 서열은 그들 서로 간의 상이한 정도(2.7% 내지 3.2%) 보다 상당히 큰 정도(22 % 내지 22.5 %)로 TSWV-B와 차이가 있다는 것을 밝혀내었다. 면역학 분석의 결과와 일치하여, CPNH1, L3 및 BL 단리물 간의 N 아미노산 서열은 TSWV-B(90.3% 내지 91.5%의 유사성 또는 79.1% 내지 79.9%의 동일성) 보다는 서로간에 보다 밀접하게(98.8% 내지 99.6%의 유사성 또는 96.9 % 내지 98.5 %의 동일성) 관련되어 있다. TSWV-I과는 훨씬 낮은 상동성이 뉴클레오티드 수준(63.1%)과 아미노산 수준(69.7%의 유사성 또는 55.3%의 동일성)에서 관찰되었다. 262개 아미노산을 코딩하는 TSWV-I의 N 전사 해독 프레임을 제외한, 다른 단리물의 N 전사 해독 프레임은 258개의 아미노산을 코딩한다. 컴퓨터 분석은 TSWV-I N 전사 해독 프레임의 여분의 잔기들이 아미노산 서열 삽입의 결과인 것으로 제안한다(잔기 82 내지 84와 잔기 116). 잠재적 N-글리코실화(glycosylation) 부위 중 하나는 잔기 68인 것으로 밝혀졌다.
1404개 뉴클레오티드의 제2 전사 해독 프레임은 예상 분자량이 52566 Da인 467개 아미노산의 비구조 단백질을 코딩한다. TSWV-CPNH1 및 TSWV-L3의 상동성 전사 해독 프레임을 비교한 결과, 뉴클레오티드 수준에서는 80 % 및 79 %의 유사성,아미노산 수준에서는 86.1 %의 유사성(또는 78.3 %의 동일성) 및 89 %의 유사성(또는 82.0%의 동일성)이 나타났다. 이 전사 해독 프레임은 4개의 잠재적 글리코실화 부위를 포함하며, 이들은 TSWV-CPNH1 및 TSWV-L3의 글리코실화 부위들과 정확하게 같은 위치에 존재한다.
TSWV-B S RNA의 인터제닉 영역은 수회의 삽입으로 인해 TSWV-CPNH1 및 TSWV-L3의 대응 부분에 비해 각각 126개 및 41개 뉴클레오티드가 더 길다. FOLD 프로그램에 의한 서열 분석으로부터, 인터제닉 영역은 자신의 U-풍부 가닥을 A-풍부 가닥과 내부적으로 염기쌍 결합시킴으로써 매우 복잡하고 안정한 헤어핀 구조를 형성할 수 있으며, 이는 최소 자유 에너지값이 의미하는 바와 같이 TSWV-CPNH1 및 TSWV-L3으로부터 생성된 헤어핀 구조와 유사한 안정성을 갖는다는 것이 밝혀졌다. 이 내부 염기쌍 구조는 전사 종결 신호로 작용할 수 있다.
또한, 상기 표의 결과로부터 TSWV-B의 N 단백질이 52 K 단백질보다 선택적 압력을 보다 크게 받으며, 52 K 단백질의 아미노산 서열 간의 유사성이 NP의 아미노산 서열에서 발견되는 유사성 보다 더욱 낮은 것으로 밝혀졌다. 뉴클레오티드 서열의 상이성은 인터제닉 영역에서 가장 높으며, 이는 이 영역이 다른 유전자 영역보다 더 적은 선택적 압력을 받는다는 것을 의미한다.
TSWV-B 및 다른 4개의 TSWV 단리물 간의 계통적 관계를 분석하여 제4도에 도시하였고, 여기서 계통수 조직은 상기 TSWV 단리물에 대해 수집한 혈청학적 데이타의 관계와 일치한다. 따라서, 본 발명에 따른 TSWV-B는 I-형 단리물 TSWV-I 보다는 L-형 단리물에 보다 밀접하게 관련되어 있으나, L-형 단리물과의 유사성이 L-형 단리물들 서로 간의 유사성 보다는 훨씬 적다.
트랜스제닉 식물은 증상 발현이 약간 지연됨에도 불구하고 TSWV의 브라질 단리물에 대해 내성을 갖지 않았다. 혈청학적 결과는 상기 단리물이 "L"형 및 "l"형 단리물과 구별되며, 호리병박 단리물과 생물학적으로 차이가 있다는 것을 보여준다. 따라서, 브라질 단리물은 TSWV의 또다른 세로그룹에 속할 수 있다. 여하튼, 감염 결과로부터 단일 NP 유전자는 토스포바이러스속의 모든 단리물에 대해 내성을 갖는 것은 아니라는 것을 보여준다.
낮거나 또는 검출이 불가능한 ELISA 반응(OD405nm: 0 내지 0.05)을 보이는 본 발명에 따른 트랜스제닉 식물은 "L" 세로그룹의 이형성 단리물(아르칸사스 및 10W 팩코이)에 의한 감염에 대해 내성을 갖지만, 높은 수준의 NP를 축적하는 식물에서는 상기 단리물에 대한 보호가 발견되지 않았다. 대조 NP(-) 식물의 ELISA 결과치(0.05 OD405nm)와 비교하여 이러한 트랜스제닉 식물은 (만일 생성한다면) TSWV-BL NP를 매우 적게 생성하게 될 것이다. CP 축적이 검출되지 않은 트랜스제닉 식물에서 이와 유사한 결과가 나타났으며, 이들은 바이러스 감염에 대해 높은 내성을 갖는다. 이러한 현상을 일으키는 메카니즘은 현재 알려져 있지 않다. 이러한 형태의 내성은 트랜스제닉 식물에서 생성된 CP RNA 분자가 바이러스 복제를 방해(아마도, 침투 바이러스의 마이너스-센스(minus-sense) 복제 RNA와 혼성화되거나, 필수 숙주 인자(예: 레플리카제)에 결합되거나 또는 비리온 어셈블리를 방해함)하기 때문인 것으로 여겨진다.
그러나, 상동성 TSWV-BL 단리물에 대한 내성은 확실히 NP 유전자의 발현 수준과는 무관하다는 사실에 주목해야 한다. TSWV-BL로 접종된 개별적 R1식물의 상대적 NP 수준을 측정하지는 않았지만, 상기 접종된 R1식물(전체 피시험 식물: 145개) 중에 생성된 NP는 검출이 불가능한 정도로부터 높은 수준의 범위인 것으로 가정할 수 있다.
"L" 세로그룹의 이형성 단리물에 대한 보호와는 반대로, TSWV-I 세로그룹의 베고니아 단리물에 대한 보호는 높은 NP-발현 R1식물 중에서 발견되었다. "L" 세로그룹의 NP 뉴클레오티드 서열을 "l" 세로그룹의 NP 뉴클레오티드 서열과 비교한 결과, 뉴클레오티드 수준 및 아미노산 수준에서 각각 62 % 및 67 %의 동일성이 나타났다. 2가지 세로그룹의 NP 유전자의 차이가 너무 커서 트랜스제닉 식물 중에 생성된 NP("L" 세로그룹)가 "l" 세로그룹의 공격성 베고니아 단리물에 대해 역기능 단백질로서 작용할지도 모른다. 이 "결손(defective)" 코트 단백질이 비리온 중에 혼입되면 바이러스의 이동 또는 그의 추가 복제를 억제하는 결손 바이러스를 생성할 수 있다. 이러한 형태의 상호작용은 보호를 위해서 높은 수준의 NP를 필요로하는 것으로 예측된다. 또한, 베고니아 단리물에 대한 내성은 R1식물 중에 생성된 NP 전사물이 바이러스 복제를 방해하는데 관여할 수 있다. 만일 그것이 사실이라면, (두 NP 유전자의 이형성 때문에) 이형성 바이러스의 복제를 억제하는데에 보다 많은 NP 전사물을 필요로 할지도 모른다.
"L" 및 "l" 세로그룹의 이형성 단리물에 대한 내성과 개별 R1식물 중의 NP 수준과의 관계를 나타내는 결과에 대해서 확실한 설명은 없으나, 이 데이타는 매우 많은 식물(190개)로부터 얻은 것이기 때문에 명백한 경향인 것으로 믿어진다. 따라서, 개별 식물 중의 CP 또는 NP 수준을 측정하는 것은 NP 또는 CP 수준과 내성과의 관계를 확립하는 보다 정확한 방법을 제공할 수 있는 것으로 믿어진다. 이러한 형태의 데이타 분석에 의한 결과는, 각 시험 식물 중의 NP 수준이 그들이 유래한 R0주의 NP 수준 보다 내성과 더 밀접하게 관련된다는 사실을 보여준다. 담배 나무중의 TSWV-BL NP 유전자에 있어서는 적어도, 식물 염색체 중의 NP 유전자의 통합(integration) 부위는 바이러스 내성에 중요하지 않을 것으로 보인다.
또한, 본 발명에 따른 TSWV-BL의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 함유하는 트랜스제닉 R1및 R2토마토의 하기 단리물에 대한 반응을 측정하기 위한 연구가 수행되었다: 브라질(관련이 적은 바이러스), T91(밀접하게 관련된 바이러스) 및 BL(상동성 단리물). 이러한 연구에서, 트랜스제닉 토마토(L. esculentum)는 공지된 방법[Plant Cell Reports 5:81 (1986) 참조]을 변경하여 토마토 점무늬 시들음병 바이러스 BL의 상치 단리물의 뉴클레오캡시드 단백질 (N) 유전자를 에이. 투메파시엔스(A, tumefaciens) 매개 유전자 전달에 의해 발아 떡잎으로 전달시켜서 제조하였다. 형질 전환을 위해서 토마토 주 "제네바(Geneva) 80"을 선택하였는데, 그 이유는 TMV에 대한 내성을 부여하는 Tm-22 유전자를 함유함으로써 다수의 바이러스 내성 주를 생성할 수 있기 때문이다.
형질 전환체를 카나마이신 배지 위에서 선택하고 뿌리가 있는 트랜스제닉 토마토를 화분에 심고 온실로 옮겼다. R1및 R2토마토 묘목은 NPT Ⅱ 유전자를 발현하였는데, 이는 식물 게놈에 상기 유전자가 다수 삽입되었음을 나타낸다. 이와 반대로, 묘목 중 단지 18 %만이 N 단백질을 검출가능한 수준으로 생성하였다.
9개의 R1및 3개의 R2주를 하기 3개의 토스포바이러스, 즉 TSWV-BL, TSWV-T91 및 TSWV-B에 대한 내성에 대해 시험하였다. 감염은 시험 식물의 육안 관찰을 기준으로 하였다. 약간의 녹빛 고리 또는 곤충 피해를 제외하고는 건강해 보이는 식물의 경우, 이러한 식물로부터 얻은 추출물을 바이러스의 존재 여부를 시험하기 위해 엔. 벤타미아나(N. benthamiana)에 접종시켰다. 하기 표에 나타낸 바와 같이, 거의 모든 대조 토마토 식물은 TSWV-BL, TSWV-T91 또는 TSWV-B로 접종시킨지 3 내지 4주 후에 식물 발육 억제, 황색 잎 모자이크 및 주름(rugosity)을 포함하는 전형적인 증상을 나타내었다. 그러나, R1및 R2트랜스제닉 식물은 단지 4 %만이 TSWV-BL에 감염되었고, 7 %가 TSWV-T91에 감염되었으며, 45 %가 TSWV-B에 감염되었다.
토마토 점무늬 시들음병 바이러스의 양상치 균주의
핵단백질 유전자를 발현하는 트랜스제닉 R1및 R2토마토의 바이러스 내성
a. 식물은 1- 또는 2-엽기에서 엔. 벤타미아나, H423 담배 나무 또는 토마토의 5-, 10- 또는 20배 희석 잎 추출물로 접종함; 같은 식물을 7일 후에 재접종하고 다시 14일 후 증상을 기록하였음; 반응은 증강을 나타낸 식물의 수/시험 식물의 수로 표시하였음.
b. 시험하지 않음
따라서, 상기의 내용은 TSWV-BL의 N 유전자를 발현하는 트랜스제닉 토마토 식물이 TSWV-BL, TSWV-BL에 밀접하게 관련된 다른 TSWV 단리물, 및 이 보다는 관련이 적은 TSWV-B의 감염에 대해 내성을 갖는다는 것을 나타낸다.
추가의 단리물에 관한 또다른 제한된 연구에서, 모든 트랜스제닉 식물은 10W(팩코이) 단리물에 대해 내성을 갖는 반면 대조 식물은 감염되었다. 이러한 결과는 트랜스제닉 토마토가 관련이 적은 단리물 보다는 밀접하게 관련된 단리물에 대해 보다 잘 보호된다는 것을 나타낸다. TSWV-BL N 유전자를 발현하는 트랜스제닉 담배 나무 및 엔. 벤타미아나와는 달리, 트랜스제닉 토마토에서는 N 단백질 발현 수준은 관찰된 보호와는 상관 관계가 없고, 트랜스제닉 토마토 중 55 %는 TSWV-B의 관련이 적은 단리물에 대해서도 내성을 가졌으며, 이러한 내성은 트랜스제닉 담배 및 엔. 벤타미아나에서는 관찰되지 않았다. 이러한 모순은 토마토가 유전적으로 토스포바이러스에 보다 덜 감염되기 쉽다는 것을 반영하는 것일 수 있다.
또한, 적은 수의 식물에서 바이러스 접종 5 내지 7주 후 바이러스의 분포를 측정하기 위한 연구도 수행되었다. 각 식물의 펼쳐진 모든 잎들의 잎조각으로부터 말단 절반을 분쇄하고 엔. 벤타미아나 상에 재접종하였다. 접종 7일 후 얻은 결과는 TSWV-BL, -T91 또는 -B로 접종된 증상이 없는 트랜스제닉 식물의 잎 조직으로 부터는 바이러스를 회수할 수 없음을 나타내며, 이는 상술한 육안 관찰을 확증한다. 증상을 보이는 트랜스제닉 식물에서, 바이러스는 식물 전체에 걸쳐 분포하지는 않는다. 예를 들면, 결국 시각적으로 평가할 수 없는 트랜스제닉 식물은 8개의 잎 중 단지 2개, 즉 식물의 하부 및 상부으로부터 제2 잎들에 바이러스를 포함한다. 이와 반대로, 바이러스는 감염된 대조 식물의 모든 잎에 존재하며, 건강한 대조 식물의 잎에는 존재하지 않는다.
만일 바이러스가 맥관계에 도입되는 경우 내성 트랜스제닉 식물이 감염될 수있는지의 여부를 시험하기 위해 이식 접종을 시도하였다. TSWV-BL, -T91 또는 -B의 1:5, 1:10 또는 1:20 희석물로 접종한 R1및 R2식물을 같은 단리물과 희석물로 접종된 대조 식물 상에 이식하였다. 31일 후, 트랜스제닉 식물 중 34개는 증상이 없는 반면, 비트랜스제닉 대조물은 감염되었다. 23일 후, 트랜스제닉 식물의 상단 46 cm를 절단하여 새로운 성장과 더 많은 식물 스트레스를 유도하였다. 접종 31일 후, 어리고 활발하게 성장하는 새로운 새싹은 증상을 나타내지 않았지만, 접종 45일 후 TSWV-BL, -T91 및 -B는 각각 33 %, 31 % 및 45 %가 잎 또는 줄기에 증상을 나타내었다. 이러한 결과는 일부 트랜스제닉 식물은 감염에 대해 내성이 있고, 다른 것들은 감염에 대해 면역성을 갖는 것을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 한 특성에 따르면 TSWV-BL 단리물의 NP 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물은 같은 세로그룹(아르칸사스 및 10W 팩코이)의 상동성 TSWV-BL 단리물과 이형성 단리물 모두의 감염에 대해 높은 내성을 갖는다. 보다 중요한 것은 이러한 내성이 다른 세로그룹에서 유래한 베고니아 단리물에 유효하다는 것이다. 간단히 말하면, 상기에서, TSWV-BL의 핵단백질 유전자를 발현하는 트랜스제닉 담배 식물은 TSWV 및 INSV에 대해 내성을 갖고, 관련이 적은 INSV에 대한 보호는 핵단백질에 의해, 상동성 단리물 및 밀접하게 관련된 TSWV 단리물에 대한 보호는 핵단백질 유전자 리보뉴클레오티드 서열에 의해 매개되는 것으로 분명하게 기재하고 있다. 이것은 이제까지 밝혀진 TSWV의 상이한 단리물에 대한 엔지니어링된 식물의 최초의 광범위한 내성이다.
코트 단백질 보호가 일반적으로 감염 및 증상 발현에 있어서 지연 및(또는) 감소를 나타내는 반면(면역성은 아님), 본 발명은 증상이 없고 감염 바이러스가 없는 트랜스제닉 식물을 매우 높은 비율(%)로 제공한다. 온실 조건하에서 이러한 식물의 내성은 이들의 생활 주기 전체에 걸쳐 유지되며, 보다 중요한 것은 상기에 나타낸 바와 같이 이들의 후손들에게 유전된다는 것이다.
본 발명에서는 (만일 생성한다면) TSWV-BL NP를 매우 적게 생성하는 트랜스제닉 식물은 상동성 단리물 및 TSWV의 같은 세로그룹 중의 다른 밀접하게 관련된 단리물에 의한 감염에 대해 높은 내성을 갖는 반면, 높은 수준의 NP 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물에서는 보호가 발견되지 않는 것으로 밝혀졌다.
TSWV의 생물학적 다양성은 상세히 기록되어 있고 토마토와 같은 경작 식물의 유전적 내성을 극복하기 위해서 보고된 것이다. 따라서, TSWV의 다수의 균주에 대해 내성을 갖는 트랜스제닉 식물을 개발하는 것은 매우 중요하다. 본 발명은 상기의 방법 중 하나가 이러한 내성을 부여하기 위해 바이러스 NP 유전자를 이용하는 것이고, 이 내성은 상이한 TSWV 단리물에 대한 것임을 나타낸다. 따라서, TSWV NP 유전자의 발현이 다양한 TSWV 단리물에 대한 높은 수준의 내성을 부여할 수 있다는 본 발명의 발견은 상업적으로 매우 중요하다.
또다른 일련의 연구에서, 실시예 IV에 따라 플라스미드 BIN19-N+를 제조하고 에이. 투메파시엔스 균주 LBA4404로 옮겨 놓고, 실시예 V에 따라 니코티아나 벤타미아나로 옮겨 넣었다. INSV-Beg 및 -LI의 뉴클레오캡시드 유전자는 올리고머 프
AAAAGCAC)를 사용하여 각각 INSV 단리물의 뉴클레오캡시드 유전자의 5'-코딩 및 3'-비코딩 영역에 혼성화하여 증폭하였다. 증폭된 뉴클레오캡시드 유전자 단편을 실시예 Ⅲ에 따라 정제하고, 실시예 IV에 따라 절단시키고 서열화하였다.
24개 N+(pBIN19-N+로 형질전환됨)와 18개 N-(벡터 pBIN19로 형질전환됨) 트랜스제닉 엔. 벤타미아나 식물 전체를 토양에 옮기고 온실에서 성장시켰다. 모든 N+주는 제 4 내지 5 엽기에서 PCR에 의해 N 유전자 서열을 포함함을 확인하였다. N 단백질 축적의 상대적 수준은 TSWV-BL N 단백질의 항체를 사용하여 DAS-ELISA에 의해 각각의 개별 R0트랜스제닉 클론성 주에서 측정하였다. 24개 N+주 중 2개는 OD405nm값이 0.50 내지 1.00이고, 17개는 0.02 내지 0.10이었으며 나머지 5개는 0.02 미만이었다. 건강한 엔. 벤타미아나 또는 트랜스제닉 N-식물은 OD405nm값이 0.00 내지 0.02이었다. 모든 R0식물은 자가 수분하며 하기 트랜스제닉 주에서 유래한 종자는 접종 시험을 위해 카나마이신(300 μg/ml) 선택 배지 위에서 발아시켰다. (1) N--2 내지 -6, 벡터 pBIN19만을 함유하는 대조 트랜스제닉 주; (2) N+-28, 검출할 수없는 양의 N 단백질을 생성하는 트랜스제닉 주 (OD405nm= 0.005); (3) N+-21, 낮은 수준의 N 단백질을 생성하는 트랜스제닉 주 (OD405nm= 0.085); (4) N+-34 및 -37, 높은 수준의 N 단백질을 축적하는 2개의 트랜스제닉 주(OD405nm= 0.5 내지 1.00). 이어서, 상기 6개의 주를 노던 혼성화에 의해 분석하였다(N 유전자 전사물의 강도는 ELISA 반응의 수준과 관계가 있음).
6개의 R0주에서 유래한 트랜스제닉 묘목은 종자를 카나마이신 선택 배지 위에서 발아시켜 선택하고, 이 묘목을 5개의 토스포바이러스로 접종시켰다. 접종된 R1식물은 바이러스 증상이 비접종된 잎에서 발견되는 경우 감염되기 쉬운 것으로 평가되었다. 예외의 가능성을 배제하기 위해, 트랜스제닉 N+식물의 각각의 접종에서 항상 트랜스제닉 대조 N-식물을 사용하였다. 추가로, 각 접종 추출물을 먼저 N+식물, 이어서 대조 N-식물을 접종하는데 항상 사용하였다. 이러한 일련의 연구 결과를 다음에 나타내었다.
a. R1식물이 유래된 R0주의 ELISA 데이타
b. 감염된 엔. 벤타미아나 식물의 30배 희석한 잎 추출물을 3 내지 5 엽기의 3개의 잎에 사용하였음. 각 추출물을 항상 N-식물을 접종한 후, 이어서 대조 N 식물을 접종하는데 사용하였음. 데이타는 접종후 적어도 2달간 매일 취하고 전신 감염된 식물의 수/접종된 식물의 수로서 표시하였음.
c. 감염되기 쉬운 R1식물의 거의 모두가 증상 발현의 현저한 지연을 나타냄을 의미함.
상기 표에 나타낸 바와 같이, 대조 N--2 및 -6 주로부터 얻은 모든 R1식물은 모든 피시험 바이러스로 접종한지 5 내지 8일 후에 전신 증상을 나타내었다. N+-28 주로부터 유래한 R1식물은 검출가능한 수준의 N 단백질을 생성하지 못했고, INSV-Beg로 접종된 한 식물을 제외한 모든 식물은 이러한 바이러스에 감염되기 쉬웠다. 접종 전 샘플로서 채취된 상기 N+-28 R1식물로부터 유래한 잎 디스크의 ELISA 분석은 INSV-Beg 내성 표현형을 갖는 것으로 확인된 식물이 높은 수준의 N 단백질을 축적한다는 사실을 명백하게 드러냈다(다른 모든 N+-28 R1식물의 OD405nm는 0.02 미만인데 비해 OD405nm가 0.78임).
낮은 N 유전자 발현 주 N+-21은 상동성 단리물 및 밀접하게 관련된 TSWV-10W 단리물에 대해 최적 내성(각각 78 % 및 57 %)을 나타내었고, 두개의 INSV 단리물에 대해서는 매우 낮은 내성(각각 3 % 및 10 %)을 나타내었으며, 단 3개의 N+-21 식물만이 INSV 단리물로 접종되었을 때 내성 표현형을 나타내었다. 이러한 INSV-내성 N+-21 R1식물로부터 얻은 잎 샘플은 훨씬 더 높은 ELISA 반응(OD405nm: 0.5 내지 1.00)을 나타냈고, 따라서 감염되기 쉬운 N+-21 식물 (OD405nm: 0.02 내지 0.20)보다 더 많은 양의 N 단백질을 생성하였다. 높은 N 유전자 발현 주 N+-34 및 -37은 INSV 단리물에 대해 가장 높은 내성(각각 18 % 및 25 %), 그 다음으로 상동성 TSWV-BL 단리물에 대해 높은 내성(각각 7 % 및 11 %)을 나타낸 반면, 어느 식물도 TSWV-10W에 대한 내성을 나타내지 않았다. 그러나, INSV 또는 TSWV-BL로 감염된 N+-34 및 -37 R1식물은 증상 발현에 있어서 다양한 기간의 지연을 나타내었다. 이러한 4개의 트랜스제닉 N+주로부터 유래한 R1식물은 TSWV-B에 대해 내성을 나타내지 않았고, N+-34 및 -37 주로부터 유래한 R1식물 중 일부가 증상 발현을 약간 지연시켰다.
N+R1식물에서 N 단백질 생성 수준이 다른 토스포바이러스에 대한 내성과 관련이 있는가를 측정하기 위한 연구에서, 기원하는 R0식물과는 무관하게 접종 전에 채취한 조직의 ELISA 반응의 강도를 기초로 하여 상기 표의 접종된 N+R1식물을 4개의 군으로 다시 나누었다. 낮은 수준의 N 단백질(OD: 0.02 내지 0.2)을 발현하는 N+R1식물은 TSWV-BL 및 -10W에 대해 높은 내성(각각 100 % 및 80 %)을 나타내었으나, 이들 모두는 INSV-Beg 및 -LI에 감염되기 쉬웠고, 대조 N-식물에 관한 증상 발현을 검출가능할 정도로 지연시키지 않음을 나타낸다. 이와 반대로, 높은 수준의 N 단백질(OD: 0.02 내지 0.2)을 생성하는 거의 모든 N+R1식물은 TSWV-BL, INSV-Beg 및 -LI에 대해 증상 발현의 짧은 지연 내지 완전한 내성까지의 다양한 수준의 보호를 나타냈고, 이 식물들의 대부분은 대조 N-식물에 관한 증상 발현에서 다양한 정도의 지연을 나타낸다. 높은 발현주에서는 TSWV-10W에 대한 보호가 관찰되지 않았다. 또한, N+R1식물은 N 유전자 발현의 수준과 무관하게 TSWV-B에 대해 내성을 갖지 않았다. 그러나, 높은 수준의 N 단백질을 생성하는 N+R1식물에서 증상 발현이 짧게 지연된 것이 관찰되었다. 모든 대조 N-R1식물과 검출할 수 없는 ELISA 반응(OD: 0 내지 0.02)을 보이는 트랜스제닉 N+R1식물은 모든 피시험 토스포바이러스에 감염되기 쉬웠다.
또한, TSWV-BL 뉴클레오캡시드 유전자를 발현하는 엔. 벤타미아나 원형질체에서 관련이 적은 INSV의 복제의 억제가 연구되었다. 이 연구에서는 트랜스진(transgene)의 생성물이 침투된 바이러스의 복제에 어떻게 영향을 미치는지를 조사하기 위해서, 3개의 트랜스제닉 주로부터 단리한 원형질체를 감염시키는데에 전체 INSV-LI 비리온을 사용하였다. 바이러스 복제는 INSV의 N 단백질에 대한 특이 항체를 사용하여 트랜스제닉 원형질체에서 감염 INSV의 N 단백질 수준을 측정함으로써 결정하였다. DAS-ELISA 분석은 주어진 주의 모든 자손이 비교적 균일하며 거의 모든 R1자손은 그들의 모 트랜스제닉 주와 유사한 트랜스제닉 N 유전자의 발현 수준을 갖는다는 것을 나타냈다. 이러한 결과는 R1집단의 모 주의 발현 수준을 기준으로 R1집단의 발현 수준의 예측을 가능하게 하였다. 낮은 발현 주 N+-21의R1식물에서 유래한 원형질체는 INSV-LI의 복제를 지지하는 한편, 보다 높은 발현 주 N+-37의 R1식물에서 유래한 원형질체는 접종 후 42시간이 되어서야 낮은 수준의 바이러스 복제가 관찰되었다. 트랜스진의 발현 수준을 모니터하기 위해서, 같은 원형질체를 TSWV-BL N 단백질에 대한 특이 항체를 사용하여 여러가지 시간 간격(예: 0, 19, 30 및 42 시간)으로 DAS-ELISA에 의해 분석하였다. 예상했던 바대로, N+-21 R1식물에서 유래한 원형질체는 비교적 낮은 수준(OD405nm: 0.338 내지 0.395)으로 생성한 반면, N+-37 R1식물에서 유래한 원형질체는 높은 수준(OD405nm: 0.822 내지 0.865)으로 축적하였다. 발현 수준은 모든 시간에서 일치하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 상기 특성에서, 적은 양의 TSWV-BL N 단백질을 축적하는 트랜스제닉 엔. 벤타미아나 식물은 상동성 및 밀접하게 관련된 (TSWV-10W) 단리물에 대해 높은 내성을 갖는 반면, 많은 양의 상기 단백질을 축적하는 식물은 상동성 및 관련이 적은 (INSV-Beg 및 INSV-LI) 바이러스에 대해 중간 수준의 보호를 갖는 것으로 나타났다. 보다 중요하게는, 이러한 발견은 트랜스제닉 엔. 벤타미아나 식물(INSV의 전신성 숙주)가 INSV-Beg 및 INSV-LI 단리물에 대해 보호된다는 것을 의미한다.
상술한 바와 같이, 본 발명자들은 TSWV의 N 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물이 상동성 단리물에 대해 내성을 가지며, TSWV-BL N 유전자를 발현하는 상기 식물은 TSWV 및 INSV에 대해 모두 내성을 갖는다는 것을 보여주었다. 또한, 상동성 및 밀접하게 관련된 단리물에 대한 최적 내성은 낮은 수준의 N 단백질을 축적하는트랜스제닉 식물에서 발견되는 반면, 높은 수준의 TSWV-BL N 단백질을 갖는 트랜스제닉 식물은 혈청학적으로 관련이 적은 INSV 단리물에 대해 보다 큰 내성을 갖는다는 사실도 보여주었다. 이러한 관찰로부터 본 발명자들은 상동성 및 밀접하게 관련된 단리물에 대해 관찰된 보호에 있어서 번역된 N 단백질 생성물의 역할을 추측하고, 식물 게놈에 삽입된 N 유전자 자신 또는 그의 전사물이 보호에 관련되는 것으로 생각하게 되었다. 이러한 가설을 시험하기 위해, 프로모터가 없는 N 유전자를 함유하거나 또는 번역 불능 센스 또는 안티센스 N 코딩 서열을 발현하는 트랜스제닉 식물을 제조하였다. 번역 불능 센스 또는 안티센스 N 유전자 RNA는 상동성 및 밀접하게 관련된 단리물에 대한 보호를 제공하고, 이러한 RNA-매개보호는 낮은 수준의 각 RNA 종류를 합성하는 식물에서 가장 효과가 크며 바이러스 복제의 억제를 통해 달성된다는 사실이 밝혀졌다.
보다 구체적으로, 트랜스제닉 식물에 도입된 코딩 서열을 제7도에 도시하였다. 도시된 바와 같이, pBIN19-N 작제물은 식물 형질 전환 벡터 pBIN19에 삽입된 프로모터가 없는 N 유전자를 포함한다(실시예 IV 참조). 다른 모든 작제물은 CaMV의 이중 35S 프로모터, 알파파 모자이크 바이러스의 5'-비번역된 리더 서열 및 노팔린 합성 효소 유전자의 3'-비번역되고 폴리아데닐화된 서열을 포함한다. pB1525는 식물 발현 벡터이며 이 연구에서는 대조용으로서 사용되고, pB1525-mN은 N 유전자의 변이(번역 불능) 형태를 포함하며, PB1525-asN은 안티센스 형태의 번역 불능 N 유전자를 포함한다. 변이 N 유전자의 5'-말단에서 1개의 뉴클레오티드의 결실은 대시 기호로 나타내었다. ATG 코돈을 밑줄로 표시하였고 변이 유전자에서의 인프레임 종결 코돈은 굵게 표시하였다.
실시예 VⅢ
TSWV-BL N 유전자의 프라이머-부위적 변이 유발 및 클로닝은 다음과 같이 수행하였다.
전체 길이의 N 유전자는 본 명세서에서 그 전체를 참조로 인용하는 문헌[Phytopathology 82: 1223 (1992)]에 기재된 바와 같이 역전사 및 폴리머라제 연쇄반응에 의해 얻었다. 번역 불능 N 코딩 서열은 올리고머 프라이머 A
유전자의 3'-비코딩 영역의 S RAN와 동일함) 및 B (AGCTAATCTAGAACCAT
RAN에 상보적임)를 사용하여 RT-PCR에 의해 유사하게 생성하였다. 후자의 올리고머 프라이머는 가능한 번역 리드쓰루(readthrough)를 차단하기 위해 번역 개시 코돈과 수개의 종결 코돈 바로 다음에 프레임쉬프트(frameshift) 변이를 포함한다. 무상(intact) N 유전자 단편과 변이 N 유전자 단편을 실시예 Ⅱ에 기재한 바와 같이 1.2 % 아가로스 겔 상에서 정제하였다. 겔에 의해 단리된 무상 및 변이 N 유전자 단편들은 실시예 IV에 기재한 바와 같이 적당한 제한 효소(들)로 절단시키고, 각각 BamHI/Xbal로 절단된 식물 형질 전환 벡터 pBIN19 및 NcoI로 절단된 식물 발현 벡터 pBI525로 직접 클로닝하였다. 그 결과 얻어진 플라스미드를 확인하고, 프로모터가 없는 무상 N 유전자를 포함하는 것은 pBIN19-N으로, 또한 변이 코딩 서열을 포함하는 것은 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 대해 센스 방향 및안티센스 방향으로 각각 pBI525-mN 및 pBI525-asN으로 표시하였다. 발현 카세트에서 변이 N 코딩 서열의 번역 가능성은 니코티아나 타바쿰(Nibotiana tabacum) 원형질체에서 일시적 발현 분석에 의해 검사하고, 이어서 센스 또는 안티센스 변이 N 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 HindⅢ/EcoRI로 부분 절단시켜서 플라스미드 pBI525로부터 잘라내고(N 코딩 서열은 내부 HindⅢ 및 EcoRI 부위를 포함하기 때문임), 같은 효소로 잘려진 식물 형질 전환 벡터 pBIN19에 라이게이션시켰다. pBIN19-N은 물론 상기에서 얻어진 벡터를 실시예 IV에 기재된 방법을 사용하여 에이. 투메파시엔스 균주 LBA4404로 옮겨 넣었다. 엔. 타바쿰 바르 하바나 씨브이 423의 잎 디스크를 다양한 작제물을 함유하는 에이. 투메파시엔스 균주 LBA4404로 접종시키고, 그 결과 얻어진 트랜스제닉 식물을 자가 수분하고 종자를 카나마이신 배지 위에서 선택적으로 발아시켰다.
PCR은 상술한 바와 같이 각 R0트랜스제닉 주에 대해서 수행하였다. 올리고머 프라이머 A 및 B는 TSWV-BL의 N 코딩 서열의 존재 여부를 측정하는데에 사용하였다. 식물 게놈에 삽입된 변이 N 코딩 서열의 (CaMV 35S 프로모터에 대한) 방향을 확인하기 위해, 올리고머 프라이머 35S 프로모터(CCCACTATCCTTCGCAAGACCC)를 올리고머 프라이머 A 또는 B와 결합시켰다. 트랜스제닉 식물 중의 N 단백질을 검출하기 위해 사용되는 DAS-ELISA는 TSWV-BL N 단백질에 대한 다클론 항체를 사용하여 수행하였다. 노던 블롯에 의해 트랜스제닉 식물에서의 RNA 전사물 수준을 측정하기 위해서, 전체 식물 RNA를 나폴리[Napoli, The Plant Cell 2: 279 (1990) 참조]에 따라 단리하고, 포름알데히드 함유 아가로스 겔(10 μg/lane) 상에서 분리시켰다. 이어서, 각 레인의 전체 식물 RNA의 균일성을 보장하기 위해 아가로스 겔을 에티듐 브로마이드로 염색하였다. 혼성화 조건은 제작자에 의한 진스크린 플러스(GeneScreen Plus) 프로토콜에 기재된 바와 같이 하였다. 얻어진 신호 블롯을 각 블롯에 포함된 대조 레인(높은 수준의 N 유전자 전사물을 생성하는 mN R1식물)의 N 유전자 전사물 밴드를 기준으로 비교 및 표준화하였다. 밀도 값(Hewelt ScanJet 및 Image Analysis Program)이 100 내지 150인 트랜스제닉 식물은 높은 발현체로서 평가된 반면, 15 내지 50의 밀도를 갖는 식물은 낮은 발현체로 평가되었다.
트랜스제닉 식물의 토스포바이러스 접종은 달리 지적한 것을 제외하고는 3 내지 4 엽기에서 접종을 행하여 상술한 바와 같이 수행하였다.
담배 나무 원형질체는 R1식물에서 유래된 표면 살균된 잎으로부터 제조하였다[개질에 대해서 Z. Pflanzanphysiol. 78: 453 (1992) 참조]. 단리된 원형질체(6 x 106원형질체)는 PEG법을 사용하여 OD260nm: 0.68의 정제된 TSVW-BL 비리온 제제물로 형질 전환하였다[Plant Mol. Biol. 8:363 (1987) 참조]. 이어서, 형질 전환된 원형질체를 배양 배지에서 암실 중에 26 ℃에서 최종 밀도 1 x 106원형질체/ml로 배양하였다. 다양한 간격으로 배양한 후, 배양된 원형질체를 W5 용액으로 2회 세척하고 효소 컨쥬게이트 완충액 중에서 삼투 쇼크에 의해 용해시켰다. 바이러스증식(복제)는 DAS-ELISA를 사용하여 바이러스의 N 단백질을 측정함으로써 평가하였다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 한 특성은 N 단백질을 생성하지 않거나 또는 겨우 검출할 수 있는 양으로 생성하는 트랜스제닉 담배 나무는 상동성 단리물 및 밀접하게 관련된 단리물에 대해 내성을 갖는다는 것을 설명한다. 이 결과로부터, 관찰된 내성은 침투된 바이러스 N 유전자 RNA와 트랜스제닉 식물에 생성된 N 유전자 전사물 또는 N 코딩 서열 자신과의 트랜스 상호 작용에 기인하는 것일 수 있다는 사실이 제안되었다. 핵 N 유전자의 존재가 관여하는지를 시험하기 위해, 트랜스제닉 PoN R0주, 및 두개의 PoN 주에서 유래된 R1식물에 4가지 토스포바이러스(TSWV-BL, TSWV-10W, INSV-Beg 및 TSWV-B)를 접종하였다. 증상이 없는 식물만이 내성을 갖는 것으로 평가하고, 증상을 나타내는 식물은 감염되기 쉬운 것으로 평가되었다. 모든 접종된 R0및 R1식물은 바이러스에 감염되기 쉬웠다.
추가로, N 트랜스진의 전사물이 보호에 관여할 수 있는가를 시험하기 위해, 센스 또는 안티센스 N 유전자 전사물을 생성하기는 하나 N 단백질은 생성하지 않는 다수의 R0트랜스제닉 식물을 상동성 단리물로 접종시켰다. 그 결과를 하기 표에 나타내었다.
a. mN 및 asN은 각각 번역 불능 센스 및 안티센스 N 유전자를 발현하는 식물을 의미하고, P0N은 프로모터가 없는 N 유전자를 함유하는 식물을 의미함.
b. N 유전자 RNA의 수준은 노던 블롯에 의해 각 주에서 측정하였고, nd는 N 유전자 전사물이 검출되지 않았음을 의미함.
c. TSWV-BL로 감염된 엔. 벤타미아니 식물의 30배 희석된 잎 추출물을 6 내지 7 엽기에서 3개의 잎에 적용하였음. 각 추출물은 먼저 모든 시험 식물, 이어서 건강한 대조 식물에 사용하였음. 데이타는 접종후 45일 동안 매일 취하였고 단지 증상이 없는 식물만이 내성을 갖는 것으로 평가함.
접종 7 내지 9일 후 전형적인 전신 증상을 나타낸 대조 식물과는 달리, 21개의 mN 식물 중 16개와 8개의 asN 식물 중 5개는 그들의 생활 주기 전체에 걸쳐 증상을 나타내지 않았다. 접종 전 채취된 잎 조직의 노던 블론 분석 결과, 모든 내성R0주는 낮은 수준의 센스 또는 안티센스 N 유전자 RNA를 생성하는 반면, 감염되기 쉬운 R0주는 RNA를 전혀 생성하지 않거나 높은 수준으로 생성하는 것으로 나타났다. 이 데이타로부터 TSWV-BL에 대한 트랜스제닉 식물의 내성은 이들의 N 유전자 전사물의 상대적 수준과 관련된다는 사실이 제안되었으므로, 높거나 또는 낮은 N 유전자 전사물 수준을 갖는 4개의 mN 및 3개의 asN R0주의 트랜스제닉 자손을 카나마이신 함유 배지 위에서 발아시켜 선택하였다. 2개의 asN 주로부터 얻은 일부 R1식물이 6 내지 7 엽기에서 접종된 것을 제외하고, 상기 트랜스제닉 식물들을 3 내지 4 엽기에서 4가지 토스포바이러스에 대한 내성에 대해 시험하였다. 그 결과를하기 표에 요약하였다.
a. R1식물이 얻어진 R0주의 노던 분석(상기 표를 참조).
b. 밑줄친 부분은 감염되기 쉬운 R1식물 중 대부분이 증상 발현이 현저히 지연되었음을 나타냄.
c. 괄호 안의 부분은 6 내지 7 엽기에서 접종된 식물로부터 얻은 접종 데이타를 의미하고, 상기 표에서 나머지 데이타는 3 내지 4 엽기에서 접종된 식물로부터 얻은 것이며, 접종된 식물은 접종 45일 후 매일 관찰하였음.
높은 발현체 주 mN-2 및 mN-7로부터 얻은 모든 R1식물은 모든 피시험 토스포바이러스에 의해 감염되기 쉬우며, 이 식물들은 대조 식물에 비해 증상 발현이 지연되지 않는다. 이와 반대로, 낮은 발현체 주 mN-13 및 -18로부터 얻은 R1식물중 높은 비율은 상동성 (TSWV-BL) 단리물 및 밀접하게 관련된 (TSWV-10W) 단리물에 대해 내성을 갖지만, 관련이 적은 토스포바이러스(INSV-Beg 및 TSWV-B)의 감염에 대해서는 내성을 갖지 않는다. 낮은 발현체 R0주에서 유래된 asN R1식물의 내성은 접종에 사용되는 TSWV 단리물에 의해 크게 영향을 받는다. 낮은 발현체 주 asN-1 및 -9로부터 얻은 작은 R1식물(3 내지 4 엽기) 중 하나를 제외하고는, 모두 상동성 TSWV-BL 단리물 또는 밀접하게 관련된 TSWV-10W 단리물에 의해 접종되었을 때 증상 발현이 지연되긴 하지만 감염되었다. 이와 반대로, asN-9 주로부터 얻은 큰 R1식물(6 내지 7 엽기)는 대부분이 상기 두개의 단리물에 대해 내성을 가졌다. 비교적으로, 대조 R1식물과 asN-4와 같은 높은 발현체 주로부터 얻은 R1식물은 시험 식물의 크기와 무관하게 상기 단리물에 대해 내성을 갖지 않는다. 안티센스 RNA 매개 보호는 관련이 적은 INSV-Beg 및 TSWV-B 단리물에 의한 감염에 대해 효과가 없었다.
상기 두개의 표에 나타낸 데이타의 분석 결과, 센스 및 안티센스 RNA 매개 보호는 N 유전자의 낮은 발현체에서만 관찰되는 것으로 제안되었다. 높은 수준의 안티센스 N 유전자 전사물을 생성하는 R1asN 식물은 대조 식물만큼 감염되기 쉽다. 이와 반대로, 낮은 asN 발현체는 3 내지 4 엽기에서 접종되었을 때 증상 발현의 지연을 나타내고, 6 내지 7 엽기에서 접종되었을 때 증가된 수준의 내성을 나타내었다.
센스 또는 안티센스 형태의 번역 불능 N 코딩 서열을 발현하는 담배 나무 원형질체에서 바이러스 복제의 억제도 관심을 모았다. 이 경우, 센스 또는 안티센스 N 유전자 전사물이 침투된 바이러스의 복제에 미치는 영향을 조사하기 위해서, TSWV-BL의 모든 비리온 제제물을 트랜스제닉 주로부터 단리된 원형질체를 감염시키는데 사용하였다. 바이러스 복제는 감염된 원형질체에 침투한 바이러스의 N 단백질의 수준을 측정함으로써 결정하였으며, 높은 수준의 각 RNA 전사물을 생성하는 식물(mN-7 및 asN-4)에서 유래된 원형질체는 바이러스 복제를 지지하는 반면, 낮은 mN 발현체(mN-18)에서 유래된 원형질체는 그렇지 않다는 사실이 밝혀졌다. 낮은 asN 발현체(asN-9)에서 유래된 원형질체는 훨씬 낮은 수준의 바이러스 복제를 지지하였다.
따라서, 본 발명의 이러한 특성에서, 본 발명자들은 센스 또는 안티센스 형태의 번역 불능 N 유전자 코딩 서열을 발현하는 트랜스제닉 식물은 상동성(TSWV-BL) 및 밀접하게 관련된 (TSWV-10W)에 대해 내성을 갖지만, 관련이 적은 (INSV-Beg 및 TSWV-B) 토스포바이러스에 대해서는 내성을 갖지 않는 것을 보여주었다. 하기 표는 다양한 형태의 TSVW-BL N 유전자를 발현하는 트랜스제닉 담배 나무에서 토스포바이러스에 대한 내성을 비교한 것이다.
a. TSWV-BL의 무상 N 유전자 (N)을 발현하는 트랜스제닉 담배 나무와 엔. 벤타미아나 식물의 4가지 토스포바이러스 접종에 대한 반응은 번역 불능 N 코딩 서열(mN), 안티센스 N 코딩 서열(asN) 및 프로모터가 없는 N 코딩 서열(P0N)을 포함하는 트랜스제닉 식물의 접종 결과와 비교하기 위해 포함시킨 것임. R = 내성, S = 감염되기 쉬움.
b. 뉴클레오티드 서열은 문헌 [Phytopathology 82: 1223 (1992) 및 Phytopatholotgy 83: 728 (1993)]에 기재되어 있음.
c. 내성의 수준은 접종물의 농도에 따라 달라질 수 있음.
상기 결과는 본 발명의 상기 특성인 TSWV에 대한 RNA 매개 보호를 확인 및 확대시킨다. 추가로, 보호는 높은 수준보다는 낮은 수준의 N 유전자 전사물을 생성하는 식물에서 관찰되며, 본 명세서에 기재한 선행 연구에서는 높은 수준의 TSWV-BL N 단백질을 생성하는 담배 나무 식물이 INSV-Beg에 대해 내성을 갖는 것으로 밝혔으나, 상기 추가의 데이타는 INSV-Beg에 대한 내성이 센스 또는 안티센스 형태의 번역 불능 N 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물에서는 관찰되지 않았고 따라서 INSV-Beg에 대한 보호는 N 유전자 전사물이 아닌 N 단백질이 존재하기 때문인 것을 의미한다. 따라서, 본 발명에 따른 트랜스제닉 식물의 TSWV 및 INSV 토스포바이러스에 대한 보호에는 두개의 상이한 메카니즘이 관여하는 것으로 여겨진다. 이 중 하나의 메카니즘은 N 유전자 전사물과 관련있고(RNA 매개), 다른 하나는 N 단백질(단백질 매개)과 관련있다. 또한, 원형질체 실험의 결과는 N 유전자 RNA 매개 보호가 바이러스 복제를 억제하는 방법을 통해 달성된다는 것을 나타내며, 상기 표에 기개된 데이타는 관련이 적은 INSV-Beg 단리물에 대한 보호가 유전자 전사물이 아닌 TSWV-BI의 N 단백질에 의해 부여되는 것임을 제안한다.
마지막으로, 본 발명의 또다른 특성, 즉 토스포바이러스 핵단백질 유전자의 일부분이 트랜스제닉 식물을 토스포바이러스에 의한 감염에 대해 보호한다는 사실을 제공하기 위한 추가의 연구가 수행되었다. N 유전자 RNA는 상동성 및 밀접하게 관련된 TSWV 단리물에 대해 보호 작용을 하는 반면, N 단백질은 상동성 단리물 및 관련이 적은 INSV 단리물에 대해 보호 작용을 하며, N 유전자 RNA 매개 보호는 낮은 수준의 N 유전자를 발현하는 식물에 유효한 반면, N 단백질 매개 보호는 높은수준의 N 단백질 축적을 필요로 하고, N 유전자 RNA 매개 보호는 바이러스 복제를 억제시킴으로써 달성된다는 사실은 이미 증명된 바 있다. 이러한 선행 데이타를 기준으로 하여, 본 발명자들은 N 유전자의 일부분이 바이러스에 의한 감염에 대해 작용하는가의 여부를 결정하는 것을 설명하겠다. 후술하는 바와 같이, 본 발명자들은 N 유전자 서열의 약 1/2을 발현하는 트랜스제닉 식물이 바이러스에 대해 내성이 있다는 것을 발견하였다.
이러한 본 발명의 최종 특성을 증명하기 위해서 TSWV-BL의 1/2 N 유전자 단편의 클로닝을 하기에 기재한다. 번역 가능 N 유전자 및 번역 불능 N 유전자의 제1 및 제2 절반을 상술한 바와 같이 역전사, 이어서 PCR에 의해 생성하였다. 제8도에 도시한 바와 같이, 번역 불능 절반 N 유전자 단편의 5'-말단에서의 뉴클레오티드 결실 또는 삽입은 대시 기호로 나타내었고, ATG 코돈은 밑줄로 표시하고 번역 불능 절반 N 유전자 단편의 개시 코돈 바로 다음의 모든 가능한 종결 코돈은 굵게 표시하였다.
번역 가능 N 유전자의 처음 절반은 (TSWV-BL N 유전자의 중심 영역에 대해
GCATTGTTGC)를 사용하여 RT-PCR에 의해 제조하였으며, 후자의 두개의 올리고머 프라이머는 N 유전자의 5'-말단과 동일하다. 이와 마찬가지로, 번역가능한 N 유전자의 두번째 절반은 (TSWV-BL N 유전자의 3'-비코딩 영역에 상보적인) 올리
며, 후자의 두개의 올리고머 프라이머는 N 유전자의 중심 영역과 동일하다. 올리고머 프라이머 ⅲ은 가능한 번역 리드쓰루를 차단하기 위해 번역 코돈과 일부의 종결 코돈 바로 다음에 프레임쉬프트 변이를 포함하는 반면, 올리고머 프라이머 vi는 번역 개시 코돈 바로 다음에 수개의 인프레임 종결 코돈을 포함한다.
절반 유전자 단편을 상술한 바와 같이 1.2 % 아가로스 겔 위에서 정제시키고, 겔에 의해 단리된 유전자 단편을 제한 효소 NcoI로 절단시키고 NcoI-절단된 식물 발현 벡터 pBI525로 직접 클론시켰다. 얻어진 플라스미드를 확인하고 (1) 번역가능한 처음 절반 N 유전자를 포함하는 것은 pBI525-1N, (2) 번역불가능한 처음 절반 N 유전자를 포함하는 것은 pBI525-1N', (3) 번역가능한 처음 절반 N 유전자를 안티센스 방향으로 포함하는 것은 pBI525-IN-, (4) 번역가능한 두번째 절반 N 유전자를 포함하는 것은 pBI525-2N, (5) 번역불가능한 두번째 절반 N 유전자를 포함하는 것은 pBI525-2N' 및 (6) 번역가능한 두번째 절반 N 유전자를 안티센스 방향으로 포함하는 것은 pBI525-2N-로 표시하였다. 이어서, 발현 카세트를 HindⅢ/EcoRI로 절단시켜 플라스미드 pBI525로부터 잘라내고, 동일 효소로 절단한 식물 형질 전환 벡터 pBIN19에 상기한 바와 같이 라이게이션시켰다. 플라스미드 pBIN19는 물론 상기에서 얻어진 벡터를 홀스터스(Holsters, 상술함)에 기재된 방법을 사용하여 에이. 투메파시엔스 균주 LBA4404에 옮겼다. 엔. 벤타미아나의 잎 디스크를 다양한 작제물을 함유하는 에이. 투메파시엔스 균주 LBA4404로 접종시켰다. 트랜스제닉 식물을 상술한 바와 같이 자가 수분하고, 종자를 카나마이신 배지 위에서 선택적으로 발아시켰다.
PCR 및 노던 혼성화 PCR에 의한 트랜스제닉 식물의 분석은 상술한 바와 같이 각 R0트랜스제닉 주에 대해서 수행하였다. 올리고머 프라이머 i 내지 vi는 TSWV-BL의 N 코딩 서열의 존재를 측정하기 위해 사용하였다. 식물 게놈에 삽입된 절반 유전자 서열의 (CaMV 35S 프로모터에 대한) 방향을 확인하기 위해 올리고머 프라이머 35S-프로모터(실시예 VⅢ 참조)를 상기 올리고머 프라이머 중 하나와 결합시켰다. 노던 분석은 실시예 VⅢ에 기재된 바와 같이 수행하였다.
트랜스제닉 식물을 접종하는데 TSWV(TSWV-BL)의 양상치 단리물을 사용하였다. 접종은 상술한 바와 같이 3 내지 4 엽기에서 시험 식물을 사용하여 수행하였다. 예외의 가능성을 배제하기 위해, 각 실험에서 대조 식물을 사용하고 각 접종 추출물을 먼저 트랜스제닉 식물, 이어서 대조 식물에 접종하였다.
본 발명의 이 특성에서 사용되는 다양한 작제물을 제8도에 도시하였다. 번역가능한 및 번역불가능한 절반 N 유전자 단편을 RT-PCR에 의해 합성하고, 이어서 식물 발현 벡터 pBI525에 직접 클로닝하였다. 번역불가능한 절반 N 유전자 단편을RT-PCR에 의해 생성하기 위해 사용하는 올리고머 프라이머 ⅲ 및 vi는 번역 개시 코돈 바로 다음에 변이를 포함하며, 얻어진 해독 프레임은 가능한 번역 리드쓰루를 차단하기 위해 수개의 종결 코돈을 포함한다. 따라서, 번역불가능한 제1 및 제2 절반 N 유전자 단편 모두는 식물에 도입되었을 때 끝이 잘린 N 단백질 단편을 생성할 수 없어야 한다. 이어서, 번역가능한 및 번역불가능한 절반 N 유전자 단편 모두를 센스 방향 또는 안티센스 방향으로 벡터 pBI525의 CaMV 35S 프로모터의 하부에 위치시켰다. 따라서, TSWV-BL의 절반 N 코딩 서열의 발현은 발현 벡터 pBI525의 알파파 모자이크 비아러스(ALMV)의 비번역 5'-리더 서열에 융합된 이중 CaMV 35S 프로모터에 의해 조절된다. 스태킹된 이중 CaMV 35S 프로모터 인자들을 이용하는 발현 벡터는 단일 35S 프로모터 성분을 갖는 유사한 벡터에 비해 보다 높은 수준으로 mRNA 전사를 생성하는 것으로 알려져 있다. 발현 카세트를 벡터 pBI525로부터 식물 형질 전환 벡터 pBIN19로 옮겼다. 이어서, 얻어진 플라스미드 및 대조 플라스미드 pBIN19를 에이. 투메파시엔스 균주 LBA4404로 옮겼다. 트랜스제닉 식물은 제8도에 도시한 트랜스제닉 주의 명칭으로 명명되었다.
모든 카나마이신 내성 트랜스제닉 주는 PCR에 의해 적당한 N 코딩 서열을 예상 방향으로 함유하는 것으로 확인되었다. 이어서, 종자에서 성장한 각 트랜스제닉 R0주를 노던 블롯을 사용하여 분석하였다. 6개의 1N R0주 중 6개, 6개의 1N' R0주 중 4개, 6개의 IN-주 중 6개, 6개의 2N 주 중 6개, 8개의 2N' 주 중 7개 및 7개의2N-주 트랜스제닉 R0주 중 6개가 절반 N 유전자 RNA를 생성하는 것으로 밝혀졌다.
트랜스제닉 R0식물을 상동성 단리물 TSWV-BL로 접종시켰다. 증상이 없는 식물만이 내성을 갖는 반면 증상(국부 병변 또는 전신 감염)을 나타내는 식물은 감염되기 쉬운 것으로 평가되었다. 접종된 모든 R0대조 식물은 바이러스에 감염되기 쉽고, 이와 반대로 9개의 1N' R0주 중 2개, 6개의 1N-R0주 중 2개, 10개의 2N' R0주 중 4개, 8개의 2N-R0주 중 1개가 바이러스 감염에 대해 완전한 내성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 1N 및 2N R0주는 높은 수준의 내성을 나타내지 않았지만, 이들 식물 중 일부는 증상 발현이 현저하게 지연되었다.
트랜스제닉 R0주의 또다른 집합을 종자 생성을 위해 발육시켰다. 묘목은 카나마이신 함유 배지 위에서 발아시키고 TSWV-BL로 접종시켰다. 하기 표에 나타낸 바와 같이, 대조 묘목과 몇몇 트랜스제닉 주로부터 얻은 묘목은 단리물에 감염되기 쉬운 반면, 1N-151, 1N'-123 및 2N'-134로부터 얻은 묘목은 증상 발현의 지연으로부터 완전한 내성까지의 다양한 수준의 보호를 나타내었다.
상기 표에서, 감염된 엔. 벤타미아나 식물의 30배 희석 추출물을 3 내지 5 엽기에서 트랜스제닉 식물, 이어서 대조 트랜스제닉 식물을 접종시키는데 사용하였음. DPI = 접종 후 경과 일수.
요약하면, 본 발명의 이러한 특성은 번역가능한 또는 번역불가능한 N 유전자 단편의 제1 또는 제2 절반을 발현하는 트랜스제닉 식물은 상동성 TSWV-BL 단리물에 대해 높은 내성을 갖는다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 N 유전자의 일부분으로도 바이러스에 대한 내성에 충분하다는 것을 증명한다.
상기에서 본 발명은 설명하는데에 나온 모든 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 목록은 다음과 같다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시 태양을 예시하였지만, 본 발명을 변화 및변경시킬 수 있으므로, 본 발명을 기재된 용어로 제한하지는 않고 여러 용어 및 조건에 본 발명을 적용할 수 있도록 변화 및 변경시키기를 원한다는 것을 이해해야 한다. 예를 들면, 이러한 변화 및 변경은 구조적으로 유사한 핵산 서열의 치환(본 발명의 서열과 변화시킨 서열 사이의 차이는 변화시킨 서열을 이용하여 입수가능한 잇점이 거의 없는 정도, 즉 두 서열들이 상기와 실질적으로 유사한 결과를 제공할 수 있는 정도임)을 포함한다. 따라서, 상기에서 특정한 서열의 기능을 실질적으로 변경시키지 않는 (뉴클레오티드 서열에서) 뉴클레오티드 또는 (펩티드 서열에서) 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 첨가에 의한 서열의 변화는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 간주한다. 또한, 본 발명자들은 본 발명을 변경시킴으로써, 단일 카세트에 본 발명의 식물의 토스포바이러스 감염에 대한 내성을 제공하는 여러 가지 단리물의 N 유전자를 결합시킬 수 있고, 이 카세트를 트랜스유전자로서 사용하여 토스포바이러스, 특히 TSWV-BL, TSWV-B 및 INSV에 대해 넓은 내성을 제공할 수 있다. 따라서, 이러한 변화 및 변경은 충분한 범위의 균등물 내에 속하고, 따라서 하기 특허 청구의 범위의 영역 내에 속하는 것으로 한다.
따라서, 본 발명이 속하는 분야 또는 관련 분야의 통상의 기술을 가진 자가 본 발명을 이용할 수 있을 정도로 상세하고 명확하며 간결하고 정확한 용어로 본 발명 및 그를 이용하는 방법을 기술하였다.
Claims (29)
- 하기 군으로부터 선택되는 단리된 뉴클레오티드 서열.
- 완전 길이의 토스포바이러스 (Tospovirus) 뉴클레오캡시드 단백질의 대략 절반 길이의 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 단편을 코딩하는 번역 가능 mRNA 또는 완전 길이의 토스포바이러스 뉴클레오캡시드 mRNA의 대략 절반 길이의 번역 불능 mRNA를 코딩하고 상기 토스포바이러스에 대한 식물 내성을 부여하는, 식물의 게놈에 삽입된 트랜스진 (transgene)을 포함하는 토스포바이러스 내성 식물.
- 완전 길이의 토스포바이러스 뉴클레어캡시드 단백질의 대략 절반 길이의 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 단편을 코딩하는 번역 가능 mRNA 또는 완전 길이의 토스포바이러스 뉴클레오캡시드 mRNA의 대략 절반 길이의 번역 불능 mRNA를 코딩하고 상기 토스포바이러스에 대해 숙주 식물의 내성을 부여하는 트랜스진을 숙주 식물에 삽입하는 것을 포함하는, 토스포바이러스 감염에 대한 내성을 숙주 식물에 제공하는 방법.
- 제2항에 있어서, 식물이 토마토 식물인 토스포바이러스 내성 식물.
- 제2항에 있어서, 식물이 담배 식물인 토스포바이러스 내성 식물.
- 완전 길이의 토스포바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 대략 절반 길이의 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 단편을 코딩하는 번역 가능 mRNA 또는 완전 길이의 토스포바이러스 뉴클레오캡시드 mRNA의 대략 절반 길이의 번역 불능 mRNA를 코딩하는 DNA 분자, 상기 DNA 분자의 5'에 작동가능하게 연결된, 식물에서 작동가능한 프로모터 및 상기 DNA 분자에 작동가능하게 연결된 3' 조절 영역을 포함하는 키메라 유전자.
- 제6항에 있어서, 상기 뉴클레오캡시드 폴리펜티드 단편이 상기 완전 길이의 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노 극말단을 포함하는 키메라 유전자.
- 제6항에 있어서, 상기 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 단편이 상기 완전 길이의뉴클레오캡시드 단백질의 카르복시 극말단을 포함하는 키메라 유전자.
- 제6항에 있어서, 상기 DNA 분자가 상기 프로모터에 대해 센스 방향인 키메라 유전자.
- 제6항에 있어서, 상기 DNA 분자가 서열 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 DNA 분자에 존재하는 키메라 유전자.
- 제6항에 있어서, 토스포바이러스가 TSWV-10W, INSV-L1, TSWV-B, TSWV-BL 및 INSV-Beg로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 키메라 유전자.
- 제6항에 따른 키메라 유전자가 삽입된 발현 벡터를 포함하는 재조합 DNA 발현 시스템.
- 제6항에 따른 키메라 유전자로 형질전환된 식물 세포.
- 제6항에 따른 키메라 유전자를 포함하는 트랜스제닉 식물.
- 제14항에 있어서, 상기 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 단편이 상기 완전 길이의 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노 극말단을 포함하는 트랜스제닉 식물.
- 제14항에 있어서, 상기 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 단편이 상기 완전 길이의 뉴클레오캡시드 단백질의 카르복시 극말단을 포함하는 트랜스제닉 식물.
- 제14항에 있어서, 상기 DNA 분자가 상기 프로모터에 대해 센스 방향인 트랜스제닉 식물.
- 제14항에 있어서, 상기 DNA 분자가 서열 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 DNA 분자에 존재하는 트랜스제닉 식물.
- 제14항에 있어서, 토스포바이러스가 TSWV-10W, INSV-L1, TSWV-B, TSWV-BL 및 INSV-Beg로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 트랜스제닉 식물.
- 제14항에 있어서, 식물이 토마토 식물인 트랜스제닉 식물.
- 제14항에 있어서, 식물이 담배 식물인 트랜스제닉 식물.
- 토스포바이러스에 대한 식물 내성을 부여하는 제6항에 따른 키메라 유전자로 식물 세포를 형질전환시키는 단계, 형질전환된 식물 세포로부터 식물을 재생시키는 단계를 포함하는, 토스포바이러스 내성의 트랜스제닉 식물의 생산 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 단편이 상기 완전 길이의 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노 극말단을 포함하는 것인 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 단편이 상기 완전 길이의 뉴클레오캡시드 단백질의 카르복시 극말단을 포함하는 것인 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 DNA 분자가 상기 프로모터에 대해 센스 방향인 것인 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 DNA 분자가 서열 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 DNA 분자에 존재하는 것인 방법.
- 제22항에 있어서, 토스포바이러스가 TSWV-10W, INSV-L1, TSWV-B, TSWV-BL 및 INSV-Beg로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제22항에 있어서, 식물이 토마토 식물인 방법.
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