KR101509653B1 - 토마토원형반점 바이러스 특이적 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

토마토원형반점 바이러스 특이적 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 토마토원형반점 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 RT-PCR 및 네스티드 PCR용 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 키트 및 이를 이용한 토마토원형반점 바이러스의 특이적 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 검출방법은 식물체 종자와 조직 등을 대상으로 기존 항혈청을 이용한 진단법보다 1,000배 이상의 검출한계로 진단할 수 있고, 지금까지 알려진 모든 계통의 토마토원형반점 바이러스들과 반응할 수 있으며 양성 및 음성 반응의 검증도 가능하기 때문에, 식물바이러스 RT-PCR 진단키트의 산업화와 수입 식물체의 검역현장에서 토마토원형반점 바이러스의 검사에 효율적으로 이용할 수 있다.

Description

토마토원형반점 바이러스 특이적 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도{PRIMER SET FOR DETECTING TOMATO RINGSPOT VIRUS AND THE USE THEREOF}
본 발명은 토마토원형반점 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 PCR용 프라이머 세트에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 토마토원형반점 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 RT-PCR 및 네스티드 PCR용 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 키트 및 이를 이용한 토마토원형반점 바이러스의 특이적 검출방법에 관한 것이다.
토마토원형반점 바이러스(Tomato ringspot virus; ToRSV)는, 분류학적으로 바이러스 Group IV (+) sense ssRNA viruses, Comoviridae과 Nepovirus속으로 분류된다. 토마토원형반점 바이러스(ToRSV)는 식물병원성 바이러스로 감염 시 과실, 꼬투리 및 잎에서 변형과 기형이 발생하며, 전체적으로 왜소화 현상이 나타난다(도 1 참조). 토마토원형반점 바이러스(TRSV)의 입자는 지름이 약 28 nm로 등방형이며, envelope는 형태는 있으나 매우 얇고, 핵산은 single-stranded RNA로 2 종류가 존재한다.
이러한 토마토원형반점 바이러스(ToRSV)는 선충 (X. americanum)의 유충과 애벌레를 벡터로 전염된다. 전염이 되는데 걸리는 시간은 약 1 시간이며, 그 이내에 예방접종을 하면 다시 회복이 된다. 사과, 담배, 제라늄, 단양 앵두, 살구, 신양 앵두, 자두, 복숭아, 동양 자두, 까치밥나무속 식물, 블랙베리, 라즈베리, 산딸기 및 포도를 주요 기주로 활동하며, 고추, 층층나무, 글라디올러스, 수국, 토마토, 난초, 딱총나무 열매, 블루베리 및 민들레에도 감염이 될 수 있다. 특히, 라즈베리 농가에서는 연간 평균 2 m 정도 토마토원형반점 바이러스(ToRSV)가 확산되는데, 일단 확산이 일어나면 바이러스는 줄 방향으로 빠르게 퍼져나가고 직사각형 모양이 남는다. 토마토원형반점 바이러스(ToRSV)에 감염이 되면 3년 이내에 라즈베리 줄기의 10-80%가 일부 또는 완전히 사멸하며, 감염된 줄기에서 열린 열매는 일반 줄기에서 열린 열매보다 무게가 21%가량 적게 나가고, 수확량이 50% 이상 감소한다.
한편, 종래의 바이러스 진단법으로는 전자현미경 또는 혈청학적 방법을 주로 사용하였다. 전자현미경을 이용한 방법은 바이러스의 존재를 확인할 수는 있지만, 형태적 특징으로 종을 진단하기는 거의 불가능하다. 혈청학적 방법 중 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 방법은 가장 일반적으로 사용되는 진단 방법이나, 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 진단법보다 검출감도가 약 1,000배 정도 낮으며, 항체와 검사시료의 예상하지 못한 비특이적 반응으로 정확한 진단이 실패하는 경우가 자주 발생한다.
종래, 토마토원형반점 바이러스(ToRSV)를 검출하기 위하여 ELISA를 주로 사용하고 있으나, 식물체 추출물과 항혈청의 비특이적 반응으로 오진단하는 경우가 종종 있으며, 검사시료에서 ToRSV의 감염율이 낮을 경우 진단에 실패할 가능성이 높은 문제점이 있다. 또한, 검역현장에서는 하나의 검사시료에 대하여 다양한 병원체의 진단을 수행하여야 되므로 여러 가지 진단법을 사용할 경우 많은 노동력과 검사비용이 소요되는 문제점도 있다. 따라서, 각각의 병원체에 대하여 동일한 검사법의 개발이 필요하다.
또한, PCR 검사법으로 진단할 때, 특이적 반응의 강도가 낮아 판별이 곤란할 경우, 또는 다른 핵산과의 비특이적 반응을 일으킬 경우를 대비한 검사시스템이 필요한 실정이다. 더욱이, 분리주 특이적 프라이머를 사용할 경우 진단에 실패할 수 있기 때문에 바이러스 종 내에 존재하는 모든 분리주를 검출할 수 있는 종 특이적 프라이머의 개발이 요구된다.
현재, RNA 바이러스의 진단에서는 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 RT-PCR 방법이 가장 일반적으로 사용되고 있다. 그러나, 병원체의 PCR 진단을 위해서는 종 특이적 프라이머의 개발이 가장 중요함에도 불구하고, 토마토원형반점 바이러스(ToRSV)를 검출하기 위한 특이적 프라이머는 아직 개발된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 농가에서 크게 문제가 되고 있는 토마토원형반점 바이러스(ToRSV)를 용이하게 검출하기 위해 연구한 결과, 현장에서 전문장비 없이 토마토원형반점 바이러스(ToRSV)의 다양한 strain들을 고감도로 신속하게 모두 검출할 수 있는 RT-PCR용 프라이머 세트를 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 토마토원형반점 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 RT-PCR 및 네스티드 PCR용 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 키트 및 이를 이용한 토마토원형반점 바이러스 특이적 검출방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 토마토원형반점 바이러스 특이적 검출을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머 세트로서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 23 및 서열번호 25로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열의 조합을 포함하되, 상기 조합은 정방향 프라이머(forward primer)가 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 23 및 서열번호 25로 이루어진 군에서 선택되고, 역방향 프라이머(reverse primer)가 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 12 및 서열번호 14로 이루어진 군에서 선택되는 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 서열번호 23 및 서열번호 4로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)용인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 서열번호 15 및 서열번호 12로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)용인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 서열번호 25 및 서열번호 6으로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트는 네스티드 중합효소연쇄반응(nested PCR)용인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 서열번호 17 및 서열번호 14로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트는 네스티드 중합효소연쇄반응(nested PCR)용인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 토마토원형반점 바이러스 특이적 검출을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 토마토원형반점 바이러스 특이적 검출을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 양성대조구로 서열번호 26 및 돌연변이 양성대조구로 서열번호 27로 이루어진 염기서열을 포함하는 플라스미드를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은,
(a) 토마토원형반점 바이러스를 검출하고자 하는 샘플로부터 추출한 RNA를 주형으로 상기 프라이머 세트를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 실시하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)로부터 얻어진 RT-PCR 산물을 주형으로 상기 프라이머 세트를 사용하여 네스티드 중합효소 연쇄반응(nested PCR)을 실시하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)로부터 얻어진 nested PCR 산물의 크기를 확인하여 토마토원형반점 바이러스의 감염여부를 판단하는 단계를 포함하는, 토마토원형반점 바이러스 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 조성물, 키트 및 이를 이용한 검출방법을 이용하면, 식물 검체로부터 단시간 내에 전문장비 없이 고정밀도로 토마토원형반점 바이러스(ToRSV)를 검출할 수 있다. 따라서 식물 재배농가에 막대한 피해를 줄 수 있는 바이러스를 조기에 검출 가능하게 하여 보다 신속하고 효율적인 ToRSV 진단 시스템을 구축할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 통해 바이러스 감염으로 인한 경제적 손실을 방지할 수 있을 것으로 기대된다.
또한, 본 발명에 따른 토마토원형반점 바이러스(ToRSV) 검출용 프라이머 세트는, 식물체 종자와 조직 등을 대상으로 기존 항혈청을 이용한 진단법보다 1,000배 이상의 검출한계로 진단할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 토마토원형반점 바이러스(ToRSV) 검출용 프라이머 세트는, 지금까지 알려진 모든 계통의 토마토원형반점 바이러스(ToRSV)들과 반응할 수 있고, 양성 및 음성 반응의 검증도 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 토마토원형반점 바이러스(ToRSV) 검출용 프라이머 세트는, 식물바이러스 RT-PCR 진단키트의 산업화와 수입 식물체의 검역현장에서 토마토원형반점 바이러스(ToRSV)의 검사에 효율적으로 이용할 수 있다.
도 1은 토마토원형반점 바이러스(ToRSV)에 감염된 증상을 나타낸 것이다.
도 2는 토마토원형반점 바이러스(ToRSV) 검출을 위해 설계한 프라이머 지도를 나타낸 것이다.
도 3은 토마토원형반점 바이러스(ToRSV) 진단용 프라이머의 1차 선발 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 토마토원형반점 바이러스(ToRSV) 진단용 프라이머의 2차 선발 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 토마토원형반점 바이러스(ToRSV) 진단용 프라이머의 3차 선발 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 토마토원형반점 바이러스(ToRSV) 진단용 프라이머의 4차 선발 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 선발된 프라이머 조합들의 end-point PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 선발된 프라이머 조합들의 nested PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 토마토원형반점 바이러스(ToRSV) 진단용 프라이머 세트 1 (N120/C20, 549bp)의 결합부위를 나타낸 것이다.
도 10은 토마토원형반점 바이러스(ToRSV) 진단용 프라이머 세트 2 (N80/C60, 741bp)의 결합부위를 나타낸 것이다.
도 11은 토마토원형반점 바이러스(ToRSV) 진단용 프라이머 구간을 포함하는 양성대조구의 산물과 최종 선발된 프라이머 조합들의 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 토마토원형반점 바이러스(ToRSV)의 양성대조구(N10/C20, 2,474 bp)의 결합부위를 나타낸 것이다.
도 13은 토마토원형반점 바이러스(ToRSV) 돌연변이-양성대조구(N120/C20, 555bp)의 결합부위, nested PCR 프라이머 결합부위, 염기서열 삽입부위를 나타낸 것이다.
본 발명은 토마토원형반점 바이러스(ToRSV)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 토마토원형반점 바이러스(ToRSV)를 검출하기 위한 최적의 RT-PCR용 프라이머 세트 및 이에 부합하는 검정용 네스티드 프라이머 세트(nested primer ser)와 이를 뒷받침할 수 있는 종 특이적 프라이머 은행 및 양성대조구를 포함하고 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 용어 "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명에서 용어 "중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)"은, DNA 또는 RNA의 특정영역을 튜브 내에 대량으로 증폭하는 획기적인 기술을 의미하며, PCR 증폭효율에 영향을 미치는 요인으로는 각 단계의 반응온도와 시간, cycle수, 반응액 조성(주형 DNA, dNTP농도, Mg2+ 농도 등) 등이 있지만, 프라이머 설계가 가장 중요하다.
본 발명에서 용어 "역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reactionpolymerase chain reaction; RT-PCR)"은 RNA를 대상으로 역전사효소를 이용하여 역전사 반응을 시행하여 complementary DNA를 합성하여 이를 주형으로 이용하여 중합효소 연쇄 반응을 시행하는 기술을 의미한다. 본 발명을 위해 RT-PCR은 42℃, 60분의 역전사반응과 95℃, 10분의 denaturation 후 95℃에서 45초, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분 과정을 35회 반복 후, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시켰다.
본 발명에서 용어 "네스티드 중합효소 연쇄반응(Nested Polymerase Chain Reactionpolymerase chain reaction; nested PCR)"은, 목적하는 영역의 처음의 PCR산물을 주형으로 처음에 사용한 프라이머의 위치보다 양쪽 모두 안쪽으로 프라이머의 위치를 설정하여 중합효소 연쇄 반응을 시행하는 기술을 의미하며, 이를 통해 목적 이외의 영역으로부터 유래하는 산물을 제거할 수 있다. 본 발명을 위해 PCR은 RT-PCR의 역전사반응을 제외한 나머지와 동일하게 반응시켰다.
본 발명은 토마토원형반점 바이러스 특이적 검출을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머 세트로서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 23 및 서열번호 25로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열의 조합을 포함하되, 상기 조합은 정방향 프라이머(forward primer)가 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 23 및 서열번호 25로 이루어진 군에서 선택되고, 역방향 프라이머(reverse primer)가 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 12 및 서열번호 14로 이루어진 군에서 선택되는 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 따른 토마토원형반점 바이러스 특이적 검출을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머 세트에서, 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)용 프라이머의 조합은 바람직하게는 서열번호 23 및 서열번호 4로 이루어진 프라이머 쌍; 또는 서열번호 15 및 서열번호 12로 이루어진 프라이머 쌍일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 토마토원형반점 바이러스 특이적 검출을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머 세트에서, 네스티드 중합효소연쇄반응(nested PCR)용 프라이머의 조합은 바람직하게는 서열번호 25 및 서열번호 6으로 이루어진 프라이머 쌍; 또는 서열번호 17 및 서열번호 14로 이루어진 프라이머 쌍일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 다양하게 조합(55가지)하여(실시예 1 참조), 조합된 프라이머 세트 중 조합 9(서열번호 23 및 서열번호 4) 및 조합 31(서열번호 15 및 서열번호 12)이 토마토원형반점 바이러스(ToRSV)를 검출하는데 최적의 프라이머 세트임을 확인하였고, 검정 시스템인 네스티드 프라이머 세트를 설계한 결과, 조합 9 및 조합 31에 대하여 각각 서열번호 25 및 서열번호 6으로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 17 및 서열번호 14로 이루어진 프라이머 세트가 최적의 네스티드 PCR용 프라이머 세트임을 확인하였다(실시예 2 참조).
이에, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 토마토원형반점 바이러스 특이적 검출을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 토마토원형반점 바이러스 특이적 검출을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 키트를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 키트는 양성대조구로 서열번호 26 및 돌연변이 양성대조구로 서열번호 27로 이루어진 염기서열을 포함하는 플라스미드를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 조성물 및 키트를 이용하면, 식물 검체로부터 단시간 내에 전문장비 없이 고정밀도로 토마토원형반점 바이러스(ToRSV)를 검출할 수 있고, 식물체 종자와 조직 등을 대상으로 기존 항혈청을 이용한 진단법보다 1,000배 이상의 검출한계로 진단할 수 있다.
이에, 본 발명은
(a) 토마토원형반점 바이러스를 검출하고자 하는 샘플로부터 추출한 RNA를 주형으로 상기 프라이머 세트를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 실시하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)로부터 얻어진 RT-PCR 산물을 주형으로 상기 프라이머 세트를 사용하여 네스티드 중합효소 연쇄반응(nested PCR)을 실시하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)로부터 얻어진 nested PCR 산물의 크기를 확인하여 토마토원형반점 바이러스의 감염여부를 판단하는 단계를 포함하는 토마토원형반점 바이러스 검출방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 토마토원형반점 바이러스( ToRSV )에 특이적으로 결합하는 프라이머 설계 및 조합
1-1. 프라이머 설계
토마토원형반점 바이러스(ToRSV)의 진단용 프라이머 설계를 위하여 미국 국립생물정보센터로부터 ToRSV의 11가지 strain과 분류학적으로 유사한 코모비리데 (Comoviridae) 3종의 염기서열을 다운로드 하였고, 구체적인 정보는 하기 표 1에 나타내었다.
Figure 112013076557211-pat00001
다운로드한 14종의 염기서열을 'fasta' format으로 정렬한 뒤, sequence alignment program인 DNAMAN package를 사용하여 multiple alignment 하였다. 그 후 ToRSV의 종 특이적인 서열을 탐색하였고, 약 7.2 Kb 중 '3,716-6,273' 부분을 대상으로 진단용 primer를 설계하였으며, 이에 대한 구체적인 프라이머 지도는 도 2에 나타내었다.
1-2. 프라이머 조합
실시예 1-1에 의해 설계한 프라이머는 정방향 13가지와 역방향 12가지의 총 25가지로, 각각의 프라이머들의 구체적인 염기서열은 하기의 표 2에 나타내었고, 이들을 조합하여 PCR 증폭이 가능한 55가지 조합을 선발하였으며, 각각의 역전사 중합효소연쇄반응(RTPCR) 산물(product)의 예상 크기(length, bp)는 표 3에 나타내었다.
Figure 112013076557211-pat00002
*GenBank accession number NC_003839를 기준으로 작성
Figure 112013076557211-pat00003
실시예 2. 토마토원형반점 바이러스(ToRSV)의 최적 프라이머 세트 선발 및 진단용 프라이머 은행 구축
2-1. 최적 프라이머 세트 선발
ToRSV의 최적 진단용 프라이머 세트 선발을 위해 상기 실시예 1-2에서 설계한 55가지 primer 조합으로 1-4차까지의 선발 과정을 진행하였다.
우선, 1차 선발에서 55가지 조합 중 10가지 조합을 선발하였다(도 3 참조). 2차 선발 대상인 유연관계 바이러스와 3차 선발 대상인 기주관련 바이러스의 목록은 하기 표 4에 나타내었다. 2차 선발에서 10가지 조합 중 7가지의 조합을 선발하였으며 (도 4 참조), 3차 선발에서 7가지 조합 중 6가지 조합을 선발하였다 (도 5 참조). 4차 선발에서 6가지 조합 모두 기주인 콩의 genomic DNA에 대한 비특이적인 반응이 나타났다(도 6 참조).
Figure 112013076557211-pat00004
1-4차 선발 결과, 밴드의 끌림이 없으며 가장 깔끔한 결과를 보인 3가지 조합 (조합 9, 31 및 48)을 선발하였다. 선발된 조합들로 end-point PCR (희석한계 실험)을 실시한 결과, 각각 10-2, 10-4 및 10-1의 민감도를 보임을 확인하였다 (도 7 참조).
한편, 각 lane 별 희석 배수는 다음과 같다. Lane 1~8: ToRSV 원액~10- 7희석; lane 9: negative control; lane 10~17: ToRSV 원액~10- 7희석; lane 18: negative control; lane 19~26: ToRSV 원액~10- 7희석; lane 27: negative control
2-2. 네스티드 중합효소 연쇄반응(nested PCR)용 프라이머 세트 설계
상기 실시예 2-1에 의해 선발된 조합들에 대하여 검정 시스템인 nested 프라이머 조합을 설계하였으며, 상기 프라이머에 대한 구체적인 정보는 하기의 표 5에 나타내었다. 이 때 주형으로 사용되는 RTPCR의 산물은 각각 1/100 희석하여 사용하였다.
Figure 112013076557211-pat00005
Nested PCR 결과, 모든 조합에서 밴드가 나타났으며 일부 비특이적인 밴드도 나타남을 확인할 수 있었다(도 8 참조). Nested PCR 프라이머는 밴드의 밝기와 두께, 비특이적인 밴드의 유무, 크기 (length) 및 선발된 조합과 산물과의 크기가 어느 정도 차이 나는 것을 고려하여 최종 선발하였다.
2-3. 프라이머 은행 구축
상기 실시예 2-1 및 2-2 실험 결과, 조합 9와 31을 ToRSV 최종 진단용 프라이머 조합으로 선발하였고, 검정 시스템인 nested primer 역시 각각 한 세트씩 선발하였다. ToRSV를 검사하기 위한 최종 진단용 primer 조합, nested 프라이머 및 양성대조구의 크기를 하기 표 6에 나타내었고, 각 프라이머의 정보를 하기 표 7에 나타내었다.
Figure 112013076557211-pat00006
Figure 112013076557211-pat00007
실시예 3. 토마토원형반점 바이러스(ToRSV)의 검출 및 양성대조구 제작
3-1. ToRSV의 검출
실시예 2에 의해 얻어진 최종 ToRSV 검출용 프라이머 세트 1과 세트 2를 사용하여 one-step 또는 two-step RT-PCR로 검사를 수행한 결과, 프라이머들이 각각의 상보적 위치에 결합(binding)하여 밴드를 형성함을 확인할 수 있었고, 이때 각각의 서열위치는 도 9 및 도 10에 나타내었다. 보다 구체적으로 즉, 도 9는 ToRSV 진단용 프라이머 세트 1 (N120/C20, 549 bp)의 결합부위([ ] 부분)를 나타낸 것이고, 도 10은 ToRSV 진단용 프라이머 세트 2 (N80/C60, 741 bp)의 결합부위([ ] 부분)를 나타낸 것이다.
3-2. 양성대조구 제작
양성대조구(positive control)로 사용할 수 있도록 진단용 프라이머가 설계된 전체 영역을 포함하는 플라스미드(plasmid)를 제조하였다. 도 11은 ToRSV 진단용 프라이머 구간을 포함하는 양성대조구의 산물과 최종 선발된 프라이머 조합들의 PCR 결과를 나타낸 것이고, 도 12는 ToRSV 양성대조구 (N10/C20, 2,474 bp; 서열번호 26)에서의 결합부위([ ] 부분)를 나타낸 것이다.
3-3. 돌연변이-양성대조구 제작
ToRSV 검출 시 양성대조구의 오염으로 인한 거짓양성이 나타날 경우를 대비하여 plasmid 서열의 일부를 변형한 돌연변이-양성대조구 (mutation positive control)(서열번호 27)를 제작하였다. 도 13은 ToRSV 돌연변이양성대조구 (N120/C20, 555 bp)에서의 결합부위([ ] 부분)과, Nested 프라이머 결합부위(< > 부분)와, 염기서열 삽입에 의한 돌연변이부위(
Figure 112013076557211-pat00008
)를 나타낸 것이다.
돌연변이-양성대조구를 사용할 때에는 ToRSV 최종 진단용 프라이머 세트 1(조합 9)을 사용하여야 하며, nested 검정 역시 set 1의 nested primer를 사용해야 한다(표 7 참조). 제작한 돌연변이-양성대조구를 positive control로 사용한다면, 검사 후에 양성반응이 나타난 시료의 염기서열 분석 할 때, 그것이 진짜 바이러스에 감염되어 있는 시료인지 우리의 양성대조구로부터 오염이 된 것인지를 판단 할 수 있을 것이다. 종 내에는 다양한 주(strain)가 있으며, 일부가 치환(substitution)되어 염기서열 확인 시 산물의 크기가 조금 차이가 있을 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Animal and Plant Quarantine Agency <120> PRIMER SET FOR DETECTING TOMATO RINGSPOT VIRUS AND THE USE THEREOF <130> PB13-11400 <160> 27 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ToRSV-R1-N10 <400> 1 gacgattccc tccggtagtt atgc 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ToRSV-R1-C10 <400> 2 atctttatta cgccagccag gtcc 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ToRSV-R1-N20 <400> 3 gagattcttc aacgggacag 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ToRSV-R1-C20 <400> 4 aaaatttarc atcgggcaca tc 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ToRSV-R1-N30 <400> 5 gaacccgtct taaatcactg g 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ToRSV-R1-C30 <400> 6 agaccacggc ttccactgag aa 22 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ToRSV-R1-N40 <400> 7 cgcttttagt cgcccatct 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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1620 gacggacatt tatcagcgcc tggctgagaa aaattcagtg gccttgaatt gtgattatag 1680 tcgctttgat gggctcctca attaccaggc atatgtgcat attgttaatt ttattaataa 1740 attgtacaac gatgaacatt ctatcgtgcg tggcaatctt ttgatggcta tgtatggtag 1800 gtggagtgtg tgtgggcaga gagttttcga agtccgcgct ggcatgccct ctgggtgtgc 1860 gctcaccgtg atcatcaatt cactttttaa cgagatgttg atcaggtatg tttatcgcat 1920 caccgtacca cgcccccttg taaataattt taaacaggag gtgtgtttga ttgtttatgg 1980 tgatgataat ttaatttcta ttaagccgga caccatgaaa tattttaatg gtgagcaaat 2040 taaaaccatt ctggctaaat ataaagttac cattactgat ggcagtgata agaactcacc 2100 tgttcttaga gccaaaccct tgaaacagct cgattttttg aagagaggtt tcagggttga 2160 aagtgatggg agggtgcttg cccctttaga tttgcaagct atctattctt ccctgtatta 2220 tattaatccg cagggaaata tattaaattc tttgtttttg aatgctcgag tcgctttgag 2280 agagttatat ctccatggcg atgttgagca atttactgct gtcaggaatt tttacgtcaa 2340 gcaaattggc ggaaatttct tgagtctacc ccagtggagg cactgcgctt cgttccatga 2400 tgaacaatat tctcagtgga agccgtggtc ccccgttaaa ttcttggagg tagatgtgcc 2460 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Claims (10)

  1. 토마토원형반점 바이러스 특이적 검출을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머 세트로서,
    상기 프라이머 세트는, 서열번호 23 및 서열번호 4로 이루어진 프라이머 세트;
    서열번호 15 및 서열번호 12로 이루어진 프라이머 세트;
    서열번호 25 및 서열번호 6으로 이루어진 프라이머 세트; 및
    서열번호 17 및 서열번호 14로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 23 및 서열번호 4로 이루어진 프라이머 세트이고, 상기 프라이머 세트는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)용인 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 15 및 서열번호 12로 이루어진 프라이머 세트이고, 상기 프라이머 세트는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)용인 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 25 및 서열번호 6으로 이루어진 프라이머 세트이고, 상기 프라이머 세트는 네스티드 중합효소연쇄반응(nested PCR)용인 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  5. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 17 및 서열번호 14로 이루어진 프라이머 세트이고, 상기 프라이머 세트는 네스티드 중합효소연쇄반응(nested PCR)용인 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  6. 제1항에 따른 프라이머 세트를 포함하는, 토마토원형반점 바이러스 특이적 검출을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 조성물.
  7. 제1항에 따른 프라이머 세트를 포함하는, 토마토원형반점 바이러스 특이적 검출을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 키트.
  8. 제7항에 있어서, 양성대조구로 서열번호 26 및 돌연변이 양성대조구로 서열번호 27로 이루어진 염기서열을 포함하는 플라스미드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 중합효소연쇄반응(PCR)용 키트.
  9. (a) 토마토원형반점 바이러스를 검출하고자 하는 샘플로부터 추출한 RNA를 주형으로 제2항에 따른 프라이머 세트를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 실시하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)로부터 얻어진 RT-PCR 산물을 주형으로 제4항에 따른 프라이머 세트를 사용하여 네스티드 중합효소 연쇄반응(nested PCR)을 실시하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)로부터 얻어진 nested PCR 산물의 크기를 확인하여 토마토원형반점 바이러스의 감염여부를 판단하는 단계를 포함하는, 토마토원형반점 바이러스 검출방법.
  10. (a) 토마토원형반점 바이러스를 검출하고자 하는 샘플로부터 추출한 RNA를 주형으로 제3항에 따른 프라이머 세트를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 실시하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)로부터 얻어진 RT-PCR 산물을 주형으로 제5항에 따른 프라이머 세트를 사용하여 네스티드 중합효소 연쇄반응(nested PCR)을 실시하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)로부터 얻어진 nested PCR 산물의 크기를 확인하여 토마토원형반점 바이러스의 감염여부를 판단하는 단계를 포함하는, 토마토원형반점 바이러스 검출방법.
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Plant Diseases, Vol. 79, No. 10, pp. 1054-1056 (1995.12.31.) *

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