KR101928444B1 - 박과 작물 바이러스 검출용 프라이머 및 이를 이용한 박과 작물 바이러스 검출 방법 - Google Patents
박과 작물 바이러스 검출용 프라이머 및 이를 이용한 박과 작물 바이러스 검출 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101928444B1 KR101928444B1 KR1020120001883A KR20120001883A KR101928444B1 KR 101928444 B1 KR101928444 B1 KR 101928444B1 KR 1020120001883 A KR1020120001883 A KR 1020120001883A KR 20120001883 A KR20120001883 A KR 20120001883A KR 101928444 B1 KR101928444 B1 KR 101928444B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- virus
- mosaic virus
- viruses
- cucumber
- primer
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 박과 작물에 병을 일으키는 4종의 주요 바이러스인 CMV, CGMMV, KGMMV, 및 ZYMV를 특이적으로 검출할 수 있는 PCR용 프라이머 세트 및 이를 이용한 박과 작물의 바이러스 감염 여부 검출 방법에 관한 것으로서, 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트는 한 번의 PCR 반응을 수행하여 박과 작물에 병을 일으키는 주요 바이러스인 CMV, CGMMV, KGMMV, 및 ZYMV의 4종 바이러스를 특이적으로 신속하고 정확하게 검출할 수 있어, 박과 작물의 바이러스에 의한 감염 여부를 매우 간단하게 진단할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 박과 작물에 병을 일으키는 4종의 주요 바이러스, 즉 CMV, CGMMV, KGMMV, 및 ZYMV를 특이적으로 검출할 수 있는 PCR용 프라이머 세트 및 이를 이용한 박과 작물의 바이러스 감염 여부를 검출하는 방법에 관한 것이다.
식물 바이러스 병은 감염 작물의 수량 및 품질을 급격히 감소시키므로 생산량 감소 등 경제적으로 큰 손실을 가져온다. 최근에도 민간업체에서 보급한 종서에서 걀쭉바이러스의 감염 사실이 뒤늦게 발견되어 종서 수거 및 감염 우려 지역에 5년간의 재배를 제한하는 등 큰 문제를 야기한 바 있다. 그럼에도 우리나라의 한해 수출입 물품의 검역이 3,500 ~ 4,200천 건에 이르고 있고, 또한 바이러스 병은 기주범위가 매우 넓고 접촉, 매개 또는 감염된 종서의 사용 등의 다양한 경로를 통해서 2차 감염이 가능하며, 효과적인 방제법이나 약제가 거의 없기 때문에 진단이나 방제가 어려운 실정이다. 따라서 식물 바이러스 병에 대한 조기진단 및 오염원 제거 시스템을 갖추는 것이 가장 효율적인 방제법이며 그 중요성이 점점 높아지고 있다.
국내의 경우 식물에 감염을 유발하는 바이러스의 분리 및 동정에 대한 연구는 대부분 식물바이러스 유전자 은행(www.virusbank.org)과 고령지 농업시험장을 중심으로 1960년대 이후로 이루어지고 있다. 바이러스 병에 의한 대표적인 피해사례로는 PLAV에 의한 잎말림병, PVX와 PVY에 의한 모자이크병(mild mosaic 과 rugose mosaic 증상)에 의한 피해 등이 있었다. 그리고 1977년에는 걀쭉바이로이드(potato spindle tuber viroid, PSTVd)가 발생하여 종자를 전량 폐기 후 일본에서 수입한 사례도 있었다. 이러한 바이러스에 의한 피해는 바이러스의 종류에 따라 약 20~50%의 생산량 감소를 초래 하였다. 이와 같이 바이러스에 감염되면 생산체계의 이상을 복구하는데 최소 5년의 기간이 소모되므로 바이러스의 조기 진단시스템 구축이 우량종서 생산 및 종자 산업에 절실하다.
한편, 일반적으로 바이러스에 의하여 발생하는 식물병에 직접 작용하는 약제방제법은 현재까지 개발되어 있지 않은 실정이기 때문에, 바이러스에 의한 식물병을 관리하기 위해서는 먼저 식물체에 바이러스가 발생하였는지 여부와, 어떠한 바이러스가 발생하였는지 여부를 정밀하고 신속하게 진단하여야 한다. 그러나 바이러스는 크기가 1㎛ 보다 작은 병원체로 광학현미경으로도 그 실체를 관찰할 수 없고, 전자현미경을 필요로 하기 때문에, 육안으로 식물체에 발생한 바이러스를 진단하는 것은 곤란하다. 이에 따라 바이러스를 진단하기 위한 다양한 방법들이 개발되어 사용되고 있다.
지금까지 바이러스를 진단하기 위하여 ELISA와 같은 혈청학적 진단법이 많이 사용되어왔다. 그러나 혈청학적 진단법은 많은 시료를 일반적인 정밀도에서 진단하는데 사용하는 경우에는 큰 무리가 없었으나, 진단대상 바이러스와 혈청학적 유연관계가 있는 바이러스가 존재할 경우에는 식물체에 발생한 바이러스를 잘못 동정하게 된다거나, 바이러스에 감염된 식물체의 종류에 따라 기주유래 물질이 달라지면서, 이 물질과 비특이적 반응으로 인하여 바이러스를 잘못 진단하게되는 문제가 발생하였다. 또한 2종 이상의 바이러스가 복합 감염된 경우에 이를 진단하기 위해서는 다른 종류의 항체를 사용해서 여러 번 진단해야 한다는 문제점이 있었다.
최근에는 식물체에 발생하는 바이러스를 정밀진단하기 위하여 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)법이 사용되고 있다. RT-PCR법에서는 사용하는 프라이머가 진단의 특이성과 정밀도를 결정짓는데, RT-PCR법에서 사용하는 프라이머는 일반적으로 바이러스의 유전자 클로닝을 목적으로 설계되기 때문에 종특이적이지 못하다는 문제가 있었다. 따라서 식물 원인 바이러스에 대한 종 특이적인 검출 프라이머가 개발된다면 식물 바이러스의 감염 여부를 매우 간편하고 신속하게 검출할 수 있을 것이다.
한편, 박과에는 오이, 참외, 멜론, 수박 등 주요 경제작물이 포함되어 있으며, 대부분 시설재배로 생산되기 때문에 바이러스 병에 대한 조기 진단에 의한 피해 예방이 중요하며, 박과의 주요 바이러스 병으로는 CMV(cucumber mosaic virus), CGMMV(cucumber green mottle mosaic virus), KGMMV(kyuri green mottle virus), WMV2(watermelon mosaic virus2), 및 ZYMV(zucchini yellow mosaic virus) 등 5종이 있다. 그러나 이러한 경제성이 우수한 박과 작물 역시 위와 같은 바이러스에 의해 감염되는 경우, 많은 경제적 손실이 초래된다.
이에 박과 작물이 바이러스에 의해 감염되었는지를 조기에 진단할 수 있는 방법으로 대한민국공개특허 제2009-0038732호에는 박과 식물 감염성 바이러스 검출용 올리고뉴클레오타이드에 대한 기술이 개발된 바 있으나, 개발된 이러한 기술은 박과 주요 바이러스들을 각기 구별할 수 있는 기술에는 미치지 못하고 있어 감염 원인 바이러스를 정확히 규명하지 못하는 문제점이 있다.
따라서 박과 작물에 감염을 일으키는 원인 바이러스를 각 종별로 특이적으로 검출할 수 있는 방법의 개발이 필요한 실정이다.
따라서 본 발명의 목적은 4종의 박과 작물 바이러스를 각 종별 특이적으로 한 번의 PCR 방법으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 박과 작물의 바이러스병 감염 여부를 진단할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 박과 작물의 바이러스병 진단용 키트를 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CMV(cucumber mosaic virus), CGMMV(cucumber green mottle mosaic virus), KGMMV(kyuri green mottle virus), 및 ZYMV(zucchini yellow mosaic virus)의 4종 바이러스를 동시에 진단할 수 있는 프라이머 조합으로서, 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 및 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍을 포함하는 박과 작물에 발생하는 4종 바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍은 CMV(cucumber mosaic virus)를 특이적으로 검출하고, 상기 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍은 CGMMV(cucumber green mottle mosaic virus)를 특이적으로 검출하고, 상기 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍은 KGMMV(kyuri green mottle virus)를 특이적으로 검출하고, 상기 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍은 ZYMV(zucchini yellow mosaic virus)를 특이적으로 검출할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 박과 작물은 오이, 참외, 멜론 또는 수박일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 프라이머 세트를 포함하는 박과 작물에 발생하는 4종 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 박과 작물에 발생하는 4종 바이러스인 CMV(cucumber mosaic virus), CGMMV(cucumber green mottle mosaic virus), KGMMV(kyuri green mottle virus), 및 ZYMV(zucchini yellow mosaic virus)를 동시에 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PCR은 미지의 바이러스 게놈을 주형으로 하여, 94℃에서 3~5분간 변성반응 시킨 후, 94℃에서 30초~50초, 55℃에서 30초~50초 및 72℃에서 45초~50초를 한 사이클로 하여 30회~35회 사이클을 반복 실시한 다음, 72℃에서 7분간 연장 반응을 수행하는 1번의 PCR 반응으로 박과 작물에 발생하는 4종 바이러스인 CMV(cucumber mosaic virus), CGMMV(cucumber green mottle mosaic virus), KGMMV(kyuri green mottle virus), 및 ZYMV(zucchini yellow mosaic virus)를 동시에 검출할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 한 번의 PCR 반응을 수행하여 박과 작물에 병을 일으키는 주요 바이러스인 CMV, CGMMV, KGMMV, 및 ZYMV의 4종 바이러스를 특이적으로 신속하고 정확하게 검출할 수 있어, 박과 작물의 바이러스에 의한 감염 여부를 쉽게 진단할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 CMV-P1 특이적 마커를 사용한 PCR 결과(위), 및 BLASTN 결과(아래)이다.
도 2는 CMV II 특이적 마커를 사용한 PCR 결과(위), 및 BLASTN 결과(아래)이다.
도 3은 CGMMV 특이적 마커를 사용한 PCR 결과(좌), 및 BLASTN 결과(우)이다.
도 4는 KGMMV 특이적 마커를 사용한 PCR 결과(좌), BLASTN 결과(우)이다.
도 5는 ZYMV 특이적 마커를 사용한 PCR 결과이다.
도 6은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 multiplex PCR 분석결과이다.
도 7은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 오이 작물에서의 바이러스 감염 여부 진단결과이다.
도 2는 CMV II 특이적 마커를 사용한 PCR 결과(위), 및 BLASTN 결과(아래)이다.
도 3은 CGMMV 특이적 마커를 사용한 PCR 결과(좌), 및 BLASTN 결과(우)이다.
도 4는 KGMMV 특이적 마커를 사용한 PCR 결과(좌), BLASTN 결과(우)이다.
도 5는 ZYMV 특이적 마커를 사용한 PCR 결과이다.
도 6은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 multiplex PCR 분석결과이다.
도 7은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 오이 작물에서의 바이러스 감염 여부 진단결과이다.
본 발명은 박과 작물에 병을 일으키는 여러 종의 바이러스를 특이적으로 한 번에 검출할 수 있는 PCR용 프라이머 세트에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 박과 작물 감염원인의 주요 바이러스인 CMV, CGMMV, KGMMV, 및 ZYMV의 4종 바이러스를 한 번의 PCR로 검출할 수 있는 프라이머 조합인 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 및 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍으로 이루어진 프라이머 세트를 제공함을 특징으로 한다.
특히 본 발명자들은 본 발명의 일실시예를 통해 박과 작물에 병을 일으키는 주요 바이러스인 상기 4종에 대한 데이터베이스 상의 서열정보를 바탕으로 이들을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머를 설계하였고, 설계한 프라이머들을 대상으로 4종 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 후보 프라이머들을 이용하여 바이러스에 감염된 작물을 대상으로 바이러스 검출을 수행한 결과, 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 및 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍으로 이루어진 프라이머 세트를 사용한 경우, 4종의 바이러스 특이 유전자를 서로 다른 크기로 동시에 탐지할 수 있으며, 단 한번의 PCR 반응으로 각 바이러스를 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명에서 제공하는 상기 박과 작물에 발생하는 4종 바이러스 검출용 프라이머 세트에 포함되는 상기 프라이머 쌍들 중, 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍은 CMV(cucumber mosaic virus)를 특이적으로 검출할 수 있고, 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍은 CGMMV(cucumber green mottle mosaic virus)를 특이적으로 검출할 수 있으며, 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍은 KGMMV(kyuri green mottle virus)를 특이적으로 검출하고, 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍은 ZYMV(zucchini yellow mosaic virus)를 특이적으로 검출할 수 있는 특징이 있다.
그러므로 본 발명에서 제공하는 상기 프라이머 세트는 박과 작물에 발생하는 상기 4종의 바이러스를 검출하는데 매우 용이하게 사용할 수 있으며, 또한 본 발명은 상기 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 박과 작물에 발생하는 4종 바이러스 검출용 키트를 제공할 수 있다.
여기서 상기 본 발명에서 사용한프라이머란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.
또한, 상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.
나아가 본 발명에서 제공하는 상기 박과 작물에 발생하는 4종 바이러스 검출용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다.
나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있으며, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
이 외에도 본 발명은 상기 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 박과 작물에 발생하는 4종 바이러스인 CMV(cucumber mosaic virus), CGMMV(cucumber green mottle mosaic virus), KGMMV(kyuri green mottle virus), 및 ZYMV(zucchini yellow mosaic virus)를 동시에 검출하는 방법을 제공할 수 있으며, 특히 본 발명에서 제공하는 상기 검출 방법은 미지의 바이러스 게놈을 주형으로 하여, 94℃에서 3~5분간 변성반응 시킨 후, 94℃에서 30초~50초, 55℃에서 30초~50초 및 72℃에서 45초~50초를 한 사이클로 하여 30회~35회 사이클을 반복 실시한 다음, 72℃에서 7분간 연장 반응을 수행하는 1번의 PCR 반응으로 박과 작물에 발생하는 4종 바이러스를 동시에 검출할 수 있다.
일반적으로 PCR 반응은 사용하는 주형 DNA 및 프라이머의 염기서열 종류와 수에 따라 PCR 반응의 시간 및 온도 조건이 각기 달리 최적화 되어지는데, 본 발명의 경우, 4종 박과 감염 바이러스에 대해 종 특이적인 프라이머들을 가지고 한 번의 PCR 반응 만으로 감염 여부를 진단할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 바이러스들이 감염시킬 수 있는 박과 작물로는 이에 제한되지는 않으나 오이,참외, 멜론 또는 수박일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
박과 작물에 바이러스의 접종 및 감염 확인
박과에 병을 일으키는 바이러스들을 각각의 기주식물체에 접종한 후 감염 여부를 확인하였다. 사용한 바이러스는 발명자들이 보유하던 균주와 식물 바이러스 유전자은행에서 분양받은 것을 사용하였는데, 즉, CMV-PI, CMV II, CGMMV, KGMMV, ZYMV-A, 및 ZYMV-Sq을 사용하였다. 식물체에 바이러스의 접종을 위해 먼저 막자사발을 이용하여 접종 대상인 식물체 0.01g을 4㎕의 0.01M K2HPO4(제2인산칼륨)에 섞어 마쇄한 후, 잘 소독된 철사에 묻혀 상기 바이러스들을 기주식물에 접종하였다. 또한, 바이러스 접종에 의한 식물병 발병조건을 위해 상기 바이러스를 기주식물의 본엽 1기에 접종한 후 온도는 22℃, 습도는 80% 이상으로 유지하였고, 본엽 3기 이후에 접종한 잎이 아닌 새잎을 육안으로 확인하고, ELISA 및 항체 여과지 진단키트(기산바이오)를 사용하여 발병 여부를 확인하였다. 또한 진단키트로 검정이 어려운 경우, PCR 산물(product)을 시퀀싱(sequencing)한 후 BLASTN을 실시하여 각 바이러스에 대한 감염 여부의 유의성을 검정하였다(도 1 내지 도 5 참조).
<
실시예
2>
바이러스 검출용
프라이머의
설계
<2-1> 바이러스 염기서열의
In
Silico
분석
상기 기주식물에 접종한 바이러스의 염기서열을 확보하기 위해 상기 4종의 박과 바이러스들에 대해 NCBI 데이터베이스에 등록된 바이러스 시퀀스(sequence)를 탐색하고, 각 바이러스의 형태적 특징에 따라 위 시퀀스를 분류하여 정리하였다. 그리고 바이러스 웹사이트(http://tree.bio.ed.ac.uk/rnavirusdb)를 활용하여 바이러스 구조를 확인한 후, CLC Sequence viewer program을 이용하여 정리된 서열을 정렬(alignment)하고, 계통수(phylogenetic tree)를 프로그램을 이용하여 작성하여 서열을 그룹화하였다.
<2-2> 특이적
프라이머
조합 설계
각 식물 바이러스에서 그룹화된 서열정보를 바탕으로 프로그램(Primer 3)을 이용하여 아래 표 1과 같이 각 바이러스를 특이적으로 탐지할 수 있는 후보 프라이머 조합을 설계하였다.
<실시예 3>
PCR 반응을 이용한 바이러스 병 진단
<3-1> 바이러스 RNA 추출(Trizol method)
상기 실시예에서 바이러를 감염시킨 기주식물체의 잎 100㎎에 액체질소를 첨가하고, 비드(bead)를 이용하여 잎을 파쇄한 후, 트리졸(Trizol) 시약 1,000㎕를 첨가하고 볼텍싱(vortexing)한 후, 상온에서 5분간 방치하였고, 다시 200㎕의 클로로포름(chloroform)을 각 튜브에 넣고 15초간 볼텍싱한 다음, 상온에 15분간 방치하였다. 12,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리한 후, 상층액 500㎕를 새로운 튜브로 옮기고, 400㎕의 아이소프로판올(isopropanol)을 첨가하여 인버팅(inverting)하였다. 12,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리한 다음, 상층액을 버리고 70% 에탄올 1㎖로 세척하였다. 12,000rpm에서 4℃의 온도로 2분간 원심분리한 후, 상층액을 버리고 상온에서 5분간 건조한 다음 DEPC 40㎕를 첨가하고 65℃에서 10분간 배양(incubation)하고 잘 섞은 후 -70℃에 보관하였다.
<3-2> 바이러스 cDNA 합성(SuperScript, invitrogen)
실시예 <3-1>에서 수득한 각 바이러스의 RNA을 대상으로 cDNA의 합성을 위해 RT-PCR을 수행하였는데, 반응 조성물로는 추출한 RNA 10ng, Oligo DT 1㎕, dNTPs 1㎕, DEPC 1㎕을 혼합하고 총 부피(volume)가 11㎕가 되도록 조정한 다음, 65℃에서 5분, 4℃에서 1분간 반응시켰다. 이후, 10X RT 2㎕, 25mM Mgcl2 4㎕, 0.1M DTT 2㎕, RNase Out 1㎕ 혼합하고 총 부피를 20㎕로 조정하고, 42℃에서 2분간 반응시켰다. 이후, SSⅡ 1㎕ 첨가 후, 총 부피 21㎕로 조정하여 42℃에서 50분, 70℃에서 15분 반응시키고 RNase H 1㎕ 넣고 37℃에서 20분간 처리하고 -20℃에서 보관하였다.
<3-3> 바이러스 cDNA에 대한 본 발명의 프라이머를 사용한 PCR 분석
상기 실시예 <3-2>의 실험을 통해 각 바이러스의 cDNA를 수득한 후, 이들 바이러스를 검출할 수 있다고 예상되는 프라이머들로서 상기 표 1에 기재된 프라이머들을 대상으로, 각 4종의 바이러스를 각각 검출할 수 있는 프라이머쌍을 선택하여 각각의 조합을 만든 후, PCR 반응을 수행하여, 4종의 바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 조합을 찾아내었는데, 먼저 이를 위한 PCR 반응 조성물로 바이러스 cDNA 10ng, 10× buffer(1.0mM MgCl2포함), dNTPs 200 μM, taq polymerase 0.1 Unit, Primer 0.25uM 를 혼합하여 총 부피가 25 ㎕가 되도록 조절한 후, 94℃에서 5분간 변성, 94℃에서 45초, 55℃에서 45초, 72℃에서 45초를 한 사이클(cycle)로 하여 총 35회 반복 실시한 후, 72℃에서 7분간 반응시켰다.
그 결과, 4종의 바이러스를 한 번에 검출할 수 있는 특이 프라이머 조합으로서, 하기 표 2의 프라이머 세트를 사용할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 여기서 CMV-PI과 CMV II의 CMV 변종 바이러스는 한 쌍의 프라이머로 검출할 수 있으며, ZYMV-A와 ZYMV-Sq의 ZYMV 변종 바이러스도 한 쌍의 프라이머로 검출할 수 있다는 것을 알 수 있었다(도 6 참조).
| 바이러스명 | 프라이머명 | 프라이머서열(5'→3') | 산물길이 | 서열번호 |
| CMV-PI & CMV II | FPCMVR2A-F | YWCVACTCTGCCYACNCAYRD | 240 | 1 |
| FPCMVR2A-R | AGCTCWGGRACRTCRGCRTTW | 2 | ||
| CGMMV | FPCGMMV_7-F | TCCTAGCAATCCGACGACTG | 214 | 3 |
| FPCGMMV_7-R | ACCACCGTCAGAAGACCCTC | 4 | ||
| KGMMV | FPKGMMV_6-F | CCAACGCTGCGACAAATAAT | 106 | 5 |
| FPKGMMV_6-R | ACCATTTTGCGTTTGCAGAG | 6 | ||
| ZYMV-A & ZYMV-Sq | FPZYMV_6F | CCAACGCTGCGACAAATAAT | 276 | 7 |
| FPZYMV_6R | GTCTTCGCTAGTGGTGGCAA | 8 |
<
실시예
4>
본 발명의 프라이머 쌍을 이용한 박과 바이러스 검출
나아가 본 발명자들은 상기 실시예 3을 통해 4종의 박과 바이러스를 검출할 수 있는 바이러스 특이 프라이머 조합을 사용하여 실제 박과 작물에 감염된 바이러스를 종별 검출가능한지 확인하기 위해, 상기 바이러스들에 감염된 오이 개체 16개를 선별하여 PCR 분석으로 병 발생 여부를 진단하였다. 이를 위해 상기 표 2의 프라이머 조합을 모두 사용하였는데, 상기 프라이머 4개 세트를 Speed Vac. 기기를 사용하여 30분간 농축시킨 다음, 이것을 시중에 판매되고 있는 Premixture와 함께 혼합한 다음, PCR 반응으로서 94℃에서 5분간 변성, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 50초를 한 사이클로 하여 총 35회 사이클을 반복 실시한 후, 72℃에서 7분간 반응시켜 합성하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 규명한 프라이머 조합을 사용하여 단 한번의 PCR 방법을 통해 4종의 박과 바이러스의 감염 여부를 신속하고 정확하게 검출할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> FNP,inc.
<120> PCR primers for detecting viruses occurring on cucurbitaceae and
method for detceting cucurbitaceae viruses
<160> 8
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FPCMVR2A-F primer
<400> 1
ywcvactctg ccyacncayr d 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FPCMVR2A-R primer
<400> 2
agctcwggra crtcrgcrtt w 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FPCGMMV_7-F primer
<400> 3
tcctagcaat ccgacgactg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FPCGMMV_7-R primer
<400> 4
accaccgtca gaagaccctc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FPKGMMV_6-F primer
<400> 5
ccaacgctgc gacaaataat 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FPKGMMV_6-R primer
<400> 6
accattttgc gtttgcagag 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FPZYMV_6F primer
<400> 7
ccaacgctgc gacaaataat 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FPZYMV_6R primer
<400> 8
gtcttcgcta gtggtggcaa 20
Claims (6)
- CMV(cucumber mosaic virus), CGMMV(cucumber green mottle mosaic virus), KGMMV(kyuri green mottle virus), 및 ZYMV(zucchini yellow mosaic virus)의 4종 바이러스를 단일 RT-PCR 반응으로 동시에 진단할 수 있는 프라이머 조합으로서, 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 및 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍을 포함하는 박과 작물에 발생하는 상기 4종 바이러스 검출용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍은 CMV(cucumber mosaic virus)를 특이적으로 검출하고,
상기 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍은 CGMMV(cucumber green mottle mosaic virus)를 특이적으로 검출하고,
상기 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍은 KGMMV(kyuri green mottle virus)를 특이적으로 검출하고,
상기 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍은 ZYMV(zucchini yellow mosaic virus)를 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 하는 박과 작물에 발생하는 4종 바이러스 검출용 프라이머 세트. - 제1항에 있어서,
상기 박과 작물은 오이, 참외, 멜론 또는 수박인 것을 특징으로 하는 박과 작물에 발생하는 4종 바이러스 검출용 프라이머 세트. - 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 박과 작물에 발생하는 CMV(cucumber mosaic virus), CGMMV(cucumber green mottle mosaic virus), KGMMV(kyuri green mottle virus), 및 ZYMV(zucchini yellow mosaic virus)로 구성되는 4종 바이러스 검출용 키트.
- 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 박과 작물에 발생하는 4종 바이러스인 CMV(cucumber mosaic virus), CGMMV(cucumber green mottle mosaic virus), KGMMV(kyuri green mottle virus), 및 ZYMV(zucchini yellow mosaic virus)를 동시에 검출하는 방법.
- 제5항에 있어서,
상기 PCR은 미지의 바이러스 게놈을 주형으로 하여, 94℃에서 3~5분간 변성반응 시킨 후, 94℃에서 30초~50초, 55℃에서 30초~50초 및 72℃에서 45초~50초를 한 사이클로 하여 30회~35회 사이클을 반복 실시한 다음, 72℃에서 7분간 연장 반응을 수행하는 1번의 PCR 반응으로 박과 작물에 발생하는 4종 바이러스인 CMV(cucumber mosaic virus), CGMMV(cucumber green mottle mosaic virus), KGMMV(kyuri green mottle virus), 및 ZYMV(zucchini yellow mosaic virus)를 동시에 검출하는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120001883A KR101928444B1 (ko) | 2012-01-06 | 2012-01-06 | 박과 작물 바이러스 검출용 프라이머 및 이를 이용한 박과 작물 바이러스 검출 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120001883A KR101928444B1 (ko) | 2012-01-06 | 2012-01-06 | 박과 작물 바이러스 검출용 프라이머 및 이를 이용한 박과 작물 바이러스 검출 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20130080968A KR20130080968A (ko) | 2013-07-16 |
| KR101928444B1 true KR101928444B1 (ko) | 2019-02-27 |
Family
ID=48992852
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020120001883A KR101928444B1 (ko) | 2012-01-06 | 2012-01-06 | 박과 작물 바이러스 검출용 프라이머 및 이를 이용한 박과 작물 바이러스 검출 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101928444B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20230085607A (ko) | 2021-12-07 | 2023-06-14 | 대한민국(농촌진흥청장) | 박과작물 황화바이러스 동시 검출용 프라이머 세트, 및 이를 이용한 박과작물 황화바이러스 검출용 조성물, 키트 및 방법 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102144834B1 (ko) * | 2018-10-30 | 2020-08-14 | 전남대학교산학협력단 | 박과 작물 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 박과 작물 바이러스병 진단방법 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100496017B1 (ko) * | 2002-11-29 | 2005-06-16 | 대한민국 | 박과작물 발생 5종 바이러스 동시진단용 프라이머 조합 |
-
2012
- 2012-01-06 KR KR1020120001883A patent/KR101928444B1/ko active IP Right Grant
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20230085607A (ko) | 2021-12-07 | 2023-06-14 | 대한민국(농촌진흥청장) | 박과작물 황화바이러스 동시 검출용 프라이머 세트, 및 이를 이용한 박과작물 황화바이러스 검출용 조성물, 키트 및 방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20130080968A (ko) | 2013-07-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rott et al. | Application of next generation sequencing for diagnostic testing of tree fruit viruses and viroids | |
| Nadin-Davis | Molecular epidemiology | |
| Ogwok et al. | Distribution and accumulation of cassava brown streak viruses within infected cassava (Manihot esculenta) plants | |
| Dovas et al. | A spot nested RT-PCR method for the simultaneous detection of members of the Vitivirus and Foveavirus genera in grapevine | |
| Lenarčič et al. | Fast real‐time detection of Potato spindle tuber viroid by RT‐LAMP | |
| Blouin et al. | A new virus discovered by immunocapture of double‐stranded RNA, a rapid method for virus enrichment in metagenomic studies | |
| KR101642771B1 (ko) | 나리 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법 | |
| Kwak et al. | The current incidence of viral disease in Korean sweet potatoes and development of multiplex RT-PCR assays for simultaneous detection of eight sweet potato viruses | |
| Kumar et al. | A multiplex RT-PCR assay for simultaneous detection of five viruses in potato | |
| KR101149422B1 (ko) | 우역 바이러스, 가성우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스의 동시 검출을 위한 다중 프라이머 세트 및 그를 이용한 검출 방법 | |
| Malandraki et al. | One-step multiplex quantitative RT-PCR for the simultaneous detection of viroids and phytoplasmas of pome fruit trees | |
| Peng et al. | One-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Apple chlorotic leaf spot virus | |
| Kwon et al. | Reverse transcription polymerase chain reaction-based system for simultaneous detection of multiple lily-infecting viruses | |
| Cui et al. | Genetic diversity of Prunus necrotic ringspot virus infecting stone fruit trees grown at seven regions in China and differentiation of three phylogroups by multiplex RT-PCR | |
| Watpade et al. | Simultaneous detection of Apple Chlorotic Leaf Spot Virus and Apple mosaic virus in crab apples and apple rootstocks by duplex RT-PCR | |
| Ferriol et al. | Rapid detection and discrimination of fabaviruses by flow‐through hybridisation with genus‐and species‐specific riboprobes | |
| Kim et al. | Identification of plant viruses infecting pear using RNA sequencing | |
| KR101928445B1 (ko) | 가지과 작물 바이러스 검출용 프라이머 및 이를 이용한 가지과 작물 바이러스 검출 방법 | |
| Guček et al. | One-step multiplex RT-PCR for simultaneous detection of four viroids from hop (Humulus lupulus L.) | |
| KR101928444B1 (ko) | 박과 작물 바이러스 검출용 프라이머 및 이를 이용한 박과 작물 바이러스 검출 방법 | |
| Huang et al. | Development of a generic method for inspection of tospoviruses | |
| Khurana et al. | Recent developments towards detection & diagnosis for management of plant viruses | |
| Lin et al. | Development of a multiplex TaqMan real-time RT-PCR assay for simultaneous detection of Asian prunus viruses, plum bark necrosis stem pitting associated virus, and peach latent mosaic viroid | |
| Wani et al. | Development of one step colorimetric RT-LAMP assays for rapid detection of Apple mosaic virus and Prunus necrotic ringspot virus | |
| Raigond et al. | Serological and molecular diagnosis of potato viruses: an overview |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |