KR100496017B1 - 박과작물 발생 5종 바이러스 동시진단용 프라이머 조합 - Google Patents
박과작물 발생 5종 바이러스 동시진단용 프라이머 조합 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 오이모자이크바이러스, 오이녹반모자이크바이러스, 큐리녹반모자이크바이러스, 수박모자이크바이러스2 및 쥬키니황화모자이크바이러스를 동시진단하기 위한 프라이머 조합을 개시한다.
본 발명에 의하면 항혈청을 이용한 진단방법보다 1,000배 이상 검출한계가 높으며, 지금까지 알려진 박과작물 5종 바이러스의 모든 계통에 대한 동시검출이 가능하다.
Description
본 발명은 박과작물에서 문제가 되고 있는 바이러스들의 동시진단을 위한 프라이머 조합에 관한 것이다.
수박, 오이, 쥬키니호박, 애호박, 멜론, 참외 등의 박과작물 재배에서 문제가 되는 바이러스로는 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus, CMV), 오이녹반모자이크바이러스 (Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV), 큐리녹반모자이크바이러스 (Kyuri green mottle mosaic virus, KGMMV), 수박모자이크바이러스2 (Watermelon mosaic virus 2, WMV2), 쥬키니황화모자이크바이러스 (Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)의 5종이 있다.
포장에서 이들 바이러스는 2종 이상 복합감염되어 있는 경우가 많으며, 바이러스에 감염된 식물체의 외관상 병징은 재배품종이나 작형, 환경요인에 따라 매우 다양하고 복합적으로 나타나므로 육안으로 바이러스를 정확하게 진단하기는 매우 어렵다. 한편, 일반적으로 사용되고 있는 바이러스 진단용 항체시약은 한 종의 바이러스만 진단이 가능하므로 복합감염된 시료를 진단해야 할 경우 수종의 시약을 사용하거나, 여러 번 진단해야 하는 문제점이 있다.
또한 이들 5종 바이러스들은 계통 간에 상당한 변이가 존재한다. 현재까지 이들 5종 바이러스에 대한 진단 방법은 혈청학적 진단 방법만이 개시되어 있을 뿐이다. 하지만 동 방법으로는 계통간 변이가 존재하는 경우 검출능의 한계로 인해 검출에 실패할 가능성이 상당히 높은 실정이나 아직 이렇다 할 대안은 제시되고 있지 못하다.
상기 종래 기술이 지니는 문제에 대한 해결방안을 제시하기 위해 안출된 본 발명의 목적은 계통간 변이에도 불구하고, 박과작물에서 발생하는 상기 5종 바이러스의 모든 종에 걸친 광범위한 검출 스펙트럼을 가지는 프라이머 조합을 제공함에 있다.
상기 과제를 해결하기 위한 제 1관점에서의 본 발명은 오이모자이크바이러스, 오이녹반모자이크바이러스, 큐리녹반모자이크바이러스, 수박모자이크바이러스2 및 쥬키니황화모자이크바이러스를 동시진단하기 위한 프라이머 조합으로서, 서열번호 5/11, 서열번호 15/22, 서열번호 27/29, 서열번호 34/40 및 서열번호 49/51로 표현되는 조합 프라이머, 또는 이들 조합 프라이머를 구성하는 개별 염기서열의 상보적인 염기서열 또는 이들 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열로 구성되는 조합 프라이머를 포함하는 상기 5종 바이러스 동시진단용 프라이머 조합을 포함한다.
상기에서 '조합 프라이머'란 개별 염기서열인 포워드프라이머/리버스프라이머로 구성된 개별 프라이머의 조합을 의미한다.
또한 '프라이머 조합'에서 프라이머란 특별한 한정이 없는 한 상기 조합 프라이머를 의미한다.
본 발명의 제 2관점에 의한 동시진단용 프라이머 조합은 오이모자이크바이러스, 오이녹반모자이크바이러스, 큐리녹반모자이크바이러스, 수박모자이크바이러스2 및 쥬키니황화모자이크바이러스를 동시진단하기 위한 프라이머 조합으로서, 서열번호 5/11, 서열번호 15/22, 서열번호 27/29, 서열번호 35/40 및 서열번호 49/51로 표현되는 조합 프라이머, 또는 이들 조합 프라이머를 구성하는 개별 염기서열의 상보적인 염기서열 또는 이들 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열로 구성되는 조합 프라이머를 포함하는 상기 5종 바이러스 동시진단용 프라이머 조합을 포함한다.
또한 상기 제 1관점 및 제 2관점에 있어서의 조합프라이머를 구성하는 변형서열은 염기서열의 일부결실, 과잉의 염기 또는 염기서열의 부가, 또는 염기 서열 중의 염기 또는 부분서열의 다른 염기서열로의 치환, 또는 이들의 복합인 서열을 포함한다.
또한 상기 제 1관점 및 제 2관점에 있어서의 염기서열은 상기 염기서열의 분자상에 결합하는 표식물 및/또는 고체상 담체에 결합가능한 부위가 도입된 서열을 포함한다.
상기에서 변형서열의 경우 실질적으로 상기 5종 바이러스의 게놈과 혼성화(hybridization)능을 유지하는 범위내에서 일부 염기의 결실, 삽입, 부가 및 치환된 서열을 의미한다.
또한 개별 변형서열은 다른 바이러스 게놈과 혼성화가 가능하지 않은 정도의 변형이어야 한다.
프라이머로 사용되는 경우 변형된 염기의 수는 혼성화능을 실질적으로 유지하는 한 특별한 한정을 요하지는 아니하나, 통상 변이의 결과 얻어진 염기서열의 총 염기 개수가 10∼50개 정도가 바람직하다.
변이의 위치는 혼성화를 방해하지 않는 한 특별히 한정되지는 않지만 바람직하게는 중합효소연쇄반응의 단계 중 신장단계(elongation step)에 영향을 미치는 3'말단 부위는 배제되거나, 최소한도의 변이만이 허용되어야 할 것이다.
상기 개별 염기서열의 분자상에 결합하는 표식물(marker)은 방사선 물질 또는 비방사선 물질의 어느 것도 포함될 수 있다. 방사선 물질은 예를 들면, 인산에스테르 부분에 방사선 동위체를 포함하는 것일 수 있다. 비방사선 표식물의 예로는 로다민, 플로오로세인 및 이들 유도체 등의 형광물질 등일 수 있다. 또한 간접적인 표식물로서 비오틴, 햅텐 등이 도입될 수도 있다.
고상 담체(solis-phase carrier)와 결합가능한 부위는 예를 들면, 샌드위치혼성화 반응 등 핵산의 특이 단편을 고상 담체에 특이적으로 결합할 경우에 이용된다. 고상 담체는 중합효소 연쇄반응 생성물의 선택적인 검출을 더욱 효과적으로 수행할 수 있도록 하는 한 특별히 한정되지는 아니한다. 이들 고상 담체의 예로는 예로는 아가로스비드, 폴리아크릴비드, 라텍스, 마이크로타이터, 폴리스티렌볼 등의 고상담체에 프라이머 중에 도입된 결합부위를 포착가능하도록 프트렙토아비딘, 항체 등을 도입한 것 등이 있다.
상기 포식물 또는 고상담체와 결합가능한 부위는 중합연쇄반응시 신장에 방해를 주지 않기 위해 바람직하게는 5'말단부위에 도입된다.
본 발명의 염기서열과는 상이하지만 상기와 같이 염기서열에서 변형서열, 표식물, 고체상 담체 등을 사용하는 보다 구체적인 예가 특허공개 2001-0095120호에 개시되어 있다.
본 발명은 상기 프라이머 조합을 미지의 바이러스의 게놈에 부가하여 중합효소연쇄반응에 의해 얻어진 산물로부터 오이모자이크바이러스, 오이녹반모자이크바이러스, 큐리녹반모자이크바이러스, 수박모자이크바이러스2 및 쥬키니황화모자이크바이러스를 동시진단하는 방법을 포함한다.
프라이머 신장반응은 예를 들면 유전자의 PCR증폭반응에 이용되는 효소, 반응조건 등에 대해서는 각종 수법들이 개시되어 있다. 본 발명의 조합 프라이머를 구성하는 개별 염기서열은 각종 PCR법의 어느 것에 의하더라도 프라이머로서 충분한 길이 및 염기서열을 지니고 있다. 따라서, 각종 PCR의 어느 것을 적용하더라도 상기 설명한 바와 같은 부가적인 변형, 염기길이의 조정, 변이의 도입 등을 필요에 따라 실시하여 바이러스를 검출할 수 있다.
이하 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되어지는 것으로 해석되어져서는 아니된다.
<실시예 1> 바이러스의 분리 및 유지
본 발명을 위해 사용된 바이러스의 분리 방법 및 유지는 다음과 같다.
(1) 실험대상 바이러스
박과작물에 발생하는 5종의 바이러스를 동시에 진단하기 위해 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus, CMV), 오이녹반모자이크바이러스 (Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV), 큐리녹반모자이크바이러스 (Kyuri green mottle mosaic virus, CGMMV), 수박모자이크바이러스2 (Watermelon mosaic virus 2, WMV2) 및 쥬키니황화모자이크바이러스(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)가 이용되었다.
(2) 실험대상 바이러스의 분리
오이모자이크바이러스는 오이, 고추로부터, 오이녹반모자이크바이러스는 수박, 오이 및 참외로부터, 큐리녹반모자이크바이러스는 쥬키니호박과 오이로부터, 수박모자이크바이러스2는 메론으로부터, 쥬키니황화모자이크바이러스는 호박으로부터 각각 분리되었다.
상기 분리된 바이러스는 명아주 (Chenopodium amaranticolor)를 사용하여 식물바이러스 분리에서 일반적으로 사용되고 있는 국부병반분리법으로 순수분리한 다음, 박과식물에 접종하여 그대로 유지시킨 것이다.
<실시예 2> 프라이머의 설계 1(오이모자이크바이러스)
(1) 오이모자이크바이러스 분리주들의 유전정보 분석
오이모자이크바이러스의 모든 계통에 사용할 수 있는 진단용 프라이머를 개발하기 위해 현재까지 알려진 오이모자이크바이러스 분리주들의 유전정보를 분석하였다. 염기서열 분석에 사용한 오이모자이크바이러스 분리주들을 하기 표 1에 나타내었다.
<표 1> 프라이머 설계에 이용한 오이모자이크바이러스 분리주
| 분리주명 | Genbank accession code |
| CMV-C7-2 | D42079 |
| CMV-E5 | D42080 |
| CMV-Fny | D10538 |
| CMV-Kin | Z12818 |
| CMV-Kor | L36251 |
| CMV-legume | D16405 |
| CMV-M | D10539 |
| CMV-M48 | D49496 |
| CMV-NT9 | D28780 |
| CMV-O | D00385 |
| CMV-Q | J02059 |
| CMV-trk7 | L15336 |
| CMV-Y | D12499 |
프라이머 합성을 위한 염기서열 분석은 외피단백질 (coat protein, CP)과 이동단백질(movement protein, MP)을 포함하는 3' 말단영역 (3' untranslated region, 3'UTR)을 대상으로 하였다.
(2) 공통 염기서열의 탐색
상기 영역에서 모든 오이모자이크바이러스 계통들이 공통적으로 가지고 있는 염기서열 중에서 프라이머로서의 조건에 맞는 서열을 탐색하여 7개의 업 스트림 프라이머와 6개의 다운 스트림 프라이머를 하기 표 2와 같이 합성하였다. 합성과정은 화학합성법을 이용하였으며, DNA 자동합성기 모델 381A(퍼킨 엘머사)이 이용되었다.
<표 2> 오이모자이크바이러스 종 특이적으로 설계한 프라이머
| 프라이머 | 염기서열 (5'→3') | 크기 |
| 서열 1 | CCAAGGTACCAGTAGGAC | 18 |
| 서열 2 | GCTACTGAGTGTGACCTA | 18 |
| 서열 3 | TGAGTGTGACCTAGGCCGGCAT | 22 |
| 서열 4 | AGCGTGTGTAGTAATTGGCAAG | 22 |
| 서열 5 | GCTCGCCTGTTGAAGTCGCA | 20 |
| 서열 6 | CGCAGGTGGTTAACGGT | 17 |
| 서열 7 | ATTTGATTCTACCGTGTGG | 19 |
| 서열 8 | CCGAAGAAACCTAGGAGATG | 20 |
| 서열 9 | CGACTGACCATTTTAGCCGTA | 21 |
| 서열 10 | GTAAGCTGGATGGACAACCCGT | 22 |
| 서열 11 | CCACACGGTAGAATCAAAT | 19 |
| 서열 12 | ACCGTTAACCACCTGCG | 17 |
| 서열 13 | TGCGACTTCAACAGGCGAGC | 20 |
상기 설계한 각 프라이머의 위치는 도 1에 나타내었다.
(3) 프라이머 선발
본 발명을 위해 사용한 총(Total) RNA 분리방법과 RT-PCR 조건은 다음과 같다.
1) 총 RNA 분리
총 RNA는 구아니딘산-페놀 추출 방법을 이용하여 분리하였다. 감염식물체 50 ㎎에 변성완충액(4 M 구아니디니움티오시아네이트, 25 mM 소듐시트레이트, 0.5% sarcosyl, 100 mM 2-머켑토에탄올) 600 ㎕를 넣고 유발과 유봉을 이용하여 마쇄하였다.
여기에 2 M 소듐아세테이트 (pH 4.0) 60 ㎕를 첨가하고, 페놀:클로로포름:이소아밀알콜 (125:24:1) 600 ㎕를 첨가하여 혼합 후, 얼음에 15분간 정치시키고 10,000 g에서 20분간 원심분리시켰다.
그런 다음, RNA를 함유하고 있는 수층을 채취하여 같은 양의 이소프로판올과 혼합한 다음 -20℃에서 30분간 정치시키고 10,000 g에서 20분간 원심분리시켰다. 형성된 침전물을 변성완충액 500 ㎕로 녹인 다음, 같은 양의 이소프로판올과 혼합하여 -20℃에서 30분간 정치시키고 10,000 g에서 10분간 원심분리시켰다.
그런 다음, 침전물을 75% 에탄올과 원심분리로 3회 세척하고, 100 ㎕ 증류수로 녹인 것을 냉동보관시켰다.
2) 역전사-중합효소연쇄반응 (RT-PCR)
RT-PCR은 아래의 조건으로 실시하였다.
역전사는 5배의 역전사완충액 (250 mM Tris-HCl, 40 mM MgCl2, 150 mM KCl, 5 mM 디티오스레이톨, pH 8.5) 4 ㎕, AMV 역전사효소 2.5 U, 10 mM dNTP 2 ㎕, RNase 억제제 10 U, 다운스트림 프라이머 25 pmole, 및 총 RNA 1 ㎕를 넣고 증류수를 첨가하여 반응액을 20 ㎕로 만든 후, 42℃에서 30분간 역전사 반응을 실시하고 95℃에서 2분간 처리한 다음 4℃로 냉각시켰다.
PCR은 상기 역전사 반응액 20 ㎕에 10배의 PCR 완충액 (100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl2, 500 mM KCl, pH 8.3) 8 ㎕, 업스트림 프라이머 25 pmole, Taq DNA 중합효소 2.5 U를 넣고 증류수를 첨가하여 100 ㎕ 반응액으로 조성하였다.
PCR은 반응액을 95℃에서 2분간 변성시킨 후, 94℃에서 45초, 58℃에서 1분, 72℃에서 1분 간 총 40회 실시하였다. PCR 산물은 1.2% 아가로오즈젤에서 분석하였다.
합성한 프라이머는 RT-PCR 산물의 크기를 감안하여 업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머를 한 쌍으로 34가지로 조합하였다. 상기 34가지 조합은 오이모자이크바이러스에 감염된 작물에서 분리한 총 RNA와 RT-PCR을 실시하여 오이모자이크바이러스 진단에 보다 효과적인 조합을 1차 선발하였다. 여기서 선발된 프라이머 조합은 서열번호 5/11, 서열번호 7/9 이다(도 2참조).
1차 선발된 프라이머 조합은 박과작물에 발생하는 다른 바이러스인, 오이녹반모자이크바이러스, 큐리녹반모자이크바이러스, 수박모자이크바이러스2, 쥬키니황화모자이크바이러스와도 RT-PCR을 수행한 결과(도 3 참조) 비특이적 반응을 일으키지 않는 것으로 확인되었다.
최종적으로 선발된 프라이머 조합과 PCR 산물의 크기는 표 3과 같다.
<표 3> 최종 선발된 오이모자이크바이러스 진단용 프라이머 조합
| 조합번호 | 포워드 프라이머 | 리버스 프라이머 | 반응생성물 사이즈(bp) |
| 24 | 서열번호 5 | 서열번호 11 | 850 |
| 33 | 서열번호 7 | 서열번호 9 | 450 |
<실시예 3> 프라이머의 설계 2(오이녹반모자이크바이러스)
(1) 오이녹반모자이크바이러스 분리주들의 유전정보 분석
오이녹반모자이크바이러스의 모든 계통에 사용할 수 있는 진단용 프라이머를 개발하기 위해 현재까지 알려진 오이녹반모자이크바이러스 분리주들의 유전정보를 분석하였다. 염기서열 분석에 사용한 오이녹반모자이크바이러스 분리주들을 하기 표 4에 나타내었다.
<표 4> 프라이머 설계에 이용한 오이녹반모자이크바이러스 분리주
| 분리주명 | 분리기주 | 발표년도 | 발표자 |
| CGMMV-W | 수박 | 1983 | Meshi, T. |
| CGMMV-SH | 메론 | 1991 | Ugaki, M. |
| CGMMV-KW1 | 수박 | 1990 | Lee, K. W. |
| CGMMV-KC1 | 오이 | 2000 | 농업과학기술원 식물병리과 |
| CGMMV-SM1 | 참외 | 2000 | 농업과학기술원 식물병리과 |
| CGMMV-SW1 | 수박 | 2000 | 농업과학기술원 식물병리과 |
프라이머 합성을 위한 염기서열 분석은 외피단백질 (coat protein, CP)과 이동단백질(movement protein, MP)을 포함하는 3' 말단영역 (3' untranslated region, 3'UTR)을 대상으로 하였다.
(2) 공통 염기서열의 탐색
상기 영역에서 모든 오이녹반모자이크바이러스 계통들이 공통적으로 가지고 있는 염기서열 중에서 프라이머로서의 조건에 맞는 서열을 탐색하여 5개의 업 스트림 프라이머와 5개의 다운 스트림 프라이머를 하기 표 5와 같이 합성하였다. 합성과정은 화학합성법을 이용하였으며, DNA 자동합성기 모델 381A(퍼킨 엘머사)이 이용되었다.
<표 5> 오이녹반모자이크바이러스 종 특이적으로 설계한 프라이머
| 종류 | 프라이머 | 염기서열 (5'→3') | 크기 | 위치 |
| 업스트림프라이머 | 서열 14 | TGATCTTACAAAACACCT | 18 | MP |
| 서열 15 | ATGGAACGTACCGGAATC | 18 | MP | |
| 서열 16 | AATCGGAGGTTGGACTCTGCTTCTG | 25 | MP | |
| 서열 17 | AATCCGATCACACCTAGCAAA | 21 | CP | |
| 서열 18 | CTGAGTCGCTTAACGCTGTA | 20 | CP | |
| 다운스트림프라이머 | 서열 19 | AGAATTACTGCCCATAGA | 18 | 3'UTR |
| 서열 20 | TAAGCTTTCGAGGTGGTAG | 19 | CP | |
| 서열 21 | GACTCTATTAAATTATCTATCTC | 23 | CP | |
| 서열 22 | AATTAAGTAAAGTCCTGACG | 20 | CP | |
| 서열 23 | TGGAGGTTTAGAATGCCGCTTAC | 23 | MP |
상기 설계한 각 프라이머의 위치는 도 4에 나타내었다.
(3) 프라이머 선발
본 발명을 위해 사용한 총(Total) RNA 분리방법과 RT-PCR 조건은 실시예 2에서와 동일하다.
합성한 프라이머는 RT-PCR 산물의 크기를 감안하여 업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머를 한 쌍으로 17가지로 조합하였다. 상기 17가지 조합은 오이녹반모자이크바이러스에 감염된 작물에서 분리한 총 RNA와 RT-PCR을 실시하여 오이녹반모자이크바이러스 진단에 효과적인 조합을 1차 선발하였다. 여기서 선발된 프라이머 조합은 서열번호 17/20, 서열번호 16/20, 서열번호 16/21 및 서열번호 15/22 이다(도 5참조).
1차 선발된 프라이머 조합은 박과작물에 발생하는 다른 바이러스인, 오이모자이크바이러스, 큐리녹반모자이크바이러스, 수박모자이크바이러스2, 쥬키니황화모자이크바이러스와도 RT-PCR을 수행하여(도 6 참조) 비특이적 반응을 일으키지 않는 프라이머 조합을 최종적으로 선발하였다.
최종적으로 선발된 프라이머 조합과 PCR 산물의 크기는 표 6과 같다.
<표 6> 최종 선발된 오이녹반모자이크바이러스 진단용 프라이머 조합
| 조합번호 | 포워드 프라이머 | 리버스 프라이머 | 반응생성물 사이즈(bp) |
| 6 | 서열번호 17 | 서열번호 20 | 476 |
| 11 | 서열번호 16 | 서열번호 21 | 447 |
| 14 | 서열번호 15 | 서열번호 22 | 609 |
<실시예 4> 프라이머의 설계 3(큐리녹반모자이크바이러스)
(1) 큐리녹반모자이크바이러스 분리주들의 유전정보 분석
큐리녹반모자이크바이러스의 모든 계통에 사용할 수 있는 진단용 프라이머를 개발하기 위해 현재까지 알려진 큐리녹반모자이크바이러스 분리주들의 유전정보를 분석하였다. 염기서열 분석에 사용한 큐리녹반모자이크바이러스 분리주들을 하기 표 7에 나타내었다.
<표 7> 프라이머 설계에 이용한 큐리녹반모자이크바이러스 분리주
| 분리주명 | 분리기주 | 염기서열 |
| KGMMV-C | 오이 | 농업과학기술원 식물병리과 |
| KGMMV-Y | 오이 | AB015145 (Genbank) |
| KGMMV-Z | 쥬키니호박 | AF239212 (Genbank) |
| KGMMV-KC | 오이 | 농업과학기술원 식물병리과 |
| KGMMV-YC1 | 오이 | 농업과학기술원 식물병리과 |
| CFMMV | 오이 | AF321057 (Genbank) |
프라이머 합성을 위한 염기서열 분석은 외피단백질 (coat protein, CP)과 이동단백질(movement protein, MP)을 포함하는 3' 말단영역 (3' untranslated region, 3'UTR)을 대상으로 하였다.
(2) 공통 염기서열의 탐색
상기 영역에서 모든 큐리녹반모자이크바이러스 계통들이 공통적으로 가지고 있는 염기서열 중에서 프라이머로서의 조건에 맞는 서열을 탐색하여 4개의 업 스트림 프라이머와 6개의 다운 스트림 프라이머를 하기 표 8와 같이 합성하였다. 합성과정은 화학합성법을 이용하였으며, DNA 자동합성기 모델 381A(퍼킨 엘머사)이 이용되었다.
<표 8> 큐리녹반모자이크바이러스 종 특이적으로 설계한 프라이머
| 프라이머 | 염기서열 (5'→3') | 크기 | 위치 |
| 서열 24 | CTTATTTTCACCTTTTAGAT | 20 | 54K |
| 서열 25 | CGTGACTTTATGGTTA | 16 | MP |
| 서열 26 | ACGCAAAATGGTAAAGACA | 19 | CP |
| 서열 27 | AGTCGCGCATTGCTGCTTTGAT | 22 | CP |
| 서열 28 | TGATTCGAACACCTCTACCCATA | 23 | 3'UTR |
| 서열 29 | CTTACGCCAGCATGTCGTCACA | 22 | 3'UTR |
| 서열 30 | ATCTGAGGAATGTCGTTGTGAG | 22 | CP |
| 서열 31 | CAGCAATGCGCGACTCACG | 19 | CP |
| 서열 32 | TAAGACACTAACACGAAGACCT | 22 | MP |
| 서열 33 | GAGAACTTACAGATAG | 16 | MP |
상기 설계한 각 프라이머의 위치는 도 7에 나타내었다.
(3) 프라이머 선발
본 발명을 위해 사용한 총(Total) RNA 분리방법과 RT-PCR 조건은 실시예 2에서와 동일하다.
합성한 프라이머는 RT-PCR 산물의 크기를 감안하여 업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머를 한 쌍으로 13가지로 조합하였다. 상기 13가지 조합은 큐리녹반모자이크바이러스에 감염된 작물에서 분리한 총 RNA와 RT-PCR을 실시하여 큐리녹반모자이크바이러스 진단에 효과적인 조합을 1차 선발하였다. 여기서 선발된 프라이머 조합은 서열번호 26/28, 서열번호 27/28, 및 서열번호 27/29 이다(도 8참조).
1차 선발된 프라이머 조합은 박과작물에 발생하는 다른 바이러스인, 오이모자이크바이러스, 오이녹반모자이크바이러스, 수박모자이크바이러스2, 쥬키니황화모자이크바이러스와도 RT-PCR을 수행하여(도 9 참조) 비특이적 반응을 일으키지 않는 프라이머 조합을 최종적으로 선발하였다.
최종적으로 선발된 프라이머 조합과 PCR 산물의 크기는 표 9와 같다.
<표 9> 최종 선발된 큐리녹반모자이크바이러스 진단용 프라이머 조합
| 조합번호 | 포워드 프라이머 | 리버스 프라이머 | 반응생성물 사이즈(bp) |
| 1 | 서열번호 27 | 서열번호 28 | 403 |
| 2 | 서열번호 26 | 서열번호 28 | 512 |
| 5 | 서열번호 27 | 서열번호 29 | 376 |
<실시예 5> 프라이머의 설계 4(수박모자이크2 바이러스)
(1) 수박모자이크바이러스2 분리주들의 유전정보 분석
수박모자이크바이러스2의 모든 계통에 사용할 수 있는 진단용 프라이머를 개발하기 위해 현재까지 알려진 수박모자이크바이러스2 분리주들의 유전정보를 분석하였다. 염기서열 분석에 사용한 수박모자이크바이러스2 분리주들을 하기 표 10에 나타내었다.
<표 10> 프라이머 설계에 이용한 수박모자이크바이러스2 분리주
| 분리주명 | 염기서열 |
| WMV2-Israeli | AF322376 (Genbank) |
| WMV2 | D00535 (Genbank) |
| WMV2-Habenaria | AB001994 (Genbank) |
| WMV2-Tonga | D22907 (Genbank) |
| WMV2-USA | D13913 (Genbank) |
프라이머 합성을 위한 염기서열 분석은 외피단백질 (coat protein, CP)과 이동단백질(movement protein, MP)을 포함하는 3' 말단영역 (3' untranslated region, 3'UTR)을 대상으로 하였다.
(2) 공통 염기서열의 탐색
상기 영역에서 모든 수박모자이크바이러스2 계통들이 공통적으로 가지고 있는 염기서열 중에서 프라이머로서의 조건에 맞는 서열을 탐색하여 5개의 업 스트림 프라이머와 6개의 다운 스트림 프라이머를 하기 표 11와 같이 합성하였다. 합성과정은 화학합성법을 이용하였으며, DNA 자동합성기 모델 381A(퍼킨 엘머사)이 이용되었다.
<표 11> 수박모자이크2 바이러스 종 특이적으로 설계한 프라이머
| 프라이머 | 염기서열 (5'→3') | 크기 |
| 서열 34 | CTCTAAGTGCTTCATTCGCTG | 21 |
| 서열 35 | TCATGTCACACCAGGCCA | 18 |
| 서열 36 | TCCATACATAGCTGAGACA | 19 |
| 서열 37 | GTTTAACACTCGAGCAA | 17 |
| 서열 38 | AGTCCGTATATGCCTAGAT | 19 |
| 서열 39 | CAACAAACATTACCGTACCTCG | 22 |
| 서열 40 | CTTATAACGACCCGAAATGCTA | 22 |
| 서열 41 | ATCTAGGCATATACGGACT | 19 |
| 서열 42 | TTATCGATACACCAAACCAT | 20 |
| 서열 43 | TTGCTCGAGTGTTAAAC | 17 |
| 서열 44 | TGTCTCAGCTATGTATGGA | 19 |
상기 설계한 각 프라이머의 위치는 도 10에 나타내었다.
(3) 프라이머 선발
본 발명을 위해 사용한 총(Total) RNA 분리방법과 RT-PCR 조건은 실시예 2에서와 동일하다.
합성한 프라이머는 RT-PCR 산물의 크기를 감안하여 업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머를 한 쌍으로 22가지로 조합하였다. 상기 22가지 조합은 수박모자이크바이러스2에 감염된 작물에서 분리한 총 RNA와 RT-PCR을 실시하여 수박모자이크바이러스2 진단에 보다 효과적인 조합을 1차 선발하였다. 여기서 선발된 프라이머 조합은 서열번호 34/41, 서열번호 34/40, 서열번호 35/40, 서열번호 38/39 이다(도 11참조).
1차 선발된 프라이머 조합은 박과작물에 발생하는 다른 바이러스인, 오이모자이크바이러스, 오이녹반모자이크바이러스, 큐리녹반모자이크바이러스, 쥬키니황화모자이크바이러스와도 RT-PCR을 수행한 결과(도 12 참조) 비특이적 반응을 일으키지 않는 프라이머 조합 중 보다 우수한 특성을 가지는 조합을 최종적으로 선발하였다.
최종적으로 선발된 프라이머 조합과 PCR 산물의 크기는 표 12와 같다.
<표 12> 최종 선발된 수박모자이크2 바이러스 진단용 프라이머 조합
| 조합번호 | 포워드 프라이머 | 리버스 프라이머 | 반응생성물 사이즈(bp) |
| 5 | 서열번호 34 | 서열번호 40 | 1340 |
| 11 | 서열번호 35 | 서열번호 40 | 1262 |
<실시예 6> 프라이머의 설계 5(쥬키니황화모자이크바이러스)
(1) 쥬키니황화모자이크바이러스 분리주들의 유전정보 분석
쥬키니황화모자이크바이러스의 모든 계통에 사용할 수 있는 진단용 프라이머를 개발하기 위해 현재까지 알려진 쥬키니황화모자이크바이러스 분리주들의 유전정보를 분석하였다. 염기서열 분석에 사용한 쥬키니황화모자이크바이러스 분리주들을 하기 표 14에 나타내었다.
<표 14> 프라이머 설계에 이용한 쥬키니황화모자이크바이러스 분리주
| 분리주명 | 염기서열 |
| ZYMV-Florida | D13914 (Genbank) |
| ZYMV-California | L31350 (Genbank) |
| ZYMV-Reunion | L29569 (Genbank) |
| ZYMV-Singapore | AF014811 (Genbank) |
프라이머 합성을 위한 염기서열 분석은 외피단백질 (coat protein, CP)과 이동단백질(movement protein, MP)을 포함하는 3' 말단영역 (3' untranslated region, 3'UTR)을 대상으로 하였다.
(2) 공통 염기서열의 탐색
상기 영역에서 모든 쥬키니황화모자이크바이러스 계통들이 공통적으로 가지고 있는 염기서열 중에서 프라이머로서의 조건에 맞는 서열을 탐색하여 6개의 업 스트림 프라이머와 6개의 다운 스트림 프라이머를 하기 표 14와 같이 합성하였다. 합성과정은 화학합성법을 이용하였으며, DNA 자동합성기 모델 381A(퍼킨 엘머사)이 이용되었다.
<표 14> 쥬키니황화모자이크바이러스 종 특이적 프라이머
| 프라이머 | 염기서열 (5'→3') | 크기 |
| 서열 45 | TGTGTACACTCCAATTCT | 18 |
| 서열 46 | GTTCATGTCCCACCAAGCAAT | 21 |
| 서열 47 | CCATACATAGCTGAGACA | 18 |
| 서열 48 | TCTCATGGGAAAATTGTGCC | 20 |
| 서열 49 | TATATAGAGATGAGAAATGCAGA | 23 |
| 서열 50 | AATGTTTCTTCAAGGTTGTT | 20 |
| 서열 51 | AGGCTTGCAAACGGAGTCTAAT | 22 |
| 서열 52 | CTGGACAACTAACATAAACT | 20 |
| 서열 53 | ATATTAGAATTACGTCGGCAG | 21 |
| 서열 54 | CCTACCCTTTACTGCATTGT | 20 |
| 서열 55 | TTCGAAGCAAACCATACCTC | 20 |
| 서열 56 | GGCACAATTTTCCCATGAGA | 20 |
상기 설계한 각 프라이머의 위치는 도 13에 나타내었다.
(3) 프라이머 선발
본 발명을 위해 사용한 총(Total) RNA 분리방법과 RT-PCR 조건은 실시예 2에서와 동일하다.
합성한 프라이머는 RT-PCR 산물의 크기를 감안하여 업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머를 한 쌍으로 29가지로 조합하였다. 상기 29가지 조합은 오이모자이크바이러스에 감염된 작물에서 분리한 총 RNA와 RT-PCR을 실시하여 오이모자이크바이러스 진단에 보다 효과적인 조합을 1차 선발하였다. 여기서 선발된 프라이머 조합은 서열번호 46/51, 서열번호 48/52, 서열번호 49/51 이다(도 14참조).
1차 선발된 프라이머 조합은 박과작물에 발생하는 다른 4종의 바이러스인, 오이모자이크바이러스, 오이녹반모자이크바이러스, 큐리녹반모자이크바이러스, 수박모자이크바이러스2와도 RT-PCR을 수행한 결과(도 15 참조) 비특이적 반응을 일으키지 않는 것으로 확인되었다.
최종적으로 선발된 프라이머 조합과 PCR 산물의 크기는 표 15과 같다.
<표 15> 최종 선발된 쥬키니황화모자이크바이러스 진단용 프라이머 조합
| 조합번호 | 포워드 프라이머 | 리버스 프라이머 | 반응생성물 사이즈(bp) |
| 12 | 서열번호 46 | 서열번호 51 | 1424,1423,1458 |
| 22 | 서열번호 48 | 서열번호 52 | 826,860 |
| 27 | 서열번호 49 | 서열번호 51 | 510,511,545 |
<실시예 7> 5종 바이러스 동시진단용 프라이머 조합
상기 실시예 2 내지 6에서 선발된 프라이머 조합 중 오이모자이크바이러스는 서열번호 5/11 및 서열번호 7/9, 오이녹반모자이크바이러스는 서열번호 17/20, 서열번호 17/21, 및 서열번호 15/22, 큐리녹반모자이크바이러스는 서열번호 27/28 및 서열번호 27/29, 수박모자이크바이러스2는 서열번호 34/40 및 서열번호 35/40, 쥬키니황화모자이크바이러스는 서열번호 48/52 및 서열번호 49/51을 선발하였다.
선발된 프라이머쌍은 RT-PCR 산물의 크기를 참고하여 전기영동 겔에서 육안으로 확인할 수 있도록 하기 표 16에서와 같이 18가지 프라이머 조합을 만들었다.
<표 16> 박과작물 발생 5종 바이러스 동시진단용 프라이머 조합의 RT-PCR 산물(서열번호)
| 조합 | CMV | CGMMV | KGMMV | WMV2 | ZYMV |
| 1 | 5/11 | 17/20 | 27/28 | 34/40 | 49/51 |
| 2 | 5/11 | 17/20 | 27/29 | 34/40 | 49/51 |
| 3 | 5/11 | 17/21 | 27/29 | 34/40 | 49/51 |
| 4 | 5/11 | 15/22 | 27/28 | 34/40 | 49/51 |
| 5 | 5/11 | 15/22 | 27/29 | 34/40 | 49/51 |
| 6 | 5/11 | 17/20 | 27/28 | 35/40 | 49/51 |
| 7 | 5/11 | 17/20 | 27/29 | 35/40 | 49/51 |
| 8 | 5/11 | 17/21 | 27/29 | 35/40 | 49/51 |
| 9 | 5/11 | 15/22 | 27/28 | 35/40 | 49/51 |
| 10 | 5/11 | 15/22 | 27/29 | 35/40 | 49/51 |
| 11 | 7/9 | 15/22 | 27/28 | 34/40 | 48/52 |
| 12 | 7/9 | 15/22 | 27/29 | 34/40 | 48/52 |
| 13 | 7/9 | 15/22 | 27/28 | 34/40 | 49/51 |
| 14 | 7/9 | 15/22 | 27/29 | 34/40 | 49/51 |
| 15 | 7/9 | 15/22 | 27/28 | 35/40 | 48/52 |
| 16 | 7/9 | 15/22 | 27/29 | 35/40 | 48/52 |
| 17 | 7/9 | 15/22 | 27/28 | 35/40 | 49/51 |
| 18 | 7/9 | 15/22 | 27/29 | 35/40 | 49/51 |
상기 18가지 프라이머 조합을 대상으로 5종 바이러스 각각에 대한 RT-PCR 수행결과는 도 16(a)∼(e)에 도시되어 있다. RT-PCR 조건은 어닐링을 52℃에서 수행한 것을 제외하고는 실시예 2에서와 실질적으로 동일하다.
상기 실험결과로부터 18가지 프라이머 조합 중에서 5가지 바이러스에 모두 효과적으로 반응하는 조합을 최종적으로 선발하였다(표 17, 도 17참조).
<표 17> 최종 선발된 박과작물발생 바이러스 동시 진단용 프라이머 조합
| 조합 | CMV | CGMMV | KGMMV | WMV2 | ZYMV |
| 5 | 5/11 | 15/22 | 27/29 | 34/40 | 49/51 |
| 10 | 5/11 | 15/22 | 27/29 | 35/40 | 49/51 |
본 발명에 의하면 항혈청을 이용한 진단방법보다 1,000배 이상 검출한계가 높으며, 지금까지 알려진 박과작물 5종 바이러스의 모든 계통에 대한 동시검출이 가능하다.
도 1은 오이모자이크바이러스(CMV) 프라이머의 위치도
도 2는 프라이머 조합에 따른 오이모자이크바이러스(CMV)와의 RT-PCR 사진
(Lane 1: 1/13, Lane 2: 1/12, Lane 3: 1/11, Lane 4: 1/10, Lane 5: 1/9, Lane 6: 1/8, Lane 7: 2/13, Lane 8: 2/12, Lane 9: 2/11, Lane 10: 2/10, Lane 11: 2/9, Lane 12: 2/8, Lane 13: 3/13, Lane 14: 3/12, Lane 15: 3/11, Lane 16: 3/10, Lane 17: 3/9, Lane 18: 3/8, Lane 19: 4/12, Lane 20: 4/11, Lane 21: 4/10, Lane 22: 4/9, Lane 23: 4/8, Lane 24: 5/11, Lane 25: 5/10, Lane 26: 5/9, Lane 27: 5/8, Lane 28: 6/11, Lane 29: 6/10, Lane 30: 6/9, Lane 31: 6/8, Lane 32: 7/10, Lane 33: 7/8, Lane 34: 7/9)
도 3은 CMV 진단을 위한 1차 선발 프라이머의 조합과 다른 관련 바이러스와의 RT-PCR 사진
(Lane 1,6: CMV, Lane 2,7: WMV2, Lane 3,8: ZYMV, Lane 4,9: CGMMV, Lane 5,10: KGMMV)
도 4는 오이녹반모자이크바이러스(CGMMV) 프라이머의 위치도
도 5는 프라이머 조합에 따른 오이녹반모자이크바이러스(CGMMV)와의 RT-PCR 사진
(Lane 1: 18/19, Lane 2: 17/19, Lane 3: 16/19, Lane 4: 15/19, Lane 5: 14/19, Lane 6: 17/20, Lane 7: 16/20, Lane 8: 15/20, Lane 9: 14/20, Lane 10: 17/21, Lane 11: 16/21, Lane 12: 15/21, Lane 13: 14/21, Lane 14: 15/22, Lane 15: 14/22, Lane 16: 15/23, Lane 17: 14/23)
도 6은 CGMMV 진단을 위한 1차 선발 프라이머의 조합과 다른 관련 바이러스와의 RT-PCR 사진
(Lane 1,6,11,16: CMV, Lane 2,7,12,17: WMV2, Lane 3,8,13,18: ZYMV, Lane 4,9,14,19: CGMMV, Lane 5,10,15,20: KGMMV)
도 7은 큐리녹반모자이크바이러스(KGMMV) 프라이머의 위치도
도 8은 프라이머 조합에 따른 큐리녹반모자이크바이러스(KGMMV)와의 RT-PCR 사진
(Lane 1: 27/28, Lane 2: 26/28, Lane 3: 25/28, Lane 4: 24/28, Lane 5: 27/29, Lane 6: 26/29, Lane 7: 25/29, Lane 8: 24/29, Lane 9: 25/30, Lane 10: 24/30, Lane 11: 25/31, Lane 12: 24/31, Lane 13: 24/33)
도 9는 KGMMV 진단을 위한 1차 선발 프라이머의 조합과 다른 관련 바이러스와의 RT-PCR 사진
(Lane 1,6,11: CMV, Lane 2,7,12: WMV2, Lane 3,8,13: ZYMV, Lane 4,9,14: CGMMV, Lane 5,10,15: KGMMV)
도 10은 수박모자이크바이러스2(WMV2) 프라이머의 위치도
도 11은 프라이머 조합에 따른 수박모자이크바이러스2(WMV2)와의 RT-PCR 사진
(Lane 1: 34/44, Lane 2: 34/43, Lane 3: 34/42, Lane 4: 34/41, Lane 5: 34/40, Lane 6: 34/39, Lane 7: 35/44, Lane 8: 35/43, Lane 9: 35/42, Lane 10: 35/41, Lane 11: 35/39, Lane 12: 35/40, Lane 13: 36/43, Lane 14: 36/42, Lane 15: 36/41, Lane 16: 36/40, Lane 17: 36/39, Lane 18: 37/41, Lane 19: 37/40, Lane 20: 37/39, Lane 21: 38/40, Lane 22: 38/39)
도 12는 WMV2 진단을 위한 1차 선발 프라이머의 조합과 다른 관련 바이러스와의 RT-PCR 사진
(Lane 1,6,11,16: CMV, Lane 2,7,12,17: WMV2, Lane 3,8,13,18: ZYMV, Lane 4,9,14,19: CGMMV, Lane 5,10,15,20: KGMMV)
도 13은 쥬키니황화모자이크바이러스(ZYMV) 프라이머의 위치도
도 14는 프라이머 조합에 따른 쥬키니황화모자이크바이러스(ZYMV)와의 RT-PCR 사진
(Lane 1: 45/56, Lane 2: 45/55, Lane 3: 45/54, Lane 4: 45/53, Lane 5: 45/52, Lane 6: 45/51, Lane 7: 46/56, Lane 8: 46/55, Lane 9: 46/54, Lane 10: 46/53, Lane 11: 46/52, Lane 12: 46/51, Lane 13: 47/56, Lane 14: 47/55, Lane 15: 47/54, Lane 16: 47/53, Lane 17: 47/52, Lane 18: 47/51, Lane 19: 48/55, Lane 20: 48/54, Lane 21: 48/53, Lane 22: 48/52, Lane 23: 48/51, Lane 24: 49/54, Lane 25: 49/53, Lane 26: 49/52, Lane 27: 49/51, Lane 28: 50/52, Lane 29: 50/51)
도 15는 ZYMV 진단을 위한 1차 선발 프라이머의 조합과 다른 관련 바이러스와의 RT-PCR 사진
(Lane 1,6,11: CMV, Lane 2,7,12: WMV2, Lane 3,8,13: ZYMV, Lane 4,9,14: CGMMV, Lane 5,10,15: KGMMV)
도 16(a)는 오이모자이크바이러스(CMV)에 대한 5종 바이러스 동시진단용 프라이머 조합의 RT-PCR 사진.
도 16(b)는 오이녹반모자이크바이러스 (CGMMV)에 대한 5종 바이러스 동시진단용 프라이머 조합의 RT-PCR 사진
도 16(c)는 큐리녹반모자이크바이러스 (KGMMV)에 대한 5종 바이러스 동시진단용 프라이머 조합의 RT-PCR 사진
도 16(d)는 수박모자이크바이러스2 (WMV2)에 대한 5종 바이러스 동시진단용 프라이머 조합의 RT-PCR 사진
도 16(e)는 쥬키니황화모자이크바이러스 (ZYMV)에 대한 5종 바이러스 동시진단용 프라이머 조합의 RT-PCR 사진
도 17은 최종 선발된 박과작물발생 5종 바이러스 동시진단용 프라이머 조합에 의한 박과작물 바이러스를 진단한 RT-PCR 사진
(Lane 1,6: CMV, Lane 2,7: WMV2, Lane 3,8: ZYMV, Lane 4,9: CGMMV, Lane 5,10: KGMMV)
<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION
<120> Primer Combination for Simultaneous Detection of Five
Cucurbit-infecting Viruses
<160> 56
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 1
ccaaggtacc agtaggac 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 2
gctactgagt gtgaccta 18
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 3
tgagtgtgac ctaggccggc at 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 4
agcgtgtgta gtaattggca ag 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 5
gctcgcctgt tgaagtcgca 20
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 6
cgcaggtggt taacggt 17
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
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<212> DNA
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<400> 56
ggcacaattt tcccatgaga 20
Claims (7)
- 오이모자이크바이러스, 오이녹반모자이크바이러스, 큐리녹반모자이크바이러스, 수박모자이크바이러스2 및 쥬키니황화모자이크바이러스를 동시진단하기 위한 프라이머 조합으로서, 서열번호 5/11, 서열번호 15/22, 서열번호 27/29, 서열번호 34/40 및 서열번호 49/51로 표현되는 조합 프라이머, 또는 이들 조합 프라이머를 구성하는 개별 염기서열의 상보적인 염기서열로 구성되는 조합 프라이머를 포함하는 상기 5종 바이러스 동시진단용 프라이머 조합.
- 삭제
- 삭제
- 오이모자이크바이러스, 오이녹반모자이크바이러스, 큐리녹반모자이크바이러스, 수박모자이크바이러스2 및 쥬키니황화모자이크바이러스를 동시진단하기 위한 프라이머 조합으로서, 서열번호 5/11, 서열번호 15/22, 서열번호 27/29, 서열번호 35/40 및 서열번호 49/51로 표현되는 조합 프라이머, 또는 이들 조합 프라이머를 구성하는 개별 염기서열의 상보적인 염기서열로 구성되는 조합 프라이머를 포함하는 상기 5종 바이러스 동시진단용 프라이머 조합.
- 삭제
- 삭제
- 제1항 또는 제4항에서 선택된 프라이머 조합을 미지의 바이러스의 게놈에 부가하여 중합효소연쇄반응에 의해 얻어진 산물로부터 오이모자이크바이러스, 오이녹반모자이크바이러스, 큐리녹반모자이크바이러스, 수박모자이크바이러스2 및 쥬키니황화모자이크바이러스를 동시진단하는 방법
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| Paper 1998, Vol.14(6) pp.630-635, * |
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