KR20000018073A - 유전자 증폭용 프라이머의 고안과 이를 이용한이병식물체로부터 오이 황화 모틀 모자이크 바이러스의신속한 유전자 진단 방법 - Google Patents

유전자 증폭용 프라이머의 고안과 이를 이용한이병식물체로부터 오이 황화 모틀 모자이크 바이러스의신속한 유전자 진단 방법 Download PDF

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장성홍
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장성홍
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Abstract

본 발명은 특정 DNA 서열을 증폭할 수 있는 중합효소연쇄반응법의 특성을 이용하여 오이 황화 모틀 모자이크 바이러스 (cucumber green mottle mosaic virus ; CGMMV)를 신속하고 정확하게 진단 및 동정할 수 있는 유전자 증폭용 프라이머이며 이의 염기서열 및 이를 이용한 박과식물 등의 바이러스 진단방법에 관한 것이다.

Description

유전자 증폭용 프라이머의 고안과 이를 이용한 이병식물체로부터 오이 황화 모틀 모자이크 바이러스의 신속한 유전자 진단 방법{Design of primers for amplification of viral gene and use of the primers for rapid molecular diagnostic method of cucumber green mottle mosaic virus from diseased plant tissue}
박과식물 중에서 수박, 박, 메론 등은 국내의 중요한 경제적 작물로서 우리나라를 비롯하여 아시아권과 유럽, 미국 등 전세계에서 대량 재배되고 있다. 그러나, 수박 등은 각종 바이러스로 인한 경제적 피해가 매우 큰 현실이며, 이들 바이러스를 방제할 농약이 없는 현실이며, 따라서, 바이러스의 방제를 목적으로 신속 정확한 바이러스의 진단과 동정을 통한 이병식물의 제거와 궁극적으로는 바이러스 저항성 형질전환 식물체를 제작 활용하고 있는 국제적 추세에 있다. 박과식물에는 cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV), zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), cucumber mosaic virus (CMV) 등이 문제가 되고 있으며, 국내에도 이들 바이러스가 수박과 메론 등에서 해마다 큰 경제적 피해를 주고 있다. 특히, 수박에 CGMMV가 발병되면 잎의 심한 병징 뿐만 아니라 감염후기에는 과육부분이 색깔이 변색하는 피수박이 되어 상품적인 가치가 전혀 없게 된다. CGMMV는 국내의 주요 수박재배단지를 중심으로 1980년대 중반부터 현재까지 경제적인 피해가 막심한 바이러스이며, 이로 인한 사회적 불안까지 일으킨 주요방제대상 병원체이다. 특히, 우량한 개체로부터 건전한 종자를 채취하여야 종자전염되는 바이러스가 이듬해 문제시 되지 않게 된다. 그러나, 현재 개발된 바이러스 동정법은 그 감도나 재현성에 문제가 있으며, 우량하고 무병상태의 모본을 선발하고 이로부터 채취된 종자를 신속하고 정확하게 바이러스의 감염여부를 조사할 필요성이 있다고 하겠다. 따라서, 본 발명에서는 CGMMV를 이병식물체로부터 신속 정확하게 유전자 진단과 동정을 할 수 있는 유전자증폭용 프라이머의 고안과 이를 이용한 식물에서의 진단방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명에서 개발된 프라이머를 사용하여 유전공학적으로 바이러스 저항성 식물육성에 직접적으로 활용 가능하며, 인공적인 항체생산의 재료와 식물발현용 바이러스 벡터개발 등에 이용 가능한 CGMMV의 외피단백질 유전자를 유전공학적으로 클로닝할 수 있는 장점이 있다.
본 발명은 특정 DNA 서열을 증폭할 수 있는 중합효소연쇄반응법의 특성을 이용하여 오이 황화 모틀 모자이크 바이러스 (cucumber green mottle mosaic virus ; CGMMV)를 신속하고 정확하게 진단 및 동정할 수 있는 유전자 증폭용 프라이머이며 이의 염기서열 및 이를 이용한 박과식물 등의 바이러스 진단방법에 관한 것이다.
도 1은 유전자 증폭용 프라이머의 위치와 예상되는 증폭산물에 대한 도식도이고,
도 2는 이병식물체 조직으로부터 유전자 진단용 시료의 제작과정 도면이며,
도 3은유전자 증폭용 프리이머를 사용한 CGMMV 유전자 진단의 예 (M: 1kb DNA marker, 1: CGMMV 이병식물체에서 추출한 전핵산, 2: 건전 수박에서 추출한 전핵산). 화살표 부분이 진단용 증폭되는 유전자의 부위이다.
실시예1:유전자 증폭용 프라이머의 고안
본 발명에서는 CGMMV의 외피단백질 유전자의 N 말단 및 C 말단의 염기서열을 이용하여 하기와 같이 CGMMV에 특이적인 프라이머 한 세트 [CGMCP3 : GenBank Accession AJ243352, CGMCP5 : GenBank Accession AJ243351]를 제작하였다 (도면 1 참조).
프라이머 이름 프라이머의 염기서열 (5'쪽 - 3'쪽)
CGMCP3 GAAGAGTCCAGTTCTGTTC
CGMCP5 ACCCTCGAAACTAAGCTTTC
실시예2:바이러스 정제 및 유전자 분리와 식물체로부터 전핵산의 제조 방법
바이러스를 떡잎상태의 건전한 오이에 인공적으로 즙액접종하여 바이러스를 대량증식한 다음, 이를 재료로 바이러스를 정제하였다. 정제된 바이러스로부터 바이러스 유전자를 phenol 추출법으로 분리 정제하였다. 또한, 실제적인 바이러스 진단을 위해 이병식물 잎을 사용하여 도면 2와 같은 방법으로 시료를 조제하여 유전자 진단에 이용하였다.
실시예3:RT-PCR법에 의한 CGMMV 유전자 진단 방법
정제된 바이러스 RNA 또는 이병식물잎으로부터 추출한 전핵산을 주형으로 하여 본 발명에서 제작한 CGMMV 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-PCR법으로 target 유전자를 대량 증폭하였다. RT-PCR시 RT는 42 ℃에서 30분간 반응시켜 단쇄상의 cDNA를 합성하였고, 합성된 cDNA를 주형으로 본 발명에서 고안한 유전자 증폭용 프라이머로 하여 PCR 반응법 (94 ℃ 1분, 50 ℃ 1분 및 72 ℃ 40초를 35회 실시)을 실시하였다. RT-PCR법으로 증폭된 유전자 산물을 아가로스겔 전기영동법으로 전개시킨 다음, 증폭된 유전자 산물 크기인 524 bp의 DNA 밴드의 형성 유무로서 바이러스의 감염여부를 진단 및 동정하였다 (도면 3의 lane 1 화살표 부분이 증폭된 바이러스 유전자임).
본 발명에서는 CGMMV를 이병식물체로부터 신속 정확하게 유전자 진단과 동정을 할 수 있는 유전자증폭용 프라이머의 고안과 이를 이용한 식물에서의 진단방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명에서 개발된 프라이머를 사용하여 유전공학적으로 바이러스 저항성 식물육성에 직접적으로 활용 가능하며, 인공적인 항체생산의 재료와 식물발현용 바이러스 벡터개발 등에 이용 가능한 CGMMV의 외피단백질 유전자를 유전공학적으로 클로닝할 수 있는 장점이 있다.

Claims (3)

  1. CGMMV 진단용 프라이머 염기서열 (도면 1 참조) 및 그와 기능적 등가물
  2. CGMMV 계통의 유전자 진단시 이병식물체로부터 유전자의 신속한 분리정제법 및 유전자 증폭을 통한 바이러스의 유전자 진단 및 동정 방법 및 그와 기능적 등가방법
  3. 본 발명에서 고안한 프라이머를 사용한 CGMMV 외피단백질 유전자의 증폭 및 클로닝과 그와 기능적 등가물
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100496017B1 (ko) * 2002-11-29 2005-06-16 대한민국 박과작물 발생 5종 바이러스 동시진단용 프라이머 조합
KR100496015B1 (ko) * 2002-11-29 2005-06-16 대한민국 큐리녹반모자이크바이러스 진단용 특이 프라이머
KR100496014B1 (ko) * 2002-11-29 2005-06-16 대한민국 수박모자이크바이러스2 진단용 특이 프라이머
KR100496013B1 (ko) * 2002-11-29 2005-06-16 대한민국 오이녹반모자이크바이러스 진단용 특이 프라이머

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