CN108239640B - 抗病转基因大豆事件b5c9122-2外源插入片段侧翼序列及其应用 - Google Patents
抗病转基因大豆事件b5c9122-2外源插入片段侧翼序列及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108239640B CN108239640B CN201810138922.7A CN201810138922A CN108239640B CN 108239640 B CN108239640 B CN 108239640B CN 201810138922 A CN201810138922 A CN 201810138922A CN 108239640 B CN108239640 B CN 108239640B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- seq
- primer
- exogenous
- flanking
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 title claims abstract description 96
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 title claims abstract description 95
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 70
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title abstract description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title abstract description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 48
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 48
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 45
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 11
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 12
- 241000723811 Soybean mosaic virus Species 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 241000710076 Bean common mosaic virus Species 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 6
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 5
- 241001310178 Watermelon mosaic virus Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 4
- 241000710078 Potyvirus Species 0.000 description 4
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 4
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 241000219317 Amaranthaceae Species 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 241000219104 Cucurbitaceae Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000220485 Fabaceae Species 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000208292 Solanaceae Species 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000007859 qualitative PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012253 re-sequencing analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940045885 sodium lauroyl sarcosinate Drugs 0.000 description 1
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009044 synergistic interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
Abstract
本发明提供一种抗病转基因大豆事件B5C9122‑2外源插入片段侧翼序列及其应用，属于植物生物技术领域。具体地，涉及一种广谱抗花叶病毒转基因大豆事件B5C9122‑2外源插入片段左、右边界侧翼序列及其应用。本发明公开的转基因大豆事件B5C9122‑2外源插入片段左边界侧翼序列如SEQ‑2所示，右边界侧翼序列如SEQ‑3所示。本发明公开的转基因大豆事件B5C9122‑2外源插入片段侧翼序列可以用作目标DNA序列，建立该转基因事件特异性检测方法。本发明提供的外源插入片段侧翼序列及检测方法适用于对该转基因大豆事件包括亲本、衍生品系或品种，及其制品包括植株、组织、种子及产品的特异性检测。
Description
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域，具体地，涉及一种广谱抗花叶病毒转基因大豆事件B5C9122-2外源插入片段侧翼序列及其应用。
背景技术
大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus，SMV)、菜豆普通花叶病毒(bean commonmosaic virus，BCMV)和西瓜花叶病毒(watermelon mosaic virus，WMV)均属于马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。马铃薯Y病毒属(Potyvirus)是植物病毒中最大的一个属，该类病毒可以侵染茄科、藜科、豆科、葫芦科等多种植物，并造成严重的产量损失。SMV是影响大豆生产的主要病毒性病害，也是我国各大豆主产区最重要的病害之一。SMV一般可造成大豆减产10％～35％，严重年份和地区甚至造成大面积绝产(Yang et al.2013，2014；Ross1983)。国外通过SMV对鉴定寄主的致病性反应将SMV株系划分为G1-G7(Cho and Goodman 1979)，我国将SMV株系划分为SC1-SC22(Li et al.2010；Wang et al.2003)。另外2种病毒-BCMV和WMV虽然在大豆生产中发生情况并不严重，但对大豆生产仍具有较大的潜在危害(Zhou etal.2014)，特别是BCMV、WMV与SMV之间的协同互作，常常造成SMV株系的变异和更为严重的产量损失(Anjos，et al.1992；Reddy，et al.2001)。目前生产上主要利用携带SMV抗性位点(Rsv1，Rsv3，Rsv4)的大豆品种控制SMV的危害(Yu，1994；Hayes，et al.，2000；Gore，etal.，2002；Jeong and Maroof，2008；Maroof，et al.，2010)。但由于抗性品种的种植造成的正向筛选压力、SMV基因组变异及SMV与寄主或其他侵染大豆病毒之间的互作，造成抗病品种原有抗性的丧失(Koo，et al.，2005；Choi，et al.，2005；Gagarinova，et al.，2008)。有报道表明，部分大豆花叶病毒小种对携带Rsv1、Rsv3和Rsv4抗性基因的商业化大豆品种均产生抗性(Choi，et al.，2005)。SMV的广泛变异及多个SMV株系或其他病毒如BCMV的混合感染使得大豆抗病毒育种工作更为严峻。
许多研究表明，在植物中表达部分病毒基因组序列片段，产生的dsRNA可以有效抑制病毒的侵染(Gao，et al.，2015；Reddy，et al.，2001；Zhang，et al.，2011；Wang，et al.，2001；Furutani，et al.，2006；Furutani，et al.，2007；Kim，et al.，2013；Tougou，et al.，2006；Lim，et al.，2007)，从而为提高大豆SMV抗性，加快大豆抗病毒育种提供了有效的手段，更为重要的是，利用RNAi干扰技术为同时抗多种病毒及病毒不同生理小种提供了一条更为有效的技术途径。吉林省农业科学院采用农杆菌介导法将外源SMV-NIb基因RNAi片段导入栽培大豆品种沈农9号(国审豆2007015)，获得抗病转基因大豆B5C9122-2。SMV-NIb基因RNAi片段大小为248bp，启动子为菜豆叶片特异性启动子RBSC2。抗性鉴定结果表明，B5C9122-2对大豆花叶病毒3号强毒株系(SMV SC3，东北大豆产区SMV主要流行株系)抗性水平极显著高于对照品种沈农9号，表现为高抗，且抗性能够稳定遗传。另外，B5C9122-2对我国大豆主产区7种主要病毒类型或小种包括SMV SC3、SMV SC7、SMV SC15、SMV SC18、SMV-R、BCMV和WMV均表现为较强的广谱抗性。目前转基因大豆事件B5C9122-2已进入安全评价阶段，随着国家转基因生物新品种培育重大专项的推进，该转化事件及其衍生品种或品系有望进入商业化应用。
对转基因事件及其衍生品系或品种特异性检测，是实现转基因植物有效监督管理，保障转基因产业健康发展的重要技术手段。外源插入片段的侧翼序列和根据此侧翼序列建立的检测方法，是对转基因植物及其产品进行有效监督管理的一个重要依据。目前已经有相关专利和文献报道了转基因植物外源插入侧翼序列。张大兵等(2006)利用TAIL-PCR方法分析了玉米品系MON863的外源插入片段的侧翼序列，建立了转基因MON863玉米的品系特异性检测方法。谢家建等(2007)利用TAIL-PCR、genome walking和LD-PCR等方法获得了转基因水稻克螟稻、Bt汕优863和科丰6号的外源插入片段的侧翼序列，杨正友等(2012)利用TAIL-PCR方法建立了转基因水稻品系SK-2的外源插入片段的侧翼序列，并建立了该品系特异性的检测方法。
对现有专利和文献进行分析，目前尚未发现抗病转基因大豆事件B5C9122-2外源插入片段侧翼序列相关的文章和专利报道。本研究通过基因组重测序技术和PCR技术，获得转基因大豆事件B5C9122-2外源插入片段左、右边界侧翼序列，并依据其序列特征，建立该转化事件特异性检测方法，为广谱抗花叶病毒转基因大豆事件B5C9122-2及其衍生品种或品系商业化应用提供依据。在此基础上，提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供广谱抗花叶病毒转基因大豆事件B5C9122-2外源插入片段左、右边界侧翼序列。本发明还提供该转基因事件特异性检测方法。
本发明通过如下技术方案实现：
本发明提供转基因大豆事件B5C9122-2外源插入片段左、右边界侧翼序列如SEQ-2和SEQ-3所示，其特征在于，由来源于大豆基因组序列和来源于外源插入片段序列组成的DNA序列。其中：
外源插入片段左边界侧翼序列特征包括：
(1)SEQ-2第1-986位点序列来源于栽培大豆沈农9号基因组序列；
(2)SEQ-2的第987-1204位点序列来源于外源插入片段序列。
外源插入片段右边界侧翼序列特征包括：
(1)SEQ-3第1-326位点序列来源于外源插入片段序列；
(2)SEQ-3第327-1308位点序列来源于栽培大豆沈农9号基因组序列。
本发明提供的转基因大豆事件B5C9122-2外源插入片段左边界和右边界侧翼序列通过如下方式获得：(1)以抗病转基因大豆事件B5C9122-2为材料，采用基因组重测序技术，并检索大豆基因组数据库(http：//soybase.org/)，确定外源片段在参考大豆基因组(Wm82.a2.v1)中的具体插入位置为Gm02染色体37620190位点，插入方式为反向单拷贝插入，并获得插入位点在参考大豆基因组中上游和下游～2kb序列，如SEQ-1所示。(2)根据参考大豆基因组中外源片段插入位置上游、下游序列及插入片段序列设计引物，以B5C9122-2基因组总DNA为模板进行PCR扩增，获得转基因大豆事件B5C9122-2外源插入片段左、右边界侧翼序列如SEQ-2和SEQ-3所示。所述序列由来源于大豆基因组序列和来源于外源插入片段序列组成的DNA序列。
鉴于转基因事件中外源片段在植物基因组中的整合具有随机性的特点，不同转基因事件其外源片段在基因组中的插入位点不同。对于特定的转基因事件来说，其侧翼序列是特异的。因此，利用插入片段侧翼序列可以对转基因事件进行特异性检测。如利用包含部分侧翼序列和部分外源插入片段序列的探针进行杂交，或是设计包含部分侧翼序列和部分外源插入片段序列的特异性引物进行PCR扩增等。
本发明提供转基因大豆事件B5C9122-2特异性检测方法或检测试剂盒。其特征在于，利用转基因大豆事件B5C9122-2外源插入片段左边界侧翼序列，设计特异性检测引物或制备特异性探针。其中一条引物为依据SEQ-2第1-986位点序列设计的正向引物，另一条引物为依据SEQ-2第987-1204位点序列设计的反向引物，即所述两条引物组合为权利要求书1所述外源插入片段左边界侧翼序列特异性检测引物。
作为优选，所述外源插入片段左边界侧翼序列特异性检测引物为：
所述正向引物为：5’-ACTGGGACCTACCTAATCTGTGG-3’(SEQ-4)
所述反向引物为：5’-GCTGGCGTAATAGCGAAGAGG-3’(SEQ-5)
本发明提供转基因大豆事件B5C9122-2特异性检测方法或检测试剂盒。其特征在于，利用转基因大豆事件B5C9122-2外源插入片段右边界侧翼序列，设计特异性检测引物或制备特异性探针。其中一条引物为依据SEQ-3第1-326位点序列设计的正向引物，另一条引物为依据SEQ-3第327-1308位点序列设计的反向引物，即所述两条引物组合为权利要求书1所述外源插入片段右边界侧翼序列特异性检测引物。
作为优选，所述外源插入片段右边界侧翼序列特异性检测引物为：
所述正向引物为：5’-GTAAAGCCTGGGGTGCCTAATG-3’(SEQ-6)
所述反向引物为：5’-TTAAAGGCATATTATGTCATTTGCATAGCC-3’(SEQ-7)
本发明提供转基因大豆事件B5C9122-2外源插入片段左边界和右边界侧翼序列及特异性检测方法在转基因大豆事件B5C9122-2包括亲本、衍生品系或品种，及其制品包括植株、组织、种子及产品检测中的应用。根据B5C9122-2外源插入片段左边界侧翼序列设计特异性检测引物如SEQ-4和SEQ-5所示；或根据B5C9122-2外源插入片段右边界侧翼序列设计特异性检测引物如SEQ-6和SEQ-7所示。分别提取转基因大豆事件B5C9122-2根、茎、叶、花和种子DNA样品，并以受体非转基因品种沈农9号及常规大豆品种作为对照，进行PCR扩增。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，并利用EB进行染色，以鉴定是否存在特异性扩增条带。所述转化事件B5C9122-2外源插入片段左边界扩增片段长度为447bp。所述转化事件B5C9122-2外源插入片段右边界扩增片段长度为424bp。
本发明中，转基因大豆事件B5C9122-2是利用农杆菌介导法将外源SMV-NIb基因RNAi片段导入栽培大豆品种沈农9号(国审豆2007015)获得的。B5C9122-2转化载体pTF101.1-RBSC2-NIbi结构图谱如图1所示。所述转化载体携带SMV-NIb基因RNAi片段表达框和筛选标记基因BAR表达框。所述转化载体pTF101.1-RBSC2-NIbi和转基因大豆事件B5C9122-2公众可从吉林省农业科学院获得。
本发明中，所述转基因大豆事件B5C9122-2特异性检测方法，PCR反应体系(25uL)为：10×PCR缓冲液2.5uL，10mmol/L dNTPs 0.5uL，5U/uL Taq酶0.5uL，DNA样品1.0uL，10umol/L正向引物0.5uL，10umol/L反向引物0.5uL，ddH2O 19.5uL。PCR反应条件为：95℃5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 45s，共30个循环；72℃ 5min。利用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物中是否存在特异性条带，分析样品中是否含有来源于B5C9122-2的成分。
本发明的有益效果
1.本发明首次公开广谱抗花叶病毒转基因大豆事件B5C9122-2外源插入片段左边界和右边界侧翼序列。
2.本发明首次分析并确认转基因大豆事件B5C9122-2外源插入片段左、右边界侧翼序列组成，包括外源插入片段序列和栽培大豆沈农9号基因组序列，并确定外源片段在大豆基因组中的具体插入位点。
3.利用本发明提供外源插入片段左边界和右边界侧翼序列特征，建立转基因大豆事件B5C9122-2特异性定性PCR检测方法或制备检测试剂盒。
4.利用本发明提供的外源插入片段左、右边界侧翼序列及特异性检测方法，对转基因大豆事件B5C9122-2包括亲本、衍生品系或品种，及其制品包括植株、组织、种子及产品进行特异性检测，从而实现对转基因大豆及其产品的有效监督管理。
附图说明
图1.B5C9122-2转化载体pTF101.1-RBSC2-NIbi结构图谱
图2.转基因大豆事件B5C9122-2左边界侧翼序列特异性PCR检测.M：DNA分子量标准(DL2000)，1：B5C9122-2根，2：B5C9122-2茎，3：B5C9122-2叶片，4：B5C9122-2花，5：B5C9122-2种子，6：大豆品种沈农9号，7：大豆品种吉育47，8：大豆品种吉育72，9：玉米叶片，10：棉花叶片
图3.转基因大豆事件B5C9122-2右边界侧翼序列特异性PCR检测.M：DNA分子量标准(DL2000)，1：B5C9122-2根，2：B5C9122-2茎，3：B5C9122-2叶片，4：B5C9122-2花，5：B5C9122-2种子，6：大豆品种沈农9号，7：大豆品种吉育47，8：大豆品种吉育72，9：玉米，10：棉花
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1.转基因大豆事件B5C9122-2外源片段插入位点分析
1.转基因大豆B5C9122-2基因组DNA提取
(1)基因组DNA提取：取1-2g大豆幼嫩叶片，液氮研磨至粉末状，装入50mL离心管中。依次加入5mL提取液A(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0，0.35mol/L山梨醇，5mmol/L EDTA，pH8.0，1％ 2-巯基乙醇)，3.5mL提取液B(50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，4.0mol/LNaCl，1.8％CTAB，25mmol/L EDTA，pH8.0)，0.3mL 30％月桂酰肌氨酸钠和2％ PVP-360，55℃下温育60～90分钟，期间轻摇几次。取出离心管，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，上下颠倒轻摇15分钟，然后常温下离心10分钟(13000rpm)。吸取上清液，加入2/3体积预冷的混合有上清液1/10体积的乙酸钠的异丙醇，4℃13000rpm离心20分钟。弃上清，用冷75％乙醇漂洗。空气中干燥DNA至表面干燥后，于-20℃保存
(2)基因组DNA纯化：用200uL ddH2O溶解DNA，加入5uL RNase(10mg/mL)，37℃温育40分钟。用等体积的酚/氯仿抽提1-2次，室温下13000rpm离心10分钟。转移上清至一个新的1.5mL离心管，并用等体积预冷100％氯仿沉淀。室温下13000rpm离心10分钟。转上清至新的2mL离心管，用两倍体积冷的无水乙醇(混合1/10体积乙酸钠)沉淀DNA，然后于-20℃放置30分钟。13000rpm离心15分钟，75％乙醇漂洗2次后，于空气中干燥15-20分钟。50～100uLddH2O溶解DNA。紫外分光光度计(Quawell Q5000)测定DNA浓度后，于-20℃保存备用。
2.转基因大豆B5C9122-2基因组重测序分析
委托北京百迈客生物科技有限公司对转基因大豆B5C9122-2进行重测序分析。将检测合格的样品基因组DNA用超声波片段化，然后对片段化的DNA进行纯化、末端修复、3′端加A、连接测序接头。再用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行PCR扩增形成测序文库。质检合格的文库采用二代高通量测序Xten平台进行测序。对测序得到的51868572个原始reads(双端序列)进行质量评估，并过滤得到51762095个Clean Reads。将Clean Reads与参考基因组序列(Wm82.a2.v1，http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias＝Org_Gmax)进行比对。通过比对定位Clean Reads在参考基因组上的位置，统计各样品的测序深度、基因组覆盖度等信息。本次分析数据量为15.50Gbp的Clean Data，Q30达到91.78％。基因组覆盖度为98.82％(至少一个碱基覆盖)，平均覆盖深度为14X。
将转基因大豆B5C9122-2基因组重测序数据分别比对到参考基因组和外源插入序列，根据比对结果找出两类Paired_end reads：第一类为一端reads比对上参考基因组序列，另一端reads比对上插入序列；第二类为两端中任何一端reads一部分序列比对上参考基因组序列，另一部分比对上插入序列。采用bwa比对参考基因组，选取能比对上外源插入序列的全部reads，进行局部组装。根据组装的contig使用blastn分别比对外源插入序列和参考基因组结果，选取contig序列比对到染色体区域，并对这些区域的bwa比对结果进行IGV截图验证，获得外源插入片段插入位置信息。分析结果表明，转基因大豆B5C9122-2外源片段插入位置为Gm02染色体37620190位点，插入方式为反向单拷贝插入。插入位点在参考基因组序列中的位置及其上游和下游～2kb序列(Gm02：37621190..37619189)，如SEQ-1所示。
实施例2.转基因大豆事件B5C9122-2外源插入片段左、右边界侧翼序列分析
根据转基因大豆事件B5C9122-2外源插入序列及插入位点在大豆参考基因组中上、下游序列，设计PCR检测引物。B5C9122-2插入位点上游序列扩增引物为B5C9122LB-F1(5’-GCAAGCAACACCTACGACCT-3’)和B5C9122LB-R1：(5’-AACCCTGGCGTTACCCAACT-3’)；B5C9122-2插入位点下游序列扩增引物为B5C9122RB-F1：(5’-ACATACTTCCTCCCTCTTCAGCA-3’)和B5C9122RB-R1(5’-TATCTATCCGTTAGTGCCGTGTTGG-3’)。以B5C9122-2基因组DNA为模板，利用上述引物分别进行PCR扩增。PCR反应体系(25uL)为：10×PCR缓冲液2.5uL，10mmol/L dNTPs 0.5uL，5U/uL Taq酶0.5uL，样品DNA 1.0uL，10umol/L正向引物0.5uL，10umol/L反向引物0.5uL，ddH2O 19.5uL。PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃ 45s，60℃ 45s，72℃ 3min，共35个循环；72℃ 15min。利用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。然后利用胶回收试剂盒纯化PCR产物，并连接到GENSTAR公司的EZ-T克隆载体。委托上海生工进行测序验证，并将测序结果与外源插入序列和参考基因组序列比对，最终获得转基因大豆事件B5C9122-2外源插入片段左边界侧翼序列如SEQ-2所示，右边界侧翼序列如SEQ-3所示。所述序列由来源于大豆基因组序列和来源于外源插入片段序列组成的DNA序列。
B5C9122-2外源插入片段左边界侧翼序列(SEQ-2)长度为1204bp，其中，第1-986位点序列来源于栽培大豆沈农9号基因组序列，第987-1204位点序列来源于外源插入片段序列。B5C9122-2外源插入片段右边界侧翼序列(SEQ-3)长度为1308bp，其中，第1-326位点序列来源于外源插入片段序列，第327-1308位点序列来源于栽培大豆沈农9号基因组序列。
实施例3.转基因大豆事件B5C9122-2特异性PCR检测
根据转基因大豆事件B5C9122-2外源插入片段左边界侧翼序列(如SEQ-2所示)和右边界侧翼序列(如SEQ-3所示)，分别设计特异性检测引物。左边界侧翼序列特异性检测引物组合中，其中一条引物为依据SEQ-2第1-986位点序列设计的正向引物，如SEQ-4所示；另一条引物为依据SEQ-2第987-1204位点序列设计的反向引物，如SEQ-5所示。右边界侧翼序列特异性检测引物组合中，其中一条引物为依据SEQ-3第1-326位点序列设计的正向引物，如SEQ-6所示；另一条引物为依据SEQ-3第327-1308位点序列设计的反向引物，如SEQ-7所示。
分别提取转基因大豆植株B5C9122-2根、茎、叶、花和种子DNA样品，DNA提取方法依实施例1中的方法。以受体非转基因大豆品种沈农9号、常规大豆品种吉育47、吉育72及玉米和棉花作为对照，进行PCR扩增。PCR反应体系(25uL)为：10×PCR缓冲液2.5uL，10mmol/LdNTPs 0.5uL，5U/uL Taq酶0.5uL，DNA样品1.0uL，10umol/L正向引物0.5uL，10umol/L反向引物0.5uL，ddH2O 19.5uL。PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 45s，共30个循环；72℃ 5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，并利用EB进行染色，以鉴定是否存在特异性扩增条带。
用上述特异性引物进行PCR扩增时，非转基因大豆品种沈农9号、常规大豆品种吉育47、吉育72及玉米和棉花均无扩增条带，只有转基因大豆B5C9122-2样品包括根、茎、叶、花和种子产生特异性扩增条带。其中，左边界侧翼序列扩增片段长度为447bp，如图2所示；右边界侧翼序列扩增片段长度为424bp，如图3所示。本研究表明，利用外源插入片段侧翼序列特异性引物进行PCR分析，可以特异性地检测样品中是否含有来源于B5C9122-2的成分。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (9)
1.广谱抗花叶病毒转基因大豆事件B5C9122-2外源插入片段左边界和右边界侧翼序列，其特征在于，外源插入片段左边界侧翼序列如SEQ ID NO：2所示，外源插入片段右边界侧翼序列如SEQ ID NO：3所示，由来源于大豆基因组序列和来源于外源插入片段序列组成的DNA序列；其中：
外源插入片段左边界侧翼序列特征包括：
(1)SEQ ID NO：2第1-986位点序列来源于栽培大豆沈农9号基因组序列；
(2)SEQ ID NO：2的第987-1204位点序列来源于外源插入片段序列；
外源插入片段右边界侧翼序列特征包括：
(1)SEQ ID NO：3第1-326位点序列来源于外源插入片段序列；
(2)SEQ ID NO：3第327-1308位点序列来源于栽培大豆沈农9号基因组序列。
2.权利要求1所示侧翼序列在建立转基因大豆事件B5C9122-2特异性检测方法或制备检测试剂盒中的应用，其特征在于，依据权利要求1所示侧翼序列，制备特异性引物或探针。
3.权利要求1所述侧翼序列、权利要求2所述特异性检测方法或检测试剂盒在转基因大豆事件B5C9122-2检测中的应用，其中，检测对象包括亲本、衍生品系或品种，及其制品或产品。
4.权利要求2或权利要求3中所述特异性检测方法，其特征在于，其中一条引物为依据SEQ ID NO：2第1-986位点序列设计的正向引物，另一条引物为依据SEQ ID NO：2第987-1204位点序列设计的反向引物，即所述两条引物组合为权利要求1所述外源插入片段左边界侧翼序列特异性检测引物。
5.权利要求2或权利要求3中所述检测试剂盒，其特征在于，其中一条引物为依据SEQID NO：2第1-986位点序列设计的正向引物，另一条引物为依据SEQ ID NO：2第987-1204位点序列设计的反向引物，即所述两条引物组合为权利要求1所述外源插入片段左边界侧翼序列特异性检测引物。
6.根据权利要求4中所述外源插入片段左边界侧翼序列特异性检测引物，其特征在于：如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示：
所述正向引物SEQ ID NO：4为：5’-ACTGGGACCTACCTAATCTGTGG-3’
所述反向引物SEQ ID NO：5为：5’-GCTGGCGTAATAGCGAAGAGG-3’。
7.权利要求2或权利要求3中所述特异性检测方法，其特征在于，其中一条引物为依据SEQ ID NO：3第1-326位点序列设计的正向引物，另一条引物为依据SEQ ID NO：3第327-1308位点序列设计的反向引物，即所述两条引物组合为权利要求1所述外源插入片段右边界侧翼序列特异性检测引物。
8.权利要求2或权利要求3中所述检测试剂盒，其特征在于，其中一条引物为依据SEQID NO：3第1-326位点序列设计的正向引物，另一条引物为依据SEQ ID NO：3第327-1308位点序列设计的反向引物，即所述两条引物组合为权利要求1所述外源插入片段右边界侧翼序列特异性检测引物。
9.根据权利要求7中所述外源插入片段右边界侧翼序列特异性检测引物，其特征在于，如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示：
所述正向引物SEQ ID NO：6为：5’-GTAAAGCCTGGGGTGCCTAATG-3’
所述反向引物SEQ ID NO：7为：5’-TTAAAGGCATATTATGTCATTTGCATAGCC-3’。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810138922.7A CN108239640B (zh) | 2018-02-03 | 2018-02-03 | 抗病转基因大豆事件b5c9122-2外源插入片段侧翼序列及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810138922.7A CN108239640B (zh) | 2018-02-03 | 2018-02-03 | 抗病转基因大豆事件b5c9122-2外源插入片段侧翼序列及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108239640A CN108239640A (zh) | 2018-07-03 |
| CN108239640B true CN108239640B (zh) | 2021-11-09 |
Family
ID=62699812
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810138922.7A Expired - Fee Related CN108239640B (zh) | 2018-02-03 | 2018-02-03 | 抗病转基因大豆事件b5c9122-2外源插入片段侧翼序列及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108239640B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113046459A (zh) * | 2019-12-27 | 2021-06-29 | 中国农业科学院棉花研究所 | 转GhFPF1基因棉花插入位点的侧翼序列及其特异性鉴定方法 |
| CN112410461B (zh) * | 2020-12-16 | 2024-01-23 | 浙江大学 | 抗花叶病毒病转基因大豆事件smv-2外源插入片段侧翼序列及其应用 |
| CN113684295A (zh) * | 2021-04-29 | 2021-11-23 | 吉林省农业科学院 | 抗旱转基因大豆事件FvC5SD-L05外源插入片段侧翼序列及应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105567682A (zh) * | 2016-01-12 | 2016-05-11 | 吉林省农业科学院 | 转基因大豆事件b4j8049外源插入片段旁侧序列及其应用 |
| CN107190003A (zh) * | 2017-06-09 | 2017-09-22 | 武汉天问生物科技有限公司 | 一种高效快速分离t‑dna插入位点侧翼序列的方法及其用途 |
-
2018
- 2018-02-03 CN CN201810138922.7A patent/CN108239640B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105567682A (zh) * | 2016-01-12 | 2016-05-11 | 吉林省农业科学院 | 转基因大豆事件b4j8049外源插入片段旁侧序列及其应用 |
| CN107190003A (zh) * | 2017-06-09 | 2017-09-22 | 武汉天问生物科技有限公司 | 一种高效快速分离t‑dna插入位点侧翼序列的方法及其用途 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Robust RNAi-Based Resistance to Mixed Infection of Three Viruses in Soybean Plants Expressing Separate Short Hairpins from a Single Transgene;Xiuchun Zhang等;《PHYTOPATHOLOGY》;20110503;第101卷(第11期);第1364-1269页 * |
| Robust RNAi-mediated resistance to infection of seven potyvirids in soybean expressing an intron hairpin NIb RNA;Xiangdong Yang等;《Transgenic Res》;20170824;第26卷(第5期);第665-676页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108239640A (zh) | 2018-07-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108239638B (zh) | 抗病转基因大豆事件b5b9013-4外源插入片段侧翼序列及其应用 | |
| CN108179146B (zh) | 抗病转基因大豆事件b5c9120-3外源插入片段侧翼序列及其应用 | |
| CN108239640B (zh) | 抗病转基因大豆事件b5c9122-2外源插入片段侧翼序列及其应用 | |
| KR101642771B1 (ko) | 나리 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법 | |
| WO2007097574A1 (en) | Molecular marker associated with tmv resistance and use thereof | |
| CN106434944B (zh) | 与桃抗蚜基因紧密连锁的snp分子标记的应用 | |
| CN108374006B (zh) | 抗病转基因大豆事件b5c9123-5外源插入片段侧翼序列及其应用 | |
| CN108239641B (zh) | 抗病转基因大豆事件b5b9104-3外源插入片段侧翼序列及其应用 | |
| CN108239637B (zh) | 抗病转基因大豆事件b5b8127-3外源插入片段侧翼序列及其应用 | |
| CN102559869B (zh) | 利用rgp-3特异性分子标记快速鉴别11个烟草种质的方法 | |
| CN108456679B (zh) | 高油酸转基因大豆事件e2d8037-3外源插入片段侧翼序列及其应用 | |
| Farzadfar et al. | Molecular identification of cucumber mosaic virus subgroup IB isolates in South Iran | |
| CN114656546B (zh) | 孤雌生殖单倍体诱导基因及其应用 | |
| CN109706154B (zh) | CsPR3基因及其在黄瓜抗枯萎病中的应用 | |
| Salehzadeh et al. | First report of canna yellow streak virus in Iran. | |
| KR101468205B1 (ko) | Ｗｍｖ－ｃｐ 형질전환 수박의 정성 분석방법 | |
| Yuan et al. | Identification of expressed resistance gene analogs (RGA) and development of RGA-SSR markers in tobacco | |
| CN108239639B (zh) | 耐逆转基因大豆事件wb1外源插入片段侧翼序列及其应用 | |
| KR20140040374A (ko) | Ｔｓｗｖ 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트 | |
| CN108374007B (zh) | 高油酸转基因大豆事件eb8072外源插入片段侧翼序列及其应用 | |
| CN108179147B (zh) | 高油酸转基因大豆事件e2d9050外源插入片段侧翼序列及其应用 | |
| CN109897913B (zh) | 一种用于检测转hrf2基因抗病大豆B1A9130的侧翼序列及其检测方法 | |
| KR100703600B1 (ko) | 곰팡이내 존재하는 ａｓｇｖ 검출용 프라이머 세트, 이를이용한 검출 방법 및 키트 | |
| CN115216555B (zh) | 一个根结线虫抗性基因Mg1及其紧密连锁分子标记的应用 | |
| CN112410461B (zh) | 抗花叶病毒病转基因大豆事件smv-2外源插入片段侧翼序列及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20211109 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |