CN108239639B

CN108239639B - 耐逆转基因大豆事件wb1外源插入片段侧翼序列及其应用

Info

Publication number: CN108239639B
Application number: CN201810138921.2A
Authority: CN
Inventors: 杨向东; 牛陆; 赵倩倩; 马瑞; 于志晶; 杜茜; 杜娟; 蔡琴安
Original assignee: Jilin Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jilin Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-02-03
Filing date: 2018-02-03
Publication date: 2022-02-11
Anticipated expiration: 2038-02-03
Also published as: CN108239639A

Abstract

本发明提供一种耐逆转基因大豆事件WB1外源插入片段侧翼序列及其应用，属于植物生物技术领域。具体地，涉及一种耐逆转基因大豆事件WB1外源插入片段左、右边界侧翼序列及其应用。本发明公开的转基因大豆事件WB1外源插入片段左边界侧翼序列如SEQ‑2所示，右边界侧翼序列如SEQ‑3所示。本发明公开的转基因大豆事件WB1外源插入片段侧翼序列可以用作目标DNA序列，建立该转基因事件特异性检测方法。本发明提供的外源插入片段侧翼序列及检测方法适用于对该转基因大豆事件包括亲本、衍生品系或品种，及其制品包括植株、组织、种子及产品的特异性检测。

Description

耐逆转基因大豆事件WB1外源插入片段侧翼序列及其应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体地，涉及一种耐逆转基因大豆事件WB1外源插入片段侧翼序列及其应用。

背景技术

土壤盐碱化是影响农作物生产的重要因素之一，其危害程度仅次于干旱。据统计，全球约有20％耕地受到盐害威胁，约占世界陆地面积的7.6％。在我国盐碱地总面积达0.27亿hm²的盐碱地。另外，由于气候变化、灌溉方法不当，过度放牧等原因，造成6.7×10⁶hm²的次生盐渍化土地。随着工业化进程的加快，灌溉水质量不断下降，土地盐碱化(包括次生盐碱化)速度还在逐渐加快。据推算，到2050年，全球50％可用耕地面积都将面临不同程度的盐碱化难题。在人口不断增长，耕地日趋减少和淡水资源不足的情况下，如何有效控制和利用盐碱土，保障农业的可持续发展就成为面临关键问题之一。

在植物诸多耐盐机制中，渗透调节能力是植物耐盐性的重要特点之一。当植物受到外界盐胁迫时，在细胞中会积累一定数量的可溶性有机物质如脯氨酸、甜菜碱、醇类等，作为渗透调节剂进行渗透调节，以适应外界的低水势。在植物细胞中，甜菜碱合成涉及到两类酶，即胆碱单氧化酶(choline monooxygenase，CMO)和甜菜碱醛脱氢酶(Betaine-aldehyde dehydrogenase，BADH)，其中BADH是该合成途径中的关键性酶。到目前为止，已从十几种植物中分离获得BADH基因。并已广泛应用于植物耐盐基因工程研究。刘风华等将来源于耐盐性很强的藜科植物山菠菜的BADH基因转入水稻、草莓和烟草中，获得的转基因植株分别能在0.5％、0.4％～0.7％和2.0％的NaCI溶液中正常生长。郭岩等将该基因转入水稻中，获得了可在含1.5％NaCl的盐池中生长并结实的转基因植株，而对照则生长受阻并最终枯萎。高志民等将甜菜碱合成途径中的三个关键酶基因(PeAMT、CMO和BADH)构建到同一表达载体上，并利用农杆菌介导法导入拟南芥，耐盐鉴定结果表明，在含125mM NaCl的培养基上，转基因植株的生长明显优于对照。梁峥等将菠菜BADH基因转入烟草，在叶绿体和胞液中均有BADH存在并具有活性，转基因植株能在300mmol/L NaCl培养液中生长。郭岩等将山菠菜中克隆的BADH基因导入水稻，得到了遗传稳定，能耐0.5％NaCl的转基因株系。张艳敏等对盐、旱逆境下转BADH基因小麦品系99T6的生长发育、甜菜碱醛脱氢酶活性及甜菜碱积累等进行了分析，结果表明，转BADH基因株系在盐逆境下甜菜碱醛脱氢酶的活性增强，甜菜碱的积累增加，并使其具有明显的生长优势，耐盐能力达到100mmol/L；电导率和质膜相对透性表明转基因株系抗膜损伤能力增强。此外，胡萝卜、番茄、杨树、苜蓿等多种植物的转化研究亦表明，与对照非转基因植株相比，转BADH植物的耐盐性均获得明显提高。

吉林省农业科学院采用农杆菌介导法将山菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因AhBADH导入大豆受体品种Williams82，获得耐逆转基因大豆事件WB1。连续多代耐盐性分析表明，转基因大豆在1.5％NaCl处理条件下能够正常萌发和开花结实，具有较强的芽期和苗期耐盐性，芽期盐害指数为7.14-8.21％(受体品种为44.01-49.82％)，苗期盐害指数为12.94-16.27％(受体品种为62.67-83.65％)，其耐盐性较对照品种Williams82显著提高。目前耐逆转基因大豆事件WB1已进入安全评价阶段，随着国家转基因生物新品种培育重大专项的推进，该转化事件及其衍生品种或品系有望进入商业化应用。

对转基因事件及其衍生品系或品种特异性检测，是实现转基因植物有效监督管理，保障转基因产业健康发展的重要技术手段。外源插入片段的侧翼序列和根据此侧翼序列建立的检测方法，是对转基因植物及其产品进行有效监督管理的一个重要依据。目前已经有相关专利和文献报道了转基因植物外源插入侧翼序列。张大兵等(2006)利用TAIL-PCR方法分析了玉米品系MON863的外源插入片段的侧翼序列，建立了转基因MON863玉米的品系特异性检测方法。谢家建等(2007)利用TAIL-PCR、genome walking和LD-PCR等方法获得了转基因水稻克螟稻、Bt汕优863和科丰6号的外源插入片段的侧翼序列，杨正友等(2012)利用TAIL-PCR方法建立了转基因水稻品系SK-2的外源插入片段的侧翼序列，并建立了该品系特异性的检测方法。

对现有专利和文献进行分析，目前尚未发现耐逆转基因大豆事件WB1外源插入片段侧翼序列相关的文章和专利报道。本研究通过基因组重测序技术和PCR技术，获得转基因大豆事件WB1外源插入片段左、右边界侧翼序列，并依据其序列特征，建立该转化事件特异性检测方法，为耐逆转基因大豆事件WB1及其衍生品种或品系商业化应用提供依据。在此基础上，提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供耐逆转基因大豆事件WB1外源插入片段左、右边界侧翼序列。本发明还提供该转基因事件特异性检测方法。

本发明通过如下技术方案实现：

本发明提供转基因大豆事件WB1外源插入片段左、右边界侧翼序列如SEQ-2和SEQ-3所示，其特征在于，由来源于大豆基因组序列和来源于外源插入片段序列组成的DNA序列。其中：

外源插入片段左边界侧翼序列特征包括：

(1)SEQ-2第1-401位点序列来源于栽培大豆Williams82基因组序列；

(2)SEQ-2第402-977位点序列来源于外源插入片段序列。

外源插入片段右边界侧翼序列特征包括：

(1)SEQ-3第1-605位点序列来源于外源插入片段序列；

(2)SEQ-3第606-1254位点序列来源于栽培大豆Williams82基因组序列。

本发明提供的转基因大豆事件WB1外源插入片段左边界和右边界侧翼序列通过如下方式获得：(1)以耐逆转基因大豆事件WB1为材料，采用基因组重测序技术，并检索大豆基因组数据库(http：//soybase.org/)，确定外源片段在参考大豆基因组(Wm82.a2.v1)中的具体插入位置为Chr15染色体的25129882位点，插入方式为正向单拷贝插入，并获得插入位点在参考大豆基因组中上游和下游～2kb序列，如SEQ-1所示。(2)根据参考大豆基因组中外源片段上游和下游序列及插入片段序列设计引物，以WB1基因组总DNA为模板进行PCR扩增，获得转基因大豆事件WB1外源插入片段左、右边界侧翼序列如SEQ-2和SEQ-3所示。所述序列由来源于大豆基因组序列和来源于外源插入片段序列组成的DNA序列。

鉴于转基因事件中外源片段在植物基因组中的整合具有随机性的特点，不同转基因事件其外源片段在基因组中的插入位点不同。对于特定的转基因事件来说，其侧翼序列是特异的。因此，利用插入片段侧翼序列可以对转基因事件进行特异性检测。如利用包含部分侧翼序列和部分外源插入片段序列的探针进行杂交，或是设计包含部分侧翼序列和部分外源插入片段序列的特异性引物进行PCR扩增等。

本发明提供转基因大豆事件WB1特异性检测方法或制备检测试剂盒。其特征在于，利用转基因大豆事件WB1外源插入片段左边界侧翼序列，设计特异性检测引物或制备特异性探针。其中一条引物为依据SEQ-2第1-401位点序列设计的正向引物，另一条引物为依据SEQ-2第402-977位点序列设计的反向引物，即所述两条引物组合为权利要求书1所述外源插入片段左边界侧翼序列特异性检测引物。

作为优选，所述外源插入片段左边界侧翼序列特异性检测引物为：

所述正向引物为：5’-TAGATGGTCCCGTATGTCGTCC-3’(SEQ-4)

所述反向引物为：5’-TGCCCGTCACCGAGATTTGA-3’(SEQ-5)

本发明提供转基因大豆事件WB1特异性检测方法或制备检测试剂盒。其特征在于，利用转基因大豆事件WB1外源插入片段右边界侧翼序列，设计特异性检测引物或制备特异性探针。其中一条引物为依据SEQ-3第1-605位点序列设计的正向引物，另一条引物为依据SEQ-3第606-1254位点序列设计的反向引物，即所述两条引物组合为权利要求书1所述外源插入片段右边界侧翼序列特异性检测引物。

作为优选，所述外源插入片段右边界侧翼序列特异性检测引物为：

所述正向引物为：5’-GCTGGCGTAATAGCGAAGAG-3’(SEQ-6)

所述反向引物为：5’-TGGAGACCAATGCGAAATGC-3’(SEQ-7)

本发明提供转基因大豆事件WB1外源插入片段左边界和右边界侧翼序列及特异性检测方法在转基因大豆事件WB1包括亲本、衍生品系或品种，及其制品包括植株、组织、种子及产品检测中的应用。根据WB1外源插入片段左边界侧翼序列设计特异性检测引物如SEQ-4和SEQ-5所示；或根据WB1外源插入片段右边界侧翼序列设计特异性检测引物如SEQ-6和SEQ-7所示。分别提取转基因大豆事件WB1根、茎、叶、花和种子DNA样品，并以受体非转基因大豆品种Williams82及常规大豆品种作为对照，进行PCR扩增。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，并利用EB进行染色，以鉴定是否存在特异性扩增条带。所述转基因大豆事件WB1外源插入片段左边界扩增片段长度为399bp。所述转基因大豆事件WB1外源插入片段右边界扩增片段长度为341bp。

本发明中，耐逆转基因大豆事件WB1是利用农杆菌介导法将山菠菜AhBADH基因导入大豆受体品种Williams82获得的。WB1转化载体pCAMBIA3300-AhBADH结构图谱如图1所示。所述载体携带AhBADH基因表达框和筛选标记基因BAR表达框。所述转化载体pCAMBIA3300-AhBADH和转基因大豆事件WB1公众可以从吉林省农业科学院获得。

本发明中，所述转基因大豆事件WB1特异性检测方法，PCR反应体系(25uL)为：10×PCR缓冲液2.5uL，10mmol/L dNTPs 0.5uL，5U/uL Taq酶0.5uL，DNA样品1.0uL，10umol/L正向引物0.5uL，10umol/L反向引物0.5uL，ddH₂O 19.5uL。PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃45s，共30个循环；72℃ 5min。利用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物中是否存在特异性条带，分析样品中是否含有来源于WB1的成分。

本发明的有益效果

1.本发明首次公开耐逆转基因大豆事件WB1外源插入片段左边界和右边界侧翼序列。

2.本发明首次分析并确认耐逆转基因大豆事件WB1外源插入片段左、右边界侧翼序列组成，包括外源插入片段序列和栽培大豆Williams82基因组序列，并确定外源片段在大豆基因组中的具体插入位点。

3.利用本发明提供外源插入片段左边界和右边界侧翼序列特征，建立耐逆转基因大豆事件WB1特异性定性PCR检测方法或制备检测试剂盒。

4.利用本发明提供的外源插入片段左、右边界侧翼序列及特异性检测方法，对转基因大豆事件WB1包括亲本、衍生品系或品种，及其制品包括植株、组织、种子及产品中进行特异性检测，从而实现对转基因大豆及其产品的有效监督管理。

附图说明

图1.WB1转化载体pCAMBIA3300-AhBADH结构图谱

图2.转基因大豆事件WB1左边界侧翼序列特异性PCR检测.M：DNA分子量标准(DL2000)，1：WB1根，2：WB1茎，3：WB1叶片，4：WB1花，5：WB1种子，6：大豆品种Williams82，7：大豆品种吉育47，8：大豆品种吉育72，9：玉米，10：棉花

图3.转基因大豆事件WB1右边界侧翼序列特异性PCR检测.M：DNA分子量标准(DL2000)，1：WB1根，2：WB1茎，3：WB1叶片，4：WB1花，5：WB1种子，6：大豆品种Williams82，7：大豆品种吉育47，8：大豆品种吉育72，9：玉米，10：棉花。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1.转基因大豆事件WB1外源片段插入位点分析

1.转基因大豆WB1基因组DNA提取

(1)基因组DNA提取：取1-2g大豆幼嫩叶片，液氮研磨至粉末状，装入50mL离心管中。依次加入5mL提取液A(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0，0.35mol/L山梨醇，5mmol/L EDTA，pH8.0，1％2-巯基乙醇)，3.5mL提取液B(50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，4.0mol/LNaCl，1.8％CTAB，25mmol/L EDTA，pH8.0)，0.3mL 30％月桂酰肌氨酸钠和2％PVP-360，55℃下温育60～90分钟，期间轻摇几次。取出离心管，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，上下颠倒轻摇15分钟，然后常温下离心10分钟(13000rpm)。吸取上清液，加入2/3体积预冷的混合有上清液1/10体积的乙酸钠的异丙醇，4℃13000rpm离心20分钟。弃上清，用冷75％乙醇漂洗。空气中干燥DNA至表面干燥后，于-20℃保存

(2)基因组DNA纯化：用200uL ddH₂O溶解DNA，加入5uL RNase(10mg/mL)，37℃温育40分钟。用等体积的酚/氯仿抽提1-2次，室温下13000rpm离心10分钟。转移上清至一个新的1.5mL离心管，并用等体积预冷100％氯仿沉淀。室温下13000rpm离心10分钟。转上清至新的2mL离心管，用两倍体积冷的无水乙醇(混合1/10体积乙酸钠)沉淀DNA，然后于-20℃放置30分钟。13000rpm离心15分钟，75％乙醇漂洗2次后，于空气中干燥15-20分钟。50～100uLddH₂O溶解DNA。紫外分光光度计(Quawell Q5000)测定DNA浓度后，于-20℃保存备用。

2.转基因大豆WB1基因组重测序分析

委托北京百迈客生物科技有限公司对转基因大豆WB1进行重测序分析。将检测合格的样品基因组DNA用超声波片段化，然后对片段化的DNA进行纯化、末端修复、3′端加A、连接测序接头。再用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行PCR扩增形成测序文库。质检合格的文库采用二代高通量测序Xten平台进行测序。对测序得到的44966942个原始reads(双端序列)进行质量评估，并过滤得到44907558个Clean Reads。然后将Clean Reads与参考基因组序列(Wm82.a2.v1，http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias＝Org_Gmax)进行比对。通过比对定位Clean Reads在参考基因组上的位置，统计各样品的测序深度、基因组覆盖度等信息。本次分析数据量为13.45Gbp的Clean Data，Q30达到90.45％。样品与参考基因组平均比对率为99.43％，平均覆盖深度为12X，基因组覆盖度为99.23％(至少一个碱基覆盖)。

将转基因大豆WB1重测序数据分别比对到参考基因组和外源插入序列，根据比对结果找出下列两类Paired_end reads：第一类为一端reads比对上参考基因组序列，另一端reads比对上插入序列；第二类为两端中任何一端reads一部分序列比对上参考基因组序列，另一部分比对上插入序列。采用bwa比对参考基因组，选取能比对上外源插入序列的全部reads，进行局部组装。根据组装的contig使用blastn分别比对外源插入序列和参考基因组结果，选取contig序列比对到染色体的区域，并对这些区域的bwa比对结果进行IGV截图验证，获得外源插入片段插入位置信息。分析结果表明，转基因大豆WB1外源片段插入位置为Chr15染色体25129882位点，插入方式为正向单拷贝插入。插入位点在参考基因组序列中的位置及其上游和下游～2kb序列(Gm15：25128882..25130881)如SEQ-1所示。

实施例2.转基因大豆事件WB1外源插入片段左、右边界侧翼序列分析

根据转基因大豆事件WB1外源插入片段序列及插入位点在大豆参考基因组中上、下游序列，设计PCR检测引物。WB1插入位点上游序列扩增引物为FA8015LB-F1(5’-TTTGTCACTCCACCCATACCTGG-3’)和FA8015LB-R1(5’-CACCATCGTCAACCACTACATCG-3’)；WB1插入位点下游序列扩增引物为FA8015RB-F1(5’-TTTACGGCGAGTTCTGTTAGGTC-3’)和FA8015RB-R1(5’-TCATACACACACCCTCATCACAC-3’)。

以WB1基因组DNA为模板，利用上述引物分别进行PCR扩增。PCR反应体系(25uL)为：10×PCR缓冲液2.5uL，10mmol/L dNTPs 0.5uL，5U/uL Taq酶0.5uL，样品DNA 1.0uL，10umol/L正向引物0.5uL，10umol/L反向引物0.5uL，ddH₂O 19.5uL。PCR反应条件为：95℃5min；94℃ 45s，60℃45s，72℃3min，共35个循环；72℃15min。利用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。然后利用胶回收试剂盒纯化PCR产物，并连接到GENSTAR公司的EZ-T克隆载体。委托上海生工进行测序验证，并将测序结果与外源插入序列和参考基因组序列比对，最终获得转基因大豆事件WB1外源插入片段左边界侧翼序列如SEQ-2所示，右边界侧翼序列如SEQ-3所示。所述序列由来源于大豆基因组序列和来源于外源插入片段序列组成的DNA序列。

WB1外源插入片段左边界侧翼序列(SEQ-2)长度为977bp，其中，第1-401位点序列来源于栽培大豆Williams82基因组序列，第402-977位点序列来源于外源插入片段序列。WB1外源插入片段右边界侧翼序列(SEQ-3)长度为1254bp，其中，第1-605位点序列来源于外源插入片段序列，第606-1254位点序列来源于栽培大豆Williams82基因组序列。

实施例3.转基因大豆事件WB1特异性PCR检测

根据转基因大豆事件WB1外源插入片段左边界侧翼序列(如SEQ-2所示)和右边界侧翼序列(如SEQ-3所示)，分别设计特异性检测引物。左边界侧翼序列特异性检测引物组合中，其中一条引物为依据SEQ-2第1-401位点序列设计的正向引物，如SEQ-4所示；另一条引物为依据SEQ-2第402-977位点序列设计的反向引物，如SEQ-5所示。右边界侧翼序列特异性检测引物组合中，其中一条引物为依据SEQ-3第1-605位点序列设计的正向引物，如SEQ-6所示；另一条引物为依据SEQ-3第606-1254位点序列设计的反向引物，如SEQ-7所示。

分别提取转基因大豆植株WB1根、茎、叶、花和种子DNA样品，DNA提取方法依实施例1中的方法。以受体非转基因大豆品种Williams82、常规大豆品种吉育47、吉育72及玉米和棉花作为对照，进行PCR扩增。PCR反应体系(25uL)为：10×PCR缓冲液2.5uL，10mmol/LdNTPs 0.5uL，5U/uL Taq酶0.5uL，DNA样品1.0uL，10umol/L正向引物0.5uL，10umol/L反向引物0.5uL，ddH₂O 19.5uL。PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃45s，共30个循环；72℃5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，并利用EB进行染色，以鉴定是否存在特异性扩增条带。用上述特异性引物进行PCR扩增时，非转基因大豆品种Williams82、常规大豆品种吉育47、吉育72及玉米和棉花均无扩增条带，只有转基因大豆WB1样品包括根、茎、叶、花和种子产生特异性扩增条带。其中，左边界侧翼序列扩增片段长度为399bp，如图2所示；右边界侧翼序列扩增片段长度为341bp，如图3所示。本研究表明，利用外源插入片段侧翼序列特异性引物进行PCR分析，可以特异性地检测样品中是否含有来源于WB1的成分。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.耐逆转基因大豆事件WB1外源插入片段左边界和右边界侧翼序列，其特征在于，外源插入片段左边界侧翼序列如SEQ-2所示，外源插入片段右边界侧翼序列SEQ-3所示，由来源于大豆基因组序列和来源于外源插入片段序列组成的DNA序列；其中：

外源插入片段左边界侧翼序列特征包括：

(1)SEQ-2第1-401位点序列来源于栽培大豆Williams82基因组序列；

(2)SEQ-2第402-977位点序列来源于外源插入片段序列；

外源插入片段右边界侧翼序列特征包括：

(1)SEQ-3第1-605位点序列来源于外源插入片段序列；

2.权利要求1所述侧翼序列在建立转基因大豆事件WB1特异性检测方法或制备检测试剂盒中的应用，其特征在于，依据权利要求1所述侧翼序列，制备特异性引物或探针。

3.权利要求1所述侧翼序列或权利要求2所述特异性检测方法或检测试剂盒在转基因大豆事件WB1检测中的应用。

4.权利要求2或权利要求3所述特异性检测方法，其特征在于，其中一条引物为依据SEQ-2第1-401位点序列设计的正向引物，另一条引物为依据SEQ-2第402-977位点序列设计的反向引物，即所述两条引物组合为权利要求1所述外源插入片段左边界侧翼序列特异性检测引物。

5.根据权利要求4所述外源插入片段左边界侧翼序列特异性检测引物，其特征在于，如SEQ-4和SEQ-5所示：

所述正向引物SEQ-4为：5’-TAGATGGTCCCGTATGTCGTCC-3’

所述反向引物SEQ-5为：5’-TGCCCGTCACCGAGATTTGA-3’。

6.权利要求2或权利要求3所述特异性检测方法，其特征在于，其中一条引物为依据SEQ-3第1-605位点序列设计的正向引物，另一条引物为依据SEQ-3第606-1254位点序列设计的反向引物，即所述两条引物组合为权利要求1所述外源插入片段右边界侧翼序列特异性检测引物。

7.根据权利要求6所述外源插入片段右边界侧翼序列特异性检测引物，其特征在于，如SEQ-6和SEQ-7所示：

所述正向引物SEQ-6为：5’-GCTGGCGTAATAGCGAAGAG-3’

所述反向引物SEQ-7为：5’-TGGAGACCAATGCGAAATGC-3’。