CN104818286B - 玉米磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p的克隆及应用 - Google Patents

Abstract

玉米磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p的克隆及应用属分子生物学和生物技术领域，本发明提供的耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；一种耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白，由ZmSEC14p基因编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；一种植物表达载体，含有耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p；构建了植物表达载体并转化拟南芥，通过低温和冷冻胁迫后观测转基因拟南芥的表型、存活率等生命状态；实验结果表明：本发明的耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p可提高拟南芥的抗冷性。

Description

玉米磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p的克隆及应用

技术领域

本发明属于分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p的克隆及应用。

背景技术

作物经常会受到各种各样的非生物胁迫，例如干旱、盐、低温等，严重制约了作物的种植区域，甚至导致产量下降^[1]。低温影响种子的萌发、幼苗的生长以及农业产量。为了抵抗或适应逆境，植物体感受外界环境的变化并将信号通过多种途径传递到细胞内，会诱导表达一些应答基因，产生一些使细胞免受低温胁迫伤害的功能蛋白、渗透调节物质以及传递信号与调控基因表达的转录因子。许多响应低温的基因已被报道，比如COR(低温调控)，KIN(低温诱导)，RD(响应脱水)基因^[2、3、4]。三个熟知的CBFs转录因子在激活COR/KIN/LTI/RD基因的转录中扮演着重要的角色。过表达CBF/DREB1基因能提高转基因植株的抗逆性，或者提高逆境响应基因(COR15A,KIN1,RD29B)的表达。水稻OsP5CS2基因，一个脯氨酸生物合成酶，被证明对植物抗盐和抗低温是必要的。因此，鉴定抗冷相关基因对丰富低温代谢途径具有重要的意义。

玉米是世界产量最大、种植范围最广的禾谷类作物，居三大粮食作物之首。起源于亚热带地区，为低温敏感作物。但是由于地理条件原因，东北春季经常遭受低温冷害的侵袭，造成大面积的减产，尤其在严重低温冷害年，玉米减产可达20％以上，品质也随之下降。在此情况下，鉴定冷响应相关基因对培育抗冷玉米新种质新品种具有重要的经济价值。SEC14p是一类磷脂酰肌醇转运蛋白，在体外具有磷脂酰肌醇与磷脂酰胆碱转移活性，同时广泛存在于真核细胞中^[5、6、7]。其功能参与必要的生物学过程，比如磷脂代谢，细胞膜运动，细胞膜极性生长，信号转导以及逆境响应^[8]。许多报道发现磷脂酰肌醇转运蛋白参与非生物胁迫。高粱在氮胁迫下转录组分析表明：高丰度的磷脂酰肌醇转运蛋白能够提高对氮胁迫的抗逆性。Jeongyeo Lee报道低温胁迫下，SEC14细胞质因子家族蛋白在抗冷卷心菜中的表达更高^[9]。尽管这些证据表明磷脂酰肌醇转运蛋白受逆境的诱导，但还未见利用这些生物逆境相关基因提高植物抗冷性的报道。

发明内容

本发明的目的在于：(1)提供一种DNA序列，其是在耐冷玉米自交系W9816中克隆得到的编码磷脂酰肌醇转运蛋白的基因，命名为ZmSEC14p；(2)提供玉米磷脂酰肌醇转运蛋白的基因ZmSEC14p在拟南芥抗冷基因工程方面的应用。

在下文中将详细描述本发明。

(一)本发明提供了一种耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

将课题组自行培育的耐冷玉米自交系W9816培育至三叶期，于人工气候箱中低温(4℃)处理12h，采集叶片用于RNA的提取。根据cDNA-AFLP获得的候选基因片段，设计3’端、5’端巢式引物，利用RACE方法进行3’端、5’端扩增，将所得的PCR产物与PMD18-T载体连接，转化Top10大肠杆菌感受态，筛选重组子，并进行测序。测序结果经分析可拼接成完整的cDNA。根据拼接结果，设计特异性引物，获得耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p预期完整的cDNA全长序列。

耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p全长为1346bp，包括888bp的开放阅读框，251bp的5’UTR和207bp的3’UTR区，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，如SEQ ID NO:1所示。

(二)本发明提供了一种耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白，由耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p所编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白由295个氨基酸组成，此蛋白包含保守的SEC14蛋白家族结构域(86-241aa)，N端包含CRAL-TRIO-N结构域(19-65aa)。与水稻(NP_001051120.1)，拟南芥(NP_195382.1)，大麦(MLOC_67500.1)，大豆(XP_003544415.1)，谷子(XP_004981935.1)，高粱(Sb01g009685.1)，小麦(EMS66889.1)和葡萄(XP_002266907.2)的氨基酸多重序列比较表明，这些蛋白在保守的SEC14结构域同源性很高。系统进化树分析表明，此蛋白与水稻亲缘关系最近，与拟南芥、酵母的亲缘关系较远。

(三)本发明提供了一种植物表达载体，其含有耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p。

根据ZmSEC14p基因的CDS序列及中间载体pCHF3300多克隆位点的相关信息，设计引物时加入相应酶切位点以扩增ZmSEC14p基因。将经测序验证的、准确的ZmSEC14p基因用相应的限制性内切酶酶切，回收小片段(基因)。同时将表达载体pCAMBIA3301以相同限制性内切酶酶切，回收大片段(载体)。用DNA连接酶将回收的大、小片段连接，重组为ZmSEC14p基因的植物表达载体。之后将重组载体转化大肠杆菌、提取质粒进行PCR和酶切鉴定。

(四)本发明提供了耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p在拟南芥抗冷基因工程方面的应用。

利用蘸花法将含有ZmSEC14p基因的植物表达载体导入拟南芥，多代经Basta筛选及分子鉴定，获得T₃代拟南芥转基因植株。对纯合的T₃代转基因拟南芥植株进行抗逆性分析，结果表明，过表达植株耐冷及抗冻性显著高于野生型。

本发明的有益效果在于提供了一种耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p的核苷酸序列及氨基酸序列，构建了植物表达载体并转化拟南芥，通过低温和冷冻胁迫后观测转基因拟南芥的表型、存活率等生命状态，结果表明玉米磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p可提高拟南芥的抗冷性。

附图说明

图1为玉米ZmSEC14p与其他植物SEC14p氨基酸的多重序列比较图

其中：NP_001051120.1为水稻；MLOC_67500.1为大麦；XP_003544415.1为大豆；XP_004981935.1为谷子；Sb01g009685.1为高粱；EMS66889.1为小麦；XP_002266907.2为葡萄。

图2为玉米ZmSEC14基因的系统进化树分析示意图

其中：NP_001051120.1为水稻；MLOC_67500.1为大麦；XP_003544415.1为大豆；XP_004981935.1为谷子；Sb01g009685.1为高粱；EMS66889.1为小麦；XP_002266907.2为葡萄；Bra010566.1-P为芜菁；GSMUA_Achr4P03190_001为香蕉；NP_014135.1为酵母；XP_001699411.1为莱茵衣藻；XP_001774454.1为小立碗藓；XP_002310229.2为毛果杨；XP_002980158.1为江南卷柏；XP_003560444.1为二穗短柄草；XP_003629457.1为蒺藜状苜蓿；XP_006340611.1为马铃薯；XP_006856013为无油樟；XP_007223256.1为碧桃。

图3至图8为玉米ZmSEC14p基因对非生物胁迫的响应示意图

其中：图3为经低温(4℃)处理后玉米幼苗叶中ZmSEC14p基因的相对表达量分析示意图

图4为经低温(4℃)处理后玉米幼苗根中ZmSEC14p基因的相对表达量分析示意图

图5为经ABA(100uM)处理后玉米幼苗叶中ZmSEC14p基因的相对表达量分析示意图

图6为经ABA(100uM)处理后玉米幼苗根中ZmSEC14p基因的相对表达量分析示意图

图7为经Nacl(250mM)处理后玉米幼苗叶中ZmSEC14p基因的相对表达量分析示意图

图8为经Nacl(250mM)处理后玉米幼苗根中ZmSEC14p基因的相对表达量分析示意图

图3至图8中：0h,2h,4h,6h,12h,24h为处理时间

图9至图12为野生型(WT)与转基因(L2/L3)拟南芥在逆境胁迫下的萌发率示意图

其中：图9为低温(4℃)处理不同时间(5、10、15、20、25天)后野生型与转基因拟南芥的萌发率示意图

图10为10uMABA处理不同时间(2、4、6、8、10天)后野生型与转基因拟南芥的萌发率示意图

图11为150mMNaCl处理不同时间(1-8天)后野生型与转基因拟南芥的萌发率示意图

图12为200mMNaCl处理不同时间(1-8天)后野生型与转基因拟南芥的萌发率示意图

图13为150、200mMNaCl低温(4℃)及400uM甘露醇处理条件下，野生型与转基因拟南芥的生长情况示意图

图14为-10℃处理10小时后野生型与转基因拟南芥长势示意图

图15为-10℃处理10小时后野生型与转基因拟南芥存活率示意图

图16至图25为野生型与转基因拟南芥中低温(4℃)处理12小时后逆境响应Marker基因的相对表达量分析示意图

其中：图16为野生型与转基因拟南芥中低温(4℃)处理12小时后COR6.6基因的相对表达量分析示意图

图17为野生型与转基因拟南芥中低温(4℃)处理12小时后COR47基因的相对表达量分析示意图

图18为野生型与转基因拟南芥中低温(4℃)处理12小时后COR15a基因的相对表达量分析示意图

图19为野生型与转基因拟南芥中低温(4℃)处理12小时后RD29B基因的相对表达量分析示意图

图20为野生型与转基因拟南芥中低温(4℃)处理12小时后CBF1基因的相对表达量分析示意图

图21为野生型与转基因拟南芥中低温(4℃)处理12小时后CBF2基因的相对表达量分析示意图

图22为野生型与转基因拟南芥中低温(4℃)处理12小时后CBF3基因的相对表达量分析示意图

图23为野生型与转基因拟南芥中低温(4℃)处理12小时后ABI5基因的相对表达量分析示意图

图24为野生型与转基因拟南芥中低温(4℃)处理12小时后ABF4基因的相对表达量分析示意图

图25为野生型与转基因拟南芥中低温(4℃)处理12小时后RD29A基因的相对表达量分析示意图

图16至图25中：0h,12h为处理时间

具体实施方式

实施例一：玉米磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14的克隆

1.RNA的提取

利用RNAiso Reagent(Takara,Japan)试剂盒提取玉米叶片的总RNA。

(1)待玉米生长至三叶期时，将其置于人工气候箱中，低温(4℃)处理12小时，取3株相同部位叶片(第三叶幼嫩处)混合后(约40mg)放入1.5mL离心管中，迅速加入液氮冷冻并研磨成粉末。

(2)于管中迅速加入1mL RNAiso reagent(Takara)试剂，室温静止5min，直至粉末融化，轻弹管壁，使粉末均匀散布在试剂中，室温静止10min。

(3)12,000×g，4℃，离心15min。

(4)吸取上清液，加入0.2ml氯仿，剧烈震荡，室温静止5min。

(5)12,000×g，4℃，离心10min。

(6)上清液转入另一新的1.5mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，-20℃醇沉1h。

(7)12,000×g，4℃，离心15min。

(8)倒掉上清，沉淀加入1mL75％无水乙醇冲洗，12,000×g，4℃，离心5min。

(9)再次加入75％无水乙醇冲洗，12,000×g，4℃，离心5min。

(10)放入超净工作台，吹干(大约10min，不能太干，否则不易溶解)。

(11)加入20μlDEPC处理水溶解，待完全溶解，-80℃保存。

(12)取1μl总RNA，稀释100倍，分光光度计测OD值，A260/A280值在1.6-1.8为合格，去2μl RNA1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，EB染色。

2.cDNA第一链的合成

cDNA第一链合成反应体系：

42℃1h，70℃15min，冰上急冷，取5μLcDNA第一链产物1％琼脂糖凝胶电泳检测。

3.cDNA第一链加polyG尾

利用TdT对cDNA第一链在5’末端附加poly G，反应体系如下：

37℃反应30分钟。

4.cDNA第一链的纯化

采用天根生化科技有限公司的超薄DNA产物纯化试剂盒纯化cDNA第一链，方法如下：

(1)向吸附柱CB1中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液BL，12000rpm(13400xg)离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱重新放回收集管中，使用当天处理过的柱子。

(2)向50μl cDNA第一链已分解RNA加入250μl结合液PB，充分混匀。

(3)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB1中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12000rpm(13400xg)离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱CB1放入收集管中。

(4)向吸附柱CB1中加入600μl漂洗液PW，12000rpm(13400xg)离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱CB1放入收集管中。重复操作一次。

(5)弃去接液管内液体，12000rpm(13400xg)离心2min，去掉残留液体，之后将吸附柱CB1置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的试验。

(6)将吸附柱CB1放置一个无菌的1.5ml新离心管中，加入20μl的去离子水，室温静止2min；12000rpm(13400xg)离心2min。重复一次可提高回收效率。

(7)弃吸附柱CB1，-20℃保存。

5.ZmSEC14p基因5’端的扩增

由实验前期cDNA-AFLP获得的片段，设计巢式PCR引物(5’RACE1/5’RACE2)和通用引物5’P，进行两轮PCR扩增。第一轮PCR：模板为实验实例1步骤中获得加尾的cDNA,引物5’P和5’RACE1；第二轮模板为第一轮的PCR产物，引物为5’P和5’RACE2；两轮的PCR扩增反应程序相同：94℃预变性5min,94℃变形30s，55℃退火30s7，2℃延伸2min,进行35循环；72℃充分延伸10min。

5’P：5’-TTAAATTAATCCCCCCCCCCCCCCC-3’

5’RACE1：5’-CAATGGCCAGCCTCTCAGGGTAATG-3’

5’RACE2：5’-CATACACAAGAAACCGAATCTGACC-3’

第二轮PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，回收，测序，分析5’端测序结果。

6.ZmSEC14p基因3’RACE扩增

由5’端获得的测序结果设计3’端的巢式特异性引物(3’RACE1/3’RACE2)和通用引物(P1,P2)进行3’RACE扩增。用实例1得到的反转录成cDNA,引物3’RACE1和P1进行第一轮反应；第二轮：模板为第一轮的PCR产物，引物为3’RACE2和P2。两轮的PCR扩增反应程序相同：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，进行35循环；72℃充分延伸10min。

P1:5’-TGCGTGGAGGACATTGTGGTAGTG(dT)₁₈-3’

P2:5’-TGCGTGGAGGACATTGTGGTAGTG-3’

3’RACE1:5’-TGAAGAAAGTCTCAAATGGAGGGCA-3’

3’RACE2:5’-TGACGGTCAGATTCGGTTTCTTGTG-3’

得到ZmSEC14p基因3’端的序列。(具体过程同上)

7.ZmSEC14p基因cDNA全长的获得

利用DNAMAN软件，对5’端和3’端的序列进行拼接，成功获得ZmSEC14p基因全长的cDNA。根据拼接结果，设计基因CDS特异性引物(ZmSECF/ZmSECR)，以反转录的cDNA为模板，成功获得预期大小的cDNA全长。PCR反应的程序同上。

ZmSECF:5’-CTGCGCTGCGCCTCAAGGCC-3’

ZmSECR:5’-CTGTAACTCATCGTGTACTGAATAA-3’

反应结束后，进行电泳，产物回收，测序，从而获得cDNA全长，其核苷酸序列如SEQID NO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

实施例二：玉米ZmSEC14基因的生物信息学分析

ZmSEC14p基因编码一种玉米磷脂酰肌醇转运蛋白，其开放阅读框有888bp的核苷酸，编码295个氨基酸，蛋白大小33.978KD。利用NCBI网站对ZmSEC14蛋白进行功能域的分析发现，此蛋白包含保守的SEC14结构域(86-241aa)，包含CRAL-TRIO-N结构域(19-65aa)。利用DNAMAN软件对多种植物(水稻，大麦，大豆，拟南芥，谷子，高粱，小麦，葡萄)的SEC14p氨基酸序列进行多重比较(如图1所示)，结果这些基因在保守的SEC14结构域同源性很高。因此该基因属于SEC14超家族成员之一。

NCBI数据库结合maizegdb数据库搜索出不同物种中同源的SEC14氨基酸序列，具体包括：水稻(NP_001051120.1)，大麦(MLOC_67500.1)，大豆(XP_003544415.1)，谷子(XP_004981935.1)，高粱(Sb01g009685.1)，小麦(EMS66889.1)，葡萄(XP_002266907.2)，芜菁(Bra010566.1-P)，香蕉(GSMUA_Achr4P03190_001)，酵母(NP_014135.1)，莱茵衣藻(XP_001699411.1)，小立碗藓(XP_001774454.1)，毛果杨(XP_002310229.2)，江南卷柏(XP_002980158.1)，二穗短柄草(XP_003560444.1)，蒺藜状苜蓿(XP_003629457.1)，马铃薯(XP_006340611.1)，无油樟(XP_006856013)，碧桃(XP_007223256.1)。系统进化树分析表明，此基因与水稻同源基因亲缘关系最近，与拟南芥、酵母的亲缘关系较远(如图2所示)。

实施例三：玉米ZmSEC14p基因对非生物胁迫的响应

待玉米长到三叶一心期时，分别用低温(4℃)、Nacl(250mM)、ABA(100uM)处理0h,2h,4h,6h,12h,24h。提取玉米叶片与根的RNA用于基因相对表达量的分析。利用ABI7500RealTime PCR System(Applied Biosystems)和7500System softwareversion1.3.1进行Real-time RT-PCR扩增。RNA提取与cDNA第一链的合成同上。之后将cDNA稀释5倍，按照试剂盒SYBR Green RealMasterMix with ROX说明进行Real-time PCR。所用引物如下：

YGSEC14F：5’-AAAATCTGCACTTGGTCCTT-3’

YGSEC14R：5’-GTCCATCCCGTGAAGTCTAT-3’

ActinF:5’-CGATTGAGCATGGCATTGTCA-3’

ActinR:5’-CCCACTAGCGTACAACGAA-3’

GAPDHF；5’-CCCTTCATCACCACGGACTAC-3’

GAPDHR；5’-ACCTTCTTGGCACCACCCT-3’

qRT-PCR的结果显示ZmSEC14基因的表达在叶片与根部受到低温、盐及ABA的诱导表达(如图3-8所示)。

实施例四：玉米ZmSEC14p植物表达载体的构建

(1)用高保真酶扩增出ZmSEC14p基因的CDS序列。根据中间载体pCHF3300多克隆位点处相应序列，引物设计时加入相应酶切位点。

(2)把经过高保真酶扩增出的基因，通过回收、加A、连接T载体、转化、PCR酶切鉴定、测序等一系列步骤，确定表达基因的正确性，有完整的开放阅读框、无错配、无移码。

(3)把测序正确的基因利用其设计的酶切位点酶切，回收小片段(基因)。

(4)把表达载体pCAMBIA3301以相同酶切位点酶切，回收大片段(载体)。

(5)把回收的大片段与小片段连接。

(6)转化大肠杆菌感受态、提取质粒进行PCR和酶切鉴定。

SECF(SmaI):5’-TCCCCCGGGATGTTCAGGAGAAAGCATGCTTCTC-3’

SECR(XbaI):5’-CTAGTCTAGATCATTAACTGGCTTTAGCAGCAATC-3’

实施例五：转ZmSEC14p基因拟南芥的获得及分子检测

利用蘸花法对基因进行拟南芥转化，具体如下：

(1)将开花的拟南芥倒置使花蕾朝下，侵入农杆菌菌液中2min。

(2)将转化后的拟南芥植株平放，盖好保鲜膜，低光强度下生长24h后置于正常光照条件下培养生长，一周后同上再侵染一次。

(3)转化后植株可正常地开花生长，待角果完全枯黄、欲开裂时，即可收获种子。

(4)收获的部分T₀代种子经Basta筛选，PCR鉴定，获得T₁代转基因植株，经过两次加代，获得T₃代拟南芥植株，可用于后续的表型筛选。

实施例六：T₃代转ZmSEC14p基因拟南芥的非生物胁迫处理与长势测定

分别随机播种野生型与转基因拟南芥种子50粒于MS培养基上，野生型于24℃/22℃，16h光照，8h黑暗，湿度80％下培养，转基因植株分别放于4℃下进行低温处理；MS培养基中各加入150mM、200mM的Nacl进行盐处理；MS培养基中加入10uM的ABA进行胁迫，观察萌发率，实验重复三次。结果显示转基因植株在低温胁迫下，其萌发显著超于野生型。此外转基因植株对盐及ABA敏感。(如图9-12所示)

待拟南芥完全萌发后，3天大的幼苗被转移到MS培养基上，分别置于4℃人工气候箱中，含有150、200mM的Nacl的MS培养基上，含有400mM的甘露醇MS培养基上，观察其生长状况，实验重复三次。结果表明在含有不同盐浓度的MS培养基和400mM的甘露醇中，转基因植株与野生型在早期生长阶段没有明显差别，但是在4℃低温生长环境下，转基因植株生长要快于野生型植株。(如图13所示)

实施例七：T₃代转基因拟南芥抗冻性测试

将四周龄野生型与转基因拟南芥在-10℃处理10h,统计存活率。结果表明转基因植株的存活率显著高于野生型植株，说明ZmSEC14p能提高转基因植株对低温的抗性。(如图14、15所示)

实施例八：T₃代转基因拟南芥抗逆marker基因的qRT-PCR检测

将生长四周龄的野生型，转基因植株放于人工气候箱低温(4℃)处理12h,提取叶片的RNA进行qRT-PCR，其过程同上。通过对逆境Marker基因的表达分析，结果显示4℃处理12h后，ZmSEC14p可以提高抗逆marker基因的表达，进而提高植株对低温的抗性(如图16-25所示)。抗逆marker基因的引物如下：

RD29AF:5’-GGAGGAAATTATTCCACCAGGG-3’

RD29AR:5’-CAGAATGAGCCGGTGCATCGTG-3’

RD29BF:5’-CCTGTCGTGTCTTCTGACCACAC-3’

RD29BR:5’-CGCTTCCCAGTCCGATGTTTCC-3’

COR6.6F:5’-CTGCTGGACAAGGCCAAGGATG-3’

COR6.6R:5’-GGCCGGTCTTGTCCTTCACGAAG-3’

COR15aF:5’-AGTGAAACCGCAGATACATTGG-3’

COR15aR:5’-ACCCTACTTTGTGGCATCCTTAGC-3’

COR47F:5’-CCACTACCATCCCGGTACCAGTG-3’

COR47R:5’-TTCTCGTCGTGGTGACCAGGAAG-3’

CBF3F:5’-TATTTCAGCAAACCATACCAAC-3’

CBF3R:5’-CTCTAACCTCACAAACCCACTT-3’

CBF2F:5’-ATCTTCTACTTACTCTACTCTC-3’

CBF2R:5’-GTTTCTTTGACGAACTCCTCTG-3’

CBF1F:5’-TACGTACTACTTAAACCTTATCCAG-3’

CBF1R:5’-AGTCTCACGAAACTTCTTACGG-3’

ABI5F:5’-ACTATGTGAAGGAGGAGAACCT-3’

ABI5R:5’-CCCAAAGAAGTAAACGGATG-3’

ABF4F:5’-GCAGCAACACACTTGTCGT-3’

ABF4R:5’-TCTGGTTACTACTCCCTTCCC-3’

AtACTINF:5’-CCGTGTTGCTCCTGAGGAACATC-3’

AtACTINR:5’-CCTCAGGACAACGGAATCGCTC-3’

根据上述技术，本发明从耐冷玉米自交系W9816中分离鉴定出一个磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p，其表达受低温、盐、ABA的诱导，可见ZmSEC14p在非生物胁迫中扮演着重要的角色。我们通过农杆菌介导的转化方法，将ZmSEC14p过表达载体成功转化拟南芥，获得了纯合的T₃代转基因拟南芥植株。我们发现：在低温胁迫下，转基因拟南芥显示出更高的萌发率、存活率，及较强的根部生长能力。此外，我们还发现：转基因拟南芥在种子萌发阶段对ABA、甘露醇敏感，尤其对盐超敏感。同时我们还检测到：在转基因拟南芥中，过表达ZmSEC14p能上调逆境响应基因的表达，包括CBF1，CBF2，CBF3，COR6.6，COR15，COR47a，RD29A，RD29B。上述结果均说明耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p能提高拟南芥的抗冷性。

Claims (4)

1.一种耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白，其特征在于由权利要求1所述的耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p序列编码，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。

3.一种植物表达载体，其特征在于含有权利要求1所述的耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p。

4.权利要求1所述的耐冷玉米自交系W9816磷脂酰肌醇转运蛋白基因ZmSEC14p在拟南芥抗冷基因工程方面的应用。