CN105420273A - 一种开花提前的转基因植物的培育方法 - Google Patents

一种开花提前的转基因植物的培育方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种开花提前的转基因植物的培育方法，属于分子生物学技术领域。本发明所公开的方法是将大豆的miRNA172a通过表达载体转移至农杆菌中，再通过农杆菌侵染宿主植株，通过靶基因降解位点的验证和筛选鉴定获得转基因阳性单株。本发明从大豆全基因组中克隆出miRNA172a基因，并通过构建表达载体将该基因转到拟南芥中成功获得转基因纯化植株及相应表型，能够有效提前拟南芥的开花时间。

Description

一种开花提前的转基因植物的培育方法
技术领域
本发明涉及一种开花提前的转基因植物的培育方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
MicroRNAs(miRNAs)是一种基本的、具有序列特异性的真核基因组的调节因子，通常在转录水平或者转录后水平调节其靶基因的表达。成熟的miRNAs是一系列小的非编码单链小分子RNA，在动物中，它通常由20-22核苷酸组成，而在植物中通常是20-24个核苷酸大小。MicroRNAs(miRNAs)在植物的生长发育以及植物对环境的适应方面发挥了重要的作用，成为近几年研究的热点。
miR172最早在拟南芥中通过小RNA测序获得的，由于它极度保守，在多种植物中也被相继发现。之前的大多数研究显示miR172通过抑制一系列AP2-like类转录因子参与植物花器官的形成与开花时间调控。然而，到目前为止，对大豆miR172家族的研究相对较少，尚没有以大豆miR172基因培育转基因植物的方法。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种开花提前的转基因植物的培育方法，所采取的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种开花提前的转基因植物的培育方法，该方法的步骤如下：
1)克隆待转基因的前体序列，并构建含有待转基因前体序列序列的表达载体；
2)将步骤1)构建的表达载体导入到农杆菌中，并利用所得农杆菌侵染宿主植物；
3)验证步骤1)中前体序列对靶基因的降解位点，并筛选鉴定步骤2)中被侵染的宿主植物，获得转基因阳性单株；
4)通过表型验证转基因株系。
优选地，步骤1)所述前体序列，是含有大豆miRNA172a基因保守区域的序列，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述克隆所用引物的序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示；所述表达载体，还含有草丁膦抗性基因。
优选地，步骤1)所述表达载体，所用质粒pCAMBIA3301。
优选地，步骤2)所述农杆菌，为农杆菌EHA105；所述宿主植物，为拟南芥。
优选地，步骤3)所述靶基因为基因Glyma03g33470。
更优选地，所述验证降解位点是验证miRNA172a对靶基因Glyma03g33470的降解位点，是提取侵染宿主植物的总RNA合成cDNA，再利用核苷酸序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的引物进行两轮巢式PCR，并通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离，回收目的DNA片段后，再将回收产物连接到pGM-T载体上，转化到大肠杆菌后进行测序鉴定。
优选地，所述测序鉴定，是分析确定降解位点是否分布在侵染植物大豆gma-miR172a成熟序列5’-端第十和第十一碱基之间。
优选地，所述靶基因，扩增靶基因所用引物的序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示。
所述培育方法的具体步骤如下：
1)以大豆基因组为模板，以如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的核苷酸序列为引物，克隆如核苷酸序列如SEQIDNO.1所示含有大豆miRNA172a基因保守区域的序列，并利用所得序列与草丁膦抗性基因、质粒pCAMBIA3301构建表达载体；
2)将步骤1)构建的表达载体导入到农杆菌EHA105中，再利用所得农杆菌侵染拟南芥，获得侵染植物；
3)提取步骤2)侵染植物中的总RNA并合成cDNA，再利用核苷酸序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的引物进行两轮巢式PCR，并通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离，回收目的DNA片段后，再将回收产物连接到pGM-T载体上，转化到大肠杆菌后进行测序鉴定，分析确定所转序列对靶基因Glyma03g33470的降解位点是否分布在侵染植物大豆gma-miR172a成熟序列5’-端第十和第十一碱基之间，鉴定后通过草丁膦抗性筛选，PCR定量鉴定，获得转基因阳性单株；
4)通过与野生型对比验证步骤3)所得转基因阳性单株的开花时间是否提前，获得转基因株系。
以上所述培育方法在作物育种中的应用也在本发明的保护范围之内。
本发明获得的有益效果是：
本发明从大豆全基因组中克隆出miRNA172a(gma-miRNA172a)基因，并通过构建表达载体将该基因转到拟南芥中成功获得转基因纯化植株及相应表型，该基因能够有效提前拟南芥的开花时间。
利用本发明所提供的培育方法能够培育出具有大豆miRNA172a基因的开花提前的拟南芥植株系。利用本发明所提供方法培育出的转基因植株，其长、短日照条件下开花时间比对照组分别提前了4和9天。本发明所提供的方法一方面验证了大豆miRNA172a基因的促进提前开花的作用，同时，本发明确定了大豆miRNA172a基因在大豆体内的靶基因。
附图说明
图1为利用DNAman软件对大豆miR172家族成员的前体序列进行比对的结果。
图2不同的生长天数、组织、光周期条件下的gma-miR172a和靶基因Glyma03g33470的表达情况；
(其中，A为不同生长天数下不同miRNA172基因及靶基因Glyma03g33470的表达情况；B为基因gma-miR172a和靶基因Glyma03g33470在植株不同部位的表达情况；C为大豆miR172a的昼夜节律表达；D为大豆Glyma03g33470的昼夜节律表达)。
图3利用5’RACE实验探索大豆miR172a对靶基因Glyma03g33470降解位点的位置。
图4为转基因植株的筛选鉴定结果；
(其中，A为T2代转基因植物中目的基因的PCR鉴定，其中M：DL2000plusDNA分子量标准；1-20：PPT抗性干涉拟南芥；21：野生型拟南芥；22：水；23：阳性质粒；B为抽提gma-miR172a转基因T3代植株RNA)。
图5以大豆miRNA172a的转基因拟南芥为实验组，野生型为对照组，比较转基因T3代在长、短日照条件下的开花情况；
(其中，A为不同日照条件下转基因植株的生长情况；B为不同日照条件下转基因植株与对照植株的叶片生长情况；C为不同日照条件下转基因植株与对照植株的开花情况)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
实施例1大豆miRNA172a的克隆与表达载体构建
1.根据已知miRNA172a基因序列的保守区域，设计大豆miRNA172a引物如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3。对由组织抽提的大豆全基因组DNA进行特异性PCR扩增；
2.常温凝胶电泳分离产物，检测到大小约159bp的条带；
3.回收条带纯化，再次用同一引物扩增后测序，结果如SEQIDNO.1。
4.利用限制性内切酶BglⅡ、BstEII双酶切pCAMBIA3301质粒和pGM-T-miR172a质粒，得到酶切片段；回收所得pCAMBIA3301酶切体系中的载体大片段和miR172a基因小片段，利用T4DNA连接酶将miR172a基因替代原pCAMBIA3301质粒上的GUS基因，构建表达载体pCAMBIA3301-miR172a；将得到的载体pCAMBIA3301-miR172a导入农杆菌EHA105，进行PCR检测和酶切鉴定，用检测转化成功的农杆菌侵染植物，得到转基因植物。
实施例2大豆miR172成员序列分析与比对
发明人将获得的gma-miR172的前体序列利用DNAman软件进行比对，结果如图1所示。从图1中可知，除了一些保守碱基外(图中星号指示的位置)，发明人发现各成员间在前体序列还是有一些差异，这可能是造成各成员功能不同的原因之一。
实施例3大豆在不同生长天数、组织、光周期条件中gma-miR172a和靶基因Glyma03g33470的表达情况。
1.根据大豆miR172a的靶基因Glyma03g33470(核苷酸序列如SEQIDNO.4)设计引物(SEQIDNO.7和SEQIDNO.8)；
2.用上述引物，以及gma-miR172a引物SEQIDNO.2和SEQIDNO.3分别在大豆不同生长天数、组织、光周期条件中下的cDNA中扩增gma-miR172a和靶基因Glyma03g33470；
结果如图2A所示。在不同生长天数条件下，gma-miR172a的表达水平明显高于其他成员，并且其表达量随着植株生长逐步提高，在长、短日照条件下分别在38和28天达到峰值，与靶基因Glyma03g33470的表达有互补效应，Glyma03g33470在幼苗期表达水平较高，随后逐步降低。gma-miR172a与靶基因在不同组织的表达也有互补效应。如图2B，在叶、茎中gma-miR172a表达水平较低，而靶基因的表达较高，此外gma-miR172a在花芽表达较高，以上结果说明其可能参与了开花调控。
在不同光周期处理下(图2C和2D)，gma-miR172a及其靶基因Glyma03g33470的表达水平在长日照条件下要比短日照条件高，而且都具有明显的昼夜节律性，证明gma-miR172a和靶基因Glyma03g33470的表达受生物钟诱导。
实施例45’RACE验证大豆miR172a对靶基因Glyma03g33470降解位点位置
将提取的总RNA直接合成第一链和第二链的cDNA，然后进行5’端接头的连接。连接好的产物利用接头引物分别和两对特异性引物如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6进行两轮巢式PCR，将上述PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，采用OMEGA胶回收试剂盒回收目的DNA片段。然后将胶回收产物连接pGM-T载体，转化大肠杆菌后进行测序鉴定，分析降解位点如图3所示分布在gma-miR172a的5’端第十和十一碱基间。
实施例5转基因植株的筛选鉴定
1)分批采摘成熟果夹，脱水干燥数天，取出种子，清理干净后放回干燥器中室温保存备用；
2)将转基因种子消毒，在拟南芥筛选培养基上(MS+6.5mg/PPT)无菌培养，4℃暗培养3d后转至人工气候室正常培养。10d后将有4片真叶并生根的抗性小苗转移到盆土，盖上薄膜保湿，在温室中培养，3d取下薄膜转为正常培养，生长良好的植株即为转基因株系。
3)以SDS法小量抽提拟南芥单株的的基因组DNA，以野生型拟南芥作空白对照，利用引物SEQIDNO.2和SEQIDNO.3，进行PCR检测，结果见图4A；
4)连续按上述步骤筛选出T1代、T2代转基因株系，验证T2代植株中抗性后，若为阳性则收其种子种植获得T3代纯合株系。
5)提取含有PPT抗性单株子代(T3代纯合)的莲座叶RNA，反转录得到cDNA样本，在cDNA样本中检测外源基因gma-miR172a的表达，结果如图4B。三个转基因株系的外源基因都有明显的表达。
实施例6转基因株系表型鉴定
以野生型作为对照，比较转基因纯合株系(3个株系)和野生型在长短日照下的开花时间，发现转基因gma-miR172a的拟南芥出现了提前开花的表型。叶片数目与野生型相比有所减少(图5A，B)。并且从萌发到开花的天数明显减少(图5A，C)，说明gma-miR172a在转基因拟南芥中促进提前开花。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种开花提前的转基因植物的培育方法，其特征在于，步骤如下：
1)克隆待转基因的前体序列，并构建含有待转基因前体序列序列的表达载体；
2)将步骤1)构建的表达载体导入到农杆菌中，并利用所得农杆菌侵染宿主植物；
3)验证步骤1)中前体序列对靶基因的降解位点，并筛选鉴定步骤2)中被侵染的宿主植物，获得转基因阳性单株；
4)通过表型验证转基因株系。
2.根据权利要求1所述培育方法，其特征在于，步骤1)所述前体序列，是含有大豆miRNA172a基因保守区域的序列，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述克隆所用引物的序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示；所述表达载体，还含有草丁膦抗性基因。
3.根据权利要求1所述培育方法，其特征在于，步骤1)所述表达载体，所用质粒pCAMBIA3301。
4.根据权利要求1所述培育方法，其特征在于，步骤2)所述农杆菌，为农杆菌EHA105；所述宿主植物，为拟南芥。
5.根据权利要求2所述培育方法，其特征在于，步骤3)所述靶基因为基因Glyma03g33470。
6.根据权利要求5所述的培育方法，其特征在于，验证miRNA172a对靶基因Glyma03g33470的降解位点，是提取大豆的总RNA合成cDNA，再利用核苷酸序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的引物进行两轮巢式PCR，并通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离，回收目的DNA片段后，再将回收产物连接到pGM-T载体上，转化到大肠杆菌后进行测序鉴定。
7.根据权利要求6所述培育方法，其特征在于，所述测序鉴定，是分析确定降解位点是否分布在侵染植物大豆gma-miR172a成熟序列5’-端第十和第十一碱基之间。
8.根据权利要求5所述培育方法，其特征在于，所述靶基因，扩增靶基因所用引物的序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示。
9.根据权利要求2所述培育方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)以大豆基因组为模板，以如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的核苷酸序列为引物，克隆如核苷酸序列如SEQIDNO.1所示含有大豆miRNA172a基因保守区域的序列，并利用所得序列与草丁膦抗性基因、质粒pCAMBIA3301构建表达载体；
2)将步骤1)构建的表达载体导入到农杆菌EHA105中，再利用所得农杆菌侵染拟南芥，获得侵染植物；
3)提取步骤2)侵染植物中的总RNA并合成cDNA，再利用核苷酸序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的引物进行两轮巢式PCR，并通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离，回收目的DNA片段后，再将回收产物连接到pGM-T载体上，转化到大肠杆菌后进行测序鉴定，分析确定所转序列对靶基因Glyma03g33470的降解位点是否分布在侵染植物大豆gma-miR172a成熟序列5’-端第十和第十一碱基之间，鉴定后通过草丁膦抗性筛选，PCR定量鉴定，获得转基因阳性单株；
4)通过与野生型对比验证步骤3)所得转基因阳性单株的开花时间是否提前，获得转基因株系。
10.权利要求1-9任一所述培育方法在作物育种中的应用。
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