CN115927377B - 一种湿加松年龄标记基因PtAP2L3及其筛选方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种湿加松年龄标记基因PtAP2L3及其筛选方法与应用，涉及生物技术领域。本发明所述的湿加松年龄标记基因PtAP2L3的表达量自幼苗起随着树龄增加而下降，与湿加松的年龄和湿加松组织器官的个体发育老化程度呈负相关。经试验证实可知，利用PtAP2L3基因可准确反映出湿加松组织器官的个体发育老化程度，与传统的依赖植物形态及生理指标的分辨方法相比，本发明对树木年龄和个体发育老化程度的判断精度更高，科学性更强，可重复性好。

Description

一种湿加松年龄标记基因PtAP2L3及其筛选方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种湿加松年龄标记基因PtAP2L3及其筛选方法与应用。

背景技术

湿加松(Pinus elliottii×P.caribaea)是以湿地松(P.elliottii)为母本，加勒比松(P.caribaea)为父本杂交选育得到的，具有生长快、分枝及干型良好、耐性及抗病虫能力强等优点，在澳大利亚及美洲多国作为速生丰产林被广泛种植。自上世纪90年代起，湿加松于我国广东省开展育种和无性系选育工作，并与其母本湿地松共同成为我国南方重要的经济树种。在湿加松无性系繁育的实践中，研究人员总结出松树扦插及规模化繁育技术，该技术将截顶促萌与重复修剪相结合，使湿加松的主茎与所有侧枝保持在同一水平面上，形成“矮桩平台式”的采穗母株，使其获得高产量、高质量、高存活率的插穗产出。此外，研究人员发现，松树扦插及规模化繁育技术所繁育的扦插后代突破了树木个体发育老化带来的技术瓶颈，期间也发现经过平茬处理能使湿加松的枝条复幼的重要生理现象。

在生产实践中，用于扦插、嫁接的无性繁殖材料应处于幼年状态，若选择的材料处于不合适的个体发育老化阶段，会导致无性系造林承受巨大损失。无性繁殖材料个体发育老化在很大程度上取决于母树的年龄，年龄愈大、愈衰老，呈现相对幼态的性状就愈困难，同时，由于树木还存在年老梯度，同一树木不同部位的材料个体发育老化程度也不尽相同。因此，判断树木组织的个体发育老化程度已成为提高造林成活率和造林质量亟待解决的重大科学问题。

最传统的植物幼年状态鉴定方法是从树木外形观察分辨，处于幼年阶段的树木具有树干通直、树枝分叉为锐角、树皮平滑等特征；而成熟阶段的树木树枝分叉呈钝角、树皮相对粗糙、枝条的节间较短，但通过外形及植物生理标准进行辨别，往往受到个体差异、环境和人为因素的影响，结果并不准确，可重复性差。近年来，随着分子生物学研究的深入，miR156和miR172等分子标记被视作与年龄相关的重要调控因子来判断树木的年龄及幼化状态，但在油松(Pinus tabuliformis)等针叶树中，该类分子标记与并未表现出与年龄的相关性，在湿加松中也尚未发现可判断树木年龄及组织器官个体发育老化程度的年龄标记基因。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种湿加松年龄标记基因PtAP2L3及其筛选方法与应用，所述年龄标记基因PtAP2L3能够高效、准确地判断树木组织器官的个体发育老化程度，为判断树木年龄提供科学参考。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种湿加松年龄标记基因PtAP2L3，所述标记基因PtAP2L3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了上述基因在判断湿加松年龄中的应用，所述基因PtAP2L3与湿加松年龄呈负相关。

本发明还提供了上述基因PtAP2L3在判断湿加松组织器官的个体发育老化程度中的应用，所述基因PtAP2L3与湿加松组织器官的个体发育老化程度呈负相关。

优选的，利用引物组分别测定待测样本和参考样本中基因PtAP2L3的表达量，通过比较待测样本和参考样本中基因PtAP2L3的表达量大小判断湿加松年龄或组织器官的个体发育老化程度。

优选的，所述引物组中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，所述参考样本为与待测样本同龄的实生湿加松最下层的枝条。

优选的，所述判断的方法为：若被测样本中PtAP2L3基因的表达量与参考样本中无显著差异，则被测样本的年龄或组织器官的个体发育老化程度与目标年龄或组织器官的个体发育老化程度大致相同；若被测样本中PtAP2L3基因的表达量显著低于参考样本，则被测样本年龄或组织器官的个体发育老化程度高于目标年龄或组织器官的个体发育老化程度；若被测样本中PtAP2L3基因的表达量显著高于参考样本，则被测样本年龄或组织器官的个体发育老化程度低于目标年龄或组织器官的个体发育老化程度。

本发明还提供了一种上述湿加松年龄标记基因PtAP2L3的筛选方法，所述筛选方法包括如下步骤：

以不同树龄的实生湿加松作为样本材料，经RNA提取、文库构建、转录组测序获得不同树龄实生湿加松的基因数据；

对所得的基因数据依次进行数据质控、参考基因组比对、基因表达量分析和加权基因共表达网络分析后即得所述湿加松年龄标记基因PtAP2L3。

优选的，所述样本材料为实生湿加松最低冠层的末梢枝条。

优选的，所述树龄包括0.5年、2年、4年、6.5年和10年。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种湿加松年龄标记基因PtAP2L3，以不同树龄的实生湿加松作为样本材料通过高通量测序及分析筛选获得，所得的湿加松年龄标记基因PtAP2L3的表达量自幼苗起随着树龄增加而下降，与湿加松年龄和组织器官的个体发育老化程度呈负相关。经试验证实可知，利用本发明基因PtAP2L3可准确反映出湿加松组织器官的个体发育老化程度，对植物年龄和组织器官的个体发育老化程度的判断精度更高，科学性更强，可重复性好。而且，本发明提供的年龄标记基因筛选方法年龄梯度设置合理，操作简便，能够快速高效地筛选出不同物种的年龄标记基因，弥补了湿加松年龄标记基因的空白，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为PtAP2L3基因在0.5年、2年、4年、6.5年、10年生实生湿加松最下层枝条中的表达量。

图2为PtAP2L3基因在0.5年实生湿加松(S0.5y)及1年、2年、3年、6.5年、8年、10年生平茬复幼湿加松(C1.0y-C10.0y)中的表达量。

具体实施方式

本发明提供了一种湿加松年龄标记基因PtAP2L3，所述标记基因PtAP2L3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上述基因PtAP2L3在判断湿加松年龄中的应用，所述基因PtAP2L3与湿加松年龄呈负相关。本发明还提供了上述基因PtAP2L3在判断湿加松组织器官的个体发育老化程度中的应用，所述基因PtAP2L3与湿加松组织器官的个体发育老化程度呈负相关。

本发明中，利用引物组分别测定待测样本和参考样本中基因PtAP2L3的表达量，通过比较待测样本和参考样本中基因PtAP2L3的表达量大小判断湿加松年龄或组织器官的个体发育老化程度。在本发明中，所述引物组优选的根据基因PtAP2L3设计得到，所述引物组中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明中，所述参考样本优选为与待测样本同龄的实生湿加松最下层的枝条，更优选为最下层枝条上距末梢10cm-12cm的嫩茎。本发明中，所述参考样本的年龄优选的根据林业生产或科学研究所需材料(即待测样本)的年龄确定。本发明以参考样本中PtAP2L3基因的表达量作为指示湿加松材料处于目标年龄的标准。本发明中，所述测定的方法优选为实时荧光定量PCR。

本发明通过比较待测样本和参考样本中基因PtAP2L3的表达量大小判断湿加松年龄或湿加松组织器官的个体发育老化程度；所述判断的方法优选为：若被测样本中PtAP2L3基因的表达量与参考样本中无显著差异，则被测样本的年龄或组织器官的个体发育老化程度与目标年龄或组织器官的个体发育老化程度大致相同；若被测样本中PtAP2L3基因的表达量显著低于参考样本，则被测样本年龄组织器官的个体发育老化程度高于目标年龄组织器官的个体发育老化程度；若被测样本中PtAP2L3基因的表达量显著高于参考样本，则被测样本年龄组织器官的个体发育老化程度低于目标年龄组织器官的个体发育老化程度。

本发明还提供了一种上述湿加松年龄标记基因PtAP2L3的筛选方法，所述筛选方法包括如下步骤：

以不同树龄的实生湿加松作为样本材料，经RNA提取、文库构建、转录组测序获得不同树龄实生湿加松的基因数据；

对所得的基因数据依次进行数据质控、参考基因组比对、基因表达量分析和加权基因共表达网络分析后即得所述湿加松年龄标记基因PtAP2L3。

本发明中，所述树龄优选的包括0.5年、2年、4年、6.5年和10年，选择所述树龄梯度合理，能够快速高效地筛选出不同物种的年龄标记基因。本发明中，所述样本材料优选为实生湿加松最低冠层的末梢枝条，更优选为所述末梢枝条距末梢10cm-12cm的嫩茎段。本发明对所述RNA提取、文库构建、转录组测序并没有具体限定，采用本领域常规的RNA提取方法、文库构建方法以及转录组测序平台进行即可。

本发明对所得的基因数据依次进行数据质控、参考基因组比对、基因表达量分析和加权基因共表达网络分析后即得所述湿加松年龄标记基因PtAP2L3。本发明中，所述参考基因组优选为油松(Pinus tabuliformis)的高质量基因组Chinese pine genome(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA784915)。本发明将质控后的数据与所述参考基因组进行比对后获得匹配数据，然后对所述匹配数据进行表达量分析。本发明中，所述基因表达量分析优选的包括如下步骤：将各样本的clean reads映射到油松参考基因组上，以获得mRNA的表达水平，利用RNA-Seq数据量化软件Kallisto计算每个uigene的表达丰度，选择以TPM的归一方法表征基因的表达量。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

年龄标记基因的筛选：

1)不同树龄实生湿加松的取样

于广东省台山市红岭种子园(112°49′N，22°9′W)选择0.5年、2年、4年、6.5年、10年实生湿加松，取样部位为最低冠层的末梢枝条，将所采枝条距末梢10cm-12cm的嫩茎段作为样本材料，每组样本3个生物学重复，上述材料在采集后均立即用液氮速冻，并于-80℃超低温冰箱中保存。

2)RNA提取、文库构建、转录组测序

通过Trizol法提取参考样本的总RNA，经过质检后使用NEB#7530试剂盒(#E7530，New EnglandBiolabs)进行转录组文库构建，在文库质检合格后，送至广州基迪奥生物科技有限公司，在Illuminanova-6000平台上进行高通量测序。

3)数据质控及参考基因组比对

对原始数据(rawreads)进行数据质控，依次过滤碱基N的比例大于10％的reads，过滤质量值Q≤20的碱基数占整个read的50％以上的reads，截去adaptor及其后的部分，过滤截去adaptor后短于50bp的reads，得到高质量的质控数据(High quality cleanreads)；

以湿加松的近缘物种——油松的高质量基因组Chinese pine gen ome(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA784915)作为参考基因组，将质控数据与之进行比对，获得后续用于转录本组装和表达量分析的匹配数据(mapped reads)。

4)基因表达量分析

将各样本的cleanreads映射到油松参考基因组上，以获得mRNA的表达水平，利用RNA-Seq数据量化软件Kallisto计算每个uigene的表达丰度，选择以TPM(Transcriptpermillion)的归一方法表征基因的表达量。

5)加权基因共表达网络分析

将基因在所有样本中表达量即TPM<1的基因过滤去除，将过滤后的基因集以软阈值“power＝15”并构建基因网络，网络构建及模块合并参数为“deepSplit＝2；minModuleSize＝100；mergeCutHeight＝0.20”。对所得模块进行模块与模块间相关性、样本与模块间相关性分析，前者通过模块基因表达量聚类，后者通过Pearson相关分析，对模块特征值与样本表达矩阵进行的相关性计算。最后对模块中基因表达量进行PCA分析，用PC1代表模块的指标即模块特征向量(MEs)，并由MEs值的变化趋势进行模块筛选。保留2个模块前1％的基因进行hub基因网络构建，使用Cytoscape软件对网络进行可视化和hub基因筛选，通过MCODE插件提取子网络，继而用CytoHubba插件结合MMC等12种算法的交集得到年龄标记基因PtAP2L3，PtAP2L3基因的序列为SEQ ID NO.1所示。

实施例2

年龄标记基因的验证

1)引物设计

根据年龄标记基因PtAP2L3的CDS序列，利用NCBI的在线引物设计网站Primer-BLAST进行引物设计，PtAP2L3基因的引物序列为：

上游引物：CTAACCCGATCTCGCTGGAC(SEQ ID NO.2)；

下游引物：CCGCGTCTGCTTTTCTTAGC(SEQ ID NO.3)。

2)不同树龄实生湿加松的取样

选择0.5年、2年、4年、6.5年、10年实生湿加松(命名为S0.5y、S2.0y、S4.0y、S6.5y、S10.0y)，取样部位为最低冠层的末梢枝条，将所采枝条距末梢10cm-12cm的嫩茎段作为样本材料，上述材料在采集后均立即用液氮速冻，并于-80℃超低温冰箱中保存。

3)样本总RNA的提取

应用天根生化科技(北京)有限公司RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(DP441)提取步骤2)所采集样本的总RNA。RNA浓度和完整性分别用Nano微量分光光度计和1％琼脂糖凝胶电泳测定。

4)样本总RNA的反转录

在RNase free PCR管中，完成步骤3)中获得的总RNA的反转录反应，并去除基因组DNA。按照下表1配制反转录体系：

表1反转录体系

将上述体系轻轻混匀，于PCR仪中42℃孵育15min，之后85℃加热5s使RT/RIEnzyme和gDNARemover彻底失活，产物保存在-20℃。

5)PtAP2L3基因的实时荧光定量PCR验证

将步骤4)中反转录生成的cDNA稀释70倍后作为模板，按照下表2中qRT-PCR反应体系和反应条件进行qRT-PCR：

表2 qRT-PCR反应体系

采用SYBR Green嵌合荧光法进行反应，预变性反应程序设置为95℃2min，PCR反应程序设置为94℃5s、60℃30s，39个循环；熔解曲线分析反应程序设置为65-95℃每5s增加0.5℃。每个样品进行3次技术重复和3次生物学重复，每板样品加入独立的内参Pt18S。

PtAP2L3基因在0.5年、2年、4年、6.5年、10年实生湿加松样本中的实时荧光定量PCR结果如图1所示，其表达量与年龄呈负相关，随湿加松年龄的增加而下降。

实施例3

年龄标记基因在判断湿加松平茬复幼中的应用

1)引物设计

引物设计方法及引物序列与实施例2中步骤1)相同，PtAP2L3基因的引物序列为：

上游引物：CTAACCCGATCTCGCTGGAC(SEQ ID NO.2)；

下游引物：CCGCGTCTGCTTTTCTTAGC(SEQ ID NO.3)。

2)设置参考样本

以0.5年树龄的实生湿加松幼苗为参考样本的取材对象，取幼苗枝条中距末梢10cm-12cm的嫩茎为参考样本，以该样本中PtAP2L3基因的表达量作为指示湿加松材料处于幼龄状态的标准。

3)被测样本及参考样本采集

林业生产及科学研究证明，平茬能够使湿加松实现复幼。采集平茬复幼后的1年、2年、3年、6.5年、8年、10年生湿加松矮桩平台的枝条，取距末梢10cm-12cm的嫩茎段作为被测样本材料(命名为C1.0y、C2.0y、C3.0y、C6.5y、C8.0y、C10.0y)；同时，采集0.5年生湿加松枝条，取距末梢10cm-12cm的嫩茎段作为参考样本材料(命名为S0.5y)。上述材料在采集后均立即用液氮速冻，并于-80℃超低温冰箱中保存。

4)被测样本及参考样本总RNA的提取

被测样本及参考样本总RNA的提取与实施例2中步骤3)相同。

5)被测样本及参考样本总RNA的反转录

被测样本及参考样本总RNA的反转录与实施例2中步骤4)相同，反转录体系如表1所示。

6)PtAP2L3基因的实时荧光定量PCR检测

实时荧光定量PCR反应流程、反应时间和反应温度均与实施例2中步骤5)相同，反应体系如表2所示。

最终获得被测样本及参考样本中PtAP2L3基因的表达量如图2所示。

根据图2中被测样本及参考样本中PtAP2L3基因的实时荧光定量PCR结果，可以判断被测样本的是否处于与参考样本相同的个体发育老化程度。若被测样本中PtAP2L3基因的表达量未显著低于参考样本中的表达量，则被测样本处于幼龄状态。被测样本C1.0y、C2.0y、C3.0y、C6.5y、C8.0y、C10.0y中PtAP2L3基因的表达量均与参考样本S0.5y中PtAP2L3基因的表达量无显著差异，故可得出平茬复幼后的1年、2年、3年、6.5年、8年、10年生湿加松枝条的个体发育老化程度与0.5年实生湿加松枝条相同，各样本均保持0.5年实生湿加松枝条的幼年状态。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (4)

1.湿加松年龄标记基因PtAP2L3表达的高低在判断湿加松年龄中的应用，其特征在于，所述基因PtAP2L3与湿加松年龄呈负相关；所述标记基因PtAP2L3的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.湿加松年龄标记基因PtAP2L3表达的高低在判断湿加松组织器官的个体发育老化程度中的应用，其特征在于，所述基因PtAP2L3的表达与湿加松组织器官的个体发育老化程度呈负相关；所述标记基因PtAP2L3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，利用引物组分别测定待测样本和参考样本中基因PtAP2L3的表达量，通过比较待测样本和参考样本中基因PtAP2L3的表达量大小判断湿加松年龄或组织器官的个体发育老化程度。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述引物组中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。