CN113502349A

CN113502349A - 树木老化时空模式鉴定、平茬复幼及扦插规模化繁育方法

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Publication number: CN113502349A
Application number: CN202111040874.6A
Authority: CN
Inventors: 林金星; 杨舜垚; 何其邹洪; 张曦; 王莉; 李福明; �林昌明; 黄少伟; 魏爱华; 詹定举; 狄贵明; 李俊峰; 马彦广; 卢银喜; 刘玄德; 薛敦孟; 贺国鑫; 李世安; 王浩; 胡东阳
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2021-09-07
Filing date: 2021-09-07
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2041-09-07
Also published as: CN113502349B

Abstract

本发明涉及树木老化时空模式鉴定、平茬复幼及扦插规模化繁育方法，包括对树木主干形成层和枝条中与老化和年龄相关基因的转录与翻译水平进行检测并建立树木老化模式，通过树木老化模式明确其具有强再生能力的幼化部位；对采穗母株进行定植，建立规模化的采穗圃；对采穗母株截顶促萌和重复修剪形成“矮桩平台式”株型，收获大量均匀、粗细适中的宜扦插复幼枝条；采用三元激素处理法对复幼枝条进行促根处理，诱导复幼枝条产生大量不定根，大幅提高树木复幼枝条扦插成活率和生根效率。本发明突破了树木扦插的多个技术瓶颈，具有繁育效率高、育苗流程化的特点，是目前最为直接且高效的树木规模化繁育方法。

Description

树木老化时空模式鉴定、平茬复幼及扦插规模化繁育方法

技术领域

本发明涉及一种树木老化时空模式鉴定、平茬复幼及扦插规模化繁育方法，属于生物林木育种领域。

背景技术

林木繁育方法和技术有很多，如种子繁殖、扦插、压条、分株、嫁接等，但因成活率和良种繁育限制，目前许多树种的林业生产仍以种子繁育和嫁接繁育为主。无性系林业是通过无性繁殖生产无性系苗木的一种营林方式，与实生苗营林相比，其优势在于能获得显著的遗传增益，极大地缩短育种周期、降低成本，促进规模化繁育且便于集约化经营。将无性繁殖用于林木改良，实现无性系育种和无性系造林已日益引起各国林学家的重视。

扦插作为一种无性繁殖技术，可进行优良品种无性系繁育，能保持品种的优良特性、节省种子，同时免除嫁接的材料及人工成本，加速良种繁殖，提早结实，加快苗木繁育和生产速度。对于杨树、银杏等雌雄异株的树种，扦插育苗还可以有选择性地培育雄株和雌株。如今，黑杨派杨树、桉树等常见的造林阔叶树，圆柏等杉类和柏类针叶树种都能够实现扦插繁殖。但毛白杨、油茶、奇楠等阔叶树，松类等针叶树以及银杏这些重要的造林和经济树种的扦插繁殖一直以来都是林学界的难题。

扦插繁殖技术的核心是促进扦插枝条（本发明所述“扦插枝条”即林业生产中所称“插穗”、“穗条”或“插条”）不定根的发生，不定根的分化是从外植体上先形成愈伤组织，再由愈伤组织产生根原基即诱生根原基，最终形成不定根。不同树种之间的扦插成活率和生根率差异非常大，其原因可以分为内部和外部因素，内部因素主要是树种本身的特性：如松树由于富含松脂以及酚类等物质使扦插的成活率普遍偏低，此外还有采穗母株年龄、扦插枝条幼嫩程度、采穗位置等。外部因素主要是扦插枝条处理、育苗袋基质、光照、温度和湿度等条件。

针对上述因素，促进不定根发生有两个策略，第一个策略是使扦插枝条复幼：利用平茬等方法使树木枝条恢复并保持幼化状态，复幼后的枝条作为扦插复幼枝条，生根能力较强；第二个策略是通过施加外源生长调节剂诱导复幼枝条不定根的发生。

上述第一个策略的制定是基于树木在幼龄期间通常具有较强的生根能力。树木的生命周期可以分为幼龄阶段、壮龄阶段、成熟龄阶段、过熟龄阶段，其中，幼龄阶段是指树木从种子萌发到首次开花的这一阶段，此阶段树木的再生能力强，生产潜力高。树木一旦从幼龄阶段进入到壮龄阶段、成熟龄阶段或者过熟龄阶段后，其再生能力和生产潜力将显著降低，其枝条的扦插生根率也将大大降低。研究表明，树木进入成熟期后即使是当年生的新枝条也被打上了“成熟”的标签，从成熟龄阶段的树木上采集的当年生新枝条往往有再生能力差、生长速度慢等劣势，如银杏硬枝扦插和嫩枝扦插的成活率受采穗母株及枝条年龄的影响很大，一般随采穗母株和枝条的年龄增加而下降：15年生和25年生树木的枝条扦插成活率仅为75%和65%，而生长5年以上的枝条扦插成活率仅为31%。而幼龄期树木枝条较少，能够采集作为复幼枝条的枝条十分有限，制约了扦插的成活率提升。因此，让树木在生长过程中大量产生复幼并保持幼化状态的枝条对提高树木繁育的效率至关重要。

植物复幼的方法有很多种，例如平茬、嫁接、连续扦插、连续多次组培等。其中平茬是一种广泛应用于生产中的复幼方法。通过在树干基部进行平茬可以刺激树干萌发出更多的新枝条，新萌发的枝条处于更加幼化状态，将之作为扦插复幼枝条有利于提高扦插成功率。

同时，采收复幼枝条时，如何确定枝条的老幼状态也是林业生产中存在的问题。已有一些林业研究者开发出植物幼化状态鉴定方法，如通过树干形态、树枝夹角、节间长短等树木外形方式来判断，但树种间差异及树木个体差异较大，在生产实践中应用有限。近年来，多项研究表明幼树和老树在分子水平存在较大的差异，与植物年龄相关的分子标记也不断被发现。例如，在阔叶树中，小分子microRNAs中的miR156是一个经典的年龄分子标记。模式植物拟南芥在幼年时，miR156的表达量较高，随着植株生长至成年期，miR156的表达量随之下降。在木本植物金合欢、蓝桉树、麻栎、加拿大杨中，也存在miR156在幼年期表达量高，成年期表达量低这一现象，而另一重要的年龄分子标记miR172的表达量增减趋势与miR156相反。在针叶树油松中，研究人员发现PtDAL1等MADS-box家族基因和树木年龄密切相关，PtDAL1表达量随树木年龄增加而增加。由此可见，选择上述分子标记或其同源的基因作为分子水平的标记，可以发明出一种鉴定枝条树木是否仍处于幼化阶段的方法。

促进扦插复幼枝条不定根发生的第二个策略是通过施加外源生长调节剂诱导不定根发生。该策略的核心是通过外源生长调节剂调控或强化植物内源激素的功能，进而促进复幼枝条基部根原基和根的发生。目前主流观点认为生长素是促进不定根发生最核心的植物激素。根的发生是一个生长素不断积累的过程，当生长素积累到一定阈值后便可刺激不定根发生。其他植物激素也可以加速不定根的发生，但是这种促进生根的效果是和生长素相互作用的结果。因此，通过施加外源生长调节剂可以一定程度上促进扦插枝条不定根产生。前人的研究揭示，以吲哚乙酸、奈乙酸等生长素或生长素类似物为主要成分，添加微量元素及其他新型生长调节剂的促根复配试剂，对促进多个树种的扦插枝条生根具有重要作用。目前市面上有多种类型的促进扦插生根的产品，在许多树种上都取得较好效果，但实践表明，单一的生长素及其类似物或以之为主要有效成分的诸多市售促进生根的试剂对银杏、油松、毛白杨等难生根物种的扦插生根效果并不十分显著。因此，开发出一种高效的、适用范围更广的促根方法或技术对提高林业生产效率尤为重要。

综上所述，扦插作为一种方便高效的无性繁殖技术，在树木规模化繁育方面拥有巨大的应用潜力。而扦插技术实现规模化繁育，在获得复幼的扦插枝条和促进其生根这两个方面均有一定的提升空间。首先，关于阔叶树、针叶树及银杏的复幼及其幼化状态的鉴定大多停留在理论研究阶段，开发一套能够落实在生产实践中的多种树木幼化状态鉴定的方法对林木扦插繁育技术的发展具有指导意义。再者，在促进扦插枝条生根方面，开发出一种更精准生长调节剂配方和施用方法可以更加高效地发挥生长调节剂的促进生根作用。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种树木老化时空差异基因表达模式鉴定、平茬复幼及扦插规模化繁育方法。

本发明的第一方面，提供一种树木老化时空的筛选方法，所述筛选方法包括树木老化时空差异基因初步筛选、对初步筛选的老化时空差异基因表达模式鉴定，以确定老化时空差异基因。

优选的，所述的树木老化时空差异基因的筛选方法包括选择不同树龄的树木维管形成层和/或叶片为材料，对其进行转录组测序、组装、分析和/或荧光定量PCR，并进行基因共表达网络分析和差异基因分析和筛选。

优选的，所述的树木老化时空差异基因的筛选方法包括还包括选取成年的、生长势良好的树木，取其自基部至顶梢的不同高度枝条的维管形成层和/或叶片为材料，对其进行转录组测序、组装、分析和/或荧光定量PCR、基因共表达网络分析、差异基因分析和筛选，以及聚类分析和功能注释。

优选的，所述树木为任意的裸子植物或者被子植物，更为优选的，所述树木为银杏树、阔叶树、针叶树。

具体的，所述针叶树包括南洋杉、金钱松、东北红豆杉、油松、云杉、黑松、雪松、大板松、五针松、华山松等等。

所述阔叶树包括落叶类阔叶树、常绿类阔叶树，例如：油茶、枫香、无花果、赤皮青冈、柏杨、垂柳、银芽柳、榆树、黄桷树、辛夷、红叶李、茶树，红叶桃、梅花、樱花、合欢、国槐、龙爪槐、元宝枫、紫薇、石榴、蒙古栎、山杨小叶榕、高山榕、垂叶榕、银桦、山玉兰、广玉兰、香樟、法国冬青、女贞、桂花、杜英、桢楠等等。

优选的，不同树龄的树木是指3-600年树龄（优选3、5、20、200、600年树龄）的树木，优选的，所述的树木为银杏。

优选的，所述的成年树木树为树龄40年的树木树；在一个具体实施方式中，所述的不同高度的枝条是指位于约25%-85%树高的枝条；在一个具体实施方式中，所述的不同生长年龄的枝条是指1-5年生的枝条，优选的，所述的树木为银杏。

优选的，所述的不同树龄的树木是来自地理位置相同、组织朝向一致、来源于同一家系的2-5、6-8、10-13、20-25、45-55、80-100和110-130年生针叶树，优选的，所述的树木为针叶树，进一步优选为油松。

优选的，所述的同一棵树上不同高度的枝条是指成年树木（优选15-20年生）主干自基部至顶端（0%-100%）中的3-5%，28-32%，48-52%，68-72%，93-97%高度的枝条。优选的，所述的树木为针叶树，进一步优选为油松。

在一个具体实施方式中，通过如上所述的筛选方法初步可以确定GbDAL1基因可以作为一种银杏老化时空差异基因。

在一个具体实施方式中，通过如上所述的筛选方法初步可以确定PtAP2R2基因可以作为一种油松老化时空差异基因。

进一步优选的，所述的老化时空差异基因表达模式鉴定是检测通过如上所述的筛选方法初步确定的树木的老化时空差异基因在不同树龄的树木基部维管形成层和/或同一棵树不同高度枝条维管形成层的转录水平和/或蛋白表达水平。

优选的，所述的基因转录水平的鉴定采用转录组测序和/或荧光定量PCR方法。

在一个具体实施方式中，提取3-600年(优选3、5、20、200、600年)树龄的银杏基部维管形成层的RNA和总蛋白，利用荧光定量PCR和免疫印迹测定GbDAL1基因表达和GbDAL1蛋白含量。

在一个具体实施方式中，提取不同高度、不同年龄枝条（例如选择位于约25%-85%，优选25%、40%、55%、70%、85%树高的枝条）的银杏基部维管形成层的mRNA和总蛋白，利用荧光定量PCR和免疫印迹测定如上所述的筛选方法初步确定的老化时空差异基因在银杏基部维管形成层的转录水平和蛋白表达水平。

通过如上的鉴定，确定GbDAL1基因可以作为一种银杏老化时空差异基因，GbDAL1基因转录和/或GbDAL1蛋白表达水平可以作为判断不同的银杏枝条幼化程度、是否适合扦插的标准。

在一个具体实施方式中，提取15-20年生油松主干自基部至顶端（0%-100%）中的3-5%，28-32%，48-52%，68-72%，93-97%高度的维管形成层，主干自基部至顶端18-22%，48-52%，78-82%的侧枝自基部至顶梢3-7%，48-52%，93-97%的RNA和总蛋白，利用转录组测序、荧光定量PCR和免疫印迹对PtAP2R2基因表达和PtAP2R2蛋白含量进行测定。其中油松3-5%的主干基部与侧枝顶梢维管形成层的PtAP2R2基因和PtAP2R2蛋白表达量较高，确定油松3-5%的主干基部与侧枝顶梢维管形成层组织较为幼嫩。

通过如上的鉴定，确定PtAP2R2基因可以作为一种针叶树老化时空差异基因，PtAP2R2基因转录和/或PtAP2R2蛋白表达水平可以作为判断不同的针叶树枝条幼化程度、是否适合扦插的标准。优选的，所述的针叶树为油松。

本发明的第二方面，提供了GbDAL1基因和/或GbDAL1蛋白在鉴定树木、树木枝条或树木器官的幼化程度中的应用。

本发明的第三方面，提供了PtAP2R2基因和/或PtAP2R2蛋白在鉴定树木、树木枝条或树木器官的幼化程度中的应用。

优选的，所述应用为GbDAL1基因在鉴定裸子植物、裸子植物枝条或裸子植物器官的幼化程度中的应用，优选的，所述的裸子植物为银杏。

优选的，所述应用为PtAP2R2基因在鉴定针叶树、针叶树枝条或针叶树器官的幼化程度中的应用，优选的，所述的针叶树为油松。

本发明的第四方面，提供一种检测GbDAL1基因和/或检测GbDAL1蛋白的试剂在鉴定树木老化时空状态中的应用。

优选的，所述试剂包括检测上述基因的探针或者引物。

更为优选的，所述试剂包括GbDAL1基因的引物，所述的引物的序列如SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3所示。

本发明的第五方面，提供一种检测PtAP2R2基因和/或检测PtAP2R2蛋白的试剂在鉴定树木老化时空状态中的应用。

优选的，所述的树木为针叶树，进一步优选为油松。

本发明的第六方面，提供上述的筛选方法在树木平茬复幼与扦插的繁育方法中的应用。

本发明的第七方面，提供一种树木平茬复幼与扦插的繁育方法，所述繁育方法包括以下步骤：

（1）利用上述任一的筛选方法对树木老化时空差异基因进行筛选；

（2）对树木进行平茬复幼处理；

（3）枝条幼化程度鉴定：检测复幼后枝条中经步骤（1）筛选出的时空老化差异基因的转录水平和/或蛋白表达水平，确定枝条的幼化程度；

（4）选择幼化程度适合的枝条扦插。

优选的，所述的幼化程度鉴定包括鉴定树木的老化时空差异基因在枝条中的转录水平和/或蛋白表达水平是指鉴定所述基因在枝条维管形成层中的转录水平和/或蛋白表达水平。

优选的，所述的老化时空差异基因选自DAL1、GbDAL1、PtAP2R2、AP2、PaLFY、PaNLY、 MADS11、miR156、miR172、SPLs和/或JAT的一种或两种以上的组合。

优选的，所述的幼化程度鉴定包括以一个老化时空差异基因为标准计算树木枝条、组织或器官的老化系数，所述的老化系数为一个标准化后的数值，所述数值的获得为测定某个老化时空差异基因不同树龄、不同高度器官/组织和/或平茬处理后的枝条的mRNA或蛋白表达量，以该基因在树冠低位的器官/组织的mRNA或蛋白表达量为标准值，该基因在树木其他位置的器官/组织的mRNA或蛋白表达量与标准值的比值（或者比值的倒数）就是所述的以该基因为标准的老化系数。优选的，当所述的老化时空差异基因在不同年龄的树木或其组织中的表达趋势为随着年龄增长而增长，则该基因在目标位置的器官/组织的mRNA或蛋白表达量与标准值的比值即为目标位置处的老化系数；优选的，当所述的老化时空差异基因在不同年龄的树木或其组织中的表达趋势为随着年龄增长而下降，则目标位置处的老化系数等于该基因在目标位置器官/组织的mRNA或蛋白表达量与标准值的比值的倒数。

在一个具体实施方式中，测定miR156在树木不同枝条、组织或器官中的mRNA或蛋白表达量，以在低位枝条中的表达量为1，在其他枝条、组织或器官中的表达量就是以该基因为标准的所在枝条、组织或器官的老化系数。

优选的，所述的幼化程度鉴定包括计算一个或一个以上的老化时空差异基因的老化系数，选取多个基因鉴定幼化程度时将每个基因相应的老化系数相加，从而评价综合了多个老化时空差异基因的转录或表达水平在内的树木、枝条、组织或树木器官的幼化程度。优选的，所述的鉴定树木的老化时空差异基因在枝条中的转录水平的方法包括转录组测序和/或荧光定量PCR。

在一个具体实施方式中，用荧光定量PCR鉴定GbDAL1基因在银杏不同位置器官或组织中的转录水平，所述的鉴定包含设计引物序列，所述的引物为如SEQ ID NO：2和/或SEQID NO：3所示的序列。

在一个具体实施方式中，用转录组测序鉴定PtAP2R2基因在油松不同位置器官或组织中的转录水平。

优选的，所述的鉴定树木的老化时空差异基因还包括测定一个或多个老化时空差异基因在不同年龄的树木和同棵树不同高度的枝条中的转录和/或表达水平。

通过如上所述的鉴定，选择幼化程度高、在分子水平均一化程度高的平茬复幼枝条进行大规模扦插。

优选的，所述的树木平茬复幼与扦插的繁育方法中的步骤（2）的平茬复幼处理包括对采穗母株进行定植，对采穗母株截顶促萌和重复修剪形成“矮桩平台式”株型。

优选的，所述的平茬（即采穗母株截顶）包括采穗圃建立及管理，以及采穗母株截顶促萌。

优选的，所述的平茬处理包括当新萌枝条高度大于第一次截顶时的高度时，定期进行修剪，确保其四周枝条紧凑，分布均匀，进而获得具有大量幼嫩侧枝的“矮桩平台式”采穗母株。

扦插枝条的质量是获得高质量高产量苗木的重要环节。采集枝条之后，对采穗母株进行修剪整形。

优选的，上述繁育方法还还包括步骤（5）：准备扦插基质。

首先包括选择合适含有不同材料配比的育苗基质，在一个具体实施方式中，所述的材料及配比如下：

基质A：压缩泥炭土：蛭石：珍珠岩=12:7:1；

基质B：压缩泥炭土：蛭石：椰糠=12:7:1；

基质C：压缩泥炭土：东北草炭土：蛭石：珍珠岩=3:3:3:1；

基质D：压缩泥炭土：东北草炭土：蛭石：椰糠=3:3:3:1；

基质E：压缩泥炭土：东北草炭土：蛭石：珍珠岩：种植木屑=4:1:3:1:1；

基质F：压缩泥炭土：河沙：珍珠岩=12:7:1；

基质G：压缩泥炭土：东北草炭土：蛭石：珍珠岩=3:3:3:1；

基质H：压缩泥炭土：东北草炭土：河沙：珍珠岩：种植木屑=4:1:3:1:1。

其次，扦插前需要用0.1%-0.5%的高锰酸钾/代森锰锌/五氯硝基苯对基质进行消毒灭菌，随后薄膜覆盖，覆盖1周之后揭开薄膜，使气体充分散发，用清水充分淋洗，再过2-3天之后再进行插苗。基质可装填入口径5-6cm的育苗袋或林木高脚穴盘（高度11 cm）中，亦可于苗床使用。

优选的，所述繁育方法还包括步骤（6）：通过三元激素处理法对步骤（4）的枝条进行促根处理。

更优选的，所述三元激素处理法包括用三种不同激素对扦插枝条按照如下的步骤依次处理：

（I）先用溶液A处理，所述的溶液A含有能够诱导植物产生防御反应的物质；

（II）再用溶液B处理，所述的溶液B含有植物生长调节剂；

（III）最后用溶液C进行处理，所述的溶液C含有植物激素合成抑制剂；

其中，在进行下一步处理前将上一步的溶液冲洗干净。

优选的，所述的溶液A含有茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MeJA）；

所述的溶液B含有α-萘乙酸（1-naphthylacetic acid，NAA）、吲哚丁酸（Indole-3-Butytric acid，IBA）、1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）和/或6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）；

所述的溶液C含有烯效唑。

优选的，所述溶液A对枝条基部处理10-60分钟。

优选的，所述溶液A中A的含量为0.05-10.0 μM，更优选为0.05-7.0 μM。可以是上述范围的任意数值。

优选的，所述溶液B对枝条基部处理1-8小时。

优选的，所述溶液B中B的含量为0.02-1000 mg/L，或者10-100 μM。

优选的，所述溶液C对枝条基部处理1-26小时或者所述溶液C对枝条顶端喷施。

更优选的，所述溶液C中C的含量为80-800 mg/L。

进一步优选的，所述三元激素处理法的处理方案选自如下的方案：

方案1：将复幼枝条基部浸入0.05-7.0 μM的MeJA溶液处理10-30分钟；清水冲洗3-5次后，使用10-1000 mg/L的IBA溶液处理1.5-8小时；清水冲洗3-5次后，再使用100-800mg/L的烯效唑溶液处理1-8小时，清水冲洗3-5次后备用；

方案2：将复幼枝条基部浸入0.05-0.2 μM的MeJA溶液处理10-30分钟；清水冲洗3-5次后，使用10-100 μM的ACC溶液处理1.5-4小时；清水冲洗3-5次后，再使用100-800 mg/L的烯效唑溶液处理1-8小时，清水冲洗3-5次后备用；

方案3：将复幼枝条基部浸入0.05-0.2 μM的MeJA溶液处理10-30分钟，清水冲洗3-5次后，使用10-1000 mg/L的IBA及10-100 μM的ACC处理1.5-4小时；清水冲洗3-5次后，再使用100-800 mg/L的烯效唑处理1-8小时，清水冲洗3-5次后备用；

方案4：将复幼枝条基部浸入0.05-0.2 μM的MeJA溶液处理10-30分钟；清水冲洗3-5次后，使用10-1000 mg/L的IBA溶液处理1.5-4小时；清水冲洗3-5次后备用，扦插后于复幼枝条顶端喷施100-800 mg/L的烯效唑溶液，并于2个月内每隔2周喷施1次；

方案5：将复幼枝条基部浸入0.05-0.2 μM的MeJA溶液处理10-30分钟；清水冲洗3-5次后，使用10-1000 mg/L的IBA及10-100 μM的ACC处理1.5-4小时；清水冲洗3-5次后备用，扦插后于复幼枝条顶端喷施100-800 mg/L的烯效唑，并于2个月内每隔2周喷施1次；

方案6：将复幼枝条浸入1.0-7.0 μM的MeJA处理10-30分钟；清水冲洗3-5次后，使用10-1000 mg/L的IBA处理1.5-4小时；清水冲洗3-5次后，再使用100-800 mg/L的烯效唑处理1-8小时，清水冲洗3-5次后备用；

方案7：将复幼枝条浸入0.11-0.29 μM的MeJA溶液处理25-60分钟；清水冲洗3-5次后，使用85-105 mg/L的IBA溶液或45-65 mg/L的NAA溶液处理1.5-3小时；清水冲洗3-5次后，再使用80-120 mg/L的烯效唑处理18-26小时，清水冲洗3-5次后备用；

方案8：将复幼枝条浸入0.45-1.56 μM的MeJA溶液处理25-60分钟；清水冲洗3-5次后，使用185-215 mg/L的IBA或85-120 mg/L的NAA溶液处理1.5-3小时；清水冲洗3-5次后，再使用80-120 mg/L的烯效唑处理18-26小时，清水冲洗3-5次后备用；

方案9：将复幼枝条浸入2.23-3.34 μM的MeJA溶液处理25-60分钟；清水冲洗3-5次后，使用290-320 mg/L的IBA或200-245 mg/L的NAA处理1.5-3小时；清水冲洗3-5次后，再使用200-380 mg/L的烯效唑处理18-26小时，清水冲洗3-5次后备用；

方案10：将复幼枝条浸入0.1 μM-10.0 μM的MeJA溶液处理25-60分钟；清水冲洗3-5次后，使用0.02 mg/L-18.62 mg/L 的NAA和0.02 mg/L-20.22 mg/L的IBA处理3-24小时；清水冲洗3-5次后，于复幼枝条顶端喷施5-50 mg/L的烯效唑后备用；

其中，

优选的，方案1-6适用于银杏的促生根；

优选的，方案7-9适用于针叶树的促生根；进一步优选的，适用于油松的促生根；

优选的，方案10适用于阔叶树的促生根；进一步优选的，适用于美洲黑杨的促生根。

优选的，所述的繁育方法还包括步骤（7）：枝条扦插。

在一个具体实施方式中，所述的复幼枝条扦插是将经过三元激素处理法处理的复幼枝条插入预处理完成的基质中，扦插深度5-6 cm，用手压实基部并适当喷水，并在当天扦插完后喷杀菌剂1次，定期用0.1%多菌灵和/或0.07%甲基托布津喷施苗床进行消毒处理。

在一个具体实施方式中，所述的扦插的方法为在扦插基质上提前打好直径1 cm，深3 cm左右的孔洞，将步骤（6）中用三元激素法处理后的枝条插入打好的孔洞中，用手指将插条周围的基质压实。

优选的，所述的繁育方法还包括步骤（8）：扦插后管理。

优选的，所述的扦插后管理是将插穗置于遮阴温室或遮阴棚中，根据树种特性控制光照及温度，对大多数树种而言温度范围控制在19-28摄氏度；通过定时喷雾、遮盖塑料薄膜或加盖穴盘盖控制湿度，使湿度保持在60-100%。后视生根状态进行炼苗、移栽等后续需工作。

在一个具体的实施方式中，所述的扦插后管理是将插穗置于遮阴温室或遮阴棚中，夏季白天光照控制在30-50%（10:00至16:00进行遮阴处理），冬季白天光照控制在40-60%；温度控制在19-25摄氏度；通过定时喷雾、遮盖塑料薄膜或加盖穴盘盖控制湿度，使湿度保持在85-100%。扦插50天后可定期喷施水溶肥，60天后开始生根。翌年移栽后定植，所述的移栽优选在春季进行。在一个具体实施方式中，所述移栽的密度为行距20-30 cm，株距8-10 cm。

在一个具体实施方式中，定期对扦插基质进行喷灌，使基质始终保持湿润状态。控制培养环境的湿度为80%左右，温度为23-27摄氏度。待扦插后第5天喷洒一次多菌灵（稀释1000倍）药液，防止细菌生长。

在一个具体实施方式中，当80-90%以上的复幼枝条生根时，即可逐步进行出圃和炼苗作业。炼苗期间，每隔10-20天追加水溶性复合肥，待生长至健壮苗木，便可进行生产造林工作。

与现有方法相比：

本发明的筛选方法从时间和空间两个维度对差异基因进行初步筛选，并进一步检测这些基因的转录与翻译水平，即从基因水平和蛋白水平两个方面进行验证，使得老化时空差异基因更准确，也更具有实际功能。

本发明从分子生物学水平研究了老化时空模式，首次以此为基础，以分子生物学鉴定出的老化时空差异基因，并以其基因的转录水平和/或蛋白表达水平确定复幼枝条的幼化程度，打破传统偏见，指导树木平茬复幼与扦插的繁育方法，使得大规模的繁育方法更为科学、精准。

优选的，本发明的平茬复幼步骤对采穗母株进行定植，建立规模化的采穗圃；对采穗母株截顶促萌和重复修剪形成“矮桩平台式”株型，收获大量复幼枝条均匀、粗细适中的宜扦插复幼枝条，且复幼的枝条老化时空差异基因在分子水平均一化程度高，大幅度提高树木幼树侧枝萌生效率并增加复幼枝条数量。

优选的本发明繁育方法的三元激素处理法对复幼枝条进行促根处理，诱导复幼枝条产生大量不定根，大幅提高树木复幼枝条扦插成活率和生根效率。

本发明的繁育方法克服了传统树木无性系繁育的弊端，且避免了传统扦插方法成活率低的缺陷，可将复幼枝条扦插成活率大幅提高。在保证获得显著的遗传增益的基础上，降低了成本，操作简便、经济实用，育苗效率高、出苗整齐，十分利于树木规模化繁育、集约化经营和生产造林等工作，具有极高的推广应用价值。

附图说明

图1：银杏老化基因空间鉴定取样示意图；

图2：构建系统进化树筛选银杏GbDAL1基因；

图3：银杏和挪威云杉保守结构域分析；

图4：不同年龄银杏GbDAL1基因表达量；

图5：不同空间位置银杏GbDAL1基因表达量；

图6：油松老化基因空间鉴定取样示意图；

图7：构建系统进化树筛选油松PtAP2R2基因；

图8：油松同拟南芥保守结构域分析；

图9：不同年龄油松PtAP2R2基因表达量；

图10：不同空间位置油松PtAP2R2基因表达量；

图11：不同空间位置美洲黑杨miR156表达；

图12：“矮桩平台式”采穗母株示意图；

图13：平茬复幼前后银杏GbDAL1基因表达量；

图14：平茬复幼前后油松PtAP2R2基因表达量；

图15：平茬复幼前后美洲黑杨miR156表达量；

图16：银杏生根插穗实物图。

具体实施方式

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种树木老化时空模式鉴定、平茬复幼及扦插规模化繁育方法。为了阐释本发明，以下提供一种具体的实施方式用于进一步详细说明，但本领域技术人员知晓，本发明的保护范围并不限于以下具体的实施方式。

本发明所采用的主要试剂：

RNA提取试剂盒：品牌：TIANGEN，品名：RNA prep Pure Plant Kit试剂盒，货号：DP441；

反转录试剂盒：品牌：TaKaRa，品名：Advantage RT-for-PCR Kit试剂盒，货号：639505；

qPCR试剂盒：品牌：TaKaRa，品名：TB Green® Fast qPCR Mix试剂盒，货号：RR430A；

microRNA提取试剂盒：品牌：TaKaRa，品名：RNAiso for Small RNA，货号：9753A；

microRNA反转录及定量试剂盒：品牌：TaKaRa，品名：Mir-X™ MicroRNAQuantification，货号：638314；

MeJA：原液品牌：Sigma，Size：5 mL，品名：MeJA，货号：392707；

ACC：原剂品牌：Solarbio，Size：1 g，品名：1-氨基环丙烷羧酸，货号：A9340；

IBA：原液品牌：PhytoTech，Size：100 mL，品名：Indole-3-Butyric AcidSolution（1 mg/mL），货号：l460；

NAA：原剂品牌：Sigma，Size：25 g，品名：1-naphthylacetic acid，货号：N0640-25G；

烯效唑：原剂品牌：Coolaber，Size：25 g，品名：Uniconazole，货号：CU11610；

高锰酸钾：原剂品牌：沪试，Size：500 g，品名：高锰酸钾，货号：10017318；

代森锰锌：原剂品牌：国光，Size：100 g，品名：代森锰锌；

五氯硝基苯：原剂品牌：国光三灭，Size：200 g，品名：五氯硝基苯；

多菌灵：原剂品牌：国光，Size：50 g，品名：多菌灵；

甲基托布津：原剂品牌：新益甲托，Size：250 g，品名：甲基硫菌灵；

ABT生根粉：原剂品牌：ABT生根粉，Size：1 g，品名：ABT生根粉1号；

赤霉酸：原剂品牌：三六，Size：1 g，品名：赤霉酸；

压缩泥炭土：品牌：K牌，Size：200 L，品名：TS 1泥炭土。

本发明所采用的主要仪器：

转录组测序由华大基因公司使用Illumina公司的HiSeq 2000测序平台及北京诺禾致源科技股份有限公司使用Illumina公司的Illumina NovaSeq 6000型二代测序仪完成；

荧光定量使用Bio-Rad公司的CFX Connect Optics Module荧光定量PCR仪，型号为CFX Connect Optics Module。

实施例1：银杏老化时空差异基因的筛选和表达模式鉴定

1、取样

（1）依照时间维度取样：选取立地条件相同、长势良好的20、200、600年银杏树，从相同朝向树干基部1.3 m高度处用刨刀或錾子采集50 mm×50 mm大小的样块，立即转移至液氮中速冻，后刮取或通过冰冻切片获得形成层。

（2）依照空间维度取样：选取树龄40年、生长势良好的银杏树，使用高枝剪剪下从其自基部至顶梢中的不同高度（位于约25%、55%、85%树高）的枝条（图1），采集叶片、用美工刀刮取维管形成层，将叶片和维管形成层样品立即转移至液氮进行速冻。

、通过转录组测序及分析初步筛选银杏老化时空差异基因

将获取的各树龄维管形成层样委托华大基因公司进行RNA提取，使用IlluminaHiSeq 2000测序平台进行转录组测序，测序组装由华大基因公司完成。使用GOseq R软件包进行差异表达基因（DEGs）的Gene Ontology（GO）富集分析，校正基因长度偏差。用Kobas软件检测DEGs在Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路中的富集情况。将银杏基因同拟南芥、杨树等模式植物及挪威云杉、火炬松、红豆杉等裸子植物的MADS-box家族基因通过MEGA软件进行序列比对，并构建系统进化树（图2）。系统进化树显示银杏基因GB_36364与同为裸子植物的挪威云杉DAL1基因分支最近且枝长短，反映其具有最高的同源性，且置信度高，因此将其命名为GbDAL1（序列如SEQ ID NO：1所示）。此外我们发现其氨基酸序列均含有两个十分保守的结构域，随后进一步对挪威云杉和银杏氨基酸序列在PFAM网络数据库进行检索分析，确定其保守结构域为MADS-box（SRF-TF）保守结构域（图3）。初步确定GbDAL1为银杏老化时空模式标记基因。

、银杏老化时空差异基因表达模式的鉴定

（1）取样：

样品组A：不同时间序列的样品：按照步骤1的取样方法取样；

样品组B：不同空间序列的样品：按照步骤1的取样方法取样。

（2）检测GbDAL1基因在不同年龄样本中的转录水平

将银杏不同树龄基部维管形成层转录组数据质控后，以银杏基因组（GigaDBhttp://gigadb.org/dataset/100209;29）为参考基因组，通过DESeq2 R软件包进行差异表达分析，采用FPKM标准化表达数据，GbDAL1在不同树龄基部维管形成层的转录水平如图4所示，GbDAL1基因在不同年龄的银杏中差异表达，表达量随年龄增加而增加，与油松PtDAL1基因趋势一致，故将GbDAL1确定为银杏老化（时间模式）标记基因。

（3）检测GbDAL1基因在不同高度样本中的转录水平

使用RNA提取试剂盒提取银杏不同高度枝条组织的RNA，对所获RNA利用反转录试剂盒反转录获得cDNA，再使用qPCR试剂盒处理后通过荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR，试剂盒相关操作均参照试剂盒使用说明书。荧光定量中GbDAL1引物序列为GbDAL1 F：GACGATAATGGACCTTGGAAC（SEQ ID NO：2），GbDAL1 R：TGTGAGTTTGCTCCTGTGG（SEQ ID NO：3）；内参引物序列为GAPDH F：CTGCCAAGGCTGTAGGTAAGG（SEQ ID NO：4），GAPDH R：TCAGATTCCTCCTTGATGGCG（SEQ ID NO：5）。上述引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

GbDAL1在不同高度转录水平如图5所示，GbDAL1基因在不同高度枝条中差异表达，表达量随高度增加而增加，因此确定银杏最下层枝条较为幼嫩。

通过银杏老化时空差异基因的筛选和表达模式鉴定，确定GbDAL1基因可以作为一种银杏老化时空差异基因，GbDAL1基因的转录水平可以作为幼嫩材料的判断标准；并且银杏最下层枝条GbDAL1基因表达量低，确定银杏最下层枝条较为幼嫩。

实施例2：油松老化时空差异基因的筛选和表达模式鉴定

1、取样

（1）依照时间维度取样：选取地理位置相同、组织朝向一致、来源于同一家系的2、3、4、7、13、20、46、55和123年生油松的基部维管形成层。

（2）依照空间维度取样：选取15-20年生针叶树主干自基部至顶端（0%-100%）中的3-5%、28-32%、48-52%、68-72%、93-97%高度的维管形成层为材料（图6）。

、通过转录组测序及分析初步筛选油松老化时空差异基因

对样品进行转录组测序、测序结果组装、基因共表达网络分析和差异基因分析和筛选，经过聚类分析和功能注释，油松基因同拟南芥、树棉、野大豆、蒺藜苜蓿、芝麻和萝卜等植物的含有AP2保守结构域的基因通过MEGA软件进行序列比对，并构建系统进化树（图7）。我们发现在上述植物氨基酸序列均含有两个十分保守的结构域，进一步对拟南芥和油松氨基酸序列在PFAM网络数据库进行检索分析，可知这两个保守结构域属于AP2 domain（图8），因此将油松的该基因命名为PtAP2R2。PtAP2R2（Pt3G66390）的基因序列如SEQ IDNO：6 所示。

、油松老化时空差异基因表达模式的鉴定

（1）取样：按照步骤1的取样方法取样

（2）检测PtAP2R2基因在不同年龄样本中的转录水平

对不同年龄油松的基部维管形成层转录组测序并分析，PtAP2R2的转录水平如图9所示，数据表明，PtAP2R2在2-4年的幼龄油松中转录水平最高，在树龄7年发生相变后的成熟期后表达量随年龄增加而递减，故将PtAP2R2确定为油松老化（时间模式）标记基因。

（3）检测PtAP2R2基因在不同高度样本中的转录水平

对不同空间位置油松的维管形成层转录组测序并分析，PtAP2R2的转录水平如图10所示，数据表明，PtAP2R2在低位取样点转录水平最高，并随着取样空间位置升高而递减，反映出油松越靠近基部的组织越幼嫩。

实施例3 美洲黑杨老化时空调控因子选择和表达模式鉴定

1、选取时空老化差异调控因子

在阔叶树中，小分子microRNAs中的miR156是一个经典的年龄分子标记，在模式植物拟南芥及多个木本植物如加拿大杨中均表现出miR156表达量随年龄增长而降低的现象，故将miR156作为阔叶树老化时空差异调控因子。

、美洲黑杨老化时空差异调控因子表达模式的鉴定

（1）取样

依照空间维度取样：选取生长状况良好的23年生美洲黑杨，分别选取距离地面4米（低位）、8米（中位）和10米（高位）高度处进行取样，采集树冠同一朝向不同高度的最外层叶片。

（2）提取microRNA

按照microRNA提取试剂盒的说明提取上述步骤1所采集样本的microRNA。

（3）检测miR156在不同高度样本中的表达量

通过miRBase数据库（http://www.miRbase.org/）检索毛果杨的年龄相关调控因子miR156的成熟核酸序列为“ TGACAGAAGAGAGTGAGCAC”（SEQ ID NO：7），将该序列作为美洲黑杨miR156的荧光定量PCR引物。

按照microRNA反转录及定量试剂盒的操作说明设置用于荧光定量PCR的反应体系，用荧光定量PCR仪检测miR156在树冠不同高度处样品的表达量，结果如图11所示，数据表明miR156在不同高度叶片中差异表达，其表达量随取样高度的增加而降低，反映出低位枝条更加幼嫩。

实施例1、实施例2和实施例3都说明了，可以通过对树木进行时间维度的采样、转录组测序及生物信息学分析，筛选树木中与年龄高度相关的差异基因。继而通过空间维度的采样、转录组测序或实时荧光定量PCR等方法进一步鉴定该基因在不同空间维度样品中的转录和表达，以确定该基因可以作为老化时空差异基因指示不同部位的枝条的幼化程度，从而为扦插和规模化繁育提供理论基础和实践指导。

实施例4 平茬复幼、复幼枝条采收和幼化程度鉴定

1、银杏平茬复幼、复幼枝条采收和幼化程度鉴定

（1）银杏平茬复幼

选择确定生长快、抗性强的2-5年龄长势健壮、主干直立的国家级良种银杏实生苗，作为采穗母株进行定植，定植密度以50 cm × 60 cm。

在母株定植2个月左右，对母株进行平茬，将其主梢剪断：2年生实生苗保留母株高度10-30 cm，3-5年生实生苗保留母株高度10-50 cm，同时将较粗的侧枝平茬，剪除生长过密过细弱的侧枝。当新萌枝条高度大于第一次平茬时的高度，定期修剪，确保其四周枝条紧凑，分布均匀，进而获得具有大量幼嫩侧枝的“矮桩平台式”采穗母株（图12）。采收插穗之后，需要对采穗母株进行修剪整形。

（2）银杏平茬复幼枝条采收及幼化程度鉴定

在5-6月或10-11月选择长度5-9 cm、直径0.4-0.8 cm银杏枝条。提取平茬前的母株枝条和平茬后的复幼枝条基部1 cm处组织的RNA，利用荧光定量PCR对GbDAL1基因的转录水平进行测定（图13）。其中各复幼枝条基部GbDAL1基因转录水平较未平茬低位枝条显著降低，且在分子水平均一化程度高，确定通过平茬可以实现复幼，矮桩平台式复幼枝条可以作为扦插枝条（即插穗）。

、油松平茬复幼、复幼枝条采收和幼化程度鉴定

（1）油松平茬复幼

基于实施例2的老化模式理论基础，在4月10日至4月25日期间，对2至3（中国南部）或3至5（中国北部）年生针叶树自根基部向顶部，量取3-20 cm处进行第一次截干平茬。

在5月25日至6月10日期间，对第一次截干平茬的针叶树自根基部向顶部，量取4-25 cm处进行第二次截干平茬。

在7月25日至8月10日期间，对第二次截干平茬的针叶树自根基部向顶部，量取6-30 cm处进行第三次截干平茬。经过2-3个月快速生长后，获取具有大量幼嫩萌芽和复幼枝条的矮桩平台式采穗母株。

（2）油松平茬复幼枝条幼化程度鉴定

提取未截干平茬的树木枝条和截干平茬后的矮桩平台式采穗母株复幼枝条的RNA，利用转录组测序对PtAP2R2基因表达进行测定。其中截干平茬后矮桩平台式采穗母株复幼枝条的PtAP2R2基因表达量较高（图14），说明截干平茬后矮桩平台式采穗母株的复幼枝条较为幼嫩，确定其为扦插枝条。

、美洲黑杨平茬复幼、复幼枝条采收和幼化程度鉴定

（1）美洲黑杨平茬复幼

在2月对2年生美洲黑杨进行平茬，平茬高度距离地面15 cm，5月中旬即可得到长度为4-6 cm的复幼枝条。

（2）美洲黑杨平茬复幼枝条采收及幼化程度鉴定

采集新枝条上从顶芽往下第3片和第4片完全展开的成熟叶片作为鉴定的样本，用锡箔纸包裹好并立刻置于液氮中冷冻保存。运用实施例3中表达模式鉴定的microRNA提取和检测的步骤对美洲黑杨平茬复幼样品进行检测，通过与平茬前样品的miR156表达量的对比，发现平茬后的组织miR156表达量显著提高（图15），可以得出结论，平茬使美洲黑杨复幼，美洲黑杨平茬枝条可以作为扦插枝条。

（3）通过计算老化系数比较美洲黑杨不同部位的幼化程度

通过miR156表达量计算黑美洲黑杨冠不同部位的老化系数，以低位枝条miR156的表达量作为参照，分别计算平茬复幼枝条、中位枝条及高位枝条的老化系数，结果表明复幼枝条具有最低的老化系数，处于最幼化的状态；此外，在成年树木中，处于低位的枝条幼化程度较高，随着高度增加，树枝的老化系数逐步增加（表1）。

以上结果证明，（1）美洲黑杨平茬复幼枝条具有最低的老化系数；（2）树冠低位枝条上的叶片具有较低的老化系数，随着高度上升，老化系数不断升高。可以进一步推断，处于树木低位处的复幼枝条处于更加幼化的程度，上述结果打破了传统的认为高位处枝条更为幼化的认知，为采用低位的、平茬复幼的枝条进行扦插从而提高扦插效率提供了直接的分子生物学依据。

实施例5 扦插基质的选择与预处理

对于银杏和美洲黑杨的扦插，选择合适含有不同材料配比的育苗基质，材料及配比为：压缩泥炭土：蛭石：珍珠岩=12:7:1；扦插前需要用0.1%-0.5%的高锰酸钾/代森锰锌/五氯硝基苯对基质进行消毒灭菌，随后薄膜覆盖，覆盖1周之后揭开薄膜，使气体充分散发，用清水充分淋洗，再过2-3天之后再进行插苗。基质可装填入口径5-6 cm的育苗袋或林木高脚穴盘（高度11 cm）中，亦可于苗床使用。

对于油松的扦插，按照花卉营养土：蛭石：珍珠岩=55-58%:28-40%:15-20%配置扦插基质。

实施例6 运用三元激素处理法促进枝条生根

1、用三元激素处理法处理实施例4得到的复幼枝条。

三元激素处理法包括组分和处理步骤，其中，组分包括溶液A、溶液B和溶液C，处理步骤为先用溶液A处理，再用溶液B处理，最后用溶液C处理，使用下一个溶液前将枝条冲洗干净。

溶液A、溶液B和溶液C具体组分以及每个溶液的处理时间有如表2所示。

、用其他方法处理实施例4的扦插枝条，并与用三元激素法处理的生根结果进行比较。

如表3所示，处理组1-12相较处理组13-15生根率及平均生根数有显著提升，处理组16相较处理组17-18生根率及平均生根数有显著提升，说明三元激素处理法对于银杏扦插成活和生根有重要提升。

如表3所示，处理组1相较处理组16，生根率及平均生根数有显著提升，说明在相同三元激素处理条件下，平茬对于扦插成活和生根有重要提升。

采用方案13-15对油松复幼枝条进行处理，生根率分别可达69.5%、89.5%、76.0%，较使用未平茬枝条自来水处理对照组的9.0%有显著提升，说明平茬复幼及三元激素法处理对提高针叶树，例如油松生根率有重要提升。

三元激素处理对美洲黑杨枝条生根的影响见表4：

表4的数据表明，采用复幼枝条和三步激素处理法处理阔叶树扦插枝条可以增加扦插枝条的生根数量，促进根伸长生长，进而得到高质量的扦插苗。

实施例7 扦插和扦插后管理

1、将实施例6的经过促生根处理的银杏复幼枝条进行扦插和扦插后管理

将经过三元激素处理法处理的复幼枝条插入预处理完成的基质中，扦插深度5-6cm，用手压实基部并适当喷水，并在当天插完后喷杀菌剂1次，定期用0.1%多菌灵及0.07%甲基托布津喷施苗床进行消毒处理。

将插穗置于遮阴温室或遮阴棚中，夏季白天光照控制在30-50%（10:00至16:00进行遮阴处理），冬季白天光照控制在40-60%；温度控制在19-25摄氏度；通过定时喷雾、遮盖塑料薄膜或加盖穴盘盖控制湿度，使湿度保持在85-100%。扦插50天后可定期喷施水溶肥，60天后开始生根（图16）。

银杏扦插苗尤其是嫩枝扦插苗不适宜当年直接造林，必须翌年移栽后方可定植。一般春季移栽成活率较高，移栽密度为行距20-30 cm，株距8-10 cm。

、将实施例6的经过促生根处理的油松复幼枝条进行扦插和扦插后管理

将经过三元激素处理法处理的复幼枝条插入预处理完成的基质中，将扦插后的基质放置于温室，温度控制范围为20-26摄氏度，湿度范围为78-90%，白天自然光照控制在40-60%。自然生长70-90天。当85-90%以上的复幼枝条生根时，即可逐步进行出圃和炼苗作业。炼苗期间，每隔15-20天追加水溶性复合肥（济南蓝爵商贸有限公司，货号：68333-79-9），待生长至健壮苗木，便可进行油松生产造林等工作。

、将实施例6的经过促生根处理的美洲黑杨复幼枝条进行扦插和扦插后管理

将经过三元激素处理法处理的复幼枝条插入预处理完成的基质中，扦插深度为插穗长度的40%左右，用手压实基部并适当喷水，并在当天插完后喷杀菌剂1次，定期用0.1%多菌灵及0.07%甲基托布津喷施苗床进行消毒处理。

将插穗置于遮阴温室或遮阴棚中，根据树种特性控制光照及温度，温度范围控制在22-24摄氏度；通过定时喷雾、遮盖塑料薄膜或加盖穴盘盖控制湿度，使湿度保持在60-95%。培养20天以上即可观察到生根，后视生根状态进行炼苗、移栽等后续需工作。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

序列表

<110> 北京林业大学

<120> 树木老化时空模式鉴定、平茬复幼及扦插规模化繁育方法

<130> 1

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 759

<212> DNA

<213> 银杏(Ginkgo biloba)

<400> 1

atgggacgag gtcgagtcca gctgaggcgc atcgagaaca aaataaatcg ccaagtcacg 60

ttttcgaagc ggcgaaatgg actgttaaag aaggcttacg aactttctgt gttgtgcgac 120

gccgaagtgg cattgattgt cttctccacc agaggcaaac tctacgagtt cgccagttcc 180

agcatgaaca agacgctcga gaggtatgaa aagtgctcgt atgcagtgca agatacaaat 240

gtctcaaacc gggaagcaca gaattggcat caagaggtta caaaactgaa gtctaaggtt 300

gagctcctac aacagtcaca aaggcatctg ttgggggaag atcttggccc actcagtgtg 360

aaggagctcc agcaacttga acgacagctg gagattgcac tgaatcatgt taggtcgaga 420

aagagtcaag ttatgatgga cttgattgat gagcttcgga aaaaggaaag gctgctacag 480

gaagtgaaca aatctctgca caagaagctt tcagaatcag agggacgaaa tgcaacccat 540

gatatgcggc atcctaccga cgataatgga ccttggaacc catctgtaaa cggtggatat 600

gccctcccat cgacccagca aaacaccaac ctccaccctg tggattgtga accgacacta 660

caaattgggt atcagtctgt tcctcgtgaa agcattgagc ctccacagga gcaaactcac 720

aaccagcccc aggataacta cacggggtgg tgggtttga 759

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacgataatg gaccttggaa c 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtgagtttg ctcctgtgg 19

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgccaaggc tgtaggtaag g 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcagattcct ccttgatggc g 21

<210> 6

<211> 1999

<212> DNA

<213> 油松(Pinus tabuliformis)

<400> 6

cacttttatg ggttagaaca taaatggaaa atgggaaaaa gtgggaacta aataccttct 60

ggcgtcctat cggcatccaa cgactctgtt cacacatctc gagaatatct attcatgtct 120

atcttcatat ctttttttaa agtctcgtct cacacatttt attcatgtga ttgcgtctcg 180

cgtattattg aaaacacaag cttgtccagc ggatttctaa agcgcctggg tcagaggtcc 240

ccgaacgccg ttgctgctgc tgttggttgg ggattctaca gtttctgact tgaggtctca 300

tccattgagg tgagccttga ttccccagat gggtagtaac acaggcgctg gtattgaaaa 360

atggcaatac gctgtgtcag gagtttcatg gaggaggagg atatagggga tgagaaggct 420

tgtctggttg ggtggttggg cagatggtgt tgcagcgttc tgtgttttgt gttggaggat 480

ttaattatta atgtctgctg gatcttagca actgcagatc tgaataaata gtccagaaag 540

cagaaaagtt tcaatctcca ggaactcact attctgtgtg ttgttgcaat tggtctgggg 600

gctttgtgtc ttagttctta gcacagtggc tgtggtcaat gtgagtaagt aaataatact 660

gcataccctc taatgaaaat ttgcagggag cttgaaatgc ttcagtgatc caaattttgt 720

gaattgtgag gagcagatga cagaatagtg tgacagcctg gttgtgagct caattgcttt 780

atgccctttg gataagagag aagaggaaga ggagggattt gagattttag agtcataaaa 840

gttgtttcaa gaagttgtgt tacaggtgta ttaagagaag agaatcacag aaactgtgaa 900

ctcaattaca tgatcttttt caagaagagg tatttatttt gaattagttg tcgagttatt 960

tcaagaagcc acagcttaca cagcatcctc atatcataga agaggcatag atcaactaac 1020

agcctgggac ataggagctg aaagcaactt tgaaggttta ggcaatggaa atgatgttag 1080

atctgaatgc agttgatact gtagaggtcg acggttcgag tcccgagccg ggttctgttt 1140

gcagcgatga tgcgatgaga tctgatatta ttagcagcga caacaagccc acgtccaacc 1200

aggatgactc cgggacgtcg aattcttctg tggttaatac agtggctgta gaaaatggtt 1260

gcccggattt cgaagcctcc tcgacgtgtt ccaacatgaa ttctcacagt ctgaaagctg 1320

ccaaatttct gggatcactg ggctccgaca tcgaccgagc agctcacccg cctgacaatc 1380

tgatattcct tgccaacgag aacccggttg gaaacgattg cgttacccgg cagtttttcc 1440

cggtcgaagt cccggaaaag cctccgcctg ataccctaac ccgatctcgc tggacggatg 1500

taacgttctg tgattcgccc gaccctgccg agcatcagaa ggcaatggcg gaaggtactc 1560

aacctgctaa gaaaagcaga cgcggcccgc ggtccaggag ttctcagtac cgcggtgtaa 1620

cgttttacag gcgtactgga cgatgggagt cacacatatg ggattgtggg aagcaagttt 1680

atctgggtgg attcgacact gcaaacgcag ctgcaagggc atatgatagg gctgctatca 1740

agtttagggg agcggaagct gacataaatt tcaaccacag tgattatgag gaggatatga 1800

agcagatgaa caatctttcc aaggaggaat tcgttcatat tctccgacgt caaagcaccg 1860

gtttctcgag agggagctcc aaatttagag gtgtaacccg gcacaaatgt ggcagatggg 1920

aagccaggat ggggcaattc cttgggaaaa agtacattta cttgggtttg ttcgacagtg 1980

agatcgaagc tgcaagagc 1999

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgacagaaga gagtgagcac 20

Claims

1.一种树木老化时空差异基因的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括树木老化时空差异基因初步筛选、对初步筛选的老化时空差异基因表达模式进行鉴定，以确定老化时空差异基因。

2.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述的树木老化时空差异基因初步筛选是以不同树龄的树木基部维管形成层为材料和/或以同一棵树不同高度枝条的维管形成层为材料，进行转录组测序、测序结果组装及分析或荧光定量PCR分析，从而初步筛选老化时空差异基因。

3.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述的老化时空差异基因表达模式鉴定是检测树木初步筛选的老化时空差异基因在不同树龄的树木基部维管形成层和/或在同一棵树不同高度枝条的维管形成层和/或叶片中的mRNA水平和蛋白表达水平。

4.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述树木的老化时空差异基因为GbDAL1和/或PtAP2R2。

5.一种树木平茬复幼与扦插的繁育方法，其特征在于，所述繁育方法包括以下步骤：

（1）利用权利要求1-4任一所述的筛选方法对树木老化时空差异基因进行筛选；

（2）对树木进行平茬复幼处理；

（4）选择幼化程度适合的枝条扦插。

6.如权利要求5所述的繁育方法，其特征在于，所述步骤（2）的平茬复幼处理包括对采穗母株进行定植，对采穗母株截顶促萌和重复修剪形成“矮桩平台式”株型。

7.如权利要求5所述的繁育方法，其特征在于，所述繁育方法还包括步骤（5）：准备扦插基质和步骤（6）：通过三元激素处理法对步骤（4）的枝条进行促根处理。

8.如权利要求7所述的繁育方法，其特征在于，所述的三元激素处理法按照如下的步骤依次进行：

（II）再用溶液B处理，所述的溶液B含有植物生长调节剂；

其中，在进行下一步处理前将上一步的溶液冲洗干净。

9.如权利要求8所述的繁育方法，其特征在于，所述的溶液A含有茉莉酸甲酯（MethylJasmonate，MeJA）；所述的溶液B含有α-萘乙酸（1-naphthylacetic acid，NAA）、吲哚丁酸（Indole-3-Butytric acid，IBA）、1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）和/或6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）；所述的溶液C含有烯效唑。

10.如权利要求9所述的繁育方法，其特征在于，所述溶液A对枝条基部处理10-60分钟；所述溶液B对枝条基部处理1-8小时；所述溶液C对枝条基部处理1-26小时或者所述溶液C对枝条顶端喷施。