CN108651273B - 基于基因检测聚合选育耐盐色叶紫薇的方法 - Google Patents

基于基因检测聚合选育耐盐色叶紫薇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于基因检测聚合选育耐盐色叶紫薇的方法，包括：选取敏盐色叶紫薇与耐盐普通紫薇品种杂交获得F1代植株群；采用不同浓度的NaCl溶液盐胁迫所述F1代植株群，并对盐胁迫后的所述F1代植株群的植株根系进行转录组测序以确定紫薇的耐盐检测基因；对所述敏盐色叶紫薇的同一时期的不同颜色的叶片进行转录组测序以确定紫薇的色叶检测基因；根据确定的所述耐盐检测基因和所述色叶检测基因检测待测的F1代植株以选育聚合耐盐色叶基因的紫薇新品种。本发明解决了花灌木色叶紫薇难以在盐碱地种植的问题。

Description

基于基因检测聚合选育耐盐色叶紫薇的方法
技术领域
本发明涉及紫薇育种技术领域，具体涉及一种基于基因检测聚合选育耐盐色叶紫薇的方法。
背景技术
紫薇，别名：痒痒花、痒痒树、紫金花、紫兰花、蚊子花、西洋水杨梅、百日红、无皮树，拉丁文名：Lagerstroemia indica L.千屈菜科、紫薇属落叶灌木或小乔木，高可达7米；树皮平滑，灰色或灰褐色；枝干多扭曲，小枝纤细，叶互生或有时对生，纸质，椭圆形、阔矩圆形或倒卵形，幼时绿色至黄色，成熟时或干燥时呈紫黑色，室背开裂；种子有翅，长约 8毫米。花期6～9月，果期9～12月。紫薇树姿优美，树干光滑洁净，花色艳丽；开花时正当夏秋少花季节，花期长，是观花、观干、观根的盆景良材；根、皮、叶、花皆可入药。紫薇对环境的适应性能较强，耐干旱和寒冷，在深厚肥沃疏松，土质呈微酸、酸性砂质土壤中生长最好。
盐碱地是盐类集积的一个种类，是指土壤里面所含的盐分影响到作物的正常生长。我国盐碱地的面积为9913万公顷。我国碱土和碱化土壤的形成，大部分与土壤中碳酸盐的累计有关，因而碱化度普遍较高，严重的盐碱土壤地区植物几乎不能生存。所以，对盐碱地的改良、开发和利用需要另辟蹊径。传统的花灌木色叶紫薇虽然观赏性强、对环境的适应性较强，但是在盐碱地难以生存种植。
发明内容
为克服现有技术所存在的缺陷，现提供一种基于基因检测聚合选育耐盐色叶紫薇的方法，以解决传统的花灌木色叶紫薇难以在盐碱地种植的问题。
为实现上述目的，提供一种基于基因检测聚合选育耐盐色叶紫薇的方法，包括以下步骤：
选取敏盐色叶紫薇(母本)与耐盐普通紫薇品种(父本)杂交获得F1代植株群；
采用不同浓度的NaCl溶液盐胁迫所述F1代植株群，并对盐胁迫后的所述F1代植株群的植株根系进行转录组测序以确定紫薇的耐盐检测基因；
对所述敏盐色叶紫薇的同一时期的不同颜色的叶片进行转录组测序以确定紫薇的色叶检测基因；
根据确定的所述耐盐检测基因和所述色叶检测基因检测待测的F1代植株以选育聚合耐盐色叶基因的紫薇新品种。
进一步的，所述选取敏盐色叶紫薇与耐盐普通紫薇品种杂交获得F1代植株群的步骤包括：
选取所述敏盐色叶紫薇与所述耐盐普通紫薇品种杂交获得多个杂交种；
将多个所述杂交种播种，使得多个所述杂交种生根成苗形成所述F1代植株群。
进一步的，所述采用不同浓度的NaCl溶液盐胁迫所述F1代植株群的步骤包括：
配置浓度分别为0mMNaCl、50mMNaCl、100mMNaCl、150mMNaCl 溶液；
截取所述F1代植株群的多条半木质化枝条并分别放置于浓度不同的所述溶液中生根进行耐盐性等级鉴定，耐盐性等级包括不耐盐、耐盐、强耐盐和极耐盐；
截取被鉴定为不耐盐和极耐盐的F1代植株的多条半木质化枝条进行扦插生根后分别分成胁迫组和对照组；
将所述胁迫组放入150mM NaCl溶液进行盐胁迫，同时，将对照组放入清水中。
进一步的，所述对盐胁迫后的所述F1代植株群的植株根系进行转录组测序以确定紫薇的耐盐检测基因的步骤包括：
将所述对照组和经过盐胁迫的所述胁迫组的植株根系进行转录组测序，筛选出耐盐差异表达基因；
利用生物信息学软件将筛选出的所述耐盐差异表达基因与公共数据库中进行比对注释筛选出待确定耐盐候选基因；
将所述待确定耐盐候选基因通过RT-PCR验证并确定出耐盐候选基因；
将所述耐盐候选基因通过烟草瞬时表达验证并确定为所述耐盐检测基因。
进一步的，所述根据确定的所述耐盐检测基因和所述色叶检测基因检测待测的F1代植株以选育聚合耐盐色叶基因的紫薇新品种的步骤包括：
截取待测的F1代植株的半木质化枝条进行扦插，使得所述待测的F1代植株的半木质化枝条生根生叶；
对生根的所述待测的F1代植株的半木质化枝条的植株根系采用盐胁迫；
利用所述耐盐检测基因和所述色叶检测基因检测经由盐胁迫的所述半木质化枝条的植株根系和叶片中的基因表达量，确定同时符合所述耐盐检测基因和所述色叶检测基因的基因表达数量的所述待测的F1代植株为所述紫薇新品种。
本发明的有益效果在于，本发明的基于基因检测聚合选育耐盐色叶紫薇的方法运用分子辅助育种技术筛选紫薇的耐盐和色叶性状关联基因，检测 F1代相关位点基因型，可以缩短紫薇育种进程，还可以在早期对含目标基因的紫薇个体进行准确选择，实现确定目标基因(耐盐基因和色叶基因)是否同时聚合存在，克服隐性性状识别困难等问题，以减少回交世代，提高紫薇育种的精确度和可靠性。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
耐盐基因指使植物表达出耐盐性的基因。色叶基因指使植物叶片表达出非绿色的基因。
在本实施例中，耐盐色叶紫薇为同时聚合了耐盐基因和色叶基因的紫薇品种。
本发明提供了一种基于基因检测聚合选育耐盐色叶紫薇的方法，包括：
S1：选取敏盐色叶紫薇与耐盐普通紫薇品种杂交获得F1代植株群。
S11选取敏盐色叶紫薇(母本)与耐盐普通紫薇(父本)品种杂交获得多个杂交种(F1)。
S12将多个杂交种(F1)播种，使得多个杂交种(F1)生根成苗形成F1代植株群。
S2：采用不同浓度的NaCl溶液盐胁迫F1代植株群，并对盐胁迫后的 F1代植株群的植株根系进行转录组测序以确定紫薇的耐盐检测基因。
S21待确定耐盐候选基因的筛选。
S211配置浓度分别为0mM(毫摩尔每升)的NaCl、50mM的NaCl、 100mM的NaCl、150mMNaCl溶液。
S212截取F1代植株群的多条半木质化枝条通过生根进行耐盐性等级鉴定。
截取的F1代植株群的多条半木质化枝条，并将多条F1代植株群的半木质化枝条分别放置于浓度分别为0mMNaCl、50mMNaCl、100mMNaCl、 150mMNaCl的溶液中进行7天盐胁迫生根。根据半木质化枝条在上述不同浓度的NaCl的溶液中的生根情况，鉴定截取的F1代植株群的半木质化枝条的耐盐性。
具体的，鉴定耐盐等级：
截取的F1代植株群的半木质化枝条只能在浓度为0mM的NaCl中正常生根的，鉴定该F1代的耐盐等级为不耐盐；只能在浓度为50mM的NaCl 正常生根的，鉴定该F1代的耐盐等级为耐盐；只能在浓度为100mM的NaCl 正常生根的，鉴定该F1代的耐盐等级为强耐盐；能在浓度为150mM的NaCl 正常生根的，鉴定该F1代的耐盐等级为极耐盐。
S213截取被鉴定为不耐盐和极耐盐的F1代植株的半木质化枝条进行无土扦插生根后分别分成胁迫组和对照组。
根据步骤S212的鉴定结果，再次截取被鉴定为不耐盐和极耐盐的F1代植株的多条半木质化枝条；
将不耐盐的F1代植株的多条半木质化枝条进行无土扦插生根，并将生根后的不耐盐的F1代植株的多条半木质化枝条分成胁迫组和对照组；
将极耐盐的F1代植株的多条半木质化枝条进行无土扦插生根，并将生根后的极耐盐的F1代植株的多条半木质化枝条分成胁迫组和对照组。
S214将不耐盐和极耐盐的胁迫组的植株根系放入浓度为150mM的 NaCl溶液进行盐胁迫，同时，将不耐盐和极耐盐的对照组的植株根系放入清水(即NaCl的浓度0mM)中。
S215经盐胁迫4小时后，将对照组和经过盐胁迫的胁迫组的植株根系进行转录组测序，筛选出耐盐和敏盐之间的耐盐差异表达基因。
S216利用生物信息学软件将筛选出的耐盐差异表达基因与公共数据库 (蛋白质序列公共数据库)中进行比对注释以筛选出待确定耐盐候选基因。
具体的，利用生物信息学软件将筛选出的耐盐差异表达基因在基因本体数据库(Gene Ontology Consortium，GO)库、京都基因与基因组百科全书 (Kyoto encyclopediaof genes and genomes，KEGG)、拟南芥蛋白质数据库、毛果杨蛋白质数据库中筛选出待确定耐盐候选基因。
S217将待确定耐盐候选基因通过RT-PCR验证并确定出耐盐候选基因。
逆转录PCR(reverse transcription PCR)或者称反转录PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
为了验证转录组测序结果，将筛选出的待确定耐盐候选基因进行 RT-PCR，当RT-PCR结果表明筛选出的待确定耐盐候选基因在耐盐和敏盐间表达变化模式与转录组测序结果一致时，则表明利用转录组测序获得基因表达结果准确，即确定待确定耐盐候选基因为耐盐候选基因。
S218将耐盐候选基因通过烟草瞬时表达验证并确定为耐盐检测基因。
将耐盐候选基因转入烟草后，烟草的愈伤组织能表达出耐盐性，则确定为最终的耐盐检测基因。
将转基因后的烟草愈伤组织注入1％的盐水，在24小时培养期内未出现水渍状则本愈伤组织表现为耐盐性。
S3：对亲本敏盐色叶紫薇的同一时期的不同颜色的叶片进行转录组测序以确定紫薇的色叶检测基因。
S31待确定色叶候选基因的筛选。
S311对亲本敏盐色叶紫薇的同一时期的不同颜色的叶进行转录组测序并分析测序结果，筛选出普通叶和色叶之间的色叶差异表达基因。
S312利用生物信息学软件将筛选出的色叶差异表达基因与公共数据库 (蛋白质序列公共数据库)中进行比对注释以筛选出待确定色叶候选基因。
具体的，利用生物信息学软件将筛选出的色叶差异表达基因在基因本体数据库(Gene Ontology Consortium，GO)库、京都基因与基因组百科全书 (Kyoto encyclopediaof genes and genomes，KEGG)、拟南芥蛋白质数据库、毛果杨蛋白质数据库中筛选出待确定色叶候选基因。
S32待确定色叶候选基因通过RT-PCR验证并确定出色叶候选基因。
为了验证转录组测序结果，将筛选出的待确定色叶候选基因进行 RT-PCR，当RT-PCR结果表明筛选出的待确定色叶候选基因在普通叶和色叶间表达变化模式与转录组测序结果一致时，则表明利用转录组测序获得基因表达结果准确，即确定筛选出的待确定色叶候选基为色叶候选基因。
S33色叶候选基因通过烟草瞬时表达验证并确定为色叶检测基因。
将色叶候选基因转入烟草后，观察烟草叶片组织颜色发生变化的则确定为最终的色叶检测基因。
S4：根据确定的耐盐检测基因和色叶检测基因检测待测的F1代植株以聚合选育耐盐色叶基因的紫薇新品种。
S41截取待测的F1代植株的半木质化枝条进行无土扦插栽培，使得待测的F1代植株的半木质化枝条生根生叶。
S42对生根的待测的F1代植株的半木质化枝条的植株根系采用盐胁迫。
具体的，盐胁迫是通过对生根的待测的F1代植株的半木质化枝条的植株根系浇灌浓度为150mM的NaCl溶液，盐胁迫时间为4小时。
S43利用耐盐检测基因和色叶检测基因检测经由盐胁迫的半木质化枝条的植株根系和叶片中的基因表达量，确定同时符合耐盐检测基因和色叶检测基因的基因表达数量的待测的F1代植株为聚合耐盐基因和色叶基因的紫薇新品种。只需同时测出耐盐基因与色叶基因表达数量即可，无关表达量的大小，因为表达量影响因子太多，有应激反应与正常表达反应等，数据差异非常大。
用耐盐检测基因对盐胁迫后的待测的F1代植株的半木质化枝条的根系采用RT-PCR检测基因表达量，同时，用色叶检测基因对盐胁迫后的待测的 F1代植株的半木质化枝条的叶采用RT-PCR检测基因表达量。
观测待测的F1代植株的耐盐基因表达量和色叶检基因表达量，同时达到耐盐检测基因和色叶检测基因的表达数量时，确定该待测的F1代植株为耐盐色叶紫薇新品种。
作为一种较佳的实施方式，在确定待测的F1代植株为耐盐色叶紫薇新品种时，可以通过观察待测的F1代植株的叶片颜色辅助确定耐盐色叶紫薇新品种；耐盐通过浇高浓度的盐水(100mMNaCl)后的生长状况。
本发明的基于基因检测聚合耐盐色叶紫薇的选育方法运用分子辅助育种技术筛选紫薇的耐盐和色叶性状关联基因，检测F1代相关位点基因型，可以缩短紫薇育种进程，还可以在早期对含目标基因的紫薇个体进行准确选择，实现确定目标基因(耐盐基因和色叶基因)是否同时聚合存在，克服隐性性状识别困难等问题，以减少回交世代，提高紫薇育种的精确度和可靠性。
最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本申请所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本申请型的保护范围之中。

Claims (2)

1.一种基于基因检测聚合选育耐盐色叶紫薇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
选取母本敏盐色叶紫薇与父本耐盐普通紫薇品种杂交获得F1代植株群；
采用不同浓度的NaCl溶液盐胁迫所述F1代植株群，并对盐胁迫后的所述F1代植株群的植株根系进行转录组测序以确定紫薇的耐盐检测基因；
对所述敏盐色叶紫薇的同一时期的不同颜色的叶片进行转录组测序以确定紫薇的色叶检测基因；
根据确定的所述耐盐检测基因和所述色叶检测基因检测待测的F1代植株以选育聚合耐盐色叶基因的紫薇新品种；
所述采用不同浓度的NaCl溶液盐胁迫所述F1代植株群的步骤包括：
配置浓度分别为0mMNaCl、50mMNaCl、100mMNaCl、150mMNaCl溶液；
截取所述F1代植株群的多条半木质化枝条并分别放置于浓度不同的所述溶液中生根进行耐盐性等级鉴定，耐盐性等级包括不耐盐、耐盐、强耐盐和极耐盐；
截取被鉴定为不耐盐和极耐盐的F1代植株的多条半木质化枝条进行扦插生根后分别分成胁迫组和对照组；
将所述胁迫组放入150mM NaCl溶液进行盐胁迫，同时，将对照组放入清水中；
所述对盐胁迫后的所述F1代植株群的植株根系进行转录组测序以确定紫薇的耐盐检测基因的步骤包括：
将所述对照组和经过盐胁迫的所述胁迫组的植株根系进行转录组测序，筛选出耐盐差异表达基因；
利用生物信息学软件将筛选出的所述耐盐差异表达基因与公共数据库中进行比对注释筛选出待确定耐盐候选基因；
将所述待确定耐盐候选基因通过RT-PCR验证并确定出耐盐候选基因；
将所述耐盐候选基因通过烟草瞬时表达验证并确定为所述耐盐检测基因；
所述根据确定的所述耐盐检测基因和所述色叶检测基因检测待测的F1代植株以选育聚合耐盐色叶基因的紫薇新品种的步骤包括：
截取待测的F1代植株的半木质化枝条进行扦插，使得所述待测的F1代植株的半木质化枝条生根生叶；
对生根的所述待测的F1代植株的半木质化枝条的植株根系采用盐胁迫；
利用所述耐盐检测基因和所述色叶检测基因检测经由盐胁迫的所述半木质化枝条的植株根系和叶片中的基因表达量，确定同时符合所述耐盐检测基因和所述色叶检测基因的基因表达数量的所述待测的F1代植株为所述紫薇新品种。
2.根据权利要求1所述的基于基因检测聚合选育耐盐色叶紫薇的方法，其特征在于，所述选取敏盐色叶紫薇与耐盐普通紫薇品种杂交获得F1代植株群的步骤包括：
选取所述敏盐色叶紫薇与所述耐盐普通紫薇品种杂交获得多个杂交种；
将多个所述杂交种播种，使得多个所述杂交种生根成苗形成所述F1代植株群。
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