CN106446596B - 与菊花耐涝性显著相关的分子标记及其鉴定方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种与菊花耐涝性显著相关的分子标记及其鉴定方法和应用，包括a.连续两年的耐涝性鉴定；b.菊花品种群体结构及亲缘关系分析；c.关联模型的比较和选择；d.与菊花耐涝性显著关联的分子标记的确定；e.优异等位变异挖掘及亲本选拔。本发明采用盆栽模拟淹水法对100个菊花品种进行连续两年的耐涝性鉴定，采用全基因组关联分析方法检测与耐涝性紧密关联的分子标记位点并进行了优异等位变异的挖掘。本发明检测到4个标记位点与菊花耐涝性显著关联，挖掘了2个优异等位变异并筛选了6份优异菊花品种，这不仅为菊花耐涝性杂交育种工作提供了优异亲本材料也为分子标记辅助育种(MAS)选择提供了一定参考。

Description

与菊花耐涝性显著相关的分子标记及其鉴定方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种与菊花耐涝性显著相关的分子标记及其鉴定方法和应用，可为菊花耐涝栽培调控及定向培育具有较强耐涝性的菊花新品种提供理论依据。
背景技术
菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)是我国的传统名优花卉也是世界四大切花之一，具有很高的经济和观赏价值。菊花为浅根，喜疏松肥沃排水良好土壤，夏季集中降雨积水往往导致涝渍胁迫。研究表明持续水淹条件下菊花表现为根系活力下降、叶绿素和叶片净光合速率降低、叶片萎蔫、干枯，严重影响菊花的品质并且会导致菊花大面积死亡[1]。因此，培育耐涝性菊花新品种是解决这一问题的直接有效方法，也是菊花育种工作的重要任务之一。
植物耐涝性受多种遗传机制以及温度、植物生长发育阶段、营养水平、土壤结构等多种环境因素的影响，是一个复杂的数量性状。目前在各个物种上耐涝性鉴定的标准尚未统一。因此，建立科学合理的菊花耐涝评价体系是开展菊花耐涝机制研究的重要前提。尹冬梅等[2]根据菊花及其近缘种属植物在盆栽淹水处理过程的表型变化，采用叶色、叶形态、茎色、茎形态等外观形态指标建立了菊花耐涝性评价体系，并据此对部分菊花及其近缘种属植物进行耐涝性鉴定，筛选出部分耐涝性强的优异种质。此外，目前在菊花上耐涝性状的研究主要集中在涝胁迫后植株在形态、细胞学、解剖学、生理生化方面的变化[3-6]，尚无菊花耐涝性相关分子遗传机制的研究。
关联分析(连锁不平衡作图或关联作图)以连锁不平衡(linkagedisequilibrium，LD)为基础，以自然群体为研究对象，检测群体内目标性状与遗传标记或候选基因的遗传变异的显著关联。相比传统的QTL连锁作图技术，关联分析具有研究周期短、可同时对同一基因座的多个等位基因进行分析、定位精度高、可以通过多年，多点试验去除环境因子对性状统计的影响等优点，已经成功应用在很多物种上并对各种性状进行了关联位点的挖掘[7-9]，但是关于其在植物非生物胁迫上，尤其是涝胁迫上应用的报道比较少。本发明是首次报道运用关联分析方法挖掘与菊花耐涝性显著关联的分子标记位点，以期为菊花耐涝性分子标记辅助育种提供一定参考。
[1]Shabala,S.(2011)Physiological and cellular aspects ofphytotoxicity tolerance in plants:the role of membrane transporters andimplications for crop breeding for waterlogging tolerance.New Phytologist,190,289-298.
[2]Yin,D.,Guan,Z.,Chen,S.and Chen,F.(2009b)Establishment ofevaluation system for waterlogging tolerance and identification ofwaterlogging tolerance in Chrysanthemum morifolium and its related generaplants.Journal of Plant Genetic Resources,10,399-404.
[3]Yin,D.,Chen,S.,Chen,F.,Guan,Z.and Fang,W.(2009a)Morphological andphysiological responses of two chrysanthemum cultivars differing in theirtolerance to waterlogging.Environmental and experimental botany,67,87-93.
[4]Yin,D.,Zhang,Z.and Luo,H.(2012)Anatomical responses towaterlogging in Chrysanthemum zawadskii.Scientia horticulturae,146,86-91
[5]WANG,L.,WANG,C.-c.,JIANG,J.-f.,CHEN,S.-m.,FANG,W.-m.,TENG,N.-j.,etal.(2013)Interspecific Hybridization Between Chrysanthemum morifolium‘Nannongyinshan’and C.zawadskii and Identification of Waterlogging Toleranceof Their Hybrid.Scientia Agricultura Sinica,20,023.
[6]LIAN,H.-y.,WANG,X.-j.and WU,Y.(2014)Effect of Waterlogging Stresson Morphology and Some Physiological Index of Chrysanthemummorifolium.Journal of Anhui Science and Technology University,1,009.
[7]Brachi,B.,Faure,N.,Bergelson,J.,Cuguen,J.and Roux,F.(2013)Genome-wide association mapping of flowering time in Arabidopsis thaliana in nature:genetics for underlying components and reaction norms across two successiveyears.Acta Botanica Gallica,160,205-219.
[8]Hwang,E.-Y.,Song,Q.,Jia,G.,Specht,J.E.,Hyten,D.L.,Costa,J.,et al.(2014)A genome-wide association study of seed protein and oil content insoybean.BMC genomics,15,1.
[9]Phung,N.T.P.,Mai,C.D.,Hoang,G.T.,Truong,H.T.M.,Lavarenne,J.,Gonin,M.,et al.(2016)Genome-wide association mapping for root traits in a panel ofrice accessions from Vietnam.BMC plant biology,16,1.
发明内容
针对菊花耐涝性分子遗传机制、优异关联位点挖掘的研究在国内外几乎空白这一现状，本发明通过利用关联分析方法筛选出多个与菊花耐涝性基因紧密关联的分子标记并对优异等位变异进行挖掘，从而提高菊花优良耐涝性种质资源的选择效率，为菊花传统杂交育种工作提供优异亲本材料，也对菊花耐涝性分子标记辅助育种(MAS)选择提供了一定参考。
本发明的目的通过以下技术手段获得：
一种鉴定与菊花耐涝性显著相关分子标记的方法，包括以下步骤：
a、耐涝性鉴定：选取多份不同来源且无直接亲缘关系的菊花品种，分别连续两年进行耐涝性鉴定，试验采用完全随机区组设计，设处理和对照，处理组10-12叶龄苗时进行涝处理，对照组植株正常管理；淹水3d后记录萎蔫指数，8d后根据淹水后叶色，叶形，茎色及茎形进行打分并统计死叶率；萎蔫指数分级标准为：1级：植株挺直，叶片自然伸展；2级：植株基本挺直，最下层叶片发软下垂，中上层叶片均自然伸展；3级：植株顶端稍有萎蔫弯曲，中下层叶片出现下垂；4级：植株顶端萎蔫弯曲，所有叶片均出现不同程度的下垂；5级：植株萎蔫严重，所有叶片皱缩明显；
采用隶属函数法求出每个指标的隶属函数值，计算公式为：
若该指标数据与耐涝性是正相关关系，则Xi＝(X-Xmin)÷(Xmax-Xmin)；
若该指标数据与耐涝性是负相关关系，则Xi＝1-(X-Xmin)÷(Xmax-Xmin)；
其中，X为某个品种某个指标的测定值，Xmin和Xmax为所有品种该指标的最小值和最大值；用各个品种所有指标的隶属函数值的平均值大小来评价该品种的耐涝性，平均隶属函数值越大，其耐涝性越强；
b、菊花品种群体结构和亲缘关系分析：
1)利用分子标记数据采用STRUCTURE软件对菊花品种群体进行类群划分，计算各个品种的Q值即某个品种的基因组变异源于某个群体的概率得到Q-矩阵，并绘制出群体结构图；
2)采用TASSEL软件对该群体进行主成分分析，将累积解释率达到25％的前几个主成分构建PC-矩阵并用于后续关联分析；
3)根据三种标记的整合数据采用SPAGeDi软件分析品种间的亲缘关系，得到亲缘关系系数K-矩阵；
c、关联模型的比较和选择：将步骤b中所得到的Q-矩阵、PC-矩阵及K-矩阵作为/不作为协变量构建了6种关联分析模型：3种一般线性模型包括GLM，GLM+Q和GLM+PC及3种混合线性模型包括MLM，MLM+Q和MLM+PC；结合分子和表型数据在TASSEL中绘制Q-Q图并根据观察–log P值与期望–log P值的偏离程度大小选择最优模型，其中偏离程度越小，模型越能控制Ⅰ类错误和Ⅱ类错误；
d、与菊花耐涝性紧密关联的分子标记的确定：根据步骤c中选择的最优模型应用TASSLE软件对两年重复试验得到的表型数据结合分子标记数据分别进行关联分析；以两年数据的关联分析都能检测到的显著标记位点(P<0.01)为与菊花耐涝性紧密关联的分子标记，同时得出该标记位点的表型变异解释率R2。
步骤a中选取100份不同来源且无直接亲缘关系的菊花品种，分别连续两年进行耐涝性鉴定，采用盆栽淹水法对供试材料进行高出土面3cm的涝处理。，采用隶属函数法求出各品种的平均隶属函数值Xi作为最终各品种的耐涝性鉴定数据，由于萎蔫指数和死叶率与耐涝性成负相关，隶属函数值Xi计算公式为：Xi＝1-(X-Xmin)÷(Xmax-Xmin)。
步骤b中运用STRUCTURE软件中的Bayesian方法对菊花品种群体进行基于数学模型的类群划分，先假设群体数目K为1-15，将MCMC开始时的不作数迭代设为10000次，并假定位点都是独立的，每个K值独立运算5次，然后根据似然函数值最大的原则和ΔK值来确定合适的K值并绘制散点曲线图，根据K值的取值确定多个菊花品种的类群划分，将100份菊花品种材料分为两个亚群，其中Pop1包括63份材料，Pop2包括37份材料，其中有12份材料由于其在某一亚群的概率小于0.6，划为混合群；
主成分分析发现前7个主成分累积解释率达到25.38％，故采用PC7-矩阵作为模型选择及关联分析的协变量；
亲缘关系分析发现该群体的亲缘关系系数在0-0.588之间，平均值为0.034，其中74.57％的亲缘关系系数小于0.05，而只有1.19％的亲缘关系系数大于0.25，说明该群体遗传多样性高且无明显的亲缘关系，适合进行关联分析。
步骤c中在以PC7为协变量的混合线性模型MLM+PC7中，观察–log P值对期望–logP值的拟合度最好，因此以MLM+PC7作为最优模型用于后续耐涝性状关联分析。
上述方法获得的与菊花耐涝性显著相关分子标记和优异等位变异位点，其中，与菊花耐涝性显著相关的分子标记包括：
(1)E2M16-2，正向引物M16-TGAGTCCAAACCGGAGG，反向引物E2-GACTGCGTACGAAT-TTGC；
(2)E11M23-1，正向引物M23-CACAGTCATGCCGGAAT，反向引物E11-GACTGCGTACGAATTTCG；
(3)E11M23-11，正向引物M23-CACAGTCATGCCGGAAT，反向引物E11-GACTGCGTACGAATT-TCG；
(4)E19M16-1，正向引物M16-TGAGTCCAAACCGGAGG，反向引物E19-TGTGGTCCGCAAATTTAG；
优异等位变异位点包括：(1)E2M16-2；(2)E19M16-1。
一种耐涝性菊花杂交育种中亲本的选择方法，对采用上述方法鉴定出的与菊花耐涝性紧密关联的分子标记进行表型效应值的计算，公式为：ai＝∑Xij/ni ∑Nk/nk，其中ai代表第i个等位变异的表型效应值，Xij为携带第i个等位变异的第j材料性状表型测定值，ni为具有第i等位变异的材料数，Nk为携带无效等位变异的第k个材料的表型测定值，nk为具有无效等位变异的材料数，由于某品种的耐涝隶属函数值越大说明其耐涝性越强(对四个显著关联标记进行效应值计算，效应值是正的即为增效等位变异位点)，所以认为具有显著增效等位变异的位点为优异等位变异位点，具有优异等位变异位点的代表品种能够作为培育具有强耐涝性菊花新品种的亲本选择。
上述的耐涝性菊花杂交育种中亲本的选择方法，所述的优异等位变异位点为E2M16-2和E19M16-1。
上述的鉴定与菊花耐涝性显著相关分子标记方法在耐涝性菊花育种中的应用。
上述的耐涝性菊花杂交育种中亲本的选择方法在耐涝性菊花育种中的应用。
上述的与菊花耐涝性显著相关分子标记及优异等位变异位点在耐涝性菊花育种中的应用。
上述技术方案的详细步骤为：
a、耐涝性鉴定：
选取不同来源且无直接亲缘关系的100份切菊花品种，分别于2014年和2015年春季采集供试材料健壮、生长一致的脚芽扦插于穴盘中，待其生根后移栽至一次性塑料杯中进行缓苗(下口径4cm×上口径5cm×高9cm，底部打洞)，1棵/杯。试验采用完全随机区组设计，设处理和对照，3次重复，每重复3株。缓苗生长8d左右长至10-12叶龄苗时将处理组杯子置入塑料周转箱中(长65cm×宽43cm×高16cm)，注入自来水使水面高于土面3cm。处理期间定时补水以保证水位，对照组植株正常管理。淹水3d后记录萎蔫指数，8d后根据淹水后叶色，叶形，茎色及茎形进行打分并统计死叶率。萎蔫指数分级标准为：1级：植株挺直，叶片自然伸展；2级：植株基本挺直，最下层叶片发软下垂，中上层叶片均自然伸展；3级：植株顶端稍有萎蔫弯曲，中下层叶片出现下垂；4级：植株顶端萎蔫弯曲，所有叶片均出现不同程度的下垂；5级：植株萎蔫严重，所有叶片皱缩明显。
采用隶属函数法求出每个指标的隶属函数值，计算公式为：
若该指标数据与耐涝性性是正相关关系，则Xi＝(X-Xmin)÷(Xmax-Xmin)；
若该指标数据与耐涝性是负相关关系，则Xi＝1-(X-Xmin)÷(Xmax-Xmin)；
其中，X为某个品种某个指标的测定值，Xmin和Xmax为所有品种该指标的最小值和最大值。用各个品种所有指标的隶属函数值的平均值大小来评价该品种的耐涝性，平均隶属函数值越大，其耐涝性越强。
b、菊花品种群体结构和亲缘关系分析：
1)利用现有技术中已有的分子标记数据(707个多态性位点，包括371个SRAP位点，49个SCoT位点及287个EST-SSR位点)采用STRUCTURE软件对该菊花品种群体进行类群划分，计算各个品种的Q值即某个品种的基因组变异源于某个群体的概率得到Q-矩阵，并绘制出群体结构图；
2)采用TASSEL软件对该群体进行主成分分析(principal component analysis，PCA)，将累积解释率达到25％的前几个主成分构建PC-矩阵并用于后续关联分析；
3)根据三种标记的整合数据采用SPAGeDi软件分析品种间的亲缘关系，得到亲缘关系系数K-矩阵；
c、关联模型的比较和选择：
将步骤b中所得到的Q-矩阵、PC-矩阵及K-矩阵作为协变量构建了6种关联分析模型：3种一般线性模型(general linear models,GLM)包括GLM，GLM+Q和GLM+PC及3种混合线性模型(mixed linear model,MLM)包括MLM，MLM+Q和MLM+PC。结合分子和表型数据在TASSEL中绘制Q-Q图并根据观察–log P值与期望–log P值的偏离程度大小选择最优模型，其中偏离程度越小，模型越能控制Ⅰ类错误和Ⅱ类错误。
d、与菊花耐涝性紧密关联的分子标记的确定：
根据步骤c中选择的最优模型应用TASSLE软件对两年重复试验得到的表型数据结合分子标记数据分别进行关联分析。以两年数据的关联分析都能检测到的显著标记位点(P<0.01)为与菊花耐涝性紧密关联的分子标记，同时得出该标记位点的表型变异解释率R2。
e、优异等位变异挖掘及亲本选拔：
对根据步骤d鉴定出的显著关联位点进行表型效应值的计算。公式为：ai＝∑Xij/ni-∑Nk/nk，其中ai代表第i个等位变异的表型效应值，Xij为携带第i个等位变异的第j材料性状表型测定值，ni为具有第i等位变异的材料数。Nk为携带无效等位变异的第k个材料的表型测定值，nk为具有无效等位变异的材料数。由于某品种的耐涝隶属函数值越大说明其耐涝性越强，所以认为具有显著增效等位变异的位点为优异等位变异位点，具有增效等位变异的代表品种可以作为培育耐涝性强的菊花新品种的亲本选择。
步骤a采用双套盆法对供试材料进行高出土面3cm的涝处理，处理3d后统计萎蔫指数，8d后根据叶色/形，茎色/茎形进行打分并统计死叶率。采用隶属函数法求出各品种的平均隶属函数值Xi作为最终各品种的耐涝性鉴定数据，由于萎蔫指数和死叶率与耐涝性成负相关，隶属函数值Xi计算公式为：Xi＝1-(X-Xmin)÷(Xmax-Xmin)。公式中的X为某个品种某个指标的测定值；Xmin和Xmax为所有品种该指标的最小值和最大值；每个品种的最终隶属函数值为各个品种所有指标的隶属函数值的平均值，平均隶属函数值越大，其耐涝性越强。
步骤b群体结构分析将100份材料分为两个亚群，其中Pop1包括57份材料，Pop2包括31份材料，剩下的12份材料由于其在某一亚群的概率小于0.6，划为混合群；PC分析发现前7个主成分累积解释率达到25.38％，故采用PC7-矩阵作为模型选择及关联分析的协变量；亲缘关系分析发现该群体的亲缘关系系数在0-0.588之间，平均值为0.034，其中74.57％的亲缘关系系数小于0.05，而只有1.19％的亲缘关系系数大于0.25，说明该群体遗传多样性高且无明显的亲缘关系，适合进行关联分析。
步骤c中在以PC7为协变量的混合线性模型MLM+PC7中，观察–log P值对期望–log P值的拟合度最好，因此以MLM+PC7作为最优模型用于后续耐涝性状分子标记。
上述方法获得的菊花耐涝性关联分子标记，菊花耐涝性关联分子标记包括：(1)E2M16-2，在2014年试验中P值为0.0038，R2为12.64％，在2015年试验中P值为6.99E-04，R2为14.90％，正向引物M16-TGAGTCCAAACCGGAGG，反向引物E2-GACTGCGTACGAATTTGC；(2)E11M23-1，在2014年试验中P值为0.0038，R2为11.88％，在2015年试验中P值为0.0016，R2为12.97％，，正向引物M23-CACAGTCATGCCGGAAT，反向引物E11-GACTGCGTACGAATTTCG；(3)E11M23-11，在2014年试验中P值为0.0052，R2为11.22％，在2015年试验中P值为0.0069，R2为9.89％，正向引物M23-CACAGTCATGCCGGAAT，反向引物E11-GACTGCGTACGAATTTCG；(4)E19M16-1，在2014年试验中P值为0.0067，R2为7.71％，在2015年试验中P值为0.0073，R2为6.94％，正向引物M16-TGAGTCCAAACCGGAGG，反向引物E19-TGTGGTCCGCAAATTTAG。优异等位变异位点包括：(1)E2M16-2，表型效应值在两年试验中均为+0.15；(2)E19M16-1，表型效应值在2014年试验中为+0.20，在2015年试验中为+0.18。携带两个优异等位变异的代表材料有‘南农雪峰’、‘小丽’、‘Qx102’、‘金莲’、‘精云’和‘希望之光’。
本发明的有益效果：
本发明选用来源广泛且无直接亲缘关系的100个菊花品种自然群体为材料，利用现有技术中已知的分子标记数据(707个多态性位点，包括371个SRAP位点，49个SCoT位点及287个EST-SSR位点)对该群体进行群体结构、主成分分析和亲缘关系分析，结合该群体连续两年的耐涝性鉴定数据，运用关联分析方法获得了与耐涝性紧密关联的分子标记。其优点是：
(1)进行关联分析之前，先进行了模型选择的研究。以群体结构Q-矩阵、PC-矩阵及亲缘关系K-矩阵为/不为协变量构建了六个不同模型，最终选择了最能减少Ⅰ类错误和Ⅱ类错误的模型MLM+PC7，从而提高了获得的关联位点的真实性及可靠性。
(2)同时运用SRAP、SCoT和EST-SSR三种分子标记技术，各标记的原理不同，可以相互补充且数量非常丰富，有利于获得与耐涝性紧密相关的分子标记。此外，我们对该群体进行了连续两年的耐涝性鉴定，并对两次表型数据分别进行关联分析，以两次分析都能检测到的显著标记位点(P<0.01)为与菊花耐涝性紧密关联的分子标记，在一定程度上较少了环境因素对关联分析结果的影响。
(3)得到与耐涝性紧密相关的分子标记后进行了位点效应值的计算，试图挖掘优异等位变异并寻找携带优异等位变异的材料，从而为菊花传统杂交育种提供优质亲本也为菊花耐涝性分子标记辅助育种提供理论基础。
附图说明
图1为通过L(K)和ΔK判断合适的群体数
图2为100个菊花品种群体结构(K＝2)
图3为100个菊花品种的亲缘关系检测
图4为Q-Q图进行模型选择
图5为菊花耐涝表型图
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
(一)试验材料及其耐涝性鉴定表型数据的获得：
试验材料：不同来源且无直接亲缘关系的100个菊花品种(表1)，所有材料保存于“中国菊花种质资源保存中心”，本领域技术人员可以从“中国菊花种质资源保存中心”中获得上述种质。
表1供试的100个菊花品种
涝胁迫处理方法：分别于2014年和2015年春季采集供试材料健壮、生长一致的脚芽扦插于穴盘中，待其生根后移栽至一次性塑料杯中进行缓苗(下口径4cm×上口径5cm×高9cm，底部打洞)，1棵/杯。试验采用完全随机区组设计，设处理和对照，3次重复，每重复3株。缓苗生长8d左右长至10-12叶龄苗时将处理组杯子置入塑料周转箱中(长65cm×宽43cm×高16cm)，注入自来水使水面高于土面3cm。处理期间定时补水以保证水位，对照组植株正常管理。
指标的观察与测定：淹水3d后记录萎蔫指数，8d后根据淹水后叶色，叶形，茎色及茎形进行打分并统计死叶率。萎蔫指数分级标准为：1级：植株挺直，叶片自然伸展；2级：植株基本挺直，最下层叶片发软下垂，中上层叶片均自然伸展；3级：植株顶端稍有萎蔫弯曲，中下层叶片出现下垂；4级：植株顶端萎蔫弯曲，所有叶片均出现不同程度的下垂；5级：植株萎蔫严重，所有叶片皱缩明显。
数据处理与分析：采用隶属函数法求出各品种的平均隶属函数值Xi作为最终各品种的耐涝性鉴定数据，由于萎蔫指数和死叶率与耐涝性成负相关，隶属函数值Xi计算公式为：Xi＝1-(X-Xmin)÷(Xmax-Xmin)。公式中的X为某个品种某个指标的测定值；Xmin和Xmax为所有品种该指标的最小值和最大值；每个品种的最终隶属函数值为各个品种所有指标的隶属函数值的平均值，平均隶属函数值越大，其耐涝性越强。
利用Microsoft Excel 2013软件对两年耐涝性鉴定数据分别进行基本描述性统计分析(表2)，可以看出，两年所有品种的耐涝隶属函数值平均值分别为0.58和0.60，变异系数分别为36.21％和36.67％，峰度和偏度的绝对值均小于1，说明该群体耐涝表型基本符合正分布(如图5为耐涝表型图)。
表2 100个菊花品种耐涝性隶属函数值的统计分析
(二)菊花品种群体结构和亲缘关系分析：
1)分子标记数据的获得
本发明所采用的分子数据“0-1矩阵”为现有技术已公开的数据。采用筛选出的条带清晰、多态性高、重复性好38对SRAP引物、7个SCOT引物和31对SSR引物(表3、表4和表5)对100个菊花品种进行了全基因组分子扫描获得753条多态性条带，去除多态性比率小于5％和丢失数据大于20％的46个条带，剩下的707个多态性条带用于后续分析。另外，标记条带的命名方法为“引物名-数字编号”，数字编号指该条带从电泳图谱上按分子量从大到小顺序依次数下来的编号，如“E11M23-4”表示SRAP标记E11M23引物对得到的电泳图谱上统计的第4条条带，“p1-2”表示SCoT标记1号引物得到的第3条条带，“EST-SSR34-5”表示EST-SSR标记34号引物得到的第5条条带。
表3 38对SRAP引物组合名称和序列
表4 7个SCoT引物名称和序列
表5 31对EST-SSR引物组合名称和序列
2)群体结构和主成分分析
运用STRUCTURE软件中的Bayesian方法对菊花品种群体进行基于数学模型的类群划分，先假设群体数目(K)为1-15，将MCMC(Markov Chain Monte Carlo)开始时的不作数迭代(length of burn-in period)设为10000次，并假定位点都是独立的，每个K值独立运算5次，然后根据似然函数值最大的原则和ΔK值来确定合适的K值并绘制散点曲线图。结果显示对数似然函数值L(K)随着设定的K值的增大而持续增大，无法确定出可靠的K值(图1A)；而ΔK在K＝2的时候最大(图1B)，当K继续增大时ΔK迅速减小，散点曲线陡直，因此判断出K值应取2，即100个菊花品种可以被分成2个主要的亚群，群体结构图如图2所示。亚群1(Pop1)包含63个品种，其中57个品种的Q值大于0.60，即品种的基因组变异源于这个亚群的概率大于60％，其余6个Q值小于0.60的品种被划至混合群；亚群2(Pop2)包含37个品种，其中Q值大于0.60的有31个品种，另外6个品种的Q值小于0.60，也被划至混合群。生成的Q-矩阵用于后续关联分析。
运用TASSEL软件，对1)中获得的分子数据进行主成分分析，发现前7个主成分累积解释率达到25.38％，所以选取前7个主成分构建PC-矩阵并用于后续关联分析。
应用SPAGeDi软件，对1)中获得的分子数据进行品种间的亲缘关系分析，得到亲缘关系系数矩阵(K-矩阵)，矩阵中每个数值的范围是0-1，取值越小表示这两个品种之间的亲缘关系越远，反之则表示品种间的亲缘关系越近。得到的成对品种间亲缘关系系数的频数分布如图3。结果显示供试菊花品种间的亲缘关系系数在0-0.588范围内，平均值为0.034。其中53.09％的品种间亲缘关系系数为0，74.57％的品种间亲缘关系系数小于0.05，而只有1.19％的品种间亲缘关系系数大于等于0.25，说明供试菊花群体品种间的亲缘关系很弱，适合进行关联分析，得到的K-矩阵将用于后续关联分析。
(三)关联分析模型的选择：
根据考虑或者不考虑群体结构和亲缘关系对于关联分析结果的影响，本发明采用三种一般线性模型(GLM、GLM+Q和GLM+PC)和三种混合线性模型(MLM、MLM+Q和MLM+PC)进行最优模型的选择。在TASSEL软件中采用六个模型对两次表型数据分别进行Q-Q图绘制(图4)。可以看出MLM+PC模型中观察–log P值与期望–log P值拟合度最好，说明PC7和亲缘关系能够很好的控制1类和2类错误。因此选用MLM+PC7模型为最佳模型并用于后续关联分析。
(四)与菊花耐涝性紧密关联的分子标记的确定：
应用(三)中所选的最优模型MLM+PC7进行耐涝性与分子标记的关联分析，即将步骤(二)主成分分析中所得到的各个品种的PC7-矩阵和亲缘关系分析中得K-矩阵都作为协变量计入模型。若P<0.01则认为标记位点与性状有显著关联，在两年耐涝性鉴定数据的关联分析中都检测到的分子标记位点即可确定为与菊花耐涝性紧密关联的分子标记，同时得出该标记位点的表型变异解释率(R2)。结果显示(表6)，共检测到4个与菊花耐涝性紧密关联的分子标记，两次试验中显著性最大的都是E2M16-2，且该标记位点在两次试验中的表型变异解释率也最高。关联位点的表型变异解释率范围是6.94％-14.90％，平均为10.42％。本发明获得的这4个与菊花耐涝性显著关联的分子标记位点将为今后分子标记辅助育种(MAS)技术在耐涝性菊花品种选育中的应用奠定重要基础。
表6与菊花耐涝性显著相关的标记位点(P<0.01)
注：R2为该位点的表型变异解释率；加黑标记为两次试验均检测到的标记位点
(五)优异等位变异挖掘及亲本选拔
对(四)中所确定的4个与菊花耐涝性紧密关联的分子标记进行表型效应值计算，公式为：ai＝∑Xij/nt-∑Nk/nk，其中ai代表第i个等位变异的表型效应值，Xij为携带第i个等位变异的第j材料性状表型测定值，ni为具有第i等位变异的材料数。Nk为携带无效等位变异的第k个材料的表型测定值，nk为具有无效等位变异的材料数。由于某品种的耐涝隶属函数值越大说明其耐涝性越强，所以认为具有显著增效等位变异的位点为优异等位变异，由表7可知E2M16-2和E19M16-1这两个显著关联位点在两次耐涝性鉴定试验中均增效等位变异。进一步分析发现携带这两个位点的代表品种有‘南农雪峰’、‘小丽’、‘Qx102’、‘金莲’、‘精云’和‘希望之光’，这些材料可以作为培育耐涝性强的菊花新品种的亲本选择。
表7显著关联位点效应值
注：粗体代表该标记位点具有增效等位变
可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种鉴定与菊花耐涝性显著相关分子标记的方法，其特征在于包括以下步骤：
a、耐涝性鉴定：选取多份不同来源且无直接亲缘关系的菊花品种，分别连续两年进行耐涝性鉴定，试验采用完全随机区组设计，设处理和对照，处理组10-12叶龄苗时进行涝处理，对照组植株正常管理；淹水3d后记录萎蔫指数，8d后根据淹水后叶色，叶形，茎色及茎形进行打分并统计死叶率；萎蔫指数分级标准为：1级：植株挺直，叶片自然伸展；2级：植株基本挺直，最下层叶片发软下垂，中上层叶片均自然伸展；3级：植株顶端稍有萎蔫弯曲，中下层叶片出现下垂；4级：植株顶端萎蔫弯曲，所有叶片均出现不同程度的下垂；5级：植株萎蔫严重，所有叶片皱缩明显；
采用隶属函数法求出每个指标的隶属函数值，计算公式为：
若该指标数据与耐涝性是正相关关系，则Xi＝(X-Xmin)÷(Xmax-Xmin)；
若该指标数据与耐涝性是负相关关系，则Xi＝1-(X-Xmin)÷(Xmax-Xmin)；
其中，X为某个品种某个指标的测定值，Xmin和Xmax为所有品种该指标的最小值和最大值；用各个品种所有指标的隶属函数值的平均值大小来评价该品种的耐涝性，平均隶属函数值越大，其耐涝性越强；
b、菊花品种群体结构和亲缘关系分析：
1)利用分子标记数据采用STRUCTURE软件对菊花品种群体进行类群划分，计算各个品种的Q值即某个品种的基因组变异源于某个群体的概率得到Q-矩阵，并绘制出群体结构图；
2)采用TASSEL软件对该群体进行主成分分析，将累积解释率达到25％的前几个主成分构建PC-矩阵并用于后续关联分析；
3)根据三种标记SRAP位点、SCoT位点及EST-SSR位点的整合数据采用SPAGeDi软件分析品种间的亲缘关系，得到亲缘关系系数K-矩阵；
c、关联模型的比较和选择：将步骤b中所得到的Q-矩阵、PC-矩阵及K-矩阵作为/不作为协变量构建了6种关联分析模型：3种一般线性模型包括GLM，GLM+Q和GLM+PC及3种混合线性模型包括MLM，MLM+Q和MLM+PC；结合分子和表型数据在TASSEL中绘制Q-Q图并根据观察–logP值与期望–log P值的偏离程度大小选择最优模型，其中偏离程度越小，模型越能控制Ⅰ类错误和Ⅱ类错误；
d、与菊花耐涝性紧密关联的分子标记的确定：根据步骤c中选择的最优模型应用TASSLE软件对两年重复试验得到的表型数据结合分子标记数据分别进行关联分析；以两年数据的关联分析都能检测到的显著标记位点P<0.01为与菊花耐涝性紧密关联的分子标记，同时得出该标记位点的表型变异解释率R2；
步骤b中运用STRUCTURE软件中的Bayesian方法对菊花品种群体进行基于数学模型的类群划分，先假设群体数目K为1-15，将MCMC开始时的不作数迭代设为10000次，并假定位点都是独立的，每个K值独立运算5次，然后根据似然函数值最大的原则和ΔK值来确定合适的K值并绘制散点曲线图，根据K值的取值确定多个菊花品种的类群划分，将100份菊花品种材料分为两个亚群，其中Pop1包括63份材料，Pop2包括37份材料，其中有12份材料由于其在某一亚群的概率小于0.6，划为混合群；
主成分分析发现前7个主成分累积解释率达到25.38％，故采用PC7-矩阵作为模型选择及关联分析的协变量；
亲缘关系分析发现该群体的亲缘关系系数在0-0.588之间，平均值为0.034，其中74.57％的亲缘关系系数小于0.05，而只有1.19％的亲缘关系系数大于0.25，说明该群体遗传多样性高且无明显的亲缘关系，适合进行关联分析。
2.根据权利要求1所述的鉴定与菊花耐涝性显著相关分子标记的方法，其特征在于：步骤a中选取100份不同来源且无直接亲缘关系的菊花品种，分别连续两年进行耐涝性鉴定，采用盆栽淹水法对供试材料进行高出土面3cm的涝处理，采用隶属函数法求出各品种的平均隶属函数值Xi作为最终各品种的耐涝性鉴定数据，由于萎蔫指数和死叶率与耐涝性成负相关，隶属函数值Xi计算公式为：Xi＝1-(X-Xmin)÷(Xmax-Xmin)。
3.根据权利要求1所述的鉴定与菊花耐涝性显著相关分子标记的方法，其特征在于：步骤c中在以PC7为协变量的混合线性模型MLM+PC7中，观察–log P值对期望–log P值的拟合度最好，因此以MLM+PC7作为最优模型用于后续耐涝性状关联分析。
4.权利要求1～3中任一所述方法获得的与菊花耐涝性显著相关分子标记，其特征在于：
与菊花耐涝性显著相关的分子标记包括：
(1)E2M16-2，正向引物M16-TGAGTCCAAACCGGAGG，反向引物E2-GACTGCGTACGAAT-TTGC；
(2)E11M23-1，正向引物M23-CACAGTCATGCCGGAAT，反向引物E11-GACTGCGTACGAATTTCG；
(3)E11M23-11，正向引物M23-CACAGTCATGCCGGAAT，反向引物E11-GACTGCGTACGAATT-TCG；
(4)E19M16-1，正向引物M16-TGAGTCCAAACCGGAGG，反向引物E19-TGTGGTCCGCAAATTTAG。
5.一种耐涝性菊花杂交育种中亲本的选择方法，其特征在于：对采用权利要求1所述方法鉴定出的与菊花耐涝性紧密关联的分子标记进行表型效应值的计算，公式为：
ai＝∑Xij/ni-∑Nk/nk
其中，ai代表第i个等位变异的表型效应值，Xij为携带第i个等位变异的第j材料性状表型测定值，ni为具有第i等位变异的材料数，Nk为携带无效等位变异的第k个材料的表型测定值，nk为具有无效等位变异的材料数；由于某品种的耐涝隶属函数值越大说明其耐涝性越强，所以认为具有显著增效等位变异的位点为优异等位变异位点，具有优异等位变异位点的代表品种能够作为培育具有强耐涝性菊花新品种的亲本选择。
6.根据权利要求5所述的耐涝性菊花杂交育种中亲本的选择方法，其特征在于：所述的优异等位变异位点为E2M16-2和E19M16-1。
7.权利要求1-3中任一项所述的鉴定与菊花耐涝性显著相关分子标记方法在耐涝性菊花育种中的应用。
8.权利要求5所述的耐涝性菊花杂交育种中亲本的选择方法在耐涝性菊花育种中的应用。
9.权利要求4所述的与菊花耐涝性显著相关分子标记在耐涝性菊花育种中的应用。
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