CN111024897A - 一种光核桃花的资源系统评价和筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于光核桃花技术领域，公开了一种西藏光核桃花的资源系统评价和筛选方法，对西藏野生光核桃花的特征进行观测筛选，筛选到花瓣数量稳定变异的材料7个；通过GPS导航进行野外精确定位西藏光核桃，以分子生物学手段的SRAP标记分析西藏光核桃花的遗传多样性；对光核桃的花进行资源系统评价和筛选；对光核桃花粉的扫描，纹饰从光滑到有孔之间出现了进化；将收集整理的西藏光核桃花的特异资源嫁接栽培于资源圃内。本发明对西藏光核桃花特异资源的筛选和评价及对系统在国内外文献及时限内未见相关报道，为西藏光核桃观赏桃花的新品种选育提供了方法。

Description

一种光核桃花的资源系统评价和筛选方法
技术领域
本发明属于光核桃花技术领域，尤其涉及一种光核桃花的资源系统评价和筛选方法。
背景技术
光核桃为蔷薇科植物。别名西藏桃(藏语康布)。落叶高大乔木。花期3-4月，果期9-10月。生于山坡杂木林中或山谷沟边。高4-10m。叶片披针形或卵状披针形。花单生或2朵并生，直径2-2.5cm，粉红色至白色。核果近球形，直径3-4cm；果核卵状椭圆形，扁而平滑。
光核桃(Prunus mira Koehne Amygdalus mira(Koehne)Kov.et Kost.)又名西藏桃，藏语为康布，属蔷薇科(Rosaceae)、李属(Prunus L.)、桃亚属(Amygdalus)，落叶乔木，树体高大，寿命可达千余年，是国内外罕见的桃种质资源的“活化石群，”根据光核桃及其它桃野生近缘种的分布，果核形态变化，确定是桃的原始种。光核桃适应性强、耐寒、耐瘠、抗病、长寿、结果力强；果实富含Vc、膳食纤维和多种矿物质，具有丰富的遗传多样性，挖掘利用潜力大。因此，加强对光核桃资源的搜集、保存与利用，对于扩大栽培桃的遗传多样性具有重要意义。光核桃主要分布于西藏境内，生长于海拔2500～3600m之间。在北纬31°10′-29°58′，东经91°50′-98°48′之间的20个县境内均有分布，其中尤以雅鲁藏布江下游及其支流尼洋河及帕隆藏布江流域最为集中，生于针阔叶混交林中或山坡、林组、田埂、路旁以及庭园栽培。但由于农田开垦，过度放牧，光核桃遗传多样性遭到破坏，自然居群的光核桃面积不断减小，因此加强对西藏光核桃的资源保护尤为重要。
目前有关光核桃的分析较少，仅在种苗培育技术、光合特性和果实加工等少数方面进行了分析，而有关光核桃遗传多样性的分析未见报道。物种的遗传多样性性既是维持其繁殖活力和适应环境变化的基础，也是其它一切多样性的基础和最重要的部分，而居群的遗传多样性水平在相当程度上制约其对环境的适应能力，从而可预测这个居群的发展趋势。
解决适应西藏的光核桃观赏桃花新品种选育的技术问题。综上所述，现有技术存在的问题是：现有技术中，没有采用野外调查、取样和室内分析相结合，利用分子标记技术、电子扫描技术解决西藏观赏桃花新品种选育的基础问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种光核桃花的资源系统评价和筛选方法，旨在解决适应西藏的光核桃观赏桃花新品种选育的基础问题。
本发明是这样实现的，每年3-4月光核桃花期通过对西藏野生光核桃花的花型、花瓣数量、花瓣颜色、花粉育性、花药颜色等进行评价和筛选，所述光核桃花的资源系统评价和筛选方法包括以下步骤：
步骤一，对西藏野生光核桃花的特征进行观测筛选，筛选到花瓣数量稳定变异的材料7个；
步骤二，通过GPS导航进行野外精确定位西藏光核桃，以分子生物学手段的SRAP标记分析西藏光核桃的遗传多样性；
步骤三，对光核桃的花进行资源系统评价和筛选；
步骤四，对光核桃花粉的扫描，纹饰从光滑到有孔之间出现了进化；
步骤五，将收集整理的西藏光核桃花的特异资源嫁接栽培于资源圃内。
光核桃的花型以蔷薇型为主，另有少量类似于梅花型。花瓣的瓣数和花轮数主要为单瓣，自然状态下有少量复瓣和半重瓣桃花。在没有人为选择和干扰下，西藏光核桃的色系以白色和粉白色为主，整体颜色较浅，红色为稀有颜色。萼筒内壁颜色为绿黄河和橙黄色。花药的颜色较深。
进一步，所述光核桃花粉的电镜观测的形状有椭圆形、长椭圆形、圆球形等；纹饰表现从光滑、条纹状到粗短；穿孔频率不同。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明更具体和系统描述从西藏野生光核桃资源中进行光核桃花的资源评价和筛选。西藏的桃花具独特的观赏魅力，桃花与蓝天、白云、雪山以及独特的藏文化具有其他桃花游无法比拟的景观优势，观赏桃花的选育可以为西藏旅游增添新的观赏点，提升西藏特色旅游产业的发展水平。
附图说明
图1是本发明实施例提供的光核桃花的资源系统评价和筛选方法流程图。
图2是本发明实施例提供的光核桃花的资源系统评价和筛选方法原理图。
图3是本发明实施例提供的SRAP引物组合(Me8+Em6)对2个居群扩增的谱带示意图。
图中：1-26：拉萨居群材料；27-30：日喀则居群材料；M：100bp NDAMarker。
图4是本发明实施例提供的70个光核桃材料的SRAP聚类图。
图中：阿拉伯数字为材料编号；1-26：拉萨市居群，27-30：日喀则地区居群，31-45：林芝地区居群(其中43-45为果核有沟材料)46-70：昌都地区居群。
图5是本发明实施例提供的变异材料的花粉电镜扫描结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明采用野外调查、取样和室内分析相结合，利用分子标记技术、电子扫描技术等原理；主要应用于西藏光核桃光赏桃花选育的应用基础分析领域，解决西藏观赏桃花新品种选育的基础问题。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例的光核桃花的资源系统评价和筛选方法包括以下步骤：
S101：光核桃筛选到花瓣数量稳定变异的材料7个。
S102：通过GPS导航进行野外精确定西藏光核桃，以分子生物学手段的SRAP标记分析西藏光核桃花的遗传多样性。
S103：对光核桃的花进行的资源系统评价和筛选。
S104：对光核桃花粉的扫描，光核桃花粉形状有椭圆形、长椭圆形、圆球形等，纹饰从光滑、条纹状到粗短、到穿孔频率不同的样品均有，纹饰从光滑到有孔之间出现了进化。
S105：将收集整理的西藏光核桃花的特异材料嫁接栽培于资源圃内保存以进行观赏桃花的新品种选育。
图2是本发明实施例提供的光核桃花的资源系统评价和筛选方法原理图。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述。
1、西藏光核桃的资源
2009-2017年，通过大量野外调查和取样，在花期对拉萨、日喀则、昌都、林芝地区以及阿里部分地区光核桃及其近缘种主要分布区域进行了野外资源收集、考察和取样，对光核桃的花从花色、花瓣、育性等表现优异的植株进行了定位和观测记录。
1)、西藏光核SRAP分子标记
利用SRAP标记对来自西藏境内的200个光核桃自然居群的遗传多样性和群体遗传结构进行了分析和评价。其中选用20对引物对4个居群的70份材料进行扩增，检测到338个多态位点。在居群水平上，多态位点百分率(PPB)为63.96％，Nei’s基因多样性(H)和Shannon信息指数(I)分别为0.1943和0.2955。在物种水平上，多态位点百分率(PPB)为89.89％，Nei’s基因多样性(H)和Shannon信息指数(I)分别为0.2460和0.3839。居群间的遗传分化系数(Gst)为0.1709，居群间的基因流(Nm)为1.2130。结果表明：光核桃遗传多样性水平较高，居群间遗传分化较小，居群间的基因交流程度较高。
2)、光核桃花的多样性
结果表明，光核桃花型有蔷薇型和铃型；花瓣类型有单瓣、重瓣以及复瓣；花瓣颜色有白、粉红、粉白；雌雄蕊高度比分为低、中、高；花粉育性有不稔和可育；萼筒内壁颜色为绿黄、橙黄；花药颜色分为白、黄、浅褐、橘红。筛选到花瓣数量稳定变异的材料7个。
3)、光核桃花粉的多样性
对光核桃资源中以花瓣数量、颜色、育性等出现变异的材料进行了花粉取样，52份花粉扫描电镜的初步分析结果表明，西藏光核桃花粉形状有椭圆形、长椭圆形、圆球形等，纹饰从光滑、条纹状到粗短、到穿孔频率不同的样品均有，纹饰从光滑到有孔之间出现了进化，纹孔密度从0-0.68个/μ㎡。具体结果将为光核桃的起源和进化提供孢粉学证据。但详细的数据还在分析中。不同于以前的文献报道，和前期认为光核桃花粉粒的形态为长圆球形，花粉外壁呈简单的平行直纹纹饰，没有穿孔现象，光核桃属于桃中最原始类型，但大量的不同表现性状的光核桃花粉扫描结果可能表明西藏光核桃也在进化。
西藏光核桃的遗传多样性、生态多样性和景观多样性极其丰富，将为西藏观赏桃的新品种选育提供基础，而景观多样性将为西藏桃花旅游的开发提供材料。
下面结合具体效果对本发明作进一步描述。
西藏光核桃的资源：80-90年代，西藏农科院、西藏农牧学院和中国农科院郑州果树所等对西藏光核桃种质资源进行过调查，但由于当时的体制和条件限制，原调查的优株现已无法找到，而且还不够深入，对资源的评价、筛选和利用多数集中于表观的描述、生态学以及果汁加工等领域。本发明在西藏光核桃主要产地林芝、山南、昌都、拉萨等地利用GPS进行定位对光核桃种质资源进行了调查和取样，对花粉方面的基础不同于以前的文献报道。和前期均认为光核桃花粉粒的形态为长圆球形，花粉外壁呈简单的平行直纹纹饰，没有穿孔现象，光核桃属于桃中最原始类型，而对不同表现性状的光核桃花粉扫描结果发现西藏光核桃花粉形状有椭圆形、长椭圆形、圆球形等，纹饰从光滑、条纹状到粗短、到穿孔频率不同的样品均有，纹饰从光滑到有孔之间出现了进化，可能表明西藏光核桃也在进化。筛选到花瓣数量稳定变异的材料7个。此方法在光核桃资源上属于首次应用。在业内首次应用SRAP分子标记西藏光核桃的遗传多样性。因此对西藏野生光核桃资源的评价筛选较以往的调查更准确、深入，对光核桃资源园艺性状和育种的针对性更强。
本发明利用SRAP光核桃花的遗传多样性，对西藏光核桃果实特异资源的筛选和评价及对花瓣变异材料的系统在所查国内外文献及时限内未见相关报道。
本发明通过多年基础分析和初步应用，已经逐步应用于育种实践，但还未有直接的经济效益。本发明技术推广应用后，可有效增加光核桃特异资源和适宜西藏栽培的桃的数量，具有十分重要的生态和社会效益。光核桃树体高大，根系深广，枝叶繁茂，对涵养水源、保持水土、防风固土、调节气候，降尘减噪、吸收CO2、净化空气、优化环境有着独特的生态功能。同时，有利于充分发挥光、热、水、土等自然资源和劳动力等社会资源优势，变资源优势为产品优势和经济优势，开辟农牧业生产的新领域，加速农牧业经济结构战略性调整，促进农牧民观念和生产方式的转变。
西藏的桃花具独特的观赏魅力，桃花与蓝天、白云、雪山以及独特的藏文化具有其他桃花游无法比拟的景观优势，可以为西藏旅游增添新的观赏点，提升西藏特色旅游产业的发展水平。
对西藏光核桃花进行的资源评价和筛选，初步得到的7个优异单株将为观赏桃的新品种选育打下材料基础。SRAP分子标记光核桃的遗传多样性将为桃的演化、优异材料鉴定和进一步的分子辅助育种提供理论和技术支持。
下面结合具体实验对本发明作进一步描述。
本发明利用SRAP标记对来自西藏境内的4个光核桃(Prunus mira Koehne)自然居群的遗传多样性和群体遗传结构进行了分析和评价。选用20对引物对4个居群的70份材料进行扩增，检测到338个多态位点。在居群水平上，多态位点百分率(PPB)为63.96％，Nei’s基因多样性(H)和Shannon信息指数(I)分别为0.1943和0.2955。在物种水平上，多态位点百分率(PPB)为89.89％，Nei’s基因多样性(H)和Shannon信息指数(I)分别为0.2460和0.3839。居群间的遗传分化系数(Gst)为0.1709，居群间的基因流(Nm)为1.2130。UPGMA聚类图中，70个个体未按4个居群各自聚在一起。结果表明：光核桃遗传多样性水平较高，居群间遗传分化较小，居群间的基因交流程度较高。本发明利用相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism，SRAP)分子标记技术对西藏境内的4个光核桃自然居群的遗传多样性进行分析，从分子水平阐明其遗传多样性水平和遗传结构，为有效保护和合理利用西藏光核桃遗传资源提供科学依据。具体如下：
1材料与方法
1.1材料
供试材料光核桃采自西藏自治区的拉萨市、日喀则地区、林芝地区和昌都地区4个自然居群。于2009年5-6月选取健康植株上的无病叶片，每个样品尽可能按体现生态和形态上的多样性原则采集，单株为1个样品，共70份(样品来源地见表1)，硅胶干燥，密封保存备用。
表1光核桃各居群的采样信息
Figure BDA0002334871160000071
1.2方法
光核桃总DNA提取采用改良CTAB法[11]进行，所提取的基因组DNA用1％琼脂糖凝胶电泳检测质量，用Eppendorf公司生产的Bio-Photometer核酸检测仪检测DNA浓度与纯度，并将其稀释为10ng/μL，在-20℃冰柜中保存备用。
表2 SRAP引物序列
Figure BDA0002334871160000081
SRAP-PCR反应体系为：总体积为25μL，包括2.5μL l0×buffer，0.35mmo l/LdNTPs，1.5mmol/L Mg2+，0.4μmol/L引物，20ng模板DNA和2.5U Taq DNA聚合酶和无菌水(试剂均购于天根生化科技有限公司)。在BIO-R AD Gene Cycler PCR仪上进行扩增，反应程序参考Li等[10]的方法进行，并对延伸时间略做修改：即SRAP采用94℃预变性5min；94℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸90s，5个循环；94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸8min，4℃保持。PCR产物用6％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，染色采用Promega银染法。引物采用Li等发表的引物及在此基础上通过改变引物3'端3个选择性碱基合成13条正向引物，13条反向引物，由上海英骏生物技术有限公司合成(表2)。
1.3数据分析
将SRAP电泳图谱上清晰且可重复出现的条带记为“1，”同一位置没有出现的带记为“0，”从而形成原始数据阵。用PopGen Version 1.31软件计算观察等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、多态位点百分率(PPB)、Nei's基因多样性指数(H)、Shannon'sInformation index(I)、Nei's遗传一致度(Nei's genetic identi ty)及遗传距离(Genetic distance，GD)、群体总基因多样性(Ht)、群体内基因多样性(Hs)、群体间的遗传分化系数(Gst)以及基因流Nm(Nm＝(1-Gst)/4Gst)。对光核桃全部材料进行聚类分析，采用NTSYS-pc2.1软件生成聚类图。
2结果与分析
2.1 SRAP扩增的多态性
试验选用20对引物组合对70份光核桃材料进行SRAP扩增，共得到376条清晰可辨的条带，其中多态性条带338条，多态性条带比高达89.89％，扩增的DNA片段大小集中在100～1 500bp之间(表3；图1)。其中，单对引物扩展条带数变幅为13条(Me10+Em8，Me13+Em5)到33条(Me9+Em10)之间，平均每对引物扩增条带数为18.80，多态性条带数16.90，Me6+Em1多态性高达100％。试验结果表明SRAP多态性较高，能检测出较多的遗传位点。
表3 70份供试材料SRAP扩增的多态性
Figure BDA0002334871160000091
2.2遗传多样性与群体遗传变异
对光核桃4个居群共70份材料的群体遗传分析表明，光核桃的遗传多样性水平较高。在所有检测到的清晰而可重复的376个有效位点当中，多态性位点有338个。在物种水平上，多态位点百分率(PPB)是89.89％，Nei’s基因多样性(H)和Shannon信息指数(I)分别为0.2460(±0.1711)和0.3839(±0.2275)。在居群水平上，多态位点百分率(PPB)为63.96％，Nei’s基因多样性(H)和Shannon信息指数(I)分别为0.1943(±0.1902)和0.2955(±0.2687)。从各个居群来看，以日喀则地区居群(RKZ，PPB＝32.18％)遗传多样性最低，昌都地区居群(CD，PPB＝84.57％)遗传多样性最高(表4)。
自然居群内基因多样性(Hs)为0.1943，群体总基因多样性(Ht)为0.1943，居群间的遗传分化系数(Gst)为0.1709，说明在物种水平上，有17.09％的遗传变异存在于居群间，而82.91％的遗传变异存在于居群内，居群内表现出较高水平的遗传分化。居群间的基因流(Nm)为1.2130，大于1，表明居群间的基因交流程度较高。如图3SRAP引物组合(Me8+Em6)对2个居群扩增的谱带示意图。图中：1-26：拉萨居群材料,27-30：日喀则居群材料；M：100bpNDA Marker。
2.3遗传一致度和遗传距离分析
表4光核桃自然居群内的遗传多样性
Figure BDA0002334871160000101
表中数据为平均值±标准差。
用PopGen Version 1.31软件计算各居群间遗传一致度及遗传距离(表5)。从表5中可以看出，其遗传一致度(I)的变化范围为0.9045～0.9785，遗传距离(D)的变化范围为0.0217～0.1003。林芝地区光核桃(LZ)与昌都地区光核桃(CD)的遗传一致度最高，为0.9785，遗传距离最小，表明这两个居群材料间亲缘关系最近。拉萨市光核桃(LS)与日喀则地区光核桃(RKZ)的遗传一致度最低，为0.9045，遗传距离最大，表明这两个居群材料间亲缘关系最远。
表5光核桃4个居群Nei’s遗传一致度(I)(矩阵上三角)和遗传距离(D)(矩阵下三角)。
Figure BDA0002334871160000111
2.4聚类分析
根据SRAP谱带数据对70份光核桃材料进行聚类，聚类结果如图2。聚类结果显示，以相似系数0.77为截值，供试材料分为4个类群。第1类包括24份拉萨居群的材料，1份林芝地区(34号)以及1份昌都地区(63号)的材料，其中来自昌都地区的材料(63号)与这组的其他材料的遗传距离较远。第2类包括的材料最多，共有40份，其中来自拉萨市的2份(24和25号)、日喀则的4份、林芝地区的11份以及昌都地区的23份材料。对第2类进行细分，又可以分为5小类：第1小类仅包括1份拉萨市居群的材料(24号)；第2小类包括1份拉萨市居群的材料(25号)、9份林芝地区的材料(编号31、32、33·41)和12份昌都地区的材料；日喀则地区的2份材料(编号29和30)单独聚为第3小类；第4小类包括了2份日喀则地区的(编号27和28)、2份林芝地区(编号40和42)以及6份昌都地区的材料；第5小类仅包括5份昌都地区的材料。林芝地区光核桃(LZ)与昌都地区光核桃(CD)的遗传一致度最高，昌都地区与林芝地区的材料大部分聚在一起，与居群的遗传一致度相符。第3类是来自林芝地区的3份材料(编号43、44和45)，这3份材料与另外67份材料的最大区别在于，果核有沟，因此单独聚为一类是符合果核形态差异特性的。第4类是来自昌都地区的一份材料(编号47)，这个材料与其余69份材料的相似系数都是最小的。这个材料是在采样中出现的一个变异类型，其树体结构与其余光核桃树体差异较大，但因为没有做其他鉴定，因此还不能断定是否为光核桃的变种。
总体来说，这70份光核桃材料未按居群划分聚在一起，其中第1类包括了林芝及昌都地区的材料，第2类包括了4个居群的材料，这应与基因漂移有关(基因流Nm＝1.2130)，并且这个居群是以行政区划而定，而行政区划中可能有地理、自然地貌上的局限，因此自然居群没有明显的地理分化，如图4中表示70个光核桃材料的SRAP聚类。中阿拉伯数字为材料编号,1-26：拉萨市居群，27-30：日喀则地区居群，31-45：林芝地区居群(其中43-45为果核有沟材料)46-70：昌都地区居群。
3结论
3.1光核桃的遗传多样性与遗传结构
普遍认为稀有的或是分布区狭窄的物种遗传多样性水平偏低。然而近年来分析发现一些特有和濒危物种仍然保持着高水平的遗传变异。本发明通过对西藏光核桃4个自然居群的SRAP分析得到多态位点百分率(PPB)为89.89％(表4)，表明光核桃虽然为中国特有种，分布区仅在2500-3600m的西藏，川西南以及云南的高原上，但是其多态位点百分率较高，遗传多样性高。
本发明结果表明，西藏光核桃居群内遗传变异(82.91％)大于居群间遗传变异(17.09％)，该结果与Hamrick等[17]的结论一致。Hamrick等曾对涉及165个属、449个种的不同类型植物的遗传变异水平和居群分化程度进行统计，结果发现，异交风媒植物只有9.9％的遗传变异存在于居群间，绝大部分(90.1％)存在于居群之内。这种遗传多样性的分布是由光核桃属于异花、虫媒或风媒传粉得外繁育系统所决定的。对于异花传粉的外繁育系统(或称开放式繁育系统)的居群来说，其大量的变异性被保存在杂合子状态下的隐性基因里，这种变异性可通过居群内的遗传重组被释放出来，因而造成了居群内个体间丰富的遗传多样性。同时，也正是由于这种开放式的繁育系统又使得居群间保持着强大的基因流(Nm＝1.2130)，从而使得大多数高频率的等位基因都出现在每个居群之内，造成了居群间的相似性大于差异性。本分析中4个光核桃居群的采样地相对比较接近，所以居群内变异高于居群间的结论可能是由于供试居群采集地接近于该物种在当地的中心居群或建立者(Founding)居群。
3.2光核桃自然居群遗传多样性的意义
许多学者根据光核桃及其他桃野生近缘种的分布，果核形态变化，确定其是桃的原始种。过国南等通过花粉粒电镜扫描，发现光核桃花粉粒的形态呈椭圆形，其外壁纹饰呈简单的直纹平行型、无穿孔，是最原始的桃亚属植物野生种，未发现与栽培种有直接关系；宗学普等通过对花粉蛋白SDS电泳分析，也认为光核桃的原始性最强。分子标记分析上，得到的结果不尽相同，SSR分子鉴定得出光核桃是原始种，PAPD技术分析揭示的桃亲缘演化顺序是内蒙古长柄扁桃比光核桃原始性更强，而AFLP鉴定结果表明光核桃和普通桃亲缘关系较近，而山桃和甘肃桃原始性较强。在这些分子标记分析中，光核桃材料仅1份，并不能代表其准确信息。因为光核桃具有丰富的遗传多样性，在本发明中光核桃自然居群具有丰富的遗传多样性(Na＝1.6396，Ne＝1.3272，H＝0.1943，I＝0.2955，PPB＝63.96％)，而在物种水平上具有更高的遗传多样性(Na＝1.9601，Ne＝1.4012，H＝0.2460，I＝0.3839，PPB＝89.89％)，光核桃自然居群遗传多样性的分析结果为光核桃是否为桃原始种的进一步分析提供良好依据。
3.3保护生物学意义
对遗传变异分布和水平的分析是建立和实施有效而经济的物种保护措施的前提条件。在人类活动的干扰下，西藏高原的光核桃居群的生境片断化日益加剧并由此引发群体数量的逐步降低。在该地区对光核桃最简单有效的保护方式是就地保护，即停止滥伐树木和过度放牧，保护适宜光核桃生存的生境。而实施异地保护方式时，不宜笼统地认为在各个居群采样点均取少量样本，而应从具有较高水平遗传多样性的居群点(昌都地区和拉萨市)大规模取样，以最小的努力获得遗传多样性保存的最大效果。
下面结合电镜扫描对本发明作进一步描述。
本发明通过电镜扫描观测了5个西藏野生光核桃的花粉形态，其中4个花瓣变异材料的花粉具有明显的形态多样性，所有材料的花粉纹饰都具有原始性。对花的特征、花粉育性、授粉方式、颜色等也进行了初步观测，研究结果表明西藏光核桃有近1/4的雄性不育，花瓣、花药、花粉的颜色能与高原的环境高度适应，但花粉、育性、和花瓣变异之间的相关性还不清楚。本研究初步发现花瓣数量发生变异的复瓣、重瓣优异材料7个。
1材料与方法
1.1材料
供试材料为西藏野生光核桃，地点包括西藏自治区拉萨市、林芝地区、昌都地区。于2010年3-4月花期采用随机调查、取样和拍照，用GPS记录相关轨迹、经纬、海拔高度地理定位的指标等。
1.2方法
1.2.1花粉采集和处理
由于才野外调查中发现了7也花瓣数量明显的变异的材料，收集了其中的饿4个花粉进行了扫描观测。参考等2009的方法：从野外即将开放的花蕾上取下花药，收集干燥散开的花粉，玻璃瓶密封，贮于硅胶中，4℃保存。常规扫描电镜制样，喷金镀膜后，在AMRAY-1000B扫描电镜下观察。观察时选取有代表性的视野，分别在500×、1800×、×2000、5000×下观察群体、个体形态、极面观和局部的纹饰，并显微照相。随机选取20-25粒花粉分别测量其花粉极轴大小、花粉赤轴大小、萌发沟长、萌发沟宽、脊宽和条洼宽，计算其平均值。同时统计100粒花粉，调查花粉的畸形率。
1.2.2花的形态特征
参考王力荣等的方法对桃花的形态特征进行描述和评价。
1.2.2.1花型
盛花期采集花药刚刚开裂的花10朵为样本，与花型模式图进行比对。结合对比参照品种。分别记为铃型、蔷薇型和菊花型。
1.2.2.2花瓣类型
以花型采集的材料为样本，采用目测的方法，观察花瓣的瓣数和花轮数，不足两轮者为单瓣，对比模式图，结合对比参照品种。分为单瓣、复瓣和重瓣。
1.2.2.3花瓣颜色
以花型采集的材料为样本，采用目测的方法，与标准色卡的颜色进行比对。或对比参照品种。分为白、粉红、红、杂色。上述没有列出的其他花瓣颜色，需要另外给予详细的描述和说明。
1.2.2.4雌雄蕊高度比
以花型采集的材料为样本，采用目测的方法，观察雌蕊和雄蕊的高度。分为低(雌蕊高度低于雄蕊高度)、等(雌蕊高度等于雄蕊高度)和高(雌蕊高度高于雄蕊高度)。
1.2.2.5花粉育性
以花型采集的材料为样本，将手指在花朵的雄蕊上捻一不，如果手指上附有花粉即为花粉可育，反之即为不稔。如有必要可进行花粉发芽实验，测定花粉的发芽率，对比参照品种。分为不稔和可育。
1.2.2.6萼筒内壁颜色
以花型采集的材料为样本，剥开萼筒观察颜色，与标准比色卡比对，结合对比参照品种。分为绿黄、橙黄。
1.2.2.7花药颜色
取花朵刚刚开放，花药尚未开裂的花10朵，采用目测的方法，观察花药的颜色，与标准比色卡比对，结合对比参照品种。分为白、黄、浅褐和橘红。上述没有列出的其他花药颜色，需要另外给予详细的描述和说明。
2结果
2.1花粉形态的多样性
从表1的统计数据可见，4号花粉的极轴大小、花粉赤轴大小、萌发沟长、萌发沟宽、脊宽和条洼宽均显著小于其余3个变异材料。如图5 1号变异材料的花粉电镜扫描结果所示。从电镜扫描结果图5(a)-图(e)可见，可以看出，5个不同材料的光核桃花粉粒的形态为长圆球形，花粉外壁呈简单的平行直纹纹饰，没有穿孔现象；各试验材料均有不同数量的花粉形态畸形。花粉的纹饰犹以4号材料比较短而曲。但各材料之间也有明显的差异，1号花粉整体长圆，极面观圆形，花粉畸形率为(21/105)20％，花粉整体较好。2号，花粉整体长圆，极面观圆形，花粉畸形率为(22/117)11.8％，花粉整体较好。3号，花粉整体长圆，极面观圆形，花粉畸形率为(19/102)18.7％，花粉整体较好，均匀。4号，花粉整体长圆，极面观圆形，花粉畸形率为(51/127)40.2％，花粉形状特殊，花粉质量较差。以上5个材料的花粉均可育。造成本次研究中光核桃不同材料花粉形态多态性的可能原因我们还不清楚，但从表现出花瓣数量的变异情况来看，可能说明几个材料处在不同的进化阶段，而地处高原环境，UV-B尤其能影响植物个体花瓣的进化历程，环境和营养条件是否也影响到以上4个变异材料的形态特征，需要做进一步的形态学、孢粉学和分子生物学上的研究。而探讨光核桃在花瓣数量上进化或者变异的机制将为观赏桃的育种和进化提供参考和依据。图5中，1#为107号，晚熟，重瓣；2#为175号，重瓣；3#为176号，重瓣；4#为177号，半重瓣。
2.2花的形态特征
2.2.1花型
随机观察记载了35个不同光核桃的花型(见附图)。其中铃型4个，占11.42％，蔷薇型31个，占80.58％。表明光核桃的花以蔷薇型为主。另外有少量材料的花型类似于梅花型。
2.2.2花瓣类型
通过目测观察了花瓣的瓣数和花轮数，样本共记载了222个，其中分为单瓣215个，约为96.85％；复瓣和重瓣7个,约为3.15％。本次野外调查表明光核桃在自然状态下有少量复瓣和重瓣的变异。
2.2.3花瓣颜色
野外共随机调查记载了57个样本，分别为白45.61％(26)、粉红43.86％(25)、红1.75％(1)、杂色8.78％(3)。说明在没有人为选择和干扰下，西藏光核桃的色系以白色和粉红为主，整体颜色较浅，红色为稀有颜色。
2.2.4雌雄蕊高度比
雌雄蕊高度说明材料传粉和授粉的不同类型，共随机观测记载了79个样本，低31.65％(25)、等10.13％(8)和高58.22％(46)。本研究可能表明在青藏高原，一半以上的光核桃可以通过风来远距离进行花粉传播，而约1/3的光核桃可以通过昆虫为媒介进行传粉，另有10％是介于2者之间。可能与高原上早春风大，传粉昆虫总体数量不多有关。
2.2.5花粉育性
本次观测共记载了223个样本，不稔为19.73％(44)和可育为80.27％(179)。表明约有1/4的光核桃自身没有花粉或花粉很少。另外在野外还发现了一株雌性不育即雌蕊不发育的材料。
2.2.6萼筒内壁颜色
共观测记载了59个样本，绿黄55.93％(33)、橙黄40.07％(26)。在栽培桃中，萼筒内壁颜色一般与果肉颜色有一定的相关性，前者果肉颜色较浅，后者较深。据此可以推断野生光核桃一半以上果肉为白色，对果实果肉颜色的分析表明光核桃的果肉颜色以白色和黄色为主，绿色和红色极少，(见果实果肉分析部分：67.4％、3.4％、25.8％和3.4％)。但由于野外材料一方面不好控制，另一方面也没有进行定点的记载和观察，现在还没有直接证据证明光核桃果实是否也有类似的相关性。
2.2.7花药颜色
采用目测的方法观察了65个样本花药的颜色，白27.69％(18)、黄55.38％(36)和橘红16.93％(11)，说明西藏光核桃花药约80％颜色较深。花药白色的多数属于没有花粉或者雄性不育的材料，此比例和观察到的花粉育性比较接近。
3结论
3.1花粉
花粉是植物较为保守的器官之一，光核桃花粉的形态简单，花粉的外壁纹饰为简单的平行状条纹，又一次证明光核桃的原始性。花粉的种内存在变异，花粉形态也存在不同居群的地理变异现象，可能与环境因素(如温度，降水，甚至紫外线辐射强度)造成的变异的有关。在长期适应环境的过程中，在内外各种因素的作用下也有了花粉形态样的多样性，特别是结合花瓣数量多少变异而采集的花粉形态更有了明显的多样性，但此不同在进化过程中的机制、阶段或者是否是形成新材料的前奏？是环境影响还是稳定的变异我们还不得而知，原因有于待进一步研究。
3.2花的特征
对于野生光核桃花的特征目前的结果还不能解释与之相关的现象。重瓣、花粉、育性之间的关系，值得进一步探索，重瓣似乎是更进化的类型，因为根据常识推测，自然界中具有复杂装饰性的花瓣似乎更有利于吸引昆虫授粉，颜色较深的花药是否对昆虫的活动具有相当的吸引力？有新西兰的学者花粉研究发现为什么是黄色的，他提出，黄色花粉对UV－b具有一定的防辐射作用，而UV－b是造成基因变异的主要因素，这可以解释在热带地区、高山地区具有生物多样性的原因。空间异质性较好的不同地理居群中，可能变异现象更明显，但紫外线辐射强度与样品采集地的相关性我们还没有涉及到。
野生植物一般育性会比较高，为何青藏高原的光核桃有如此大比例的雄性不育材料还不能理解。通常植物散发花粉是为保存后代的一种有效手段，但植物开花、散发花粉无疑会消耗大量能量或者营养，是否也是为了适应高原严酷的环境而节约能量我们还不得而知，结合雌雄蕊高度的变化，50％以上的光核桃雌蕊高于雄蕊，说明即使没有花粉也可以接受随风飘移而来的花粉达到可以结实产生种子的目的，而且由于不同植株之间的异花授粉也增加了光核桃后代的变异可能，因此，也表现出在自然群体中居群之间和居群内部遗传丰富的遗传多样性。可见，西藏野生的光核桃可能有一套适应不同环境的育性机制，也许因此才能在青藏高原不同的生态类型都能长期适应、生存。
中国农业科学院郑州果树研究所不仅收集保存20多份观赏价值极高的品种，而且培育出低需冷量、低需热量的观赏桃品种(以上资料来自郑州果树所“中国的圣诞树—桃”)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种光核桃花的资源系统评价和筛选方法，其特征在于，所述光核桃花的资源系统评价和筛选方法包括以下步骤：
步骤一，对西藏野生光核桃花的特征进行观测筛选，筛选到花瓣数量稳定变异的材料7个；
步骤二，通过GPS导航进行野外精确定位西藏光核桃，以分子生物学手段的SRAP标记分析西藏光核桃花的遗传多样性；
步骤三，对光核桃的花进行资源系统评价和筛选；
步骤四，对光核桃花粉的扫描，纹饰从光滑到有孔之间出现了进化；
步骤五，将收集整理的西藏光核桃花的特异资源嫁接栽培于资源圃内。
2.如权利要求1所述的光核桃花的资源系统评价和筛选方法，其特征在于，所述光核桃花粉形状有椭圆形、长椭圆形、圆球形等，纹饰从光滑、条纹状到粗短、到穿孔频率不同的样品发生了变化。
3.如权利要求1所述的光核桃花的资源系统评价和筛选方法，其特征在于，所述光核桃从花色到花瓣数量的变化。
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