CN106937597A

CN106937597A - 一种适用于高类黄酮苹果新品系的组培快繁法

Info

Publication number: CN106937597A
Application number: CN201710236032.5A
Authority: CN
Inventors: 陈学森; 张瑞洁; 毛志泉; 姜远茂; 王志刚; 王楠; 张宗营; 徐海峰; 姜生辉; 王意程
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2017-04-12
Filing date: 2017-04-12
Publication date: 2017-07-11
Anticipated expiration: 2037-04-12
Also published as: CN106937597B

Abstract

本发明公开了一种适用于高类黄酮苹果新品系的组培快繁法。本发明提供了一种苹果(Malus domestica)CSR6R6‑666的扩繁方法，包括如下步骤：(1)取苹果CSR6R6‑666的腋芽萌发的新梢，接种到增殖培养基上进行培养；(2)完成步骤(1)后，从基部切取不定稍，接种到生根培养基上进行培养；所述增殖培养基为含0.8mg/L 6‑BA、0.2mg/L NAA和30g/L蔗糖的MS固体培养基；所述生根培养基为含0.5mg/L IBA和20g/L蔗糖的MS固体培养基。本发明开发了适于苹果(Malus domestica)CSR6R6‑666的扩繁方法。苹果(Malus domestica)CSR6R6‑666对于功能性苹果育种具有重大的应用价值。因此，本发明对于功能性苹果育种具有重大的应用价值。

Description

一种适用于高类黄酮苹果新品系的组培快繁法

技术领域

本发明涉及一种适用于高类黄酮苹果新品系的组培快繁法。

背景技术

“医食同源”是发展方向，“吃营养，吃健康”已成为人们的共识。苹果果实含有较多的人体容易吸收的游离多酚或类黄酮，在抗氧化、预防心脑血管疾病及抗肿瘤等方面均具有较好的作用，“一天一苹果，医生远离我”，世界上相当多的国家都将苹果作为主要消费果品而大力推荐。苹果果实的红皮和红肉性状主要由花青苷发育而来，是类黄酮的主要组分。为此，进一步选育外观品质好、保健价值大的高类黄酮苹果新品种，对推动苹果产业发展、改进人类健康具有重要意义。

易着色、高类黄酮苹果育种是多个品质性状(基因)的有效集成与平衡，为完善新品种选育方案，提高育种效率，陈学森教授所在课题组采取了三项措施：一是在新疆红肉苹果与苹果品种杂种一代果实总酚含量等性状遗传变异研究的基础上，提出并实施了“三选两早一促”的苹果育种法(专利号ZL 2013 1 0205419.6)，育种效率显著提高；二是利用遗传背景复杂的‘嘎啦’、‘美国八号’、‘寒富’及‘富士’等苹果品种与新疆红肉苹果(M.sieversiif.niedzwetzkyana)进行多亲本杂交与反复回交，旨在进行品质育种，目前已构建回交一、二代分离群体40个，定植杂种实生苗4万株，并申报了“果树多种源品质育种法(专利申请号2015 10428448.8)”及“易着色苹果品种培育法(专利申请号201510890141.X)”2个育种技术发明专利；三是及时地以性状基本稳定的后代株系为试材，进行品质性状评价及发育机理的研究，并已取得了诸多重要进展。目前，已创建了常规杂交与生物技术有机结合的苹果高效育种技术体系，创制了一批新品种及优异种质，研发了苹果新品种配套高效栽培技术体系。授权和申报发明专利10余项，育成新品种(系)16个；发表相关研究论文120篇，其中SCI论文20余篇，这些研究成果总体处在国际同类研究的领先水平。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于高类黄酮苹果新品系的组培快繁法。

本发明提供了一种苹果(Malus domestica)CSR6R6-666的扩繁方法，包括如下步骤：

(1)取苹果CSR6R6-666的腋芽萌发的新梢，接种到增殖培养基上进行培养；

(2)完成步骤(1)后，从基部切取不定稍，接种到生根培养基上进行培养；

所述增殖培养基为如下(a1)、(a2)、(a3)或(a4)：

(a1)含6-BA和NAA的培养基；

(a2)含0.8mg/L 6-BA和0.2mg/L NAA的培养基；

(a3)含0.8mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA和30g/L蔗糖的培养基；

(a4)含0.8mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA和30g/L蔗糖的MS固体培养基；

所述生根培养基为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：

(b1)含IBA的培养基；

(b2)含0.5mg/L IBA的培养基；

(b3)含0.5mg/L IBA和20g/L蔗糖的培养基；

(b4)含0.5mg/L IBA和20g/L蔗糖的MS固体培养基。

所述步骤(1)中，培养至不定梢长度为1.5cm以上。

所述步骤(1)中，培养条件为：26℃、16小时光照/8小时黑暗、光照强度2000lux。

所述步骤(2)中，培养条件为：26℃、16小时光照/8小时黑暗、光照强度2000lux。

所述“腋芽萌发的新梢”的长度为2-3厘米。

所述“腋芽萌发的新梢”的制备方法如下：取具有腋芽的茎段，进行三次转接，以克服解决褐化现象。

所述“腋芽萌发的新梢”的制备方法如下：取具有腋芽的茎段，接种到培养基甲上培养2小时，然后转接到新的培养基甲上培养10小时，然后转接到新的培养基甲上培养24小时，然后转接到新的培养基甲上培养至腋芽萌发的新梢长度为2-3厘米；

所述培养基甲为如下(c1)、(c2)、(c3)或(c4)：

(c1)含6-BA和NAA的培养基；

(c2)含0.8mg/L 6-BA和0.15mg/L NAA的培养基；

(c3)含0.8mg/L 6-BA、0.15mg/L NAA、500mg/L PVP40000和30g/L蔗糖的培养基；

(c4)含0.8mg/L 6-BA、0.15mg/L NAA、500mg/L PVP40000和30g/L蔗糖的MS固体培养基。

腋芽萌发的新梢长度为2-3厘米时，从基部切取腋芽萌发的新梢接种到增殖培养基上进行培养。

所述“具有腋芽的茎段”为具有1个腋芽的茎段。

所述“具有腋芽的茎段”的长度为1.0-1.5cm。

所述具有腋芽的茎段的制备方法具体如下：

①取‘CSR6R6-666’的一年生枝条上抽生出来的的新梢；

②从步骤①得到的新梢上截取茎段(长度为1.0-1.5cm，每个茎段上具有一个腋芽)，去除展开叶，在自来水下冲洗40min；

③取步骤②得到的茎段，依次按如下步骤消毒：用75％(体积百分含量)酒精溶液浸泡30s，然后用0.1％(质量百分含量)HgCl₂溶液浸泡10min，然后用无菌水冲洗。

所述方法还包括如下步骤(3)：步骤(2)中植株的根长度达到2cm时，转移到温室培养7天左右，然后炼苗2-4天，然后将植株移栽到栽培基质中。

本发明还保护一种用于苹果(Malus domestica)CSR6R6-666的扩繁的试剂盒，包括以上任一所述的增殖培养基和以上任一所述的生根培养基。所述试剂盒还包括以上任一所述的培养基甲。

‘CSR6R6-666’，又称苹果(Malus domestica)CSR6R6-666，已于2017年2月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.13783。

本发明开发了适于苹果(Malus domestica)CSR6R6-666的扩繁方法。苹果(Malusdomestica)CSR6R6-666对于功能性苹果育种具有重大的应用价值。育种的目的植株为满足如下(f1)和/或(f2)和/或(f3)和/或(f4)的苹果植株：(f1)果肉全红；(f2)果肉高类黄酮含量；(f3)果肉高花青苷含量；(f4)果肉高抗氧化能力。所述果肉高类黄酮含量指的是每千克鲜重的果肉中的类黄酮的含量为5000mg以上。所述果肉高花青苷含量指的是每千克鲜重的果肉中的花青苷含量为200mg以上。果肉高抗氧化能力指的是每千克鲜重的果肉中的抗氧化能力(又称抗氧化物含量)为3μmol以上。因此，本发明对于功能性苹果育种具有重大的应用价值。

附图说明

图1为实施例2的步骤一的阶段四中培养14天后的照片。

图2为图1中一个茎段的放大照片。

图3为实施例2的步骤二中培养30天后的照片。

图4为实施例2的步骤二中培养基乙-I中培养30天后的照片。

图5为实施例2的步骤三中培养37天后的照片。

图6为实施例2的步骤三中培养基丙-B中培养21天后的植株的根部照片。

图7为实施例2的步骤三中培养基丙-B中培养30天后的植株照片。

图8为实施例2的步骤三中培养基丙-B中培养37天后的植株照片。

图9为实施例2的步骤四中在栽培基质上培养14天后的照片。

图10为实施例2的步骤四中在栽培基质上培养30天后的照片。

图11为红富士、品种甲和品种乙的果皮中的花青苷检测结果。

图12为红富士、品种甲和品种乙的果皮中的特异DNA分子甲基化水平检测结果。

图13为品种甲的照片。

图14为品种乙的照片。

图15为品种丁的照片。

图16为嘎啦的照片。

图17为品种己的照片。

图18为苹果新品系‘功能1号’的照片。

图19为苹果新品系‘功能2号’的照片。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

MS培养基的组成：溶剂为水；溶质及其浓度见表1。

1/2MS培养基的组成：溶剂为水；溶质及其浓度见表2。

表1

溶质	溶质在培养基中的浓度(mg/L)
		硝酸钾	1900
硝酸铵	1650
		磷酸二氢钾	170
硫酸镁	370
		氯化钙	440
硫酸锰	22.3
		硫酸锌	8.6
硼酸	6.2
		碘化钾	0.83
钼酸钠	0.25
		硫酸铜	0.025
氯化钴	0.025
		乙二胺四乙酸二钠	37.3
硫酸亚铁	27.8
		甘氨酸	2
烟酸硫胺素	0.1
		盐酸吡哆醇	0.5
烟酸	0.5
		肌醇	100

表2

溶质	溶质在培养基中的浓度(mg/L)
		硝酸钾	950
硝酸铵	825
		磷酸二氢钾	85
硫酸镁	185
		氯化钙	220
硫酸锰	22.3
		硫酸锌	8.6
硼酸	6.2
		碘化钾	0.83
钼酸钠	0.25
		硫酸铜	0.025
氯化钴	0.025
		乙二胺四乙酸二钠	37.3
硫酸亚铁	27.8
		甘氨酸	2
烟酸硫胺素	0.1
		盐酸吡哆醇	0.5
烟酸	0.5
		肌醇	100

MS固体培养基：在MS培养基的基础上，每升添加6g琼脂。

1/2MS固体培养基：在1/2MS培养基的基础上，每升添加6g琼脂。

6-BA全称为6-苄氨基腺嘌呤。NAA全称为1-萘乙酸。IBA全称为吲哚丁酸。PVP40000：贝斯特公司，CAS编号为9003-39-8；PVP40000的全称为聚乙烯吡咯烷酮40000，分子量为40000。

表4和表5中：数据为Mean±SE(平均值±标准误)；同列数相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，不同字母表示差异显著(P＜0.05)。

着色指数指的是：成熟苹果果实表皮，红色区域面积占表皮总面积的比例。

芦丁的结构式如下：

Trolox的结构式如下：

80％丙酮溶液：将4体积份丙酮与1体积份水混合。

1％盐酸甲醇溶液：97.2ml甲醇与2.8ml浓盐酸混合。浓盐酸即市售12mol/L盐酸。

0.5％盐酸甲醇溶液的制备方法：将0.5体积份35％浓盐酸与99.5体积份甲醇混合。

提及‘红富士’苹果和‘嘎啦’苹果的参考文献：陈学森，辛培刚等，元帅和金帅在苹果新品种选育中的作用，山东农业大学学报，1994，25(2)：236—248。

实施例1、苹果优异种质‘CSR6R6-666’的获得和鉴定

鉴定苹果植株为R1R1基因型、R6R6基因型还是R6R1基因型的方法如下：从待测苹果植株上取苹果，提取苹果果肉的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用F3和R3组成的引物对进行PCR扩增，然后按如下标准判读基因型：如果PCR扩增产物为一条带且为497bp，待测苹果植株为R6R6基因型；如果PCR扩增产物为一条带且为386bp，待测苹果植株为R1R1基因型；如果PCR扩增产物为两条带且分别为497bp和386bp，待测苹果植株为R6R1基因型。

F3：5’-GGTGGTCAAAGATGTGTGTTGT-3’；

R3：5’-TTTGCCTGCTACCCACTTCA-3’。

经检测，‘红富士’苹果和‘嘎啦’苹果均为R1R1基因型。

一、‘CSR6R6-666’的获得

新疆红肉苹果作为亲本，与‘红富士’等白肉栽培苹果品种杂交。按照孟德尔遗传定律，新疆红肉苹果(R6R1基因型)与‘红富士’(R1R1基因型)等白肉栽培苹果品种杂交,其后代群体应为红肉表型(R6R1基因型):白肉表型(R1R1基因型)＝1:1。但是，在杂交F₁代群体中发现了R6R6基因型的单株。

将一株R6R6基因型的单株命名为‘CSR6R6-666’。

‘CSR6R6-666’具有如下表型：茎、叶、花、果皮和果肉等各部分及各个发育阶段均为紫红色。

‘CSR6R6-666’的果实鲜食品质：酸甜适口，酥脆多汁，鲜食品质优良。

二、‘CSR6R6-666’的保藏

三、‘CSR6R6-777’的保藏

‘CSR6R6-777’是发明人所在的实验室前期选育出来的另一株R6R6基因型的单株。

‘CSR6R6-777’，又称苹果(Malus domestica)CSR6R6-777，已于2016年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.12468。

四、类黄酮组分含量分析

分别将‘CSR6R6-666’和‘CSR6R6-777’作为待测植株。

1、取待测植株上的苹果，取苹果果肉。

2、取步骤1得到的果肉，在液氮中研磨得到粉末。

3、称取2g步骤2得到的粉末，加入5mL 0.5％盐酸甲醇溶液，4℃静置提取2h，然后8000rpm离心20min，分别收集上清液和残渣。

4、取步骤3得到的残渣，加入5mL 0.5％盐酸甲醇溶液，4℃静置提取1h，然后8000rpm离心20min，收集上清液。

5、将步骤3得到的上清液和步骤4得到的上清液混合，得到混合液。

6、取步骤5得到的混合液，37℃旋蒸除去甲醇，残留物用2-3ml甲醇溶解，然后8000rpm离心20min，收集上清液。

7、取步骤6得到的上清液，用甲醇定容至5ml，然后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液。

8、将步骤7得到的滤液进行HPLC-MS分析。

液相色谱条件：

采用WATERS ACQUITY UPLC色谱仪，色谱柱为BEH C18柱(100mm×2.1mm)，填料粒径1.7μm；柱温45℃；进样体积1μL；

流动相为A液和B液的混合液，流速为0.3mL/min；A液为乙腈，B液为含0.2％(体积分数)甲酸的水溶液；0-0.1min，A液占流动相的体积分数为5％；0.1-20min，A液占流动相的体积分数由5％线性上升至20％；20-22min，A液占流动相的体积分数由20％线性上升至80％；22-22.1min，A液占流动相的体积分数由80％线性下降至5％；22.1-25min，A液占流动相的体积分数为5％。

质谱条件：

质谱仪为WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS，ESI电离源，电喷雾离子化正离子采集模式(ESI+)；扫描范围100-1500m/z；毛细管电压3.5kV，锥孔电压30V；源温度100℃，脱溶温度300℃；脱溶剂气流量500L/h。

9种特定黄酮醇物质的含量见表3。表3中的9种特有物质的检测方法均属于类黄酮组分及含量检测方法，参考文献(陈学森,张晶,刘大亮,等.新疆红肉苹果杂种一代的遗传变异及功能型苹果优株评价[J].中国农业科学,2014,47(11):2193-2204.。

表3

以上结果表明，‘CSR6R6-666’和‘CSR6R6-777’均具有很强的类黄酮合成能力，果肉富含类黄酮，并且含有特殊的黄酮醇类组分，是培育功能型苹果品种的优异种质。‘CSR6R6-666’优于‘CSR6R6-777’。

实施例2、‘CSR6R6-666’的扩繁(组培方法)

一、无菌苗的获得

1、取‘CSR6R6-666’的一年生枝条上抽生出来的10cm左右的新梢。

2、从步骤1得到的新梢上截取茎段(长约1.0-1.5cm，每个茎段上具有一个腋芽)，去除展开叶，在自来水下冲洗40min。

3、取步骤2得到的茎段，依次按如下步骤消毒：用75％(体积百分含量)酒精溶液浸泡30s，然后用0.1％(质量百分含量)HgCl₂溶液浸泡10min，然后用无菌水冲洗。

4、取步骤3得到的茎段，接种到培养基甲上培养2小时(阶段一)，然后转接到新的培养基甲上培养10小时(阶段二)，然后转接到新的培养基甲上培养24小时(阶段三)，然后转接到新的培养基甲上培养至腋芽萌发的新梢长度为2-3厘米(阶段四)。本步骤的培养条件为：26℃、16小时光照/8小时黑暗、光照强度2000lux。均采用腋芽向上的方式接种。本步骤中，多次转接的目的是为了解决褐化现象。

培养基甲(pH5.8)：含0.8mg/L 6-BA、0.15mg/L NAA、500mg/L PVP40000和30g/L蔗糖的MS固体培养基。

图1为阶段四中培养14天后的照片。

图2为图1中一个茎段的放大照片。

二、多丛芽诱导与增殖

取完成步骤一的茎段，从基部切取腋芽萌发的新梢，转移到装有培养基乙的三角瓶中，在“26℃、16小时光照/8小时黑暗、光照强度2000lux”的条件下培养。

培养基乙(pH5.8)为培养基乙-A、培养基乙-B、培养基乙-C、培养基乙-D、培养基乙-E、培养基乙-F、培养基乙-G、培养基乙-H、培养基乙-I或培养基乙-J。

培养基乙-A：含0.15mg/L NAA和30g/L蔗糖的MS固体培养基。

培养基乙-B：含0.5mg/L 6-BA、0.15mg/L NAA和30g/L蔗糖的MS固体培养基。

培养基乙-C：含0.8mg/L 6-BA、0.15mg/L NAA和30g/L蔗糖的MS固体培养基。

培养基乙-D：含1.0mg/L 6-BA、0.15mg/L NAA和30g/L蔗糖的MS固体培养基。

培养基乙-E：含1.2mg/L 6-BA、0.15mg/L NAA和30g/L蔗糖的MS固体培养基。

培养基乙-F：含1.5mg/L 6-BA、0.15mg/L NAA和30g/L蔗糖的MS固体培养基。

培养基乙-G：含0.5mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA和30g/L蔗糖的MS固体培养基。

培养基乙-H：含0.5mg/L 6-BA、0.3mg/L NAA和30g/L蔗糖的MS固体培养基。

培养基乙-I：含0.8mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA和30g/L蔗糖的MS固体培养基。

培养基乙-J：含0.8mg/L 6-BA、0.3mg/L NAA和30g/L蔗糖的MS固体培养基。

进行三次重复试验，每次重复试验中每种培养基15个三角瓶，每个三角瓶中2株。

培养30天后的照片见图3。图3中，A至J依次对应培养基乙-A至培养基乙-J。

培养基乙-I中培养30天后的照片见图4。

培养30天后统计增殖系数(增殖系数＝培养30天后的总不定稍个数/初始接种的总新梢个数)。结果见表4。

结果表明：采用培养基乙-A、培养基乙-B、培养基乙-C、培养基乙-G、培养基乙-H、培养基乙-J进行培养，增殖系数低；采用培养基乙-D、培养基乙-E、培养基乙-F进行培养，不仅增殖系数低，而且出现了玻璃化现象；采用培养基乙-I进行培养，增殖系数最大(高达6.58)，且芽生长势壮。因此，适于‘CSR6R6-666’的新梢增殖不定稍的最适增殖培养基为培养基乙-I。

表4

	增殖系数
		培养基乙-A	1.00±0.00i
培养基乙-B	4.16±0.12e
		培养基乙-C	5.22±0.09c
培养基乙-D	3.71±0.10f
		培养基乙-E	3.37±0.10g
培养基乙-F	3.01±0.06h
		培养基乙-G	5.62±0.11b
培养基乙-H	3.91±0.22f
		培养基乙-I	6.58±0.16a
培养基乙-J	4.77±0.13d

三、生根培养与试管植株的获得

步骤二中的培养基乙-I中的不定梢长度达到1.5cm时，从基部切取整个不定梢，接种于装有培养基丙的组培瓶中，在“26℃、16小时光照/8小时黑暗、光照强度2000lux”的条件下培养。

培养基丙(pH5.8)为培养基丙-A、培养基丙-B、培养基丙-C、培养基丙-D或培养基丙-E。

培养基丙-A：含0.2mg/L IBA和20g/L蔗糖的MS固体培养基。

培养基丙-B：含0.5mg/L IBA和20g/L蔗糖的MS固体培养基。

培养基丙-C：含0.8mg/L IBA和20g/L蔗糖的MS固体培养基。

培养基丙-D：含1.0mg/L IBA和20g/L蔗糖的MS固体培养基。

培养基丙-E：含1.5mg/L IBA和20g/L蔗糖的MS固体培养基。

进行三次重复试验，每次重复试验中每种培养基15个组培瓶，每个三角瓶中2株。

培养37天后的照片见图5。图5中，A至E依次对应培养基丙-A至培养基丙-E。

培养基丙-B中培养21天后的植株的根部照片见图6。可以观察到根系变红。

培养基丙-B中培养30天后的植株照片见图7。

培养基丙-B中培养37天后的植株照片见图8。

培养30天后统计不定梢的生根率，结果见表5。

结果表明：采用培养基丙-C、培养基丙-D、培养基丙-E培养，茎基部出现了愈伤组织化，并且根系和植株长势弱；采用培养基丙-A、培养基丙-B进行培养植株的根系发育较好；采用培养基丙-B进行培养，生根率最高(生根率高达78.9％)，且根系粗壮、产生了大量侧根。因此，适于‘CSR6R6-666’的不定稍生根的最适生根培养基为培养基丙-B。

表5

处理	生根率
		培养基丙-A	70.00％±3.33b
培养基丙-B	78.92％±1.86a
		培养基丙-C	61.11％±1.92c
培养基丙-D	53.33±3.34d
		培养基丙-E	38.89％±2.05e

四、基质筛选与移栽

温室条件：25-30℃，自然光。

1、步骤三中的培养基丙-B中植株的根长度达到2cm时，转移到温室培养7天左右。

2、完成步骤1后，将组培瓶口打开，开瓶炼苗2-4天。

3、完成步骤2后，取出植株，将根部放入0.1％多菌灵溶液中浸泡5min，并把根部多余的培养基清洗干净，最后用清水冲洗2-3次。

4、完成步骤3后，将植株移栽到装有栽培基质的容器中，适时浇水。

栽培基质的配方：牛粪与蛭石等体积混合。

在栽培基质上培养14天后的照片见图9。

在栽培基质上培养30天后的照片见图10。

在栽培基质上培养21天后统计存活率，为77.78％。

实施例3、通过持续多代芽变选种对苹果红皮性状进行持续改良的方法的建立

一、苹果红色芽变的特点

调研发现，苹果的红色芽变具有如下三个特点：

(1)苹果红色芽变的重演性

调研发现，苹果的红色芽变可在国内外不同地区及不同年份重复发生，表现出芽变的重演性。这为有效利用芽变选种技术对苹果红皮性状持续改良提供了科学依据。

(2)苹果红色芽变的多效性

对多个苹果红色芽变品种进行调研发现，尽管均是红色芽变，但不同芽变品种(系)在着色类型(条红或片红)、着色速度以及对光的敏感程度等存在明显差异。这为有效利用芽变选种技术选育特色多样化品种、满足消费者和栽培者的多样化需求提供了科学依据；

(3)苹果红色芽变的稳定性

对多个苹果红色芽变品种嫁接繁殖后的稳定性进行了调研，结果表明，苹果红色芽变具有很好的遗传稳定性和一致性。这为苹果红色芽变品种的大面积推广应用提供了科学依据。

二、芽变的机理

经过发明人的大量研究，苹果的红色芽变是特异DNA分子甲基化水平差异引起的表观遗传。特异DNA分子如序列表的序列1所示。

经检测，‘红富士’苹果和‘嘎啦’苹果的基因组中均具有序列表的序列1所示的特异DNA分子。

三、通过持续多代芽变选种对苹果红皮性状进行持续改良的方法的建立

建立如下方法：将苹果品种C0进行持续多代的芽变选种，第一代芽变选种将苹果品种CO作为出发品种，以后的每代芽变选种均将上一代芽变选种得到的品种作为出发品种，每代芽变选种从全满足如下三个性状的芽发育出的枝条或植株中选择目标品种：(a)发生红色芽变；(b)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的花青苷含量为出发品种的2倍以上；(c)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的特异DNA分子的甲基化水平为出发品种的二分之一以下。上述果皮均指的是成熟苹果的果皮。

检测果皮的花青苷含量的方法如下：

①取0.5g果皮，液氮研磨，加入5ml 4℃预冷的1％盐酸甲醇溶液，4℃避光静置，提取24h。

②完成步骤①后，取提取液，分为两份，每份1ml，一份加入4ml KCl缓冲液，另一份加入4ml NaAC缓冲液，混匀后4℃避光静置提取15min，然后8000r/min离心10min，收集上清液。

KCl缓冲液(pH＝1、0.025M)：1.86g KCl用980ml蒸馏水溶解，用浓盐酸调pH为1.0，转移到1L容量瓶中，用蒸馏水定容。

NaAC缓冲液(pH＝4.5、0.4M)：54.43g NaAC用960ml蒸馏水溶解，用浓盐酸调pH为4.5，转移到1L容量瓶中，用蒸馏水定容。

③取步骤②得到的上清液，分别测定510nm和700nm下的吸光值。

花青苷含量(mg/g)＝△A*5*0.005*1000*449.2/(26900*0.5)；

△A＝(A_510nm-A_700nm)_{pH1.0条件下}-(A_510nm-A_700nm)_{pH4.5条件下}。

“mg/g”中，mg指的是花青苷的质量，g指的是果皮鲜重。

检测果皮的特异DNA分子的甲基化水平的方法如下：

①利用QIAGEN植物基因组DNA抽提试剂盒提取果皮的基因组DNA。

②取步骤①得到基因组DNA，采用EZ DNA Methylation-Gold试剂盒进行亚硫酸盐转化，得到亚硫酸盐处理的DNA。

③取步骤②得到的亚硫酸盐处理的DNA，作为模板，分两个体系进行PCR扩增。

PCR扩增体系Ⅰ：10×Ex Taq Buffer 2.5μl，dNTP Mixture 2μl，引物F1 2μl、引物R1 2μl，TaKaRa Ex Taq HS 0.5μl，模板4μl，ddH₂O 12μl。

PCR扩增体系Ⅰ的反应程序：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒、51℃退火30秒、72℃延伸1分钟，共进行40个循环；72℃延伸10分钟。

PCR扩增体系Ⅱ：10×Ex Taq Buffer 2.5μl，dNTP Mixture 2μl，引物F2 2μl、引物R2 2μl，TaKaRa Ex Taq HS 0.5μl，模板4μl，ddH₂O 12μl。

PCR扩增体系Ⅱ的反应程序：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒、54℃退火30秒、72℃延伸1分钟，共进行40个循环；72℃延伸10分钟。

引物F1：5’-TAGGTTTGAAGAATTAATTAGGGAT-3’；

引物R1：GGGAAATTTTGGTTTTTATATGGTTTAG-3’。

引物F2：TTTTATTTTTTATATATATTATGTTATT-3’；

引物R2：GGATTATGTTATTAGATGGT-3’。

④分别将步骤③的两个体系的扩增产物进行测序，利用CyMATE软件(Hetzl etal.,2007)输出甲基化水平数据。

特异DNA分子的甲基化水平＝(体系Ⅰ的甲基化水平数据+体系Ⅱ的甲基化水平数据)÷2。

实施例4、应用实施例3建立的方法通过持续多代芽变选种对苹果红皮性状进行持续改良

本实施例中检测果皮的花青苷含量的方法和检测果皮的特异DNA分子的甲基化水平的方法同实施例3。

一、红富士苹果红色芽变新品种选育

1、第一代芽变选种：

将红富士作为出发品种，将满足如下三个性状的芽发育出的枝条或植株作为初选对象：(a)发生红色芽变；(b)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的花青苷含量为红富士的2倍以上；(c)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的特异DNA分子的甲基化水平为红富士的二分之一以下。上述果皮均指的是成熟苹果的果皮。

将初选对象进行复选和决选后，得到的某一个品种作为品种甲。

2、第二代芽变选种：

将品种甲作为出发品种，将满足如下三个性状的芽发育出的枝条或植株作为初选对象：(a)发生红色芽变；(b)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的花青苷含量为品种甲的2倍以上；(c)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的特异DNA分子的甲基化水平为品种甲的二分之一以下。上述果皮均指的是成熟苹果的果皮。

将初选对象进行复选和决选后，得到的某一个品种作为品种乙。

红富士、品种甲和品种乙的果皮中的花青苷检测结果见图11。品种甲的果皮的花青苷含量为红富士的2倍以上，品种乙的果皮的花青苷含量为品种甲的2倍以上。

红富士、品种甲和品种乙的果皮中的特异DNA分子甲基化水平检测结果见图12。品种甲的果皮的特异DNA分子的甲基化水平是红富士的二分之一以下，品种乙的果皮的特异DNA分子的甲基化水平是品种甲的二分之一以下。

红富士的果皮颜色性状：着色速度较慢(除袋之后10-15天着色)，着色指数为25％-35％(成熟果实表皮，25％-35％显示为浅红色、剩余部分显示为黄色或绿色)。红富士的果肉颜色性状：乳白色果肉。

品种甲的果皮颜色性状：着色速度较快(除袋之后6-9天着色)，着色指数为75％-85％(成熟果实表皮，75％-85％显示为鲜红色)。品种甲的照片见图13。品种甲的果肉颜色性状：乳白色果肉。

品种乙的果皮颜色性状：着色速度快(除袋之后3-4天着色)，着色指数为90％以上(成熟果实表皮，90％以上为宝石红色)。品种乙的照片见图14。品种乙的果肉颜色性状：乳白色果肉。

二、红富士苹果红色、短枝双芽变优质短枝型新品种选育

1、第一代芽变选种：

将红富士作为出发品种，将满足如下四个性状的芽发育出的枝条或植株作为初选对象：(a)发生红色芽变；(b)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的花青苷含量为红富士的2倍以上；(c)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的特异DNA分子的甲基化水平为红富士的二分之一以下；(d)芽发育成的枝条或植株上生长的枝条的节间长度为2cm以下。上述果皮均指的是成熟苹果的果皮。

将初选对象进行复选和决选后，得到的某一个品种作为品种丙。

2、第二代芽变选种：

将品种丙作为出发品种，将满足如下四个性状的芽发育出的枝条或植株作为初选对象：(a)发生红色芽变；(b)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的花青苷含量为品种丙的2倍以上；(c)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的特异DNA分子的甲基化水平为品种丙的二分之一以下；(d)芽发育成的枝条或植株上生长的枝条的节间长度为2cm以下。上述果皮均指的是成熟苹果的果皮。

将初选对象进行复选和决选后，得到的某一个品种作为品种丁。

品种丙的果皮颜色性状：着色速度较快(除袋之后7-10天着色)，着色指数为75％-85％(成熟果实表皮，75％-85％显示为鲜红色)。品种丙的果肉颜色性状：乳白色果肉。品种丙的短枝性状：节间长度为2cm以下。

品种丁的果皮颜色性状：着色速度快(除袋之后3-5天着色)，着色指数为90％以上(成熟果实表皮，90％以上为浓红色)。品种丁的照片见图15。品种丁的果肉颜色性状：乳白色果肉。品种丁的短枝性状：节间长度为2cm以下。

三、嘎啦苹果红色芽变新品种选育

1、第一代芽变选种：

将嘎啦作为出发品种，将满足如下三个性状的芽发育出的枝条或植株作为初选对象：(a)发生红色芽变；(b)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的花青苷含量为嘎啦的2倍以上；(c)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的特异DNA分子的甲基化水平为嘎啦的二分之一以下。上述果皮均指的是成熟苹果的果皮。

将初选对象进行复选和决选后，得到的某一个品种作为品种戊。

2、第二代芽变选种：

将品种戊作为出发品种，将满足如下三个性状的芽发育出的枝条或植株作为初选对象：(a)发生红色芽变；(b)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的花青苷含量为品种戊的2倍以上；(c)芽发育成的枝条或植株上生长的苹果的果皮的特异DNA分子的甲基化水平为品种戊的二分之一以下。上述果皮均指的是成熟苹果的果皮。

将初选对象进行复选和决选后，得到的某一个品种作为品种己。

嘎啦的果皮颜色性状：着色速度较慢(除袋之后8-12天着色)，着色指数为25％-35％(成熟果实表皮，25％-35％显示为浅红色、剩余部分显示为黄色或绿色)。嘎啦的果肉颜色性状：乳白色果肉。嘎啦的照片见图16。

品种戊的果皮颜色性状：着色速度较快(除袋之后5-8天着色)，着色指数为75％-85％(成熟果实表皮，75％-85％显示为鲜红色)。品种戊的果肉颜色性状：乳白色果肉。

品种己的果皮颜色性状：着色速度快(除袋之后3-5天着色)，着色指数为90％以上(成熟果实表皮，90％以上为浓红色)。品种己的照片见图17。品种己的果肉颜色性状：乳白色果肉。

实施例5、芽变选种和杂交育种有机结合培育‘功能1号’功能型苹果新品系

一、功能型苹果新品系

1、回交(在山东烟台市牟平区进行)

2011年4月，取‘CSR6R6-666’的花粉，对去雄后的品种乙进行授粉，收获BC₁杂交种子，将BC₁杂交种子洗净后放到1-3℃冰箱保鲜室层积处理60d左右(目的是通过满足需冷量来解除种子休眠)。

2、温室育苗(在山东泰安进行)

2011年12月，将步骤1得到的BC₁杂交种子播种于装有育苗基质的营养钵(每个营养钵播种3-5粒种子)培养至实生苗高度为8-15cm且根颈处木质化(通常为播种2-3个月)，然后将实生苗移栽至新的装有育苗基质的营养钵(每个营养钵移栽1株)进行培养；本步骤中的培养条件为：25℃、每天光照12小时(光照强度3000lx)，从种子萌发开始每7-10天浇一次营养液(将MS基本培养基的大量元素母液用水稀释至10倍体积即为营养液)、每次每个营养钵浇40-50ml。

3、杂种实生苗定植(在山东冠县进行)

2012年2月，在拟定植实生苗的选种圃(大田)中每亩施入有机肥(本实施例中采用的为充分腐熟的奶牛粪)6000kg并浇水沉实；2012年4月，将3600株步骤2得到的实生苗定植于选种圃，2012年4月在定植有实生苗的选种圃中每亩再施入有机肥(本实施例中采用充分腐熟的奶牛粪)6000kg并及时浇水。

4、杂种实生苗环剥处理

2015年5月，在离地面20cm处对各实生苗的主干进行环剥，环剥宽度为0.5-1.0cm，深达木质部。此操作的目的是促进营养物质的积累及花芽分化，以缩短童期、提早结果。

5、花果管理

2016年4-5月，在各实生苗的盛花期进行疏花(每个花序的5朵花仅保留中心花，其他全部疏除)。幼果不套袋，常规管理。

6、功能型苹果新品系‘功能1号’的获得

2016年9月，从回交后代群体中选育出功能型苹果新品系‘功能1号’(照片见图18)。‘功能1号’的果肉全红、果皮全红。

二、类黄酮含量、花青苷含量及抗氧化能力分析

待测材料：‘功能1号’上生长的苹果、‘CSR6R6-666’上生长的苹果和‘CSR6R6-777’上生长的苹果。

1、果肉的类黄酮含量测定

(1)取1g果肉，液氮研磨，然后加入10ml 4℃预冷的65％(体积百分含量)乙醇水溶液并混匀，4℃避光静置提取4h，然后12000g离心20min，收集上清液。

(2)取试管，加入0.5ml步骤(1)得到的上清液，然后依次加入1mL 5g/100ml NaNO₂水溶液、1ml 10g/100ml AL(NO₃)₃水溶液、4mL 2M NaOH水溶液，混匀后静置15min，8000rpm离心10min，取上清，然后在510nm下测定吸光值。

以芦丁(rutin,Sigma chemical,ST,Loiuis,USA)为标样做标准曲线。

2、果肉的花青苷含量测定

(1)取0.5g果肉，液氮研磨，加入5ml 4℃预冷的1％盐酸甲醇溶液，4℃避光静置提取24h。

(2)取步骤(1)得到的提取液，分成2份，每份1ml，第一份加入4ml KCl缓冲液，第二份加入4ml NaAC缓冲液，混匀后4℃避光静置提取15min，然后8000r/min离心10min，收集上清液。

(3)取步骤(2)得到的上清液，分别测定510nm和700nm下的吸光值。

花青苷含量(mg/g)＝△A*5*0.005*1000*449.2/(26900*0.5)；

△A＝(A_510nm-A_700nm)_{pH1.0条件下}-(A_510nm-A_700nm)_{pH4.5条件下}。

“mg/g”中，mg指的是花青苷的质量，g指的是果肉鲜重。

3、果肉的抗氧化能力测定

(1)取果肉，液氮研磨，得到粉末。

(2)称取10g步骤(1)得到的粉末，加入50mL 80％丙酮溶液，4℃静置提取2h，8000rpm离心10min，收集上清。

(3)取完成步骤(2)的残渣，加入50mL 80％丙酮溶液，4℃静置提取1h，8000rpm离心10min，收集上清。

(4)将步骤(2)得到的上清和步骤(3)得到的上清合并，得到混合液。

(5)取步骤(4)得到的混合液，40℃旋蒸除去丙酮，残留部分5000rpm离心，取上清液，用去离子水定容至20mL，得到待测样品。

(6)10体积份乙酸缓冲液、1体积份20mM FeCl₃·6H₂O水溶液和1体积份TPTZ溶液混合，37℃水浴5min。

乙酸缓冲液(pH3.6、300mM)：16.8克冰醋酸和0.8克氢氧化钠与水配制成1升溶液。

TPTZ溶液：含10mM 2,4,6–三吡啶基三嗪和40mM盐酸的水溶液。

(7)完成步骤(6)后，取4mL溶液，与30μL待测样品混合，37℃静置反应120min，然后593nm测其吸光度。以Trolox为标样做标准曲线。

结果见表6。

实施例6、芽变选种和杂交育种有机结合培育‘功能2号’功能型苹果新品系用品种己代替品种乙，按照实施例5的步骤进行操作。

2016年7月，从回交后代群体中选育出功能型苹果新品系‘功能2号’(照片见图19)。‘功能2号’的果肉全红、果皮全红。

结果见表6。

表6

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一种适用于高类黄酮苹果新品系的组培快繁法

<130> GNCYX170794

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 841

<212> DNA

<213> 苹果

<400> 1

taggcttgaa gaatcaatta gggatttaca aaatgattaa agggattttg ggtgtttgct 60

gttgccattt ttgaacacaa catcagttcc actactcttt cattttccct caatttctga 120

gcaaccaaac aagtagcatt attgacaaca tactgagctc ctcgtgtcaa ccattcttga 180

aagaatccta ataaagattt ataggcaaat tatgccctag aaaaaattta ataaaaagga 240

ccctgaacac gtaggaaccg gcccgtttgt aacagactga gataggtccg gttctatttc 300

ttaaaaaccc aacacccgct acgttccatt tataaacggg tcggtctggt ccctccaact 360

ttgagcccgg ctcgacttgt gcccactcct aaactaaacc atataaaaac caagatttcc 420

ctttcatctt tcacacatat cacgttactt tccaacaaca attcaacaat cacaacaaat 480

aatcaaccat caagatcata tatcacgtca ctaataaaga caaccttcat aagggttgcc 540

gtagttctct acttgaaatc caattgtcta gcattgtaac cctaagttac agacacaaac 600

ataaacttga gcaacttcta tgcataagaa tctagggttt tggactaact caacagaacc 660

taacaagaaa taatattctg gaccgcttaa cggaatccaa cgaagacaag gtttcggacc 720

actcaacgga acaaataagg aagggatata aaccattcaa cgaaatccat ctttagaata 780

cgcatagtcc cccaatacgg attaaccaag tgagaacata cgccatctga tagcgtggtc 840

c 841

Claims

1.一种苹果(Malus domestica)CSR6R6-666的扩繁方法，包括如下步骤：

苹果(Malus domestica)CSR6R6-666，其保藏编号为CGMCC NO.13783；

所述增殖培养基为如下(a1)、(a2)、(a3)或(a4)：

(a1)含6-BA和NAA的培养基；

(a2)含0.8mg/L 6-BA和0.2mg/L NAA的培养基；

(a3)含0.8mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA和30g/L蔗糖的培养基；

(a4)含0.8mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA和30g/L蔗糖的MS固体培养基；

所述生根培养基为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：

(b1)含IBA的培养基；

(b2)含0.5mg/L IBA的培养基；

(b3)含0.5mg/L IBA和20g/L蔗糖的培养基；

(b4)含0.5mg/L IBA和20g/L蔗糖的MS固体培养基。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，培养至不定梢长度为1.5cm以上。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述“腋芽萌发的新梢”的长度为2-3厘米。

4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述“腋芽萌发的新梢”的制备方法如下：取具有腋芽的茎段，进行三次转接，以克服解决褐化现象。

5.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述“腋芽萌发的新梢”的制备方法如下：取具有腋芽的茎段，接种到培养基甲上培养2小时，然后转接到新的培养基甲上培养10小时，然后转接到新的培养基甲上培养24小时，然后转接到新的培养基甲上培养至腋芽萌发的新梢长度为2-3厘米；

所述培养基甲为如下(c1)、(c2)、(c3)或(c4)：

(c1)含6-BA和NAA的培养基；

(c2)含0.8mg/L 6-BA和0.15mg/L NAA的培养基；

6.如权利要求4或5或6所述的方法，其特征在于：所述具有腋芽的茎段为具有1个腋芽的茎段。

7.一种用于苹果(Malus domestica)CSR6R6-666的扩繁的试剂盒，包括权利要求1中所述的增殖培养基和权利要求1中所述的生根培养基。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括权利要求5中所述的培养基甲。