CN104313150A - 菊花抗蚜性关联分子标记、筛选方法及应用 - Google Patents

菊花抗蚜性关联分子标记、筛选方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，提供菊花抗蚜性关联分子标记、分子标记引物、分子标记筛选方法及上述三者在菊花新品种培育上的应用。菊花抗蚜性关联分子标记包括主效QTL位点NoaE2G1、NoaE2G7、NoaE1H3、NoaE2H7、NoaE2H8的分子标记。其筛选方法包括：(1)试验材料及其表型数据的获得；(2)菊花连锁图谱构建；(3)菊花抗蚜性状的QTL定位；(4)菊花抗蚜性状关联分子标记的确定。解决了目前菊花抗蚜性状基因的精确定位和克隆的研究在国内外几乎空白这一现状，筛选出与菊花蚜虫抗性基因紧密关联的分子标记，建立菊花抗蚜性分子标记辅助选择体系，提高菊花抗蚜性选择效率，为菊花新品种的选育奠定基础。

Description

菊花抗蚜性关联分子标记、筛选方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及菊花抗蚜性关联分子标记、筛选方法及上述二者在菊花抗蚜性状优良基因的定位、克隆及菊花新品种的培育上的应用。
背景技术
菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)是经长期人工培育的我国传统名花，具有药用、食用、观赏和保健价值。蚜虫是危害菊花的主要害虫之一，其中以菊姬长管蚜的危害最为严重。蚜虫不仅影响菊花的观赏价值，而且大大降低菊花的产量和品质，造成极大经济损失。目前，蚜虫的防治多采用化学方法，但农药防治不仅消耗人力物力、造成蚜虫的抗药性，还会造成环境的污染。因此，培育抗蚜性新品种、提高菊花的遗传抗性是解决这个问题的最佳方法。
传统的杂交育种方法因耗时较长，且无法定向改良特定性状，在育种中存在一定局限性。随着育种工作的不断深入，分子标记辅助选择育种(marker-assistedselection,MAS)为菊花育种工作提供了新的研究思路。分子辅助标记选择的第一步是寻找到与重要性状紧密相连锁的分子标记。寻找与性状相关的分子标记的方法有很多，如集团分离分析法(bulked segeration analysis,BSA)、单因素方差分析法(analysis of variance,ANOVA)和数量性状基因定位(quantitative traitloci,QTL)法。目前，连锁遗传图谱构建与QTL定位研究已经在月季、杜鹃、百合、康乃馨等许多观赏植物中陆续展开。在菊花上，由于其本身复杂的遗传基础导致了这方面的研究起步较晚，研究进展较慢。近年来，已有部分研究者在菊花的营养性状、花器性状、花期、分枝等性状成功进行了QTL定位，但关于菊花抗蚜性的QTL定位研究未见报道。
研究发现植物的抗蚜性遗传机制比较复杂，不仅受到加性、上位性互作效应和环境因子的影响，而且不同作物的抗蚜性遗传控制机制差异较大。因此，进一步了解菊花抗蚜性性状的遗传机制，并获得控制抗蚜性状的主效QTL，可为菊花抗蚜性状的分子标记辅助育种创造条件。本发明将获得的与菊花抗蚜性相关联的分子标记，为菊花新品种选育、蚜虫抗性相关基因的精确定位和克隆奠定理论基础。
Cindy JM,Broeke T,Marcel D,et al.Resistance to a new biotype of the lettuce aphidNasonovia ribisnigri in lactuca virosa accession IVT280[J].Euphytica,2013,193(2):265-275.
Deng YM,Chen SM,Lu AM,et al.Production and characterization of theintergeneric hybrids between Dendranthema morifolium and Artemisia vulgarisexhibiting enhanced resistance to chrysanthemum aphid(Macrosiphoniellasanbourni)[J].Planta,2010,231:693-703.
Liliana NG,Norma GC,Graciela ES,et al.Diallelic analysis of genetic effectsdetermining days to flowering in kenaf[J].Industial Crops and Products,2006,23:194-200.
Roger LV,Yniv P,Liu SX,et al.Detection of QTL in Rainbow Trout AffectingSurvival When Challenged with Flavobacterium psychrophilim[J].MarineBiotechnology,2014,16(3):349-360.
Zhen L,Mei SF,Zhong M,et al.Mapping of QTL associated with waterloggingtolerance and drought resistance during the seedling stage in oilseedrape(Brassica napus)[J].Euphytica,2014,197(3):341-353.
常金华,夏雪岩,张丽,等.高粱抗蚜基因的遗传分析和SSR标记定位[J].草业科学,2005,15:113-118.
何俊平,陈发棣,陈素梅,等.不同菊花品种抗蚜虫性鉴定[J].生态学杂志,2010,29(7):1382-1386.
彭辉,陈发棣,房伟民,等.切花小菊分枝性状杂种优势表现与遗传分析[J].园艺学报,2013,40(7):1327-1336.
孙娅,陈素梅,陈发棣,等.菊花近缘种属植物抗蚜机制研究[J].南京农业大学学报,2012,35(3):25-30.
张飞.菊花连锁遗传图谱构建及其重要观赏性状的基因定位与遗传分析[D].南京:南京农业大学,2010.
张飞,陈发棣,房伟民,等.菊花管状花数量和花心直径的QTL分析[J].中国农业科学,2011,44(7):1443-1450.
发明内容
针对目前菊花抗蚜性状优质基因的精确定位和克隆的研究在国内外几乎空白这一现状，本发明的主要目的是：筛选出一个或多个与菊花蚜虫抗性基因紧密关联的分子标记，建立菊花抗蚜性分子标记辅助选择体系，从而提高菊花抗蚜性的选择效率，为菊花新品种的选育奠定基础。
本发明的目的通过以下技术手段获得：
1.本发明提供一种菊花抗蚜性关联分子标记的筛选方法，该方法包括如下步骤：
(1)、试验材料及其表型数据的获得：第一年选择抗蚜性状差异明显的两个菊花品种进行人工杂交，获得F1杂交种子，次年点播，连同亲本扦插苗，常规管理同大田；选取生长健壮、长势一致的6～8叶龄扦插苗作为人工蚜虫接种的供试材料，进行连续两年的蚜虫接种试验，根据菊花品种蚜量比值的不同，进行抗蚜性性状分析；对抗蚜性性状在两个年份的表型数据分别进行基本描述性统计分析；
所选择的杂交亲本之间的抗蚜性要存在足够大的差异，这样QTL位点才有可能在分离群体中被检测到，这种选择不仅局限在表型上的差异，更重要的是遗传上的差异。
本发明利用Microsoft Excel 2003软件和SPSS 11.5软件对抗蚜性性状在两个年份的表型数据分别进行基本描述性统计分析；
(2)、菊花连锁图谱构建：
a.提取亲本及其F1杂交后代基因组DNA；
b.利用亲本及8个F1杂交子代对SRAP、SSR引物组合和SCoT引物进行多态性筛选，将筛选出的多态性引物用于作图群体的多态性扩增并统计扩增后的多态性条带数据；
多态性条带数据统计方法，按照“有”记为“1”，“无”记为“0”的原则对清晰易辨的多态性SSR、SRAP和SCoT扩增位点进行统计。
c.运用JoinMap4.0软件，选用‘CP作图模型’，设置LOD为3.0，分别对双亲的分离位点进行连锁分析，获得双亲的分子标记连锁群，再用Mapchart2.2软件绘制连锁图；
对只存在于亲本之一(Testcross marker，测交标记位点)和同时存在于杂交双亲中(Intercross marker,交叉标记位点)的多态性标记位点，分别按照1:1和3:1孟德尔分离比例在0.05显著水平进行卡方检验。
(3)、菊花抗蚜性状的QTL定位：结合表型数据和分子遗传图谱，运用WinQTL5.0软件及复合区间作图法进行菊花抗蚜性的QTL分析，并估算各QTL的遗传参数：加性效应、对表型变异的贡献率、最大LOD值、QTL在相应连锁群上的位置、与最近分子标记的距离；
(4)、菊花抗蚜性状关联分子标记的确定：根据步骤(3)所得的主效QTL所在的标记区间即可确定与菊花抗蚜性状紧密关联的分子标记。
2.上述1提供的菊花抗蚜性关联分子标记的筛选方法，其中，亲本为‘南农宫粉’为父本和‘韩2’为母本。
3.上述1提供的菊花抗蚜性关联分子标记的筛选方法，其中，步骤(1)抗蚜性鉴定中，蚜量比值＝该材料接种21d时的平均蚜量/全部观测材料21d时的平均蚜量。
4.上述1提供的菊花抗蚜性关联分子标记的筛选方法，其中，步骤(2)中采用的分子标记连锁群是显性标记SRAP、SCoT和共显性标记SSR相结合连锁群；分子标记的命名方法为：“引物名-数字编号”，数字编号指该条带的分子量大小，分子量大小由软件Quantity one估算；
连锁图绘制过程中，连锁分析采用Joinmap 3.0的CP群体的模式来完成，LOD≥3.0，采用Kosambi法将重组率转换成遗传距离以cM表示，根据连锁分析结果采用MapChart 2.2软件制作遗传图谱。
5.上述1提供的菊花抗蚜性关联分子标记的筛选方法，其中，步骤(3)中所述的主效QTL是多年重复出现并且贡献率大于10％的QTL；
QTL分析定位中软件运行参数设置为：Walk speed＝2cM；Window size＝10.00；Model＝6，取LOD阈值为3.0，当LOD峰值大于3.0时即可确定该处存在一个显著QTL位点，置信区间根据LOD值的峰值两侧各下降1个LOD值来确定；
QTL命名：首字母大写的性状英文缩写名称+以E1,E2表示的不同环境+连锁群的序号或者首字母大写的性状英文缩写名称+以E1,E2表示的不同环境+连锁群的序号+QTL的序号。
6.上述1提供的菊花抗蚜性关联分子标记的筛选方法，其中，所述的主效QTL位点包括位点NoaE2G1、NoaE2G7、NoaE1H3、NoaE2H7、NoaE2H8；
其中，主效QTL位点NoaE2G1位于亲本‘南农宫粉’遗传图的G1连锁群上，图谱距离为36.44cM，对抗蚜性表型的贡献率为14.30％；主效QTL位点NoaE2G7位于亲本‘南农宫粉’遗传图G7连锁群上，图谱距离为80.12cM，对抗蚜性表型的贡献率为25.4％；主效QTL位点NoaE1H3位于亲本‘韩2’遗传图H3连锁群上，图谱距离为54.78cM，对抗蚜性表型的贡献率为19.4％；主效QTL位点NoaE2H7位于亲本‘韩2’遗传图H7连锁群上，图谱距离为28.92cM，对抗蚜性表型的贡献率为24.7％；主效QTL位点NoaE2H8位于亲本‘韩2’遗传图H8连锁群上，图谱距离为87.68cM，对抗蚜性表型的贡献率为28.0％。
7.由上述1-6任一项菊花抗蚜性关联分子标记的筛选方法获得的分子标记，所述的主效QTL位点包括位点NoaE2G1、NoaE2G7、NoaE1H3、NoaE2H7、NoaE2H8；
主效QTL位点NoaE2G1的分子标记为SR149-268和E8M9-215，NoaE2G1的距离区间为1cM；
其中位点NoaE2G1接近分子标记SR149-268，SR149-268连锁群图谱距离为35.4cM，与位点NoaE2G1相距1.04cM，分子量为268，由引物对SR149扩增获得，正向引物：序列SEQ ID NO.1所示，反向引物：序列如SEQ ID NO.2所示；E8M9-215的连锁群图谱距离为50.1cM，与位点NoaE2G1相距13.66cM，分子量为215，由引物对E8M9扩增获得，正向引物：序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物：序列如SEQ ID NO.4所示；
主效QTL位点NoaE2G7的分子标记为E12M18-99和E12M18-80，位点NoaE2G7的距离区间为2cM；
其中位点NoaE2G7接近分子标记E12M18-99，E12M18-99的连锁图谱距离为74.1cM，与位点NoaE2G7相距6.02cM，分子量为99，由引物对E12M18扩增获得，正向引物：序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物：序列如SEQ ID NO.6所示；E12M18-80的连锁图谱距离为86.7cM，与位点NoaE2G7相距6.58cM，分子量为80，由引物对E12M18扩增获得，正向引物：序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物：序列如SEQ ID NO.6所示；
主效QTL位点NoaE1H3的分子标记为E16M6-383和SR197-113，位点NoaE1H3的距离区间为6cM；
其中位点NoaE1H3接近分子标记SR197-113，SR197-113的连锁图谱距离为62.8cM，与位点NoaE1H3相距8.02cM，分子量大小为113，由引物对SR197扩增获得，正向引物：序列如SEQ ID NO.9所示，反向引物：序列如SEQ ID NO.10所示；E16M6-383的连锁图谱距离为41.5cM，与位点NoaE1H3相距13.28cM，分子量大小为383，由引物对E16M6扩增获得，正向引物：序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物：序列如SEQ ID NO.8所示；
主效QTL位点NoaE2H7的分子标记为S14-676和S16-370，位点NoaE2H7的距离区间为4.0cM；
其中位点NoaE2H7接近分子标记S16-370，S16-370的连锁图谱距离为87.2cM，与位点NoaE2H7相距8.28cM，分子量大小为370，由引物S16扩增获得，引物序列如SEQ ID NO.13所示；S14-676的连锁图谱距离为70.7cM，与位点NoaE2H7相距8.22cM，分子量大小为676，由引物S14扩增获得，引物序列如SEQ ID NO.12所示；
主效QTL位点NoaE2H8的分子标记为S11-700和E16M18-109，位点NoaE2H8的距离区间为8cM；
其中位点NoaE2H8接近分子标记E16M18-109，E16M18-109的连锁图谱距离为102.1cM，与位点NoaE2H8相距14.42cM，分子量大小为109，由引物对E16M18扩增获得，正向引物：序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物：序列如SEQ ID NO.8所示；S11-700的连锁图谱距离为70.7cM，与位点NoaE2H8相距16.98cM，分子量大小为700，，由引物S11扩增获得，引物序列如SEQ ID NO.11所示。
8.本发明提供上述1-6任一项菊花抗蚜性关联分子标记的筛选方法在抗蚜性菊花育种上的应用，该方法如下：
菊花抗蚜基因定位：提取待测菊花的基因组，(1)分别以引物对SR149、E8M9进行PCR扩增，产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳后分析，如果分子量大小为268和215的分子标记出现，则说明在2个分子标记间存在菊花抗蚜性主效QTL位点NoaE2G1；
(2)以引物对E12M18进行PCR扩增，产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳后分析，如果分子量大小为99和80的分子标记出现，则说明在2个分子标记间存在菊花抗蚜性主效QTL位点NoaE2G7；
(3)以引物对E16M6、SR197进行PCR扩增，产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳后分析，如果分子量大小为113和113的2个分子标记出现，则说明在2个分子标记间存在菊花抗蚜性主效QTL位点NoaE1H3；
(4)以引物对S14、S16进行PCR扩增，产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳后分析，如果分子量大小为676和370的2个分子标记出现，则说明在2个分子标记间存在菊花抗蚜性主效QTL位点NoaE2H7；
(5)以引物对S11、E16M18进行PCR扩增，产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳后分析，如果分子量大小为700和109的2个分子标记出现，则说明在2个分子标记间存在菊花抗蚜性主效QTL位点NoaE2H8。
抗蚜性菊花筛选：如果待测菊花经过步骤(1)和/或步骤(2)和/或步骤(3)和/或步骤(4)和/或步骤(5)检测后出现上述步骤中所述的菊花抗蚜性主效QTL位点，则可预测该待测菊花具有抗蚜性或抗蚜性潜力。
9.上述7提供的分子标记在菊花育种中的应用，该方法如下：
菊花抗蚜基因定位：提取待测菊花的基因组，(1)分别以引物对SR149、E8M9进行PCR扩增，产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳后分析，如果分子量大小为268和215的分子标记出现，则说明在2个分子标记间存在菊花抗蚜性主效QTL位点NoaE2G1；
(2)以引物对E12M18进行PCR扩增，产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳后分析，如果分子量大小为99和80的分子标记出现，则说明在2个分子标记间存在菊花抗蚜性主效QTL位点NoaE2G7；
(3)以引物对E16M6、SR197进行PCR扩增，产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳后分析，如果分子量大小为113和113的2个分子标记出现，则说明在2个分子标记间存在菊花抗蚜性主效QTL位点NoaE1H3；
(4)以引物对S14、S16进行PCR扩增，产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳后分析，如果分子量大小为676和370的2个分子标记出现，则说明在2个分子标记间存在菊花抗蚜性主效QTL位点NoaE2H7；
(5)以引物对S11、E16M18进行PCR扩增，产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳后分析，如果分子量大小为700和109的2个分子标记出现，则说明在2个分子标记间存在菊花抗蚜性主效QTL位点NoaE2H8；
抗蚜性菊花筛选：如果待测菊花经过步骤(1)和/或步骤(2)和/或步骤(3)和/或步骤(4)和/或步骤(5)检测后出现上述步骤中所述的菊花抗蚜性主效QTL位点，则可预测该待测菊花具有抗蚜性或抗蚜性潜力。
有益效果：本发明以蚜虫高抗的切花小菊品种‘韩2’为母本，蚜虫敏感品种‘南农宫粉’为父本杂交获得的133株F1分离群体为试材，利用SRAP、SSR和SCoT分子标记构建了双亲的分子遗传连锁图谱，获得菊花抗蚜性性状的主效QTL及与其紧密关联的分子标记。与目前技术相比，其优点是：
(1)SSR标记为共显性标记，多态性好，重复性高，覆盖整个基因组，具有多等位基因的特性，是构建遗传连锁图谱较理想的分子标记。SRAP标记系统具有简便、产率高、易从序列中得到分离条带等优点，该标记的正反引物分别针对基因组的内含子和外显子区域设计，对开放阅读框(open reading frames,ORFs)进行扩增，与SSR标记的扩增区域互补，可以作为SSR标记的补充标记，有效地增加图谱的密度和基因组覆盖率，其多态性和效价比(产生多态性的效率/成本)都很高。SCoT标记为显性标记，具有操作简单、引物设计简单、能有效产生与性状连锁的标记、重复性好等优势。利用三种分子标记构建菊花遗传图谱更有利于挖掘抗蚜性相关联的分子标记位点。
(2)菊花的传统杂交育种周期长、费时费力，且无法定向改良特定性状，在育种中存在一定局限性。分子标记辅助选择育种克服了菊花抗蚜性性状优良基因型鉴定的困难。选择范围更广，强度更大，还可以在菊花生长早期进行抗蚜性鉴定。通过本发明构建了菊花的遗传连锁图谱，为菊花抗逆性状的QTL定位奠定了基础；菊花抗蚜性状关联分子标记的获得可以实现优良品种提早选择，减少工作量，大大提高菊花新基因型的选择效率，从而加快育种进程。
附图说明
图1菊花‘南农宫粉’的连锁遗传图谱与菊花主要抗蚜性状显著相关联的QTL其中，G1-G24：‘南农宫粉’遗传图谱的24个连锁群标号；左边数据：图谱距离(cM)；右边编号：图谱距离对应的标记位点名称；黑色实心方框：2012年(E2)在连锁群上检测到的关于抗蚜性状的QTL。
图2菊花‘韩2’的连锁遗传图谱与菊花主要抗蚜性状显著相关联的QTL其中，H1-H30：‘韩2’遗传图谱的30个连锁群标号；左边数据：图谱距离(cM)；右边编号：图谱距离对应的标记位点名称；灰色实心方框：2011年(E1)在连锁群上检测到的关于抗蚜性状的QTL，黑色实心方框：2012年(E2)在连锁群上检测到的关于抗蚜性状的QTL。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
(一)试验材料及其表型数据的获得
试验材料为保存于南京农业大学“中国菊花种质资源保存中心”的切花小菊品种‘南农宫粉’和‘韩2’。如果其他同行需要，南京农业大学“中国菊花种质资源保存中心”可向国内单位提供这些种质。两个品种的抗蚜性状差异明显，这样QTL位点才有可能在分离群体中被检测到，这种选择不仅局限在表型上的差异，更重要的是遗传上的差异。本发明选择的亲本为‘南农宫粉’为蚜虫敏感材料，‘韩2’为高抗材料。2010年秋，以‘韩2’为母本，‘南农宫粉’为父本进行人工杂交。选取母本‘韩2’发育良好的花蕾，在舌状花刚露色时去雄，用硫酸纸袋套袋，同时将父本‘南农宫粉’的花序套袋。待母本柱头伸出并开叉呈锐角和分泌粘液时，收集已套袋父本的新鲜花粉，用毛笔对母本进行授粉、套袋，次日重复授粉。当花梗变黄变枯萎时采集授粉花序，脱粒，获得133粒F1杂交种子，次年3月初经穴盘点播，连同亲本扦插苗于4月中下旬单株标号后定植“中国菊花种质资源保存中心”的大棚里，常规管理同大田。
选取生长健壮、长势一致的插穗进行扦插繁殖，待其生根后移栽到塑料杯中，选取6～8叶龄的幼苗作为人工蚜虫接种的供试材料，分别于2011年和2012年进行蚜虫接种试验，具体方法为：
1)从易感蚜虫品种植株上采集菊姬长管蚜(Macrosiphoniella sanbourni)，在23℃～28℃、RH80％条件下饲养，选取两龄若虫作为待接种蚜虫；
2)将待接蚜虫饥饿处理4h，而后用毛笔小心将两龄若虫接种到植株顶部的嫩叶上，每个植株用透气的隔离罩隔离，规格为25cm(长)×12cm(直径)，以防止蚜虫在不同植株间转移。每株接种5头两龄若虫，每处理10株，重复3次；
3)接种21d时统计蚜口数量。采用蚜量比值法对各材料进行抗蚜性鉴定，蚜量比值＝该材料接种21d时的蚜量(一个处理的平均值)/全部观测材料21d时的平均蚜量，计算3个重复的蚜量平均值。根据菊花品种蚜量比值的不同，进行抗蚜性分析。
4)利用Microsoft Excel 2003软件和SPSS 11.5软件对分枝性状在两个年份的表型数据分别进行基本描述性统计分析(见表1)。
表1菊花‘韩2’ב南农宫粉’杂交组合群体抗蚜性表型特征值
Table 1 Phenotypic statistic values for aphid-resistance traits of chrysanthemumcultivars‘Han 2’(M)and‘Nannong Gongfen’(F)and their F1mapping population in2011and 2012season
(二)菊花连锁图谱构建
1)取亲本及其F1杂交后代菊花嫩叶采用CTAB微量法提取基因组DNA，Lambda DNA 1.0％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度，并用ddH2O稀释至25ng·μL-1，-20℃保存备用。
2)以双亲及8个F1子代DNA作为模板，从500对SRAP、300对SSR和36个SCoT引物扩增中分别筛选得到由62对SRAP(表2)、54对SSR引物(表3)和3个SCoT引物(表4)扩增得到的清晰可辨的多态性条带。将筛选出的引物用于作图群体及亲本的多态性扩增。
表2用于菊花作图群体进行多态性分析的SRAP引物名称及其序列
Table 2 SRAP primers utilized for polymorphism analysis in thechrysanthemum mapping population
表3用于菊花作图群体进行多态性分析的SSR引物名称及其序列
Table 3-2 SSR primers utilized for polymorphism analysis in the mappingpopulation
表4用于菊花作图群体进行多态性分析的SCoT引物名称及其序列
Table 4 SCoT primers utilized for polymorphism analysis in thechrysanthemum mapping population
按照“有”记为“1”，“无”记为“0”的原则对清晰易辨的多态性SSR和SRAP扩增位点进行统计。标记条带的命名方法为“引物名-数字编号”，数字编号指该条带的分子量大小，分子量大小由软件Quantity one估算。如“E8M9-215”表示SRAP标记E8M9引物组合得到的电泳图谱上的分子量为215bp的条带，“S14-676”表示SCoT标记14号引物得到的分子量为676bp的条带，“SR149-268”表示SSR标记149号引物得到的分子量为268bp的条带。对只存在于亲本之一(Testcrossmarker，测交标记位点)和同时存在于杂交双亲中(Intercross marker,交叉标记位点)的多态性标记位点，分别按照1:1和3:1孟德尔分离比例在0.05显著水平进行卡方检验。最后所得标记数据见表5。
表5SRAP、SSR和SCoT三种分子标记在菊花作图群体中分离分析
Table 5 Segregation analyses for the markers scored in the chrysanthemum progenyusing SRAP,SSR and SCoT analysis
SRAP-PCR反应体系与反应程序：SRAP-PCR反应混合液总体积为10μl，其中包括1×PCR buffer、Mg2+3.125mmol·L-1、dNTPs 187.5μmol·L-1、引物10μmol·L-1、模板DNA 50ng、Taq DNA聚合酶0.5U。SRAP-PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸1min，5个循环；94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，10℃保存。SRAP-PCR产物采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后拍照保存。
SSR-PCR反应体系与反应程序：SSR-PCR反应混合液总体积为25μl，其中包括1×PCR buffer 2.5μl、25mM Mg2+1.5μl、2mM dNTPs 2.0μl、10μM引物各1μl、模板50ng DNA 1μl、Taq DNA聚合酶0.5U。SSR-PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸1min，5个循环；94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，10℃保存。反应结束，产物检测同SRAP。
SCoT-PCR反应体系与反应程序：SCoT-PCR反应混合液总体积为25μl，其中包括1.20mmol·L-1Mg2+、dNTPs 0.15mmol·L-1、引物0.8μmol·L-1、Taq DNA聚合酶1U、模板DNA 50ng。扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性50s，49.4℃退火35s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸7min，10℃保存。反应结束，产物检测同SRAP。
实验用的Lambda DNA、Taq DNA聚合酶、dNTPs以及100bp DNA marker(100、300、500、700、1000、1500、2000bp)购自宝生物工程(大连)有限公司，SSR和SRAP引物由上海英俊生物技术有限公司合成。实验中使用的主要仪器有Eppendorf 5810R型高速冷冻离心机、DYY-6C型电泳仪、PTC-100TM型PCR仪、JS-380型凝胶成像分析仪。
3)根据双假测交作图策略(Grattapaglia and Sederoff,1994)，将多态性标记位点按照其分离类型分为两大类，每一类中分别包括仅出现在亲本之一的测交标记位点和同时出现在双亲中的交叉标记位点。对该两种类型的分子标记数据分别进行连锁分析，进而产生杂交双亲的两张连锁遗传图谱。连锁分析采用Joinmap3.0的CP群体的模式来完成，LOD≥3.0，采用Kosambi法将重组率转换成遗传距离(centiMorgans,cM)。根据连锁分析结果采用MapChart 2.2软件制作遗传图谱(如图1、图2)。
‘南农宫粉’遗传图谱(如图1所示)总共含有120个标记，其中SSR标记46个，SRAP标记71个，SCoT标记3个，相邻标记之间的最大距离为76cM，最小距离为0.6cM，平均标记之间的距离为11.9cM。图谱包含25个连锁群，其中较大的连锁群有14个，较小的连锁群有11个，包括2个三联体：G19和G24及9个二联体：G14、G16、G17、G19、G20、G21、G22、G23和G25。平均连锁群的长度为57.1cM，最大连锁群的长度为194.1cM，最小的长度为0.6cM。期望基因组大小为2119.57cM，实际图谱获得的累积长度为1428.68cM，基因组覆盖率为67.4％。
‘韩2’遗传图谱(如图2所示)总共含有142个标记，其中SSR标记29个，SRAP标记85个，SCoT标记28个，相邻两个标记之间的距离为11.9cM，最大的距离为33.4cM，最小的距离为3.8cM；得到连锁群30个，其中较大的连锁群有15个，较小的连锁群有15个，包括4个三联体：H15、H21、H27和H28及11个二联体：H12、H16、H17、H19、H20、H22、H24、H25、H26、H29和H30。最大连锁群长度为167.3cM，最小连锁群长度为5.0cM，平均每个连锁群的长度为56.5cM。通过公式计算得出，期望基因组大小为2497.38cM，实际获得图谱的累积长度为1694cM，基因组覆盖率为67.8％(表6)。
表6菊花品种‘韩2’和‘南农宫粉’遗传图谱的相关标记参数
Table 6 Marker statistics regarding the maps of chrysanthemum‘Han2’and‘Nannong Gongfen’
单剂量标记：指一个位点上只有一个拷贝，不是所有的单剂量标记都可以连锁在图谱上
(三)菊花抗蚜性状的QTL定位
基于步骤(二)已经构建的分子遗传图谱并结合步骤(一)得到的表型数据，运用WinQTL5.0软件及复合区间作图法对菊花抗蚜性状在2011和2012年的表型数据分别进行QTL检测，分别利用‘韩2’和‘南农宫粉’两份遗传图谱进行全基因组扫描。利用Map Chart v2.2软件绘制QTL分布图。QTL命名基本遵照改良后的McCouch等方法。性状英文缩写名称(首字母大写)+环境(E1,E2)+连锁群的序号[+QTL的序号]。例如，“NoaE2G1-1”表示利用2012年(E2)表型数据在连锁群G1上检测到的第一个关于菊花抗蚜虫(Noa)性状QTL。
研究结果在杂交双亲2011和2012年的两个不同环境间共检测到5个QTL：NoaE2G1、NoaE2G7、NoaE1H3、NoaE2H7、NoaE2H8(图1、2)与菊花抗蚜性性状显著相关。其中，主效QTL位点NoaE2G1位于亲本‘南农宫粉’遗传图的G1连锁群上，图谱距离为36.44cM，对抗蚜性表型的贡献率为14.30％；主效QTL位点NoaE2G7位于亲本‘南农宫粉’遗传图G7连锁群上，图谱距离为80.12cM，对抗蚜性表型的贡献率为25.4％；主效QTL位点NoaE1H3位于亲本‘韩2’遗传图H3连锁群上，图谱距离为54.78cM，对抗蚜性表型的贡献率为19.4％；主效QTL位点NoaE2H7位于亲本‘韩2’遗传图H7连锁群上，图谱距离为28.92cM，对抗蚜性表型的贡献率为24.7％；主效QTL位点NoaE2H8位于亲本‘韩2’遗传图H8连锁群上，图谱距离为87.68cM，对抗蚜性表型的贡献率为28.0％。表7所示，5个QTL均为减效QTL，即该QTL的存在使抗蚜比值减少多少，LOD值介于2.60～3.94之间，单个QTL对表型变异的贡献率在14.30％～28.00％之间。
表7菊花主要抗蚜性状在2011和2012两个年度的QTL定位分析
Table 7 QTL mapping for plant aphid-resistance of chrysanthemumin two years(environments),detected by WinQTL5.0
(四)菊花抗蚜性状关联分子标记的确定
根据步骤(三)所得的主效QTL所在标记区间即可初步确定与菊花抗蚜性状紧密关联的分子标记如图1、图2所示。由表4可以初步得到9个与菊花抗蚜性相关联的分子标记，它们分别为：位点NoaE2G1接近分子标记SR149-268，SR149-268连锁群图谱距离为35.4cM，与位点NoaE2G1相距1.04cM，分子量为268，由引物对SR149扩增获得，正向引物：序列SEQ ID NO.1所示，反向引物：序列如SEQ ID NO.2所示；E8M9-215的连锁群图谱距离为50.1cM，与位点NoaE2G1相距13.66cM，分子量为215，由引物对E8M9扩增获得，正向引物：序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物：序列如SEQ ID NO.4所示；
主效QTL位点NoaE2G7的分子标记为E12M18-99和E12M18-80，位点NoaE2G7的距离区间为2cM；
其中位点NoaE2G7接近分子标记E12M18-99，E12M18-99的连锁图谱距离为74.1cM，与位点NoaE2G7相距6.02cM，分子量为99，由引物对E12M18扩增获得，正向引物：序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物：序列如SEQ ID NO.6所示；E12M18-80的连锁图谱距离为86.7cM，与位点NoaE2G7相距6.58cM，分子量为80，由引物对E12M18扩增获得，正向引物：序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物：序列如SEQ ID NO.6所示；
主效QTL位点NoaE1H3的分子标记为E16M6-383和SR197-113，位点NoaE1H3的距离区间为6cM；
其中位点NoaE1H3接近分子标记SR197-113，SR197-113的连锁图谱距离为62.8cM，与位点NoaE1H3相距8.02cM，分子量大小为113，由引物对SR197扩增获得，正向引物：序列如SEQ ID NO.9所示，反向引物：序列如SEQ ID NO.10所示；E16M6-383的连锁图谱距离为41.5cM，与位点NoaE1H3相距13.28cM，分子量大小为383，由引物对E16M6扩增获得，正向引物：序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物：序列如SEQ ID NO.8所示；
主效QTL位点NoaE2H7的分子标记为S14-676和S16-370，位点NoaE2H7的距离区间为4.0cM；
其中位点NoaE2H7接近分子标记S16-370，S16-370的连锁图谱距离为87.2cM，与位点NoaE2H7相距8.28cM，分子量大小为370，由引物S16扩增获得，引物序列如SEQ ID NO.13所示；S14-676的连锁图谱距离为70.7cM，与位点NoaE2H7相距8.22cM，分子量大小为676，由引物S14扩增获得，引物序列如SEQ ID NO.12所示；
主效QTL位点NoaE2H8的分子标记为S11-700和E16M18-109，位点NoaE2H8的距离区间为8cM；
其中位点NoaE2H8接近分子标记E16M18-109，E16M18-109的连锁图谱距离为102.1cM，与位点NoaE2H8相距14.42cM，分子量大小为109，由引物对E16M18扩增获得，正向引物：序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物：序列如SEQ ID NO.8所示；S11-700的连锁图谱距离为70.7cM，与位点NoaE2H8相距16.98cM，分子量大小为700，，由引物S11扩增获得，引物序列如SEQ ID NO.11所示。
可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种菊花抗蚜性关联分子标记的筛选方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)、试验材料及其表型数据的获得：第一年选择抗蚜性状差异明显的两个菊花品种进行人工杂交，获得F1杂交种子，次年点播，连同亲本扦插苗，常规管理同大田；选取生长健壮、长势一致的6～8叶龄扦插苗作为人工蚜虫接种的供试材料，进行连续两年的蚜虫接种试验，根据菊花品种蚜量比值的不同，进行抗蚜性性状分析；对抗蚜性性状在两个年份的表型数据分别进行基本描述性统计分析；
(2)、菊花连锁图谱构建：
a.提取亲本及其F1杂交后代基因组DNA；
b.利用亲本及8-10个F1杂交子代对SRAP、SSR引物组合和SCoT引物进行多态性筛选，将筛选出的多态性引物用于作图群体的多态性扩增并统计扩增后的多态性条带数据；
c.运用JoinMap4.0软件，选用‘CP作图模型’，设置LOD为3.0，分别对双亲的分离位点进行连锁分析，获得双亲的分子标记连锁群，再用Mapchart2.2软件绘制连锁图；
(3)、菊花抗蚜性状的QTL定位：结合表型数据和分子遗传图谱，运用WinQTL5.0软件及复合区间作图法进行菊花抗蚜性的QTL分析，并估算各QTL的遗传参数：加性效应、对表型变异的贡献率、最大LOD值、QTL在相应连锁群上的位置、与最近分子标记的距离；
(4)、菊花抗蚜性状关联分子标记的确定：根据步骤(3)所得的主效QTL所在的标记区间即可确定与菊花抗蚜性状紧密关联的分子标记。
2.权利要求1所述的菊花抗蚜性关联分子标记的筛选方法，其特征在于：亲本为‘南农宫粉’为父本和‘韩2’为母本。
3.权利要求1所述的菊花抗蚜性关联分子标记的筛选方法，其特征在于：步骤(1)抗蚜性鉴定中，蚜量比值＝该材料接种21d时的平均蚜量/全部观测材料21d时的平均蚜量。
4.权利要求1所述的菊花抗蚜性关联分子标记的筛选方法，其特征在于：步骤(2)中采用的分子标记连锁群是显性标记SRAP、SCoT和共显性标记SSR相结合连锁群；分子标记的命名方法为：“引物名-数字编号”，数字编号指该条带的分子量大小，分子量大小由软件Quantity one估算；
连锁图绘制过程中，连锁分析采用Joinmap 3.0的CP群体的模式来完成，LOD≥3.0，采用Kosambi法将重组率转换成遗传距离以cM表示，根据连锁分析结果采用MapChart 2.2软件制作遗传图谱。
5.权利要求1所述的菊花抗蚜性关联分子标记的筛选方法，其特征在于：步骤(3)中所述的主效QTL是多年重复出现并且贡献率大于10％的QTL；
QTL分析定位中软件运行参数设置为：Walk speed＝2cM；Window size＝10.00；Model＝6，取LOD阈值为3.0，当LOD峰值大于3.0时即可确定该处存在一个显著QTL位点，置信区间根据LOD值的峰值两侧各下降1个LOD值来确定；
QTL命名：首字母大写的性状英文缩写名称+以E1,E2表示的不同环境+连锁群的序号或者首字母大写的性状英文缩写名称+以E1,E2表示的不同环境+连锁群的序号+QTL的序号。
6.权利要求1所述的菊花抗蚜性关联分子标记的筛选方法，其特征在于：所述的主效QTL位点包括位点NoaE2G1、NoaE2G7、NoaE1H3、NoaE2H7、NoaE2H8；
其中，主效QTL位点NoaE2G1位于亲本‘南农宫粉’遗传图的G1连锁群上，图谱距离为36.44cM，对抗蚜性表型的贡献率为14.30％；主效QTL位点NoaE2G7位于亲本‘南农宫粉’遗传图G7连锁群上，图谱距离为80.12cM，对抗蚜性表型的贡献率为25.4％；主效QTL位点NoaE1H3位于亲本‘韩2’遗传图H3连锁群上，图谱距离为54.78cM，对抗蚜性表型的贡献率为19.4％；主效QTL位点NoaE2H7位于亲本‘韩2’遗传图H7连锁群上，图谱距离为78.92cM，对抗蚜性表型的贡献率为24.7％；主效QTL位点NoaE2H8位于亲本‘韩2’遗传图H8连锁群上，图谱距离为87.68cM，对抗蚜性表型的贡献率为28.0％。
7.由权利要求1-6任一项菊花抗蚜性关联分子标记的筛选方法获得的分子标记，其特征在于：所述的主效QTL位点包括位点NoaE2G1、NoaE2G7、NoaE1H3、NoaE2H7、NoaE2H8；
主效QTL位点NoaE2G1的分子标记为SR149-268和E8M9-215，NoaE2G1的距离区间为1cM；
其中位点NoaE2G1接近分子标记SR149-268，SR149-268连锁群图谱距离为35.4cM，与位点NoaE2G1相距1.04cM，分子量为268，由引物对SR149扩增获得，正向引物：序列SEQ ID NO.1所示，反向引物：序列如SEQ ID NO.2所示；E8M9-215的连锁群图谱距离为50.1cM，与位点NoaE2G1相距13.66cM，分子量为215，由引物对E8M9扩增获得，正向引物：序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物：序列如SEQ ID NO.4所示；
主效QTL位点NoaE2G7的分子标记为E12M18-99和E12M18-80，位点NoaE2G7的距离区间为2cM；
其中位点NoaE2G7接近分子标记E12M18-99，E12M18-99的连锁图谱距离为74.1cM，与位点NoaE2G7相距6.02cM，分子量为99，由引物对E12M18扩增获得，正向引物：序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物：序列如SEQ ID NO.6所示；E12M18-80的连锁图谱距离为86.7cM，与位点NoaE2G7相距6.58cM，分子量为80，由引物对E12M18扩增获得，正向引物：序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物：序列如SEQ ID NO.6所示；
主效QTL位点NoaE1H3的分子标记为E16M6-383和SR197-113，位点NoaE1H3的距离区间为6cM；
其中位点NoaE1H3接近分子标记SR197-113，SR197-113的连锁图谱距离为62.8cM，与位点NoaE1H3相距8.02cM，分子量大小为113，由引物对SR197扩增获得，正向引物：序列如SEQ ID NO.9所示，反向引物：序列如SEQ ID NO.10所示；E16M6-383的连锁图谱距离为41.5cM，与位点NoaE1H3相距13.28cM，分子量大小为383，由引物对E16M6扩增获得，正向引物：序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物：序列如SEQ ID NO.8所示；
主效QTL位点NoaE2H7的分子标记为S14-676和S16-370，位点NoaE2H7的距离区间为4.0cM；
其中位点NoaE2H7接近分子标记S16-370，S16-370的连锁图谱距离为87.2cM，与位点NoaE2H7相距8.28cM，分子量大小为370，由引物S16扩增获得，引物序列如SEQ ID NO.13所示；S14-676的连锁图谱距离为70.7cM，与位点NoaE2H7相距8.22cM，分子量大小为676，由引物S14扩增获得，引物序列如SEQ ID NO.12所示；
主效QTL位点NoaE2H8的分子标记为S11-700和E16M18-109，位点NoaE2H8的距离区间为8cM；
其中位点NoaE2H8接近分子标记E16M18-109，E16M18-109的连锁图谱距离为102.1cM，与位点NoaE2H8相距14.42cM，分子量大小为109，由引物对E16M18扩增获得，正向引物：序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物：序列如SEQ ID NO.8所示；S11-700的连锁图谱距离为70.7cM，与位点NoaE2H8相距16.98cM，分子量大小为700，，由引物S11扩增获得，引物序列如SEQ ID NO.11所示。
8.权利要求1-6任一项菊花抗蚜性关联分子标记的筛选方法在抗蚜性菊花育种上的应用，其特征在于：
菊花抗蚜基因定位：提取待测菊花的基因组，(1)分别以引物对SR149、E8M9进行PCR扩增，产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳后分析，如果分子量大小为268和215的分子标记出现，则说明在2个分子标记间存在菊花抗蚜性主效QTL位点NoaE2G1；
(2)以引物对E12M18进行PCR扩增，产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳后分析，如果分子量大小为99和80的分子标记出现，则说明在2个分子标记间存在菊花抗蚜性主效QTL位点NoaE2G7；
(3)以引物对E16M6、SR197进行PCR扩增，产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳后分析，如果分子量大小为113和113的2个分子标记出现，则说明在2个分子标记间存在菊花抗蚜性主效QTL位点NoaE1H3；
(4)以引物对S14、S16进行PCR扩增，产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳后分析，如果分子量大小为676和370的2个分子标记出现，则说明在2个分子标记间存在菊花抗蚜性主效QTL位点NoaE2H7；
(5)以引物对S11、E16M18进行PCR扩增，产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳后分析，如果分子量大小为700和109的2个分子标记出现，则说明在2个分子标记间存在菊花抗蚜性主效QTL位点NoaE2H8。
抗蚜性菊花筛选：如果待测菊花经过步骤(1)和/或步骤(2)和/或步骤(3)和/或步骤(4)和/或步骤(5)检测后出现上述步骤中所述的菊花抗蚜性主效QTL位点，则可预测该待测菊花具有抗蚜性或抗蚜性潜力。
9.权利要求7所述的分子标记在菊花育种中的应用，其特征在于：
菊花抗蚜基因定位：提取待测菊花的基因组，(1)分别以引物对SR149、E8M9进行PCR扩增，产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳后分析，如果分子量大小为268和215的分子标记出现，则说明在2个分子标记间存在菊花抗蚜性主效QTL位点NoaE2G1；
(2)以引物对E12M18进行PCR扩增，产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳后分析，如果分子量大小为99和80的分子标记出现，则说明在2个分子标记间存在菊花抗蚜性主效QTL位点NoaE2G7；
(3)以引物对E16M6、SR197进行PCR扩增，产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳后分析，如果分子量大小为113和113的2个分子标记出现，则说明在2个分子标记间存在菊花抗蚜性主效QTL位点NoaE1H3；
(4)以引物对S14、S16进行PCR扩增，产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳后分析，如果分子量大小为676和370的2个分子标记出现，则说明在2个分子标记间存在菊花抗蚜性主效QTL位点NoaE2H7；
(5)以引物对S11、E16M18进行PCR扩增，产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳后分析，如果分子量大小为700和109的2个分子标记出现，则说明在2个分子标记间存在菊花抗蚜性主效QTL位点NoaE2H8；
抗蚜性菊花筛选：如果待测菊花经过步骤(1)和/或步骤(2)和/或步骤(3)和/或步骤(4)和/或步骤(5)检测后出现上述步骤中所述的菊花抗蚜性主效QTL位点，则可预测该待测菊花具有抗蚜性或抗蚜性潜力。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106446596A (zh) * 2016-07-15 2017-02-22 南京农业大学 一种与菊花耐涝性显著相关的分子标记及其鉴定方法和应用
CN109769688A (zh) * 2019-01-27 2019-05-21 云南省农业科学院甘蔗研究所 一种构建甘蔗抗褐锈病基因定位遗传分离群体的方法
CN111024897A (zh) * 2019-12-25 2020-04-17 西藏自治区农牧科学院蔬菜研究所 一种光核桃花的资源系统评价和筛选方法
CN113249515A (zh) * 2021-07-02 2021-08-13 仲恺农业工程学院 一种菊花叶绿体基因组ssr标记库、其获得方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101831460A (zh) * 2010-02-02 2010-09-15 浙江省亚热带作物研究所 一种通过转基因提高菊花抗蚜虫性的方法
WO2014104350A1 (ja) * 2012-12-30 2014-07-03 国立大学法人東北大学 病原菌および害虫の駆除方法ならびに病原菌および害虫の駆除装置

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101831460A (zh) * 2010-02-02 2010-09-15 浙江省亚热带作物研究所 一种通过转基因提高菊花抗蚜虫性的方法
WO2014104350A1 (ja) * 2012-12-30 2014-07-03 国立大学法人東北大学 病原菌および害虫の駆除方法ならびに病原菌および害虫の駆除装置

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张飞等: "菊花开花持续期的QTL定位", 《园艺学报》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106446596A (zh) * 2016-07-15 2017-02-22 南京农业大学 一种与菊花耐涝性显著相关的分子标记及其鉴定方法和应用
CN106446596B (zh) * 2016-07-15 2019-04-30 南京农业大学 与菊花耐涝性显著相关的分子标记及其鉴定方法和应用
CN109769688A (zh) * 2019-01-27 2019-05-21 云南省农业科学院甘蔗研究所 一种构建甘蔗抗褐锈病基因定位遗传分离群体的方法
CN111024897A (zh) * 2019-12-25 2020-04-17 西藏自治区农牧科学院蔬菜研究所 一种光核桃花的资源系统评价和筛选方法
CN113249515A (zh) * 2021-07-02 2021-08-13 仲恺农业工程学院 一种菊花叶绿体基因组ssr标记库、其获得方法及其应用
CN113249515B (zh) * 2021-07-02 2022-01-21 仲恺农业工程学院 一种菊花叶绿体基因组ssr标记库、其获得方法及其应用

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