CN104351037A - Nk718三系配套杂交种制种方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种NK718三系配套杂交种制种方法，本发明提供了一种杂交制种的方法，包括如下步骤：以玉米不育系S京464为不育系，玉米自交系京464为保持系，玉米自交系京2416为恢复系，进行三系配套制种，得到杂交种NK718。本发明的实验证明，本发明利用育成的不育系S京464、保持系京464和恢复系京2416进行NK718三系配套杂交种制种，配制的不育化杂交种NK718种子在产量、抗性及其他农艺性状上与常规制种方法生产的NK718种子基本相同。

Description

NK718三系配套杂交种制种方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种NK718三系配套杂交种制种方法。

背景技术

强优势杂交种的选育和推广是提高玉米产量的重要途径。利用常规的制种方法配制杂交种需要对母本进行人工去雄，不仅耗费大量的劳动力，增加种子生产成本，且存在由于去雄不及时、不彻底影响种子质量的潜在风险。利用雄性不育系制种是保证种子纯度提高玉米产量的一种有效方法。

早在上世纪五六十年代，国内外就开始了对玉米不育化制种的研究。细胞质雄性不育由于容易实现不育系、保持系和恢复系的配套，是玉米育种中利用的主要类型。细胞质雄性不育系可划分为T、S和C型。60年代初，T型不育系引入我国。由于对玉米小斑病“T小种”专化性侵染，T型不育系的应用受到严重限制。70年代，我国育种工作者从国外引进C型、S型不育系。C型不育系虽然不育性较稳定、彻底，但其恢复系通常需要重新转育，周期长且步骤繁琐，导致该型不育系在实践中难以普及应用。S型不育系是3种类型中最大的一个组，已有研究证明昌7-2等黄改系材料是其天然强恢复系。但S型不育系的育性因基因型背景的不同而有较大差异，在特定的遗传背景下育性高度稳定。国内优良玉米杂交种的父本多属黄改种质，因此充分利用S型不育系可以节省恢复系的转育工作，是实现快速不育化制种研究和应用的有效途径。

实现玉米细胞质雄性不育化制种的关键是不育系、保持系和恢复系的选育。选育不育系最常用的方法是回交转育法，即用稳定的不育系作非轮回亲本，选择优良自交系作轮回亲本，进行多代回交，育成不育性稳定的优良不育自交系，而原轮回亲本便是该不育系的保持系。但仅仅利用传统的回交转育方法，一般需回交5-6代，转育周期较长，延缓了不育化制种技术在玉米杂交种上的应用。利用回交转育方法进行恢复系的选育比不育系更为复杂，在回交的同时要进行测交，以测交结果作为恢复系的选择标准；或在回交转育中利用不育细胞质提供育性的指标性状。由于选育过程相对繁琐，在恢复系尚未育成或只有部分恢复性的情况下，须将不育化的杂交种子与正常杂交种种子按适当比例掺合使用，这就给种子生产在技术和管理上提出了更高的要求。因此，如何加快不育系的选育速度、简化恢复系的选育过程，是目前雄性不育化制种技术亟需解决的问题。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种杂交制种的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：以玉米不育系S京464为不育系，玉米自交系京464为保持系，玉米自交系京2416为恢复系，进行三系配套制种，得到杂交种NK718。

上述方法中，所述不育系S京464为按照包括如下步骤的方法转育：

a)玉米不育系S京724做母本，京464做父本杂交，得到雄性不育杂交子代F₁；

b)以所述雄性不育杂交子代F₁为母本、与京464回交，得到雄性不育BC₁代群体；

c)以所述雄性不育BC₁代群体单株为母本、与京464继续回交，得到京464的雄性不育系。

上述方法中，在步骤b)和c)之间，还包括分子鉴定的步骤，所述分子鉴定为用SSR核心引物umc2105k3、bnlg240k1、umc1231k4对所述雄性不育BC₁代群体单株进行PCR扩增实现分子鉴定，选取扩增图谱与用同样引物对所述京464PCR扩增得到的图谱相同的雄性不育BC₁代单株；由于40个SSR核心引物中，S京724和京464只在umc2105k3、bnlg240k1、umc1231k4这三对引物上存在差异，因此只需要检测这三对引物。

所述核心引物umc2105k3是由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成的引物对；

所述核心引物bnlg240k1是由序列表中序列29所示的单链DNA分子和序列表中序列30所示的单链DNA分子组成的引物对；

所述核心引物umc1231k4是由序列表中序列75所示的单链DNA分子和序列表中序列76所示的单链DNA分子组成的引物对。

上述方法中，为了减少工作量，在步骤b)和c)之间的分子鉴定前还包括表型鉴定的步骤，所述表型鉴定为选取所述雄性不育BC₁代群体中表型与京464一致的BC₁代单株。

上述表型与所述玉米京464一致为表型与玉米京464完全相同或接近；表型具体为株高、穗位高、株型、雄穗分枝数和/或果穗性状等。

上述方法中，所述不育系S京724为按照包括如下步骤的方法选育：以玉米S型细胞质雄性不育系MD32CGMCC No.8657为供体、玉米自交系京724为受体，进行回交转育，得到京724的雄性不育系S京724。

上述方法中，所述回交次数为3次。

上述方法中，所述回交转育包括如下步骤：

1)以玉米雄性不育系MD32CGMCC No.8657为供体、玉米自交系京724为受体，杂交，得到雄性不育杂交子代F₁；

2)以雄性不育杂交子代F₁为母本、与京724回交，得到雄性不育BC₁代群体；

3)以雄性不育BC₁代单株为母本、与京724继续回交，得到雄性不育BC₂代群体；

4)以雄性不育BC₂代单株为母本、与京724继续回交，得到京724的雄性不育系S京724。

上述方法中，在步骤2)和步骤3)之间，还包括如下分子鉴定的步骤：从所述雄性不育BC₁代群体中选取与所述玉米京724遗传相似度在92.5-95％的雄性不育BC₁代单株。

上述方法中，所述从所述雄性不育BC₁代群体中选取与所述玉米京724遗传相似度在92.5-95％的雄性不育BC₁代单株的方法包括如下步骤：用40对SSR核心引物分别对雄性不育BC₁代单株和玉米自交系京724进行PCR扩增，得到SSR谱带，通过比较BC₁代单株和玉米自交系京724的SSR图谱，计算遗传相似度；

所述遗传相似度计算公式：[1-(差异等位基因数/(2×比较总位点数))]×100％

所述差异等位基因数为用SSR核心引物扩增得到的所述雄性不育BC₁代单株SSR谱带带型与所述玉米自交系京724的SSR谱带带型不一致的等位基因数目；所述比较总位点数为40。

上述40对SSR核心引物中各个引物的序列分别为序列表中序列1-80所示，具体见实施例的表1。

上述方法中，为了减少工作量，在所述分子鉴定前还包括如下步骤：从所述雄性不育BC₁代群体中选取表型与所述玉米京724一致的雄性不育BC₁代单株。

上述方法中，在步骤3)和步骤4)之间，还具体包括如下分子鉴定的步骤：从所述雄性不育BC₂代群体中选取与所述玉米京724遗传相似度在98.75％-100％的雄性不育BC₂代单株。

所述从所述雄性不育BC₂代群体中选取与所述玉米自交系京724遗传相似度在98.75％-100％的雄性不育BC₂代单株的方法包括如下步骤：用引物A分别对雄性不育BC₂代单株和玉米自交系京724进行PCR扩增，得到SSR谱带，通过比较BC₂代单株和玉米自交系京724的SSR图谱，计算遗传相似度；

所述引物A为BC₂代单株对应的母本BC₁代与京724相比扩增带型不同的SSR引物；

所述遗传相似度计算公式：[1-(差异等位基因数/(2×比较总位点数))]×100％

所述差异等位基因数为用引物A扩增得到的所述雄性不育BC₂代单株SSR谱带带型与所述玉米自交系京724的SSR谱带带型不一致的等位基因数目；

所述比较总位点数为40。

上述方法中，在所述分子鉴定前还具体包括如下步骤：从所述雄性不育BC₂代群体中选取表型与所述玉米京724一致的雄性不育BC₂代单株。

上述表型与所述玉米京724一致为表型与玉米京724完全相同或接近；表型具体为株高、穗位高、株型、雄穗分枝数和/或果穗性状等。

本发明的另一个目的是提供培育不育系S京464的方法。

本发明提供的的方法，包括如下步骤：

a)玉米不育系S京724做母本，京464做父本杂交，得到雄性不育杂交子代F₁；

b)以所述雄性不育杂交子代F₁为母本、与京464回交，得到雄性不育BC₁代群体；

c)以所述雄性不育BC₁代群体单株为母本、与京464继续回交，得到京464的雄性不育系；

在步骤b)和c)之间，还具体包括分子鉴定的步骤，所述分子鉴定为用SSR核心引物umc2105k3、bnlg240k1、umc1231k4对所述雄性不育BC₁代群体单株进行PCR扩增，选取扩增图谱与用同样引物对所述京464进行PCR扩增得到的图谱相同的雄性不育BC₁代单株；

所述核心引物umc2105k3是由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成的引物对；

所述核心引物bnlg240k1是由序列表中序列29所示的单链DNA分子和序列表中序列30所示的单链DNA分子组成的引物对；

所述核心引物umc1231k4是由序列表中序列75所示的单链DNA分子和序列表中序列76所示的单链DNA分子组成的引物对；

在步骤b)和c)之间的分子鉴定前还具体包括表型鉴定的步骤，所述表型鉴定为选取所述雄性不育BC₁代群体中表型与京464一致的BC₁代单株。

上述玉米不育系S京464在杂交制种中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的实验证明，本发明具体有如下优势：

1、由于昌7-2等黄改材料是S型细胞质雄性不育系的强恢复系，NK718父本京2416为黄改种质，因此选择京2416具有强恢复性的S型不育系作为母本京464不育系转育的供体，节省了选育父本恢复系的繁琐工作；

2、选用已获得的与母本京464亲缘关系较近的不育系S京724为供体，结合分子标记辅助选择技术实现快速转育，仅回交两代即可获得玉米不育系S京464，具有配合力高、抗倒性好、耐密植等优点；

3、选用的S型不育系MD32不育性稳定、花粉败育彻底，在已报道的玉米杂交种雄性不育化制种研究中未见使用；

总之，本发明利用育成的不育系S京464、保持系京464和恢复系京2416进行NK718三系配套杂交种制种，配制的不育化杂交种NK718种子在产量、抗性及其他农艺性状上与常规制种方法生产的NK718种子基本相同，且节省了常规制种中母本人工去雄的时间和成本，消除了由于去雄不及时、影响种子质量的潜在风险。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、雄性不育系S京724的选育

一、不育系供体MD32细胞质雄性不育类型的确定

1、玉米不育系MD32

玉米不育系MD32选育过程：利用构建的X系群体(以X1132为基础)进行“高大严”选系，从中选择优良S5高代系与外引杂交种构建新的选系基础群体。在自交后代中发现不育株，雄穗花药不外露，选择同穗行表型相近的姊妹株对其进行成对授粉。杂交后代全部表现彻底不育，植株表型也趋向基本一致。遂将该材料命名为玉米雄性不育系MD32。

玉米不育系MD32不育性彻底：花药不外露；

玉米不育系MD32不育性稳定：在多种遗传背景下，不育性表现彻底；

玉米不育系MD32综合性状优良：种子芽势旺盛，出苗力强，幼苗叶鞘色紫色，叶片宽大，叶色浓绿，株型半紧凑，果穗筒型，粒型半硬粒型，综合抗性好。

玉米不育系MD32于2013年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.8657，该植株分类命名为玉米(Zea mays)。

2、不育系MD32细胞质雄性不育类型的确定

提取玉米不育系MD32幼苗的DNA作为模板，用如下表1的引物进行PCR扩增，得到扩增产物在Agarose凝胶上，90V电泳1小时30分钟。根据扩增片段图谱鉴别玉米MD32胞质不育类型。

结果，利用C、T型引物对MD32的DNA进行PCR扩增时，均未检测到扩增产物；利用S型引物对其进行检测时，PCR产物片段大小为885bp。因此确定MD32为S型细胞质雄性不育系。

表1 为鉴定胞质类型的引物

胞质类型	引物序列
		C-1	TGAAAGGGTGGTGGAATA
C-2	GAGCCAAAGTAATGAGAAAA
		S-1	GATGCTATGCTAAGCGAGAT
S-2	CCGCTAACCCACTCTTCT
		T-1	GTCGTGTCCTGGTAGCCT
T-2	CCTCCTTCATTCCGTTGT

二、玉米雄性不育系S京724的选育

1、雄性不育杂交子代F₁代的获得

第一年夏，以玉米雄性不育系MD32(非轮回亲本)做供体、京724(北京市农林科学院玉米研究中心，品种权申请公告号为CNA007811E)(轮回亲本)做受体杂交组配F₁代，收获F₁代的种子。

同年冬海南第一代，种植F₁代的种子，得到127株F₁代玉米植株。

127株F₁代玉米植株花药均不外露，不育性表现彻底。

2、回交一次BC₁代的获得

1)回交

以F₁代植株做母本，继续与轮回亲本京724回交，收获BC₁代群体的种子。

同年冬海南第二代，种植BC₁代群体的种子，得到BC₁代群体。

BC₁代群体花药均不外露，不育性表现彻底。

2)分子鉴定

从种植的2000株BC₁代群体中选择雄花完全不育、植株性状(株高、穗位高、株型、雄穗分枝数和果穗性状等)与京724接近的616个BC₁代单株挂牌标记；提取616个BC₁代单株叶片的DNA作为模板，利用40对SSR核心引物(表2)分别对每一株进行PCR扩增；以京724为对照。每对SSR核心引物对应一个位点；每个位点有2个等位基因。

表2 为40对SSR核心引物

每个BC₁代单株得到40个位点对应的PCR扩增图谱，与京724得到的40个位点对应的PCR扩增图谱进行比较，PCR扩增图谱谱带不一致的等位基因数目为差异等位基因数；比较总位点数为40。

遗传相似度计算公式：[1-(差异等位基因数/(2×比较总位点数))]×100％

根据扩增结果，选取与京724差异等位基因数最少的前30个单株作为下一轮回交的母本，且经过遗传相似度计算，前30个单株与京724间的遗传相似度均在92.5-95％之间。

3、回交二次BC₂代的获得

1)回交

以上述2选取的与京724遗传相似度在92.5-95％之间的BC₁代单株做母本，继续与轮回亲本京724回交，收获BC₂代群体的种子。

次年夏，种植BC₂代群体的种子，按穗行田间种植，每个穗行种植50株，共计1500株。

2)分子鉴定

选择雄花完全不育、植株性状与京724接近的300个BC₂代单株挂牌标记，分别提取300个BC₂代单株叶片的DNA作为模板，利用BC₂代单株对应的母本BC₁代与京724扩增带型不同的SSR引物对其进行PCR扩增；以京724为对照。

按照上述方法，计算遗传相似度，其中，差异等位基因数为雄性不育BC₂代单株SSR谱带带型与所述玉米自交系京724的SSR谱带带型不一致的等位基因数目，BC₂代群体的单株SSR谱带为用BC₂代单株对应的母本BC₁代与京724相比扩增带型不一致的SSR引物进行扩增得到的谱带；比较总位点数为40。

选取遗传相似度为98.75％-100％(与京724差异等位基因数最少的前30个单株)作为下一轮回交的母本。

4、回交3次不育系S京724的获得

以上述3选取的与京724遗传相似度在98.75％-100％之间的BC₂代单株做母本，继续与轮回亲本京724回交，收获BC₃代群体，即为不育系S京724。

不育系S京724花药不外露，不育性表现彻底。

三、常规转育与本发明方法的比较

常规转育与上述二的方法基本相同，不同的是不进行分子鉴定，结果回交6代，才能获得遗传背景回复到轮回亲本的不育系(遗传背景回复率见表3所示)。

计算遗传背景回复率G(g)＝[L+X(g)]/2L；其中，g指回交世代数，G(g)指在g代的遗传背景回复率；X(g)指在回交g代表现为受体亲本带型的分子标记数量；L指所参与分析的分子标记数量。

表3 为本发明方法与常规育种的背景回复率

从上述看出，本发明的方法利用分子标记辅助背景选择与回交转育相结合，只需要回交3代即获得了遗传背景回复到轮回亲本的不育系。

实施例2、母本京464不育系S京464的转育

由于京464和京724亲缘关系较近，因此选用不育系S京724作为京464不育系转育的供体材料。

以不育系S京724做母本，京464(北京市农林科学院玉米研究中心，品种权申请公告号为CNA007810E)做父本杂交组配F₁代，F₁代田间表现完全不育；

再以F₁代做母本，继续与京464回交得到BC₁代群体。

从种植的200株BC₁代群体中选择雄花完全不育、植株性状(株高、穗位高、轴色、雄穗分枝数、果穗性状和生育期等)与京464接近的60个单株挂牌标记；提取BC₁代单株叶片的DNA作为模板，利用40对SSR核心引物中在S京724和京464间存在差异的三对引物(表2中的umc2105k3、bnlg240k1、umc1231k4)分别对每一株进行PCR扩增；以京464为对照。选择与京464扩增图谱相同的单株，记作BC₁-A；

将BC₁-A与京464继续回交得到BC₂代群体，即母本京464的不育系S京464。

观察育性，不育系S京464花药不外露，不育性表现彻底。

实施例3、京2416对不育系S京464的恢复性鉴定

以由实施例2创制的不育系S京464做母本，京2416(北京市农林科学院玉米研究中心，品种权授权公告号为CNA004319G)做父本，杂交组配F₁代，收获F₁代的种子。次年，分别在北京、海南、吉林等多点田间种植F₁代，得到F₁代植株。观察鉴定F₁代植株雄穗的育性恢复情况，均表现为育性恢复正常。

说明京2416是不育系S京464的强恢复系，具有完全恢复能力。

实施例4、NK718三系配套制种

一、三系的繁殖

1、不育系繁殖

用由实施例2制备的不育系S京464进行不育系繁殖：

母本雄性不育系S京464在甘肃扩繁时，与其它玉米花粉来源地空间隔离距离不少于500米。不育系S京464与保持系京464按照8:2行比种植，种植密度为5500株/亩，授粉结束后砍除母本保持系，避免不育系中混入保持系种子。不育系繁殖产量一般在每亩400千克以上。

2、保持系繁殖

母本保持系京464的繁殖与常规亲本繁殖方法相同。在甘肃扩繁时，与其它玉米花粉来源地空间隔离距离不少于500米。保持系京464种植密度为5500株/亩，繁殖产量一般在每亩400千克以上。

3、恢复系繁殖

恢复系京2416的繁殖与常规亲本繁殖方法相同。在甘肃扩繁时，与其它玉米花粉来源地空间隔离距离不少于500米。恢复系京2416种植密度为6000株/亩，繁殖产量一般在每亩500千克以上。

二、不育化杂交种制种：

以不育系S京464为母本，京2416为父本，进行NK718杂交种不育化制种，具体如下：

在甘肃制种时，与其它玉米花粉来源地空间隔离距离不少于300米。将母本不育系S京464与父本京2416按照5:1行比种植，种植密度为5500株/亩，母本不育系与父本同期播种，授粉结束后砍除父本行，避免杂交种中混入父本种子。其中行比及父母本播种时间可根据制种实际情况做适当调整。

得到不育化杂交种NK718种子。

按照国家普通玉米品种区试项目的调查标准，检测不育化杂交种NK718产量、抗性及株型、株高、穗位高、穗型、穗长、穗行数、轴色、千粒重等农艺性状，具体测量方法如下：

1、产量：小区果穗风干后脱粒，称量籽粒干重，按标准水份(14％)折算，即为小区产量，再由小区产量折成亩产。

2、抗性：按照中华人民共和国农业行业标准《玉米抗病虫性鉴定技术规范》进行玉米螟、大斑病和丝黑穗病等玉米主要病虫害田间接种抗性鉴定，调查记录抗感情况。

3、农艺性状

1)株型：根据植株叶片的夹角大小，分紧凑、半紧凑、平展三种。

2)株高：在乳熟期连续取生育正常的植株10株(定义为取样株)，测量地面至雄穗顶端的高度，求其平均数。

3)穗位高：测量取样株由地面至第一果穗着生节位的高度，求其平均数。

4)穗型：根据果穗形状，分筒型、锥型两种。

5)穗长：测量取样株果穗从穗基部到顶端的长度，求其平均数。

6)穗行数：计数取样株果穗中部的籽粒行数。

7)轴色：分红、白两种。

8)千粒重：将取样株果穗脱粒后，籽粒充分混合，从中随机取500粒称重、重复取样3次，将两个相近数相加，即为千粒重。

结果不育化杂交种NK718的产量(籽粒重)为每亩867.3千克；

经田间抗性接种鉴定，抗玉米螟、中抗大斑病和丝黑穗病等；

株高294厘米，穗位高123厘米，筒型穗，穗长17.5厘米，穗行数16行，穗轴白色，千粒重333克。

采用常规制种(以京464为母本，以京2416为父本杂交得到NK718)的方法生产的NK718种子在产量、抗性及其他农艺性状上，与上述三系配套产生的NK718无显著差异，但是需要母本人工去雄的步骤，增加了制种成本。

因此说明制种成功。

Claims (10)

1.一种杂交制种的方法，包括如下步骤：以玉米不育系S京464为不育系，玉米自交系京464为保持系，玉米自交系京2416为恢复系，进行三系配套制种，得到杂交种NK718。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述不育系S京464为按照包括如下步骤的方法转育：

a)玉米不育系S京724做母本，京464做父本杂交，得到雄性不育杂交子代F₁；

b)以所述雄性不育杂交子代F₁为母本、与京464回交，得到雄性不育BC₁代群体；

c)以所述雄性不育BC₁代群体单株为母本、与京464继续回交，得到京464的雄性不育系。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

在步骤b)和c)之间，还包括分子鉴定的步骤，所述分子鉴定为用SSR核心引物umc2105k3、bnlg240k1、umc1231k4对所述雄性不育BC₁代群体单株进行PCR扩增，选取扩增图谱与用同样引物对所述京464进行PCR扩增得到的图谱相同的雄性不育BC₁代单株；

所述核心引物umc2105k3是由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成的引物对；

所述核心引物bnlg240k1是由序列表中序列29所示的单链DNA分子和序列表中序列30所示的单链DNA分子组成的引物对；

所述核心引物umc1231k4是由序列表中序列75所示的单链DNA分子和序列表中序列76所示的单链DNA分子组成的引物对。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

在步骤b)和c)之间的分子鉴定前还包括表型鉴定的步骤，所述表型鉴定为选取所述雄性不育BC₁代群体中表型与京464一致的BC₁代单株。

5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：

所述不育系S京724为按照包括如下步骤的方法选育：以玉米S型细胞质雄性不育系MD32CGMCC No.8657为供体、玉米自交系京724为受体，进行回交转育，得到京724的雄性不育系S京724。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述回交次数为3次；

所述回交转育具体包括如下步骤：

1)以玉米雄性不育系MD32CGMCC No.8657为供体、玉米自交系京724为受体，杂交，得到雄性不育杂交子代F₁；

2)以雄性不育杂交子代F₁为母本、与京724回交，得到雄性不育BC₁代群体；

3)以雄性不育BC₁代单株为母本、与京724继续回交，得到雄性不育BC₂代群体；

4)以雄性不育BC₂代单株为母本、与京724继续回交，得到京724的雄性不育系S京724。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：在步骤2)和步骤3)之间，还包括如下分子鉴定的步骤：从所述雄性不育BC₁代群体中选取与所述玉米京724遗传相似度在92.5-95％的雄性不育BC₁代单株。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：在所述分子鉴定前还包括如下步骤：从所述雄性不育BC₁代群体中选取表型与所述玉米京724一致的雄性不育BC₁代单株；

在步骤3)和步骤4)之间，还具体包括如下分子鉴定的步骤：从所述雄性不育BC₂代群体中选取与所述玉米京724遗传相似度在98.75％-100％的雄性不育BC₂代单株；

在所述分子鉴定前还具体包括如下步骤：从所述雄性不育BC₂代群体中选取表型与所述玉米京724一致的雄性不育BC₂代单株。

9.一种培育不育系S京464的方法，包括如下步骤：

a)玉米不育系S京724做母本，京464做父本杂交，得到雄性不育杂交子代F₁；

b)以所述雄性不育杂交子代F₁为母本、与京464回交，得到雄性不育BC₁代群体；

c)以所述雄性不育BC₁代群体单株为母本、与京464继续回交，得到京464的雄性不育系；

在步骤b)和c)之间，还具体包括分子鉴定的步骤，所述分子鉴定为用SSR核心引物umc2105k3、bnlg240k1、umc1231k4对所述雄性不育BC₁代群体单株进行PCR扩增，选取扩增图谱与用同样引物对所述京464进行PCR扩增得到的图谱相同的雄性不育BC₁代单株；

所述核心引物umc2105k3是由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成的引物对；

所述核心引物bnlg240k1是由序列表中序列29所示的单链DNA分子和序列表中序列30所示的单链DNA分子组成的引物对；

所述核心引物umc1231k4是由序列表中序列75所示的单链DNA分子和序列表中序列76所示的单链DNA分子组成的引物对；

在步骤b)和c)之间的分子鉴定前还具体包括表型鉴定的步骤，所述表型鉴定为选取所述雄性不育BC₁代群体中表型与京464一致的BC₁代单株。

10.权利要求1-9所述方法中的所述玉米不育系S京464在杂交制种中的应用。