CN104498475A - 一种菊花抗旱性关联分子标记的获得方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，提供一种菊花抗旱性关联分子标记的获得方法，用于菊花抗旱性优良基因的定位和克隆及菊花新品种的培育。该获得方法包括a.抗旱性鉴定；b.菊花品种群体结构分析；c.菊花品种亲缘关系分析；d、与菊花抗旱性紧密关联的分子标记的确定。本方法同时运用SRAP、SCoT和EST-SSR三种分子标记技术，原理各不相同且各有针对，得到的染色条带多态性好，重复性高，可以覆盖整个基因组且条带数量非常丰富，有利于获得与抗旱性紧密相关的分子标记。共获得菊花抗旱性关联分子标记8个，实现优良抗旱品种提早选择，定向选择和准确选择，可以减少工作量，大大提高菊花抗旱基因型的选择效率，从而加快育种进程。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种菊花抗旱性关联分子标记的获得方法，用于菊花抗旱性优良基因的定位和克隆及菊花新品种的培育。
背景技术
菊花是我国十大传统名花和世界四大切花之一，在花卉生产和园林绿化中占有重要地位。近年来，关于菊花株型、花器等观赏性状的遗传研究较多，在一定程度上推动了菊花杂交育种进程。但随着育种工作的不断深入，传统的杂交育种方法因无法定向改良特定性状而带来了一定的盲目性和局限性。分子标记辅助选择育种具有定向、节省人力和时间等多种优点，已成为育种工作的热点研究方向。
伴随着分子标记技术的迅速发展，传统的挖掘复杂数量基因位点的方法主要是通过构建分子标记连锁作图来进行定位，即通常所说的QTL遗传图谱定位，但是该方法需要先构建一定数量和要求的遗传群体，对于生长周期很长的果树或杂交、自交困难的作物来讲难度很大，所需要的实验周期较长，并且群体所包含的遗传信息受双亲的限制，只能分析有限的遗传差异，所供挖掘的优异基因位点也有限。相比之下，关联分析方法在这些方面就具有很多优势，其不需要专门构建作图群体，自然群体就可作为研究材料，群体中含有更为丰富的遗传信息，可以同时分析同一基因座的多个等位基因且具有更高的分辨率和精确度。
目前，我国的菊花生产条件还比较有限，在菊花种苗繁殖和栽培过程中的干旱胁迫会严重影响菊花的生长发育并造成外观品质下降。因此，提高菊花品种的抗旱性是菊花育种研究中的一个重要目标。然而目前关于菊花抗旱性关联分子标记的精确定位和克隆还尚未见报道。
发明内容
针对现有技术中菊花抗旱性优质基因的精确定位和克隆的研究在国内外几乎空白这一现状，本发明通过筛选出多个与菊花抗旱性基因位点紧密关联的分子标记，从而建立菊花抗旱性分子标记辅助选择体系，提高菊花优良抗旱性种质资 源的筛选效率，为菊花新品种选育提供技术支持。。
本发明的目的通过以下技术手段获得：
1、本发明提供一种菊花抗旱性关联分子标记的获得方法，该方法包括以下步骤：a、抗旱性鉴定：选取不同来源且无直接亲缘关系的菊花品种，分别进行自然失水胁迫处理和穴盘快速干旱两种干旱胁迫处理；不同时间连续观察记录所有品种的失水萎蔫情况，鉴定抗旱性得出抗旱性数据；对抗旱性数据进行基本描述性统计分析；
b、菊花品种群体结构分析：
1)提取菊花品种的基因组DNA；
2)随机选取菊花品种基因组DNA，对SRAP、SCoT和EST-SSR引物组合进行筛选，将筛选出的扩增条带清晰、稳定且多态性丰富的引物组合用于菊花品种的全基因组分子标记扫描，统计扫描得到的多态性条带数据结果；
3)对菊花品种群体进行类群划分，计算各个品种的Q值即某个品种的基因组变异源于某个群体的概率，并绘制出群体结构图；
c、菊花品种亲缘关系分析：根据三种标记的整合数据分析品种间的亲缘关系，得到亲缘关系系数K矩阵；
d、与菊花抗旱性紧密关联的分子标记的确定：应用TESSLE 3.0软件中的混合线性模型MLM进行抗旱性与分子标记的关联分析，将步骤b群体分析中所得到的各个品种的Q值和步骤c亲缘关系分析中得到的K矩阵都作为协变量计入模型；在抗旱性鉴定数据的关联分析中都检测到的分子标记位点即可确定为与菊花抗旱性紧密关联的分子标记，同时得出该标记位点的表型变异解释率R2。
2、本发明提供的一种菊花抗旱性关联分子标记的获得方法，其具体过程包括以下步骤：
a、试验材料及其抗旱性鉴定数据的获得：试验材料为不同来源且无直接亲缘关系的菊花品种，连续两年在所有品种10叶龄幼苗时分别进行自然失水胁迫处理和穴盘快速干旱两种干旱胁迫处理；不同时间连续观察记录所有品种的失水萎蔫情况，用隶属函数法求出各品种的平均隶属函数值作为抗旱性鉴定数据；利用Microsoft Excel 2007软件对两个年份的抗旱性鉴定数据分别进行基本描述性统计分析；
b、菊花品种群体结构分析：
1)采用CTAB微量法提取菊花品种的基因组DNA；
2)随机选取8个菊花品种基因组DNA对SRAP、SCoT和EST-SSR引物组合进行筛选，将筛选出的扩增条带清晰、稳定且多态性丰富的引物组合用于菊花品种的全基因组分子标记扫描，统计扫描得到的多态性条带数据结果；
3)运用STRUCTURE软件中的Bayesian方法对菊花品种群体进行基于数学模型的类群划分，得到每个供试品种相应的Q值，即某个品种的基因组变异源于某个群体的概率，并绘制出群体结构图；
c、菊花品种亲缘关系分析：应用SPAGeDi软件，根据三种标记的整合数据分析品种间的亲缘关系，得到亲缘关系系数K矩阵；
d、与菊花抗旱性紧密关联的分子标记的确定：应用TESSLE 3.0软件中的混合线性模型MLM进行抗旱性与分子标记的关联分析，将步骤b群体分析中所得到的各个品种的Q值和步骤c亲缘关系分析中得到的K矩阵都作为协变量计入模型；在两年抗旱性鉴定数据的关联分析中都检测到的分子标记位点即可确定为与菊花抗旱性紧密关联的分子标记，同时得出该标记位点的表型变异解释率R2。
3、上述1或2提供的一种菊花抗旱性关联分子标记的获得方法，其中，步骤a自然失水胁迫过程中以萎蔫指数作为抗旱性指标，穴盘快速干旱处理中以复水后植株死亡率作为抗旱性指标，综合两种处理的数据结果，用隶属函数法求出各品种的平均隶属函数值Xi作为最终各品种的抗旱性鉴定数据，由于萎蔫指数和死亡率均与抗旱性成负相关，隶属函数值Xi计算公式为：则Xi＝1-(X-Xmin)÷(Xmax-Xmin)；
公式中的X为某个品种某个指标的测定值，Xmin和Xmax为所有品种该指标的最小值和最大值；每个品种的最终隶属函数值为各个品种所有指标的隶属函数值的平均值，平均隶属函数值越大，其抗旱性越强。
4、上述1或2提供的一种菊花抗旱性关联分子标记的获得方法，其中，步骤b菊花品种的全基因组分子标记扫描中，标记条带的命名方法为“引物名-数字编号”，数字编号指该条带从电泳图谱上按分子量从大到小顺序数下来的编号。
5、上述1或2提供的一种菊花抗旱性关联分子标记的获得方法，其中，应用TESSLE 3.0软件中的混合线性模型MLM进行抗旱性与分子标记的关联分析， 若P＜0.01则认为标记位点与抗旱性状有显著关联，在两年抗旱性鉴定数据的关联分析中都检测到的分子标记位点即可确定为与菊花抗旱性紧密关联的分子标记。
6、本发明还提供根据上述1-5所述方法获得的菊花抗旱性关联分子标记，该菊花抗旱性关联分子标记包括EST-SSR34-2，P值为0.0013，扩增引物对为正向引物34F-CCTAGTATCAAAGCTGCGAACA，反向引物34R-CAATCGCGTTATCGTGTACC；E11M24-9，P值为0.0020，扩增引物对为正向引物M24-GACCAGTAAACCGGATG，反向引物E 11-GACTGCGTACGAATTTCG；E15M21-4，P值为0.0028，扩增引物对为正向引物M21-GTACATAGAACCGGAGT，反向引物E15-GACTGCGTACGAATTCTG；E3M2-8，P值为0.0030，扩增引物对为正向引物M2-TGAGTCCAAACCGGAGC，反向引物E3-GACTGCGTACGAATTGAC；E1M5-5，P值为0.0031，M5-TGAGTCCAAACCGGAAG，反向引物E1-GACTGCGTACGAATTAAT；EST-SSR34-3，P值为0.0035，扩增引物对为正向扩增引物34F-CCTAGTATCAAAGCTGCGAACA，反向扩增引物34R-CAATCGCGTTATCGTGTACC；EST-SSR27-8，P值为0.0043，扩增引物对为正向扩增引物27F-ATCCCATCATATCCCATCCA，反向扩增引物27R-TATTGGGAGGATGCCTTTTG；E9M24-2，P值为0.0093，扩增引物对为正向扩增引物M24-GACCAGTAAACCGGATG，反向扩增引物E9-GACTGCGTACGAATTACG。
7、上述1-5任一项菊花抗旱性关联分子标记的获得方法在抗旱性菊花育种的应用。
8、上述6获得的菊花抗旱性关联分子标记在抗旱性菊花育种的应用。
有益效果：
本发明选用来源广泛且无直接亲缘关系的159个菊花品种自然群体为材料，利用SRAP、SCoT和EST-SSR三种标记技术对其进行全基因组分子扫描，得到了该群体的群体结构和亲缘关系，结合对该群体所有品种连续两年的抗旱性鉴定评价数据，运用关联分析方法获得了与抗旱性紧密关联的分子标记。其优点是：
(1)关联分析不需要专门构建作图群体，自然群体就可以作为研究材料， 可节省很多实验时间。同时所用的群体含有更为丰富的遗传信息，可以同时分析同一基因座的多个等位基因。关联分析的基础是连锁不平衡，利用的是自然群体在长期进化过程中累积的重组信息，一般LD的衰减距离较短，因此具有更高的分辨率，对目标基因位点定位更加精确。
(2)同时运用SRAP、SCoT和EST-SSR三种分子标记技术，他们的原理各不相同且各有针对，得到的染色条带多态性好，重复性高，可以覆盖整个基因组且条带数量非常丰富，有利于获得与抗旱性紧密相关的分子标记。
(3)得到与抗旱性紧密相关的分子标记后可进行分子标记辅助育种，实现优良抗旱品种提早选择，定向选择和准确选择，可以减少工作量，大大提高菊花抗旱基因型的选择效率，从而加快育种进程。
附图说明
图1群体数目散点曲线图，通过L(K)和ΔK判断合适的群体数；
图2159个菊花品种群体结构(K＝2)；
图3159个菊花品种的亲缘关系检测。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
(一)试验材料及其抗旱性强弱鉴定数据的获得
试验材料为不同来源且无直接亲缘关系，类型广泛、代表性强的159个菊花品种(表1)，所有材料保存于“中国菊花种质资源保存中心”，如果其他同行需要，南京农业大学“中国菊花种质资源保存中心”可向国内单位提供这些种质。分别于连续两年的春季取所有品种的健康脚芽进行穴盘扦插育苗，待扦插苗生根并生长至10叶龄幼苗时分别进行自然失水胁迫处理和穴盘快速干旱两种干旱胁迫处理。
表1 供试的159个菊花品种
自然失水胁迫处理参考张常青的方法(张常青，洪波，李建科，高俊平2005地被菊花幼苗耐旱性评价方法研究.中国农业科学04:789-796)，将穴盘中已生根的幼苗取出，冲洗去除根部的基质，拭干水分后称取其胁迫处理前的质量，然 后将植株平放于玻璃培养皿内，置于室内，让其在空气中逐渐失水，分别于1h、2h、3h后拍照并记录植株萎蔫情况，于1.5h后称取其胁迫处理后的植株质量，每个品种测定5个植株的数据。穴盘快速干旱处理方法是将所有供试品种的穴盘生根苗同一时间开始停止浇水，穴盘放置于塑料小拱棚内，连续观察记录干旱处理后2～5天植株的萎蔫情况，在第6天进行复水，观察记录复水后不同品种植株的成活和恢复情况。
两种干旱处理后观察植株萎蔫情况，记录不同品种的萎蔫指数。萎蔫指数分为5级，1级：植株挺直，叶片自然伸展，基本没有出现萎蔫；2级：植株基本挺直，最下层叶片发软下垂，中上层叶片均自然伸展；3级：植株顶端稍有萎蔫弯曲，中下层叶片出现下垂；4级：植株顶端萎蔫弯曲，所有叶片均出现不同程度的皱缩下垂；5级：植株萎蔫严重，所有叶片皱缩明显。每个品种每个时间点记录5个植株的萎蔫指数，取其算数平均值。穴盘快速干旱处理复水后统计不同品种的植株死亡率，并且参照上述分级标准记录植株形态的恢复情况。
采用隶属函数法求出每个指标(两种失水胁迫处理后的萎蔫指数、自然失水胁迫后鲜重损失率、穴盘快速干旱处理后植株死亡率)的隶属函数值，计算公式为：
指标数据(两种失水胁迫处理后的萎蔫指数、自然失水胁迫后鲜重损失率、穴盘快速干旱处理后植株死亡率)与抗旱性是负相关关系，采用公式：Xi＝1-(X-Xmin)÷(Xmax-Xmin)；
公式中的X为某个品种某个指标的测定值，Xmin和Xmax为所有品种该指标的最小值和最大值。用各个品种所有指标(两种失水胁迫处理后的萎蔫指数、自然失水胁迫后鲜重损失率、穴盘快速干旱处理后植株死亡率)的隶属函数值的平均值大小来评价该品种的抗旱性，平均隶属函数值越大，其抗旱性越强。
利用Microsoft Excel 2007软件对两个年份的抗旱性鉴定数据分别进行基本描述性统计分析。从表2可以看出，两年所有品种的抗旱隶属函数值范围分别为是0.23-0.87和0.20-0.92，平均值分别为0.57和0.54，变异系数分别为26.3％和27.7％。
表2 159个菊花品种抗旱性隶属函数值的统计分析
(二)菊花品种群体结构分析：
1)参照CTAB微量法(Murray&Thompson，1980)提取159个菊花品种基因组DNA，Lambda DNA琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和质量，最后用ddH2O稀释至50ng/μL，置于-20℃冰箱保存备用。
2)随机选取8个菊花品种基因组DNA对SRAP、SCoT和EST-SSR引物组合进行筛选。实验用的Lambda DNA、TaqDNA聚合酶、dNTPs均购自宝生物工程(大连)有限公司，SRAP、SCoT和EST-SSR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
SRAP-PCR的10μL扩增体系中：10×PCR Buffer 1.0μL，Mg2+2.25mM、dNTPs 0.225mM、前后引物各5μM、TaqDNA聚合酶0.5U、模板DNA 50ng。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，35℃复性1min，2℃延伸1min，共5个循环；94℃变性1min；50℃复性1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存备用。
SCoT-PCR的25μL扩增体系中：Mg2+1.20mM、dNTPs 0.15mM，引物4μM，Taq DNA聚合酶1U，模板DNA 50ng。扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性50s，49.4℃退火35s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸7min，4℃保存备用。
EST-SSR-PCR的25μL体系中：10×PCR Buffer 2.5μL，Mg2+1.50mM、dNTPs 0.20mM、前后引物各4μM、TaqDNA聚合酶1.0U、模板DNA 35ng。扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，54℃复性30s，72℃延伸30s，共34个循环；72℃延伸7min，4℃保存备用。
三种分子标记的PCR扩增产物均用8％非变性聚丙稀酰胺凝胶(PAGE)电泳检测，银染法染色。
统计三种分子标记条带时，在电泳图谱的相同迁移位置上，有条带的记为1，没有条带的记为0，因不同原因造成带型不清或数据缺失的记为N(在后续软件分析中根据不同软件的录入数据要求转换成相应的记录形式)，标记条带的命名方法为“引物名-数字编号”，数字编号指该条带从电泳图谱上按分子量从大到 小顺序数下来的编号，如“E19M21-3”表示SRAP标记E19M21引物组合得到的电泳图谱上的第3条条带，“p35-12”表示SCoT标记35号引物得到的第12条条带，“EST-SSR150-6”表示EST-SSR标记150号引物得到的第6条条带。
共筛选出38对SRAP引物(表3)，共扩增出406条多态性条带，每对引物扩增条带5-18条，平均为10.68条；7个SCoT引物(表4)，共扩增出50条多态性条带，每对引物扩增条带2-10条，平均为7.14条；31对EST-SSR引物(表5)，共扩增出297条多态性条带，每对引物扩增条带3-17条，平均为9.58条(表6)。所有品种中扩增条带出现率小于5％的条带共有46条，其中35条SRAP条带、1条SCoT条带和10条EST-SSR条带，在后续实验中将它们去除，以减小偶然性误差。
表3 筛选出的38对SRAP引物组合序列
表4 筛选出的7个SCoT引物序列
表5 筛选出的31对EST-SSR引物组合序列
表6 SRAP，SCoT和EST-SSR标记在菊花基因组中的扩增多样性
3)运用STRUCTURE软件中的Bayesian方法对菊花品种群体进行基于数学 模型的类群划分，先假设群体数目(K)为1-15，将MCMC(Markov Chain Monte Carlo)开始时的不作数迭代(1ength ofburn-in period)设为10000次，并假定位点都是独立的，每个K值独立运算5次，然后根据似然函数值最大的原则和ΔK值(Evanno et al.2005)来确定合适的K值并绘制散点曲线图。结果显示对数似然函数值【L(K)】随着设定的K值的增大而持续增大，无法确定出可靠的K值(图1A)；而ΔK在K＝2的时候最大(图1B)，当K继续增大时ΔK迅速减小，散点曲线陡直，因此判断出K值应取2，即159个菊花品种可以被分成2个主要的亚群，群体结构图如图2所示。亚群1(Popl)包含100个品种，其中86个品种的Q值大于0.60，即品种的基因组变异源于这个亚群的概率大于60％，其余14个Q值小于0.60的品种被划至混合群；亚群2(Pop2)包含59个品种，其中Q值大于0.60的有47个品种，另外12个品种的Q值小于0.60，也被划至混合群。这样混合群共有26个品种。
(三)菊花品种亲缘关系分析
应用SPAGeDi软件，根据三种标记的整合数据(371个SRAP条带数据，49个SCoT条带数据和287个EST-SSR条带数据)分析品种间的亲缘关系，得到亲缘关系系数矩阵(K矩阵)，矩阵中每个数值的范围是0-1，取值越小表示这两个品种之间的亲缘关系越远，反之则表示品种间的亲缘关系越近。得到的成对品种间亲缘关系系数的频数分布如图3。结果显示52.7％的品种间亲缘关系系数为0，21.3％的品种间亲缘关系系数小于0.05，品种间亲缘关系系数大于等于0.3的仅占1.2％，所有供试菊花品种间的亲缘关系系数平均值为0.074，说明供试菊花群体品种间的亲缘关系很弱，适合进行关联分析，得到的亲缘关系系数矩阵(K矩阵)将作为后续关联分析模型中的协变量。
(四)与菊花抗旱性紧密关联的分子标记的确定
应用TESSLE 3.0软件中的混合线性模型(mixed linear model，MLM)进行抗旱性与分子标记的关联分析，将步骤(二)群体分析中所得到的各个品种的Q值和步骤(三)亲缘关系分析中得到的矩阵(K矩阵)都作为协变量计入模型。若P＜0.01则认为标记位点与性状有显著关联，在两年抗旱性鉴定数据的关联分析中都检测到的分子标记位点即可确定为与菊花抗旱性紧密关联的分子标记，同时得出该标记位点的表型变异解释率(R2)。
结果显示(表7)，分别有13个和11个标记位点与品种的抗旱性显著关联(P＜0.01)，其中两年都检测到显著相关位点有8个，以“★”表示，显著性最大的是EST-SSR27-8(P＝7.00E-04)。关联位点的表型变异解释率范围是4.40％-7.57％，平均为5.63％，其中位点EST-SSR27-8不仅显著性最大而且表型变异解释率也最大。获得的这些与抗旱性显著关联的分子标记位点将为今后分子标记辅助育种技术在抗旱性菊花品种选育中的应用奠定重要基础。
表7 与抗旱性显著相关的标记位点(P＜0.01)
★表示标记位点在2011年和2012年都检测到与抗旱性显著相关。
可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种菊花抗旱性关联分子标记的获得方法，其特征在于包括以下步骤：a、抗旱性鉴定：选取不同来源且无直接亲缘关系的菊花品种，分别进行自然失水胁迫处理和穴盘快速干旱两种干旱胁迫处理；不同时间连续观察记录所有品种的失水萎蔫情况，鉴定抗旱性得出抗旱性数据；对抗旱性数据进行基本描述性统计分析；
b、菊花品种群体结构分析：
1)提取菊花品种的基因组DNA；
2)随机选取菊花品种基因组DNA，对SRAP、SCoT和EST-SSR引物组合进行筛选，将筛选出的扩增条带清晰、稳定且多态性丰富的引物组合用于菊花品种的全基因组分子标记扫描，统计扫描得到的多态性条带数据结果；
3)对菊花品种群体进行类群划分，计算各个品种的Q值即某个品种的基因组变异源于某个群体的概率，并绘制出群体结构图；
c、菊花品种亲缘关系分析：根据三种标记的整合数据分析品种间的亲缘关系，得到亲缘关系系数K矩阵；
d、与菊花抗旱性紧密关联的分子标记的确定：应用TESSLE 3.0软件中的混合线性模型MLM进行抗旱性与分子标记的关联分析，将步骤b群体分析中所得到的各个品种的Q值和步骤c亲缘关系分析中得到的K矩阵都作为协变量计入模型；在抗旱性鉴定数据的关联分析中都检测到的分子标记位点即可确定为与菊花抗旱性紧密关联的分子标记，同时得出该标记位点的表型变异解释率R2。
2.一种菊花抗旱性关联分子标记的获得方法，其特征在于包括以下步骤：
a、抗旱性鉴定：试验材料为不同来源且无直接亲缘关系的菊花品种，连续两年在所有品种10叶龄幼苗时分别进行自然失水胁迫处理和穴盘快速干旱两种干旱胁迫处理；不同时间连续观察记录所有品种的失水萎蔫情况，用隶属函数法求出各品种的平均隶属函数值作为抗旱性鉴定数据；利用Microsoft Excel 2007软件对两个年份的抗旱性鉴定数据分别进行基本描述性统计分析；
b、菊花品种群体结构分析：
1)采用CTAB微量法提取菊花品种的基因组DNA；
2)随机选取8个菊花品种基因组DNA对SRAP、SCoT和EST-SSR引物组合进行筛选，将筛选出的扩增条带清晰、稳定且多态性丰富的引物组合用于菊花品种的全基因组分子标记扫描，统计扫描得到的多态性条带数据结果；
3)运用STRUCTURE软件中的Bayesian方法对菊花品种群体进行基于数学模型的类群划分，得到每个供试品种相应的Q值，即某个品种的基因组变异源于某个群体的概率，并绘制出群体结构图；
c、菊花品种亲缘关系分析：应用SPAGeDi软件，根据三种标记的整合数据分析品种间的亲缘关系，得到亲缘关系系数K矩阵；
d、与菊花抗旱性紧密关联的分子标记的确定：应用TESSLE 3.0软件中的混合线性模型MLM进行抗旱性与分子标记的关联分析，将步骤b群体分析中所得到的各个品种的Q值和步骤c亲缘关系分析中得到的K矩阵都作为协变量计入模型；在两年抗旱性鉴定数据的关联分析中都检测到的分子标记位点即可确定为与菊花抗旱性紧密关联的分子标记，同时得出该标记位点的表型变异解释率R2。
3.权利要求1或2所述的一种菊花抗旱性关联分子标记的获得方法，其特征在于：步骤a自然失水胁迫过程中以萎蔫指数作为抗旱性指标，穴盘快速干旱处理中以复水后植株死亡率作为抗旱性指标，综合两种处理的数据结果，用隶属函数法求出各品种的平均隶属函数值Xi作为最终各品种的抗旱性鉴定数据，由于萎蔫指数和死亡率均与抗旱性成负相关，隶属函数值Xi计算公式为：则Xi＝1-(X-Xmin)÷(Xmax-Xmin)；
公式中的X为某个品种某个指标的测定值，Xmin和Xmax为所有品种该指标的最小值和最大值；每个品种的最终隶属函数值为各个品种所有指标的隶属函数值的平均值，平均隶属函数值越大，其抗旱性越强。
4.权利要求1或2所述的一种菊花抗旱性关联分子标记的获得方法，其特征在于：步骤b菊花品种的全基因组分子标记扫描中，标记条带的命名方法为“引物名-数字编号”，数字编号指该条带从电泳图谱上按分子量从大到小顺序数下来的编号。
5.权利要求1或2所述的一种菊花抗旱性关联分子标记的获得方法，其特征在于：应用TESSLE 3.0软件中的混合线性模型MLM进行抗旱性与分子标记的关联分析，若P＜0.01则认为标记位点与抗旱性状有显著关联，在两年抗旱性鉴定数据的关联分析中都检测到的分子标记位点即可确定为与菊花抗旱性紧密关联的分子标记。
6.根据权利要求1-5所述方法获得的菊花抗旱性关联分子标记，其特征在于，菊花抗旱性关联分子标记包括：EST-SSR34-2，P值为0.0013，扩增引物对为正向引物34F-CCTAGTATCAAAGCTGCGAACA，反向引物34R-CAATCGCGTTATCGTGTACC；E11M24-9，P值为0.0020，扩增引物对为正向引物M24-GACCAGTAAACCGGATG，反向引物E11-GACTGCGTACGAATTTCG；E15M21-4，P值为0.0028，扩增引物对为正向引物M21-GTACATAGAACCGGAGT，反向引物E15-GACTGCGTACGAATTCTG；E3M2-8，P值为0.0030，扩增引物对为正向引物M2-TGAGTCCAAACCGGAGC，反向引物E3-GACTGCGTACGAATTGAC；E1M5-5，P值为0.0031，M5-TGAGTCCAAACCGGAAG，反向引物E1-GACTGCGTACGAATTAAT；EST-SSR34-3，P值为0.0035，扩增引物对为正向扩增引物34F-CCTAGTATCAAAGCTGCGAACA，反向扩增引物34R-CAATCGCGTTATCGTGTACC；EST-SSR27-8，P值为0.0043，扩增引物对为正向扩增引物27F-ATCCCATCATATCCCATCCA，反向扩增引物27R-TATTGGGAGGATGCCTTTTG；E9M24-2，P值为0.0093，扩增引物对为正向扩增引物M24-GACCAGTAAACCGGATG，反向扩增引物E9-GACTGCGTACGAATTACG。
7.权利要求1-5任一项菊花抗旱性关联分子标记的获得方法在抗旱性菊花育种的应用。
8.权利要求6获得的菊花抗旱性关联分子标记在抗旱性菊花育种的应用。
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