CN105454047A - 一种大花序桉的组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大花序桉的组培快繁方法，该方法采用大花序桉优良家系的优良单株，伐倒后促生萌芽，利用萌芽作为外殖体，以带有潜伏芽的茎段离体诱导无菌芽，无菌芽的获得，不经过愈伤组织成苗途径，而是直接由外植体茎段萌生侧芽或不定芽，经过对无菌芽进行继代增殖培养、生根培养和生根苗移栽，获得再生植株。本发明的大花序桉组培快繁方法，操作难度较低、无菌芽繁殖体系生长稳定，重复性良好，可反复多代规模扩繁，剪切芽苗生根培养后，生根率较高，已具备推广价值，生根小苗移植后能成活，苗木生长正常，获得的再生植株大田种植后能健壮生长，造林成活率95%以上,并能保持优树的优良遗传性状。
Description
技术领域
本发明涉及桉树栽培技术领域，特别是涉及一种大花序桉的组培快繁方法。
背景技术
桉树原产澳大利亚，是桃金娘科（Mytaceae)桉树属（Eucalyptus)、杯果木属（Angophora）、伞房属（Corymbia）3个属树种的统称。共有1039个种、亚种和变种，大花序桉属于桉树的一个种。因为天然分布在澳大利亚昆士兰州，故又名昆士兰桉。
桉树由于生长速度快，用途广泛，经济效益高，目前已经成为世界公认的三大人工林树种之一。桉树在我国的引种栽培和发展非常迅速，对中国林业的发展发挥了突出的作用。到2013年，中国桉树人工林面积达440万公顷，占我国森林面积的2.2%，但提供了占全国木材总量25%的木材。为缓解我国木材资源短缺，解决木材供需矛盾，维护我国生态安全发挥了十分重要作用。
但目前我国桉树木材的利用方式，主要是造纸和纤维板，而作为高档实木材被忽视。随着社会经济的发展，对木材的需求越来越大。据有关资料显示，2007年国内林木产品折算的木材消费总量约3.71亿立方米，但国内可供给量只有2.02亿立方米，实际消费缺口超过1亿立方米。而且木材消费呈刚性增长，预计到2020年，我国木材消费总量达到4.57-4.77亿立方米，木材供应缺口将长期保持在1-1.5亿立方米。木材供求矛盾十分突出，每年有40%以上木材需要从国外进口，因此，发展替代天然林实木材的桉树速生丰产林就显得十分迫切。
大花序桉是一种顶端优势强，自然整枝良好，干形通直的常绿高大乔木，树高可达35-45m，其木材呈黄褐色，沉重坚固，非常耐久，是很好的锯材，有桉树中的“红木”之称。该树种耐干旱贫瘠，抗病虫能力强，后期生长优势非常明显，是商品经营大径材的优良树种。
我国引种大花序桉始于1972年，在广东、广西、海南、福建、四川都做了引种试验。特别在1982-1989年间，通过中澳技术合作——东门桉树示范林项目实施，东门林场引种了大花序桉11个种源，建立了种源试验。到现在，树高达30-35m，平均胸径达到30-42cm，树干通直，生长良好，适合东门地区种植。
大花序桉生长迅速，后期生长优势明显，轮伐周期比尾叶桉、尾巨桉稍长，在12-15年，在实施国家木材战略储备林建设中，具有极重要的地位。同时也为解决速生桉的大量木材生产和保障生态安全的矛盾创造了条件。因为尾巨桉等速丰林在快速发展中，由于单纯追求经济效益的超短轮伐期利用，结果出现造林中树种单一，全部为短周期工业用材林，林分单纯，全为纯林，林地生物多样性不够丰富，产品用途单一，全部用于纸浆材和人造板，实木利用的树种很少，存在森林生态功能不够强，抵抗病虫害能力弱等问题。发展大花序桉正好弥补了尾巨桉等树种的不足。
大花序桉的优越性非常明确，可是，因为现在的存量很少，而且开花结实量不多，要扩大种植，种子要依靠进口，价格昂贵，种子播种后发芽率低，远低于尾叶桉，加上实生苗造林后遗传分化明显，进而制约了规模推广种植。同时，采用无性繁殖方式获得苗木，大花序桉是一种难生根树种，扦插繁殖生根困难，生根率几乎为零，因此，种苗问题已成为发展大花序桉的突出瓶颈。
为打破这一制约瓶颈，利用组培快繁方法是最有效的途径。
我国在20世纪70年代开展桉树组培研究，至今，在尾叶桉、巨桉、赤桉、园角桉及其杂交子代的组培繁育上，取得了长足的进步，已大规模应用于工厂化生产苗木造林。对于大花序桉组培育苗，有不少学者进行了尝试，取得一定进展，但由于各学者的研究结果不同，许多问题都有待进一步研究和解决。最关键的是，至今未见到有建立大花序桉组培无性系林分的报道。
广西国有东门林场立足于推广引种驯化成功的大花序桉种源，选取优良家系的优良单株，重视外植体的选择，直接用优树伐倒后的萌芽条作为外植体，由芽器官离体诱导无菌芽的途径获得无菌快繁体系，不经过愈伤组织途径，没有经过脱分化过程。这样的组培苗造林后能够保持母树的优良性状，造林后林相整齐，生长量高，是目前最佳的林木组培方式，目前，大花序桉组培育苗技术取得突破性进展，建立了大田种植的组培无性系苗木。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用引种驯化后适合本地生长的大花序桉优良种源/家系的优良单株，伐倒后萌芽条作外殖体，不经过愈伤组织途径,直接由芽器官离体诱导无菌芽进行组织培养，快速获得大量的再生植株的大花序桉的组培快繁方法，使用该方法得到的无菌繁殖体系，生长稳定，重复性良好，可反复多代规模扩繁，用无菌芽作生根培养，总的生根率达到72.8%以上，已具备推广价值，生根小苗移植后成活率高达78%，苗木生长正常，再生植株大田种植后，生长健壮，能保持优树的优良遗传性状。
为实现本发明的目的，采取如下技术方案：
一种大花序桉的组培快繁方法，是采用大花序桉优良家系的优良单株，对其进行伐桩萌芽，利用萌芽作为外殖体，通过带芽茎段离体诱导无菌芽，经过对无菌芽的继代增殖培养、生根培养和生根苗移栽，获得再生植株；
该方法的具体步骤如下：
（1）在澳大利亚引种的家系试验林中，经测试对比，选择出适合本地生长的大花序桉优良家系；
（2）在大花序桉优良家系中，通过测量胸径、树高、蓄积、连年生长量、木材材性以及干形指标，综合对比后选择出优良单株；
（3）将优良单株在离地面15-20cm高度处伐倒，促萌芽，当萌芽条长到12-18cm时，剪取萌芽条，用水浸泡基部带回实验室备用；
（4）萌芽条修剪去叶片、叶柄，用自来水流水冲洗3-5min,再用饱和洗衣粉溶液洗涤10min，用纯净水清洗干净；
（5）在超净工作台上，将萌芽条剪去嫩梢段和基部老化部分，留半木质化茎段，切成长2-3cm，保留有1-2个潜伏芽的切段做消毒材料；
（6）将待消毒材料置于高压灭菌处理过的无菌瓶中，用75%酒精溶液浸泡15-17s，无菌水清洗3-5次，洗去残留酒精，再用0.1%HgCL2溶液浸泡并适当搅拌，7-9min后倒去HgCL2溶液至专用收集罐中，用无菌水清洗材料5-6次；
（7）用镊子夹取清洗好的茎段，放置在灭菌的接种碟上，用灭菌过的滤纸吸干表面水分，切去叶柄和茎段的两端，接种到无菌芽诱导培养基上，全暗培养8-12天后，在温度26±2℃，光照12h/d,光照强度1500-2000lux条件下培养15-25天；
（8）外殖体萌芽后，侧芽和不定芽不断生长，萌芽15-20天后，选取没有污染的无菌芽，切割后转入继代增殖培养基上，在温度26±2℃，光照强度2000-2500lux条件下，培养18-23天，以促进丛芽增殖和生长，在增殖培养基上反复继代培养，无菌芽苗数量不断增多；
（9）当继代培养的芽苗长到2-3cm，并有3-4对叶片时，切取芽苗转入生根培养基上培养，温度28-30℃，光照强度1200-1500lux，培养6-10天，当切口冒出短根或根点，出根率达到30-40%时，移瓶至温度28-35℃，光照强度3000-5000lux的自然光下培养15-20天；
（10）生根齐全，苗高3-4cm的生根瓶苗，洗去琼脂，移栽至用KMnO4消毒过的黄心土和蛭石做基质的营养杯或轻基质育苗杯上，黄心土和蛭石的比例为5：1，培养60-80天，得到再生植株；
(11)将具有发育不完全根，苗高1.5-2.0cm的生根瓶苗，洗去琼脂，移栽到用KMnO4消毒过的黄心土+蛭石+河沙按照4:1:1做基质的营养杯，移栽前用ABT1生根粉100-500ppm水溶液浸泡10-30min，移栽后特殊培养25-30天，将长出真根的苗和未长出真根的苗分开管理，再培养60-80天后，得到再生植株。
上述的大花序桉的组培快繁方法中，所述的优良家系是指，从澳大利亚引种的种源/家系，通过栽培试验、测定分析，选择出适合本地生长、生长量高、抗逆性强，已成功驯化的家系/种群。
上述步骤的大花序桉的组培快繁方法中，所述的优良单株是指，经试验测定分析后，确定的优良家系中树高、胸径、蓄积量等生长指标突出，木材材性、干形、抗病虫害能力等指标优越的优势木个体。
上述步骤（7）中的无菌芽诱导培养基为：改良MS+N6苄基腺嘌呤（6-BA)1.0mg/L+萘乙酸0.2-0.4mg/L+维生素C(Vc)2.0mg/L+核黄素(维生素B2)7.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂3.75g/L，pH5.8-6.0。
上述步骤（8）中的继代增值培养基为：改良MS+N6苄基腺嘌呤（6-BA)0.3-0.5mg/L+萘乙酸0.1-0.15mg/L+核黄素(维生素B2)7.0mg/L+维生素C2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂3.75g/L，pH5.8-6.0。
上述步骤（9）中的生根培养基为：1/2改良MS+ABT10.6mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖15g/L+琼脂3.9g/L，pH5.8-6.2。
上述步骤（11）中的发育不完全根是指，从苗茎切口长出的根状突起，长0.5-1.0cm，表面光滑，没有根毛，又称假根的根状组织。
上述步骤（11）中的特殊培养是指，将发育不完全根的苗移栽后弱光培养，光照强度1000Lux，用微型喷头喷淋雾状水保湿，始终保持叶面湿润，栽培基质保持不干不涝状态，不积水，小苗生长稳定后，叶面喷施低浓度大量元素和微量元素肥。
本发明生根培养基中的ABT1能通过强化、调控植物内源激素的含量、重要酶的活性，促进生物分子的合成，诱导植物不定根或不定芽的形态建成，调节植物代谢作用强度，从而提高组培苗的成活率；IBA能够促进植物主根生长,提高发芽率,成活率。本发明其它的培养基化合物可以从化学词典或农作物栽培的教科书检索到其名称和作用，本发明采用这些化合物进行组合对大花序桉最为适合，是经过多次试验筛选才最终确定的。
本发明的有益效果为：
1、本发明采用大花序桉优良家系的优良单株萌芽作为外殖体，组培快繁材料来源的遗传信息是已知的，并经过栽培试验检测过的，优树的生长量和抗逆性是可靠的，所有培育的目标明确，而非随机和盲目。
2、本发明的组培快繁方法中，组培无菌芽获得方式是由芽器官（带潜伏芽的茎段）离体诱导丛生芽，不经过愈伤组织途径，无菌芽诱导过程中没有经过脱分化过程，培育的组培苗遗传性状稳定，能够完整保持母树的遗传特性，不易发生变异。
3、本发明的大花序桉的组培快繁方法操作难度不高、生产成本较低。针对难生根树种大花序桉的生根技术，采用瓶内促根和移植后促根两步成苗方法，对瓶内促根后长出发育不全根者，通过移植后特殊培养获得再生植株，并获得成功,总的生根率高达72.8%以上，从而解决了大花序桉瓶内促根率不高的缺陷，最终打破制约大花序桉无性系推广的瓶颈，在技术上取得了突破。采用本发明的大花序桉的组培快繁方法可以获得大量整齐一致，遗传性状稳定的再生植株。
4、本发明的大花序桉的组培快繁方法试验结果稳定，重复性良好，组培再生植株经初步造林试验，造林成活率95%以上，生长良好，苗木能够保持优树的优良遗传特性，适合大面积种植，可以应用于大规模商品化育苗。另外，在此基础上，也可以进行大花序桉的转基因育种。
附图说明
图1是大花序桉优良家系中的优良单株（24年生）；
图2是大花序桉优良家系中的优良单株伐倒后的萌芽；
图3是大花序桉优树萌芽条作为外殖体，诱导萌生的无菌芽；
图4是大花序桉无菌芽继代增殖苗；
图5是大花序桉瓶内生根苗；
图6是大花序桉组培瓶苗移栽；
图7是大花序桉移栽苗特殊培养荫棚；
图8是大花序桉组培成苗；
图9是大花序桉造林情况。
具体实施方式
下面对本发明的具体实例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围作出更为清楚明确的界定。
实施例1
一种大花序桉的组培快繁方法，其步骤如下：
（1）在澳大利亚引种的家系试验林中，经测试对比，选择出适合本地生长的大花序桉优良家系；
（2）在大花序桉优良家系中，通过测量胸径、树高、蓄积、连年生长量、木材材性以及干形指标，综合对比后选择出优良单株；
（3）将优良单株在离地面15cm高度处伐倒，促萌芽，当萌芽条长到12cm时，剪取萌芽条，用水浸泡基部带回实验室备用；
（4）萌芽条修剪去叶片、叶柄，用自来水流水冲洗3min,再用饱和洗衣粉溶液洗涤10min，用纯净水清洗干净；
（5）在超净工作台上，将萌芽条剪去嫩梢段和基部老化部分，留半木质化茎段，切成长2-3cm，保留有1-2个潜伏芽的切段做消毒材料；
（6）将待消毒材料置于高压灭菌处理过的无菌瓶中，用75%酒精溶液浸泡15s，无菌水清洗3次，洗去残留酒精，再用0.1%HgCL2溶液浸泡并适当搅拌，7min后倒去HgCL2溶液至专用收集罐中，用无菌水清洗材料5次；
（7）用镊子夹取清洗好的茎段，放置在灭菌的接种碟上，用灭菌过的滤纸吸干表面水分，切去叶柄和茎段的两端，接种到无菌芽诱导培养基上，无菌芽诱导培养基为：改良MS+N6苄基腺嘌呤（6-BA)1.0mg/L+萘乙酸0.2mg/L+维生素C2.0mg/L+核黄素7.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂3.75g/L，pH5.8-6.0；全暗培养8天后，在温度26±2℃，光照12h/d,光照强度1500-2000lux条件下培养25天；
（8）外殖体萌芽后，侧芽和不定芽不断生长，萌芽15天后，选取没有污染的无菌芽，切割后转入继代增殖培养基上，继代增值培养基为：改良MS+N6苄基腺嘌呤（6-BA)0.3mg/L+萘乙酸0.1mg/L+核黄素7.0mg/L+维生素C2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂3.75g/L，pH5.8-6.0；在温度26±2℃，光照强度2000-2500lux条件下，培养23天，以促进丛芽增殖和生长，在增殖培养基上反复继代培养，无菌芽苗数量不断增多；
（9）当继代培养的芽苗长到2-3cm，并有3-4对叶片时，切取芽苗转入生根培养基上培养，生根培养基为：1/2改良MS+ABT10.6mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖15g/L+琼脂3.9g/L，pH5.8-6.2；温度28-30℃，光照强度1200-1500lux，培养8天，当切口冒出短根或根点，出根率达到30-40%时，移瓶至温度28-35℃，光照强度3000-5000lux的自然光下培养18天；
（10）将生根齐全，苗高3-4cm的生根瓶苗，洗去琼脂，移栽至用KMnO4消毒过的黄心土和蛭石做基质的营养杯或轻基质育苗杯上，黄心土和蛭石的比例为5：1，培养60天，得到再生植株；
(11)将具有发育不完全根，苗高1.5-2.0cm的生根瓶苗，洗去琼脂，移栽到用KMnO4消毒过的黄心土+蛭石+河沙按照4:1:1做基质的营养杯，移栽前用ABT1生根粉500ppm水溶液浸泡10min，移栽后特殊培养25天，将长出真根的苗和未长出真根的苗分开管理，再培养80天后，长出真根的苗得到再生植株。
所述的优良家系是指，从澳大利亚引种的种源/家系，通过栽培试验、测定分析，选择出适合本地生长、生长量高、抗逆性强，已成功驯化的家系/种群。所述的优良单株是指，经试验测定分析后，确定的优良家系中树高、胸径、蓄积量等生长指标突出，木材材性、干形、抗病虫害能力等指标优越的优势木个体。
上述步骤（11）中的发育不完全根是指，从苗茎切口长出的根状突起，长0.5-1.0cm，表面光滑，没有根毛，又称假根的根状组织；特殊培养是指，将发育不完全根的苗移栽后弱光培养，光照强度1000Lux，用微型喷头喷淋雾状水保湿，始终保持叶面湿润，栽培基质保持不干不涝状态，不积水，小苗生长稳定后，叶面喷施低浓度大量元素和微量元素肥。
实施例2
一种大花序桉的组培快繁方法，其步骤如下：
（1）在澳大利亚引种的家系试验林中，经测试对比，选择出适合本地生长的大花序桉优良家系；
（2）在大花序桉优良家系中，通过测量胸径、树高、蓄积、连年生长量、木材材性以及干形指标，综合对比后选择出优良单株；
（3）将优良单株在离地面18cm高度处伐倒，促萌芽，当萌芽条长到15cm时，剪取萌芽条，用水浸泡基部带回实验室备用；
（4）萌芽条修剪去叶片、叶柄，用自来水流水冲洗4min,再用饱和洗衣粉溶液洗涤10min，用纯净水清洗干净；
（5）在超净工作台上，将萌芽条剪去嫩梢段和基部老化部分，留半木质化茎段，切成长2-3cm，保留有1-2个潜伏芽的切段做消毒材料；
（6）将待消毒材料置于高压灭菌处理过的无菌瓶中，用75%酒精溶液浸泡16s，无菌水清洗4次，洗去残留酒精，再用0.1%HgCL2溶液浸泡并适当搅拌，8min后倒去HgCL2溶液至专用收集罐中，用无菌水清洗材料6次；
（7）用镊子夹取清洗好的茎段，放置在灭菌的接种碟上，用灭菌过的滤纸吸干表面水分，切去叶柄和茎段的两端，接种到无菌芽诱导培养基上，无菌芽诱导培养基为：改良MS+N6苄基腺嘌呤（6-BA)1.0mg/L+萘乙酸0.3mg/L+维生素C2.0mg/L+核黄素7.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂3.75g/L，pH5.8-6.0；全暗培养10天后，在温度26±2℃，光照12h/d,光照强度1500-2000lux条件下培养20天；
（8）外殖体萌芽后，侧芽和不定芽不断生长，萌芽18天后，选取没有污染的无菌芽，切割后转入继代增殖培养基上，继代增值培养基为：改良MS+N6苄基腺嘌呤（6-BA)0.4mg/L+萘乙酸0.15mg/L+核黄素7.0mg/L+维生素C2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂3.75g/L，pH5.8-6.0；在温度26±2℃，光照强度2000-2500lux条件下，培养20天，以促进丛芽增殖和生长，在增殖培养基上反复继代培养，无菌芽苗数量不断增多；
（9）当继代培养的芽苗长到2-3cm，并有3-4对叶片时，切取芽苗转入生根培养基上培养，生根培养基为：1/2改良MS+ABT10.6mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖15g/L+琼脂3.9g/L，pH5.8-6.2；温度28-30℃，光照强度1200-1500lux，培养6天，当切口冒出短根或根点，出根率达到30-40%时，移瓶至温度28-35℃，光照强度3000-5000lux的自然光下培养20天；
（10）将生根齐全，苗高3-4cm的生根瓶苗，洗去琼脂，移栽至用KMnO4消毒过的黄心土和蛭石做基质的营养杯或轻基质育苗杯上，黄心土和蛭石的比例为5：1，培养70天，得到再生植株；
（11）将具有发育不完全根、苗高1.5-2.0cm的生根瓶苗，洗去琼脂，移栽到用KMnO4消毒过的黄心土+蛭石+河沙按照4:1:1的比例配置的营养杯或轻基质育苗杯上，小苗移栽前用ABT1生根粉200ppm水溶液浸泡20min，移栽后特殊培养27d，将长出真根的苗和未长出真根的苗分开管理，再培养70天后，长出真根的苗得到再生植株。
所述的优良家系是指，从澳大利亚引种的种源/家系，通过栽培试验、测定分析，选择出适合本地生长、生长量高、抗逆性强，已成功驯化的家系/种群。所述的优良单株是指，经试验测定分析后，确定的优良家系中树高、胸径、蓄积量等生长指标突出，木材材性、干形、抗病虫害能力等指标优越的优势木个体。
上述步骤（11）中的发育不完全根是指，从苗茎切口长出的根状突起，长0.5-1.0cm，表面光滑，没有根毛，又称假根的根状组织；特殊培养是指，将发育不完全根的苗移栽后弱光培养，光照强度1000Lux，用微型喷头喷淋雾状水保湿，始终保持叶面湿润，栽培基质保持不干不涝状态，不积水，小苗生长稳定后，叶面喷施低浓度大量元素和微量元素肥。
实施例3
一种大花序桉的组培快繁方法，其步骤如下：
（1）在澳大利亚引种的家系试验林中，经测试对比，选择出适合本地生长的大花序桉优良家系；
（2）在大花序桉优良家系中，通过测量胸径、树高、蓄积、连年生长量、木材材性以及干形指标，综合对比后选择出优良单株；
（3）将优良单株在离地面20cm高度处伐倒，促萌芽，当萌芽条长到18cm时，剪取萌芽条，用水浸泡基部带回实验室备用；
（4）萌芽条修剪去叶片、叶柄，用自来水流水冲洗5min,再用饱和洗衣粉溶液洗涤10min，用纯净水清洗干净；
（5）在超净工作台上，将萌芽条剪去嫩梢段和基部老化部分，留半木质化茎段，切成长2-3cm，保留有1-2个潜伏芽的切段做消毒材料；
（6）将待消毒材料置于高压灭菌处理过的无菌瓶中，用75%酒精溶液浸泡17s，无菌水清洗5次，洗去残留酒精，再用0.1%HgCL2溶液浸泡并适当搅拌，9min后倒去HgCL2溶液至专用收集罐中，用无菌水清洗材料6次；
（7）用镊子夹取清洗好的茎段，放置在灭菌的接种碟上，用灭菌过的滤纸吸干表面水分，切去叶柄和茎段的两端，接种到无菌芽诱导培养基上，无菌芽诱导培养基为：改良MS+N6苄基腺嘌呤（6-BA)1.0mg/L+萘乙酸0.4mg/L+维生素C2.0mg/L+核黄素7.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂3.75g/L，pH5.8-6.0；全暗培养12天后，在温度26±2℃，光照12h/d,光照强度1500-2000lux条件下培养15天；
（8）外殖体萌芽后，侧芽和不定芽不断生长，萌芽20天后，选取没有污染的无菌芽，切割后转入继代增殖培养基上，继代增值培养基为：改良MS+N6苄基腺嘌呤（6-BA)0.5mg/L+萘乙酸0.15mg/L+核黄素7.0mg/L+维生素C2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂3.75g/L，pH5.8-6.0；在温度26±2℃，光照强度2000-2500lux条件下，培养18天，以促进丛芽增殖和生长，在增殖培养基上反复继代培养，无菌芽苗数量不断增多；
（9）当继代培养的芽苗长到2-3cm，并有3-4对叶片时，切取芽苗转入生根培养基上培养，生根培养基为：1/2改良MS+ABT10.6mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖15g/L+琼脂3.9g/L，pH5.8-6.2；温度28-30℃，光照强度1200-1500lux，培养10天，当切口冒出短根或根点，出根率达到30-40%时，移瓶至温度28-35℃，光照强度3000-5000lux的自然光下培养15天；
（10）生根齐全，苗高3-4cm的生根瓶苗，洗去琼脂，移栽至用KMnO4消毒过的黄心土和蛭石做基质的营养杯或轻基质育苗杯上，黄心土和蛭石的比例为5：1，培养80天，得到再生植株；
（11）将具有发育不完全根、苗高1.5-2.0cm的生根瓶苗，洗去琼脂，移栽到用KMnO4消毒过的黄心土+蛭石+河沙按照4:1:1的比例配置的营养杯或轻基质育苗杯上，小苗移栽前用ABT1生根粉100ppm水溶液浸泡30min，移栽后特殊培养30d，将长出真根的苗和未长出真根的苗分开管理，再培养60天后，长出真根的苗得到再生植株。
所述的优良家系是指，从澳大利亚引种的种源/家系，通过栽培试验、测定分析，选择出适合本地生长、生长量高、抗逆性强，已成功驯化的家系/种群。所述的优良单株是指，经试验测定分析后，确定的优良家系中树高、胸径、蓄积量等生长指标突出，木材材性、干形、抗病虫害能力等指标优越的优势木个体。
上述步骤（11）中的发育不完全根是指，从苗茎切口长出的根状突起，长0.5-1.0cm，表面光滑，没有根毛，又称假根的根状组织；特殊培养是指，将发育不完全根的苗移栽后弱光培养，光照强度1000Lux，用微型喷头喷淋雾状水保湿，始终保持叶面湿润，栽培基质保持不干不涝状态，不积水，小苗生长稳定后，叶面喷施低浓度大量元素和微量元素肥。
以下为本发明方法得到的大花序桉组培苗繁育结果：
可以看出，本发明大花序桉的组培快繁方法，繁殖成苗率高，在对发育不完全根苗实施特殊培养方法移栽后，总的生根率达72.8%以上，移栽成活率在70%以上，组培苗移栽后能迅速适应露天环境，生长迅速，抗外界不良环境能力强，再生植株大田定值后，生长健壮，造林成活率95%以上。
Claims (8)
1.一种大花序桉的组培快繁方法，其特征在于：采用大花序桉优良家系的优良单株，对其进行伐桩萌芽，利用萌芽作为外殖体，通过带芽茎段离体诱导无菌芽，经过对无菌芽的继代增殖培养、生根培养和生根苗移栽，获得再生植株；
该方法的具体步骤如下：
（1）在澳大利亚引种的家系试验林中，经测试对比，选择出适合本地生长的大花序桉优良家系；
（2）在大花序桉优良家系中，通过测量胸径、树高、蓄积、连年生长量、木材材性以及干形指标，综合对比后选择出优良单株；
（3）将优良单株在离地面15-20cm高度处伐倒，促萌芽，当萌芽条长到12-18cm时，剪取萌芽条，用水浸泡基部带回实验室备用；
（4）萌芽条修剪去叶片、叶柄，用自来水流水冲洗3-5min,再用饱和洗衣粉溶液洗涤10min，用纯净水清洗干净；
（5）在超净工作台上，将萌芽条剪去嫩梢段和基部老化部分，留半木质化茎段，切成长2-3cm，保留有1-2个潜伏芽的切段做消毒材料；
（6）将待消毒材料置于高压灭菌处理过的无菌瓶中，用75%酒精溶液浸泡15-17s，无菌水清洗3-5次，洗去残留酒精，再用0.1%HgCL2溶液浸泡并适当搅拌，7-9min后倒去HgCL2溶液至专用收集罐中，用无菌水清洗材料5-6次；
（7）用镊子夹取清洗好的茎段，放置在灭菌的接种碟上，用灭菌过的滤纸吸干表面水分，切去叶柄和茎段的两端，接种到无菌芽诱导培养基上，全暗培养8-12天后，在温度26±2℃，光照12h/d,光照强度1500-2000lux条件下培养15-25天；
（8）外殖体萌芽后，侧芽和不定芽不断生长，萌芽15-20天后，选取没有污染的无菌芽，切割后转入继代增殖培养基上，在温度26±2℃，光照强度2000-2500lux条件下，培养18-23天，以促进丛芽增殖和生长，在增殖培养基上反复继代培养，无菌芽苗数量不断增多；
（9）当继代培养的芽苗长到2-3cm，并有3-4对叶片时，切取芽苗转入生根培养基上培养，温度28-30℃，光照强度1200-1500lux，培养6-10天，当切口冒出短根或根点，出根率达到30-40%时，移瓶至温度28-35℃，光照强度3000-5000lux的自然光下培养15-20天；
（10）生根齐全，苗高3-4cm的生根瓶苗，洗去琼脂，移栽至用KMnO4消毒过的黄心土和蛭石做基质的营养杯或轻基质育苗杯上，黄心土和蛭石的比例为5：1，培养60-80天，得到再生植株；
(11)将具有发育不完全根，苗高1.5-2.0cm的生根瓶苗，洗去琼脂，移栽到用KMnO4消毒过的黄心土+蛭石+河沙按照4:1:1做基质的营养杯，移栽前用ABT1生根粉100-500ppm水溶液浸泡10-30min，移栽后特殊培养25-30天，将长出真根的苗和未长出真根的苗分开管理，再培养60-80天后，得到再生植株。
2.根据权利要求1所述的大花序桉的组培快繁方法，其特征在于：所述的优良家系是指，从澳大利亚引种的种源/家系，通过栽培试验、测定分析，选择出适合本地生长、生长量高、抗逆性强，已成功驯化的家系/种群。
3.根据权利要求1所述的大花序桉的组培快繁方法，其特征在于：所述的优良单株是指:引种的试验林经测定分析后确定的优良家系中，生长指标如树高、胸径和蓄积量突出，木材材性、干形、抗病虫害能力指标优越的优势木个体。
4.根据权利要求1所述的大花序桉的组培快繁方法，其特征在于：所述步骤（7）中的无菌芽诱导培养基为：改良MS+N6苄基腺嘌呤（6-BA)1.0mg/L+萘乙酸0.2-0.4mg/L+维生素C2.0mg/L+核黄素7.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂3.75g/L，pH5.8-6.0。
5.根据权利要求1所述的大花序桉的组培快繁方法，其特征在于：所述步骤（8）中的继代增值培养基为：改良MS+N6苄基腺嘌呤（6-BA)0.3-0.5mg/L+萘乙酸0.1-0.15mg/L+核黄素7.0mg/L+维生素C2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂3.75g/L，pH5.8-6.0。
6.根据权利要求1所述的大花序桉的组培快繁方法，其特征在于：所述步骤（9）中的生根培养基为：1/2改良MS+ABT10.6mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖15g/L+琼脂3.9g/L，pH5.8-6.2。
7.根据权利要求1所述的大花序桉的组培快繁方法，其特征在于：所述步骤（11）中的发育不完全根是指：从苗茎切口处长出根状突起，长1.0-1.5cm，表面光滑，没有根毛，又称假根的根状组织。
8.根据权利要求1所述的大花序桉的组培快繁方法，其特征在于：所述步骤（11）中的特殊培养是指，将发育不完全根的苗移栽后弱光培养，光照强度1000Lux，用微型喷头喷淋雾状水保湿，始终保持叶面湿润，栽培基质保持不干不涝状态，不积水，小苗生长稳定后，叶面喷施低浓度大量元素和微量元素肥。
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