CN116584383A - 一种托里桉组培育苗体系的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种托里桉组培育苗体系的建立方法。本发明中以托里桉种质资源为繁殖材料，筛选得到一组能够显著提高托里桉组培育苗的生根率和成活率的培养基，包括脱毒培养基、诱导培养基、增殖培养基和生根培养基，并以此建立了一套完善的托里桉组培育苗体系，能够提高育苗效率，同时促进造林成活率，降低运输成本和造林劳动强度，育苗时间较短，可快速生产合格苗，45～50d即可出圃造林，节约了育苗成本，能够满足生产需求。
Description
技术领域
本发明涉及针叶树种的组培快繁育苗技术领域，特别涉及一种托里桉组培育苗体系的建立方法。
背景技术
托里桉(Corymbia torelliana)为常绿乔木树种，树木高达30m，树皮绿光滑无龟裂不脱落，树冠密集，幼枝嫩叶带红色绒毛，叶片有疏风解热、消炎抗菌以及一定杀虫作用。我国已经在维度较低的广东、广西以及福建南部引种成功，最早云南引种，1974年在广西东门林场引种成功，后引入到广东，作为造林树种以及四旁绿化树种。斯里兰卡也将托里桉作为重要的用材树种种植；非洲尼日利亚、刚果等国家也为用材树种成功引种，同时开发出其药用价；美国将托里桉作为能源树种，开发相关林业产品和省委燃料等；印度择将其作为纸浆材树种大面积种植。
但目前为止，由于无性系繁殖研究不足，苗木生产数量收到一定的限制，大面积推广种植还不具备条件，相关研究文献主要集中在造林管理以及林化产品研究方面，组培无性系苗木繁育鲜有报道，因此，很有必要建立一种托里桉组培育苗体系，达到在短期内成功扩繁根系完整、活力好的相当数量无性系苗，以满足当前生产需要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种托里桉组培育苗体系的建立方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种托里桉组培育苗体系的建立方法，包括如下步骤：
(1)托里桉外植体采集及消毒
在托里桉母株上选取顶芽饱满、无病虫害的嫩芽，剪除叶片，保留每个芽点，剪成4～5cm大小的枝条，用流水冲洗掉表面灰尘；然后利用洗衣粉水和升汞消毒液消毒，并用无菌水浸泡冲洗，得到托里桉外植体；
(2)脱毒培养、诱导培养和生根培养
将步骤(1)中得到的托里桉外植体用刀片切成1～2cm大小的芽段，每个芽段必须保留一个芽点，接入到脱毒培养基中培养10～15天进行脱毒处理，然后将脱毒成功的外植体切掉底部2～3mm后接入到诱导培养基中培养20～30天，待其长出新芽；接着将长出的新芽切下4～5mm接入到增殖培养基中，以20天为周转日期，培养至9～10代；再取长1～1.5cm的芽枝接入生根培养基中培养7～8天，使其长出根须，继续培养到20天，转入炼苗大棚继续培养10～12天，获得无菌苗；其中，培养基配方如下：
脱毒培养基：MS改良培养基、5mg/L的L-半胱氨酸、0.83mg/L的KI、4mg/L的核黄素、0.5mg/L的6-BA、0.35mg/L的NAA、6g/L的卡拉胶、30g/L的白糖；
诱导培养基：MS改良培养基、5mg/L的L-半胱氨酸、0.83mg/L的KI、4mg/L的核黄素、0.45mg/L的6-BA、0.35mg/L的NAA、6g/L的卡拉胶、30g/L的白糖；
增殖培养基：MS改良培养基、6mg/L的L-半胱氨酸、0.83mg/L的KI、4.8mg/L的核黄素、0.4mg/L的6-BA、0.3mg/L的NAA、1mg/L的维生素C、6g/L的卡拉胶、30g/L的白糖；
生根培养基：MS改良培养基、1mg/L的L-半胱氨酸、1mg/L的IBA、0.4mg/L的ABT生根粉、9.6mg/L的VB1、0.05g/L的活性炭粉、7g/L的卡拉胶、20g/L的白糖；
(3)炼苗、移栽和苗期管理
将步骤(2)中得到的无菌苗放置在温室中，进行高温炼苗，当苗木高度达到或超过4㎝时，用净水反复将培养基清洗干净，然后将洗净的苗木移栽到培养袋中，移栽完成后立即浇定根水(定根水应将袋中基质灌透)，覆盖薄膜并加遮阴网保温保湿，于遮阴度70～80％、湿度80～90％和温度15～28℃条件下进行培养；移栽后第5～7天后去掉薄膜，并对幼苗进行第1次消毒，之后每7～10天消毒1次，移栽20～25天喷施第1次复合肥水溶液，此后每7～10天喷施复合肥水溶液一次，苗高15～25cm时出圃造林。
步骤(1)中所述的托里桉外植体采集及消毒优选为在组培接种室进行。
步骤(1)中所述的托里桉母株来源于超级或优选种子苗、和/或中龄林树干基部环剥萌芽；优选为2年生超级苗。
步骤(1)中所述的用洗衣粉水和升汞消毒液消毒通过如下步骤实现：
将枝条用200g/L的洗衣粉水浸泡15min，边浸泡边用毛笔刷洗，然后用流水冲洗干净残留的洗衣粉水；再将处理后的枝条用无菌水浸泡1min，倒掉无菌水后，加入升汞消毒液并滴入三滴吐温-20摇晃浸泡7min，用无菌水浸泡冲洗三遍，分别是2min、5min、8min。
所述的升汞消毒液的配制方法如下：将0.5g升汞和500ml水混合后，再滴加20滴吐温-20。
步骤(2)中，将脱毒成功的外植体接入到诱导培养基前，切掉底部2～3mm使其露出新鲜切口，可使芽段更好地吸收新的培养基中的营养成分。
步骤(2)中，脱毒培养基、诱导培养基和增殖培养基中的MS改良培养基配方如下：KNO3 1.8g/L、NH4NO3 0.504g/L、KH2PO4 0.324g/L、Ca(NO3)2*4H2O 0.66g/L、MgSO4*7H200.3625g/L。
步骤(2)中，生根培养基中的MS改良培养基配方如下：KNO3 0.288g/L、NH4NO30.36g/L、KH2PO4 0.27g/L、Ca(NO3)2*4H2O 0.6g/L、MgSO4*7H20 0.3625g/L。
步骤(2)中所述的脱毒培养、诱导培养和生根培养的温度为25～28℃。
步骤(2)中所述的高温炼苗的温度为30～33℃。
步骤(3)中，移栽后以及苗期管理在遮阴薄膜或玻璃棚中进行。
步骤(3)中所述的第1次消毒为采用多菌灵水溶液进行喷雾消毒；优选为采用采用多菌灵1000倍液(1/1000多菌灵水溶液)进行喷雾消毒。
步骤(3)中所述的7～10天消毒一次为采用甲基托布津水溶液、百菌清水溶液和多菌灵水溶液中的至少一种进行消毒；优选为采用甲基托布津水溶液、百菌清水溶液和多菌灵水溶液交替进行消毒；更优选为采用甲基托布津800倍液(1/800甲基托布津水溶液)、百菌清800倍液(1/800百菌清水溶液)和多菌灵1000倍液(1/1000多菌灵水溶液)交替进行消毒。
步骤(3)中所述的复合肥优选为俄罗斯阿康复合肥料，氮磷钾16-16-16。
步骤(3)中所述的复合肥水溶液的浓度为0.5～1.0wt‰的复合肥水溶液。
步骤(3)中所述的苗期管理还包括水分管理：移栽后50天内使用喷雾设备或喷壶浇水，每日早晚各一次，棚内空气湿度控制在80％～90％，保证基质保持湿润；移栽50天后根据培养袋中的基质表面的干燥情况确定浇灌，以确保移栽苗不萎蔫，晴或阴天揭开遮阴网炼苗。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明以目前国内引种托里桉种质资源早期优选株(超级苗或中龄林木)为繁殖材料、选取合理配比的基质，进行组培育苗，实现了基质轻、生根好的工厂化育苗方式，普通营养土袋苗每株重0.11～0.20㎏，而本发明中的基质苗每株仅重0.068～0.080㎏；因此，该方法节约了育苗成本，提高育苗效率，同时促进造林成活率，降低运输成本和造林劳动强度。
(2)本发明的托里桉瓶苗在接入培养基后7～8天即开始生根，与现有其他托里桉组培育苗配方及技术相比，生根时间提前5～10天，生根时间集中；50d平均苗高15.4～18.8cm，平均侧根数达到6.82～9.13条/株，地径0.212～0.245cm，移栽上袋成活率由65～80％提高到90～95％，显著高于其它托里桉组培育苗方法，可节约育苗和造林成本之目的，提高育苗效率和造林效率。
(3)本发明采用托里桉组培苗培育，生根率和成活率均超过90％，属组培育苗的较高水平，同时保持了托里桉母树的优良遗传特性。
(4)本发明通过引进托里桉种质资源进行无性系扩繁，操作简便、设备要求简单，技术容易掌握，易于推广，育苗时间较短，可快速生产合格苗，45～50d即可出圃造林，满足生产需求，也可通过延长苗圃培育时间培育大苗，从而由本技术体系的建立快速为市场提供大量的良种壮苗。
附图说明
图1是实施例1中的托里桉的增殖情况图。
图2是实施例1中的托里桉培养至第8天的生根整体情况图。
图3是实施例1中的托里桉培养至第8天的生根情况细节图。
图4是实施例1中的托里桉培养至第14天的生根整体情况图。
图5是实施例1中的托里桉培养至第14天的生根情况细节图。
图6是实施例1中移栽上袋15天的根系和植株生长情况图。
图7是实施例1中移栽上袋30天的根系和植株生长情况图。
图8是实施例1中移栽上袋45天的根系和植株生长情况图。
图9是对比例1中的托里桉在生根培养基(ZL2)中炼苗6天的情况图；其中，A为生根瓶苗中的苗木生长情况，其叶片未舒展开，茎秆较细；B为生根瓶苗中的苗木生长情况，其长势停滞，部分趋于死亡，叶片干枯。
图10是实施例1与对比例1中的托里桉在生根培养基(ZL1)中炼苗6天情况对比图(图中，A为对比例1中的托里桉；B为实施例1中的托里桉)。
图11是实施例1与对比例1中的托里桉在生根培养基(ZL5)中炼苗6天情况对比图(图中，A为实施例1中的托里桉；B为对比例1中的托里桉)。
图12是对比例1中的托里桉在生根培养基(ZL3)中炼苗6天的情况图；其中，A为生根瓶苗中的苗木生长情况，其部分顶芽枯萎，茎秆偏细弱；B为生根瓶苗中的苗木生长情况，其植株矮小，部分趋于死亡。
图13是对比例1中的托里桉在生根培养基(ZL4)中炼苗6天的情况图；其中，A为生根瓶苗中的苗木生长情况，其顶芽枯萎，部分趋于死亡；B为生根瓶苗中的苗木生长情况，其长势较好，但叶片未舒展开，植株较矮。
图14是对比例2中的托里桉培养至第8天的生根整体情况图。
图15是对比例2中的托里桉培养至第8天的生根情况细节图。
图16是对比例2中移栽上袋15天的根系和植株生长情况图。
图17是对比例2中移栽上袋30天的根系和植株生长情况图。
图18是对比例2中移栽上袋45天的根系和植株生长情况图。
图19是对比例3中的大花序桉的增殖培养情况图。
图20是对比例4中的台湾牛樟的增殖培养情况图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
如无特殊说明，本发明中所述的光照为自然条件下的光照。
本发明中涉及的托里桉(Corymbia torelliana)、大花序桉和台湾牛樟均为本领域常规树种；其中，实施例和对比例中涉及的托里桉和大花序桉是澳大利亚进口树种，台湾牛樟为中国台湾购买的种子苗。
本发明实施例和对比例中涉及的卡拉胶购自绿新(福建)食品有限公司(型号LV-R-03)。
本发明实施例和对比例中涉及的ABT生根粉购自北京艾比蒂生物科技有限公司(产品标准号：Q/CPABT0001-2016)；活性炭粉购自茉钡特生物(纯度规格AR)。
本发明实施例和对比例中涉及的苗木高度、根系长度等按本领常规方法进行测定。
实施例1
1.外植体采集及消毒(地点：福建漳州，8～9月进行)
托里桉的外植体材料来源于2年生超级苗，在采穗母株上选取顶芽饱满，无病虫害的嫩芽，剪除叶片，保留每个芽点，剪成4～5cm大小的枝条，用流水冲洗掉表面灰尘；加洗衣粉水(雕牌除菌无磷洗衣粉)(200g/L)浸泡15min，边浸泡边用毛笔刷洗；用流水冲洗干净残留的洗衣粉水；将已处理枝条放置超净台内用无菌水浸泡1min；倒掉无菌水，加入适量的升汞消毒液(浸没外植体材料，其中升汞消毒液：0.5g升汞+500ml水+20滴吐温-20)并滴入3滴吐温-20(注：由于托里桉表面有绒毛，需另外滴加吐温-20消除绒毛表面的气泡，确保外植体完全接触消毒液)(吐温品牌为BioFroxx，货号：1247LT001)，摇晃浸泡7min；然后用无菌水浸泡冲洗三遍，分别是2min、5min、8min。
2.繁殖材料诱导培养(地点：福建漳州，8～9月进行)
2.1配制培养基
①MS改良培养基：KNO3 1.8g/L、NH4NO3 0.504g/L、KH2PO4 0.324g/L、Ca(NO3)2*4H2O0.66g/L、MgSO4*7H20 0.3625g/L；
②脱毒培养基：MS改良培养基、5mg/L的L-半胱氨酸、0.83mg/L的KI、4mg/L的核黄素、0.5mg/L的6-BA(6-苄氨基嘌呤)、0.35mg/L的NAA(1-萘乙酸)、6g/L的卡拉胶、30g/L的白糖；
③诱导培养基：MS改良培养基、5mg/L的L-半胱氨酸、0.83mg/L的KI、4mg/L的核黄素、0.45mg/L的6-BA、0.35mg/L的NAA、6g/L的卡拉胶、30g/L的白糖。
2.2诱导培养
将消毒洗净的外植体放置在超净台中，用刀片切成1～2cm大小的芽段，每个芽段必须保留一个芽点，用消毒过的镊子一个一个接入脱毒培养基中，每瓶培养基只接入一个芽段。在光照充足(温度25～28℃)的培养架上静置培养10～15天，如未出现污染则证明脱毒完成；接着将消毒过头和脱毒失败的外植体移除，其他外植体分别取出来切掉底部一小段(2～3mm)，露出新鲜切口(注：这一步是为了让芽段更好地吸收新的培养基中营养成分)，再把每个芽段挨个接入诱导培养基中，每瓶培养基只接入一个芽段，在光照充足的培养架上静置培养20～30天，待其长出新芽。
3.繁殖材料增殖培养(地点：福建漳州，9～10月进行)
3.1配制培养基
①MS改良培养基：同上述2.1；
②增殖培养基：MS改良培养基、6mg/L的L-半胱氨酸、0.83mg/L的KI、4.8mg/L的核黄素、0.4mg/L的6-BA、0.3mg/L的NAA、1mg/L的维生素C(简称维C)、6g/L的卡拉胶、30g/L的白糖。
3.2增殖培养
在超净台中，将长出的新芽用刀片切下来，保留一小部分(4～5mm)芽段(注：不把芽段全部剔除，是为了让新芽在增殖培养基中有一个缓冲期)，再把新芽挨个接入增殖培养基中，每瓶增殖培养基只接入一个新芽，在光照充足(温度25～28℃)的培养架上静置培养20～30天，观察其芽丛分化生长情况。更换2～3次增殖培养基后，芽丛长到密集一些，就可以把芽段全部剔除，只保留新长出来的芽丛。观察发现培养20天为最优周转日期，此时无菌苗表现正常，有活力，叶片展开且翠绿，芽条达到切生根标准，培养至9～10代以后，每瓶无菌苗至少能出50～60根生根芽条。
4.繁殖材料生根培养(地点：福建漳州，9～10月进行)
4.1配制培养基
①MS改良培养基：KNO3 0.288g/L、NH4NO3 0.36g/L、KH2PO4 0.27g/L、Ca(NO3)2*4H2O0.6g/L、MgSO4*7H20 0.3625g/L；
②生根培养基：MS改良培养基、1mg/L的L-半胱氨酸、1mg/L的IBA(3-吲哚丁酸)、0.4mg/L的ABT生根粉、9.6mg/L的VB1(维生素B1)、0.05g/L的活性炭粉、7g/L的卡拉胶、20g/L的白糖。
4.2生根培养
当无菌苗瓶苗扩繁增殖到500～800瓶左右，在超净台中用刀片取下每瓶增殖苗中长1～1.5cm的芽枝，用镊子各取27根芽枝接入一瓶生根培养基中，一瓶增殖瓶苗可以切下两瓶生根苗的量。在光照不强的培养架上静置，先暗培养7～8天直至长出根须，再换到光照充足的培养架上继续培养到20天，温度保持在25～28℃，观察发现此时根系浓密，适合炼苗。再转入炼苗大棚中继续静置培养10～12天，直至瓶内苗木高度达到4cm，此时叶片展开且翠绿，茎秆变得粗壮，根系浓密，主根明显，布满三级根，可洗苗上袋。
5.炼苗、苗木移栽上袋及苗期管理(地点：福建漳州，10～11月进行)
5.1炼苗
将瓶苗放置在温室中，进行高温炼苗(温度30～33℃)，当瓶内苗木高度达到或超过4㎝时候，可洗苗上袋；洗苗的方法为净水冲洗，反复将培养基清洗干净，洗净的苗木应立即准备移栽上培养袋培育(培养袋为无纺布土袋，采用普通的沙土，培养袋规格为直径7cm*高10cm，下同)。
5.2移栽上袋
用竹签将袋中间基质插孔，苗木根系直接放入孔中，确保根系舒展，将孔捏紧，上袋完成后立即浇定根水，定根水应将袋中基质灌透。操作在遮阴薄膜或玻璃棚中进行，所述的阴棚的条件为：遮阴度70～80％、湿度80～90％、温度15～28℃。
5.3苗期管理
上袋后，覆盖薄膜保温保湿，并需要遮阴，遮阴度70～80％、湿度80～90％和温度15～28℃，当天气温度太高时应在傍晚进行通风降温半小时。移栽上袋5～7天可去掉薄膜，并进行第1次喷雾消毒，采用1/1000(质量分数)多菌灵水溶液进行喷雾消毒。移栽上袋15天后进行多次消毒，7～10天消毒一次，采用1/800(质量分数)甲基托布津水溶液、1/800(质量分数)百菌清水溶液或1/1000多菌灵水溶液交替进行消毒。移栽20～25天喷施第一次0.5～1.0wt‰的复合肥水溶液(复合肥为俄罗斯阿康复合肥料，氮磷钾16-16-16)此后每7～10天喷施0.5～1.0wt‰的复合肥水溶液一次。
水分管理：移栽后50天内使用喷雾设备或喷壶浇水，每日早晚各一次，棚内空气湿度控制在80％～90％，保证基质保持湿润；移栽50天后根据培养袋中的基质(扦质)表面的干燥情况确定浇灌，以苗不萎蔫为度，晴或阴天揭开遮阴网炼苗。
6.组培育苗结果
6.1增殖情况
在增殖9代～10代以后，托里桉芽丛在增殖培养基中育苗20天，随机挑选出100瓶无菌苗，可以观察到无菌苗表现正常，有活力，叶片展开且翠绿，芽条达到切生根标准，每瓶无菌苗至少能出50～60根生根芽条(图1)。
6.2生根情况
随机挑选出70瓶生根瓶苗，培养至第8天，苗已大部分生根，且主根明显(图2、图3)，继续培养至第14天，瓶内所有生根苗各有3～7根根须，根系浓密粗壮，具有二级根及三级根，平均生根率为96.56％(图4和图5)。继续培养至20天，从70瓶生根瓶苗中随机挑选出14瓶，编号为1-14，统计其生根情况，结果如表1所示。
表1
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 |
| 生根数 | 24 | 27 | 25 | 27 | 25 | 26 | 25 | 27 | 26 | 27 | 27 | 25 | 27 | 27 |
6.3大棚炼苗情况
大棚内育苗至第6天，观察发现苗木茎秆变得粗壮，根系更加浓密，叶片展开变大，长势很好；大棚内育苗至第8天，苗木长势很好，炼苗效果达到，苗高在3.5～4cm。
6.4移栽情况
移栽上袋15天、30天、45天的根系和植株生长情况如图6～8所示。共统计1890株根系和植株生长情况：移栽上袋15天苗木平均高度4cm，根系长度3.5cm；30天苗木平均高度10cm，根系长度7cm；45天苗木平均高度15cm，根系长度13cm，主根明显，须根生长旺盛，达到出圃苗标准，平均成活率达到95.7％。
对比例1
1.外植体采集及消毒(地点：福建漳州，8～12月进行)
托里桉外植体的采集及消毒方法同实施例1。
2.繁殖材料诱导培养(地点：福建漳州，8～12月进行)
繁殖材料诱导培养方法同实施例1。
3.繁殖材料增殖培养
3.1配制培养基
(1)①MS改良培养基1：KNO3 1.8g/L、NH4NO3 0.504g/L、KH2PO4 0.324g/L、Ca(NO3)2*4H2O 0.6g/L、MgSO4*7H20 0.3625g/L；
②MS改良培养基2：KNO3 1.8g/L、NH4NO3 0.504g/L、KH2PO4 0.324g/L、Ca(NO3)2*4H2O 0.66g/L、MgSO4*7H20 0.3625g/L；
③MS改良培养基3：KNO3 1.8g/L、NH4NO3 0.504g/L、KH2PO4 0.324g/L、Ca(NO3)2*4H2O 0.72g/L、MgSO4*7H20 0.3625g/L；
(2)增值培养基选择以下10种，与实施例1中的培养基进行对比，分别为：
①增殖培养基(ZL01)：MS改良培养基1(Ca(NO3)4·4H2O：600mg/L，下同)、5mg/L的L-半胱氨酸、0.83mg/L的KI、4mg/L的核黄素、0.45mg/L的6-BA、0.35mg/L的NAA、6g/L的卡拉胶、30g/L的白糖；
②增殖培养基(ZL02)：MS改良培养基1、5mg/L的L-半胱氨酸、0.83mg/L的KI、4mg/L的核黄素、0.4mg/L的6-BA、0.35mg/L的NAA、6g/L的卡拉胶、30g/L的白糖；
③增殖培养基(ZL03)：MS改良培养基1、5mg/L的L-半胱氨酸、0.83mg/L的KI、4mg/L的核黄素、0.4mg/L的6-BA、0.4mg/L的NAA、6g/L的卡拉胶、30g/L的白糖；
④增殖培养基(ZL04)：MS改良培养基2(Ca(NO3)4 .4H2O：660mg/L，下同)、5mg/L的L-半胱氨酸、0.83mg/L的KI、4mg/L的核黄素、0.4mg/L的6-BA、0.4mg/L的NAA、6g/L的卡拉胶、30g/L的白糖；
⑤增殖培养基(ZL05)：MS改良培养基2、5mg/L的L-半胱氨酸、0.83mg/L的KI、4mg/L的核黄素、0.4mg/L的6-BA、0.35mg/L的NAA、6g/L的卡拉胶、30g/L的白糖；
⑥增殖培养基(ZL06)：MS改良培养基2、5mg/L的L-半胱氨酸、0.83mg/L的KI、4mg/L的核黄素、0.4mg/L的6-BA、0.3mg/L的NAA、6g/L的卡拉胶、30g/L的白糖；
⑦增殖培养基(ZL07)：MS改良培养基2、5mg/L的L-半胱氨酸、0.83mg/L的KI、4mg/L的核黄素、0.4mg/L的6-BA、0.3mg/L的NAA、0.5g/L的花宝一号、6g/L的卡拉胶、30g/L的白糖；
⑧增殖培养基(ZL08)：MS改良培养基3(Ca(NO3)4·4H2O：720mg/L，下同)、5mg/L的L-半胱氨酸、0.83mg/L的KI、4mg/L的核黄素、0.4mg/L的6-BA、0.3mg/L的NAA、6g/L的卡拉胶、30g/L的白糖；
⑨增殖培养基(ZL09)：MS改良培养基2、5mg/L的L-半胱氨酸、0.83mg/L的KI、4mg/L的核黄素、0.4mg/L的6-BA、0.3mg/L的NAA、0.7g/L的花宝一号、6g/L的卡拉胶、30g/L的白糖；
⑩增殖培养基(ZL10)：MS改良培养基2、5mg/L的L-半胱氨酸、0.83mg/L的KI、4mg/L的核黄素、0.4mg/L的6-BA、0.3mg/L的NAA、1g/L的花宝一号、6g/L的卡拉胶、30g/L的白糖。
3.2增殖培养
增殖培养方法同实施例1。通过20天瓶苗增殖情况的比较，观察芽丛增长分化情况，比较增殖系数以及无菌苗株高、粗壮与否、是否容易在增殖周期内出现顶梢枯萎叶片脱落情况、是否容易玻璃化等各种参数，我们确定实施例1中增殖培养基为当前托里桉组培技术的最佳增殖培养基。
4.繁殖材料生根培养(地点：福建漳州，9～10月进行)
在生根试验中，我们选择以下5种培养基作为生根培养基与实施例1进行对比(除生根培养基，其他方法步骤同实施例1)。通过比较无菌苗生根率、根系是否粗壮浓密、有无主根、大棚炼苗情况以及移栽后存活率等指标，确定在ABT生根粉、VB1以及活性炭粉用量改变下繁殖材料对其适应情况。
①MS改良培养基：同实施例1中4.1；
②生根培养基(ZL1)：MS改良培养基、1mg/L的L-半胱氨酸、1mg/L的IBA、0.5mg/L的ABT、9.6mg/L的VB1、0.1g/L的活性炭粉、7g/L的卡拉胶、20g/L的白糖；
③生根培养基(ZL2)：MS改良培养基、1mg/L的L-半胱氨酸、1mg/L的IBA、0.2mg/L的ABT、9.6mg/L的VB1、0.07g/L的活性炭粉、7g/L的卡拉胶、20g/L的白糖；
④生根培养基(ZL3)：MS改良培养基、1mg/L的L-半胱氨酸、1mg/L的IBA、0.3mg/L的ABT、9.6mg/L的VB1、0.03g/L的活性炭粉、7g/L的卡拉胶、20g/L的白糖；
⑤生根培养基(ZL4)：MS改良培养基、1mg/L的L-半胱氨酸、1mg/L的IBA、0.4mg/L的ABT、10mg/L的VB1、0.05g/L的活性炭粉、7g/L的卡拉胶、20g/L的白糖；
⑥生根培养基(ZL5)：MS改良培养基、1mg/L的L-半胱氨酸、1mg/L的IBA、0.4mg/L的ABT、9mg/L的VB1、0.05g/L的活性炭粉、7g/L的卡拉胶、20g/L的白糖。
5.炼苗、苗木移栽上袋及苗期管理(地点：福建漳州，10～11月进行)
具体步骤同实施例1。
6.组培育苗结果
6.1增殖情况
在增殖9～10代以后，从育苗20天的对比增殖培养瓶随机挑选出各100瓶，比对芽丛增殖分化情况，可以观察到无菌苗表现为活力较弱，植株矮小，芽条较细弱，叶片未完全展开，未能达到切生根瓶苗的标准，部分出现顶梢枯萎、叶片脱落(表2)。其中，芽丛增殖系数＝瓶苗在一个周期(实施例20天)内形成的有效苗数/接种苗数。
表2
6.2生根情况
随机挑选出各70瓶生根瓶苗，同实施例1培养至第8天，可以观察到各生根培养基有生根出现，但生根长度、根系浓密度以及生根率明显低于实施例；个别只在茎基部出现稍微膨大状态，同实施例1继续培养至第14天，直至长出根须；再换到光照充足的培养架上继续培养到20天，温度保持在25～28℃。统计对比，从70瓶生根瓶苗中随机挑选出14瓶，编号为1-14，统计其生根情况，结果如表3所示：本对比例中的生根率最高约为90％，最低仅为50％，远低于实施例1的96.56％。
表3
6.3大棚炼苗情况
大棚内炼苗至第6天，观察发现少部分苗木长势停滞，部分趋于死亡，叶片干枯，同实施例1对比明显；而生根较好的那部分无菌苗根系开始变得浓密，茎秆粗壮些，但就整体情况来说，还是较实施例1差，生根率以及生根苗木长势对比明显；大棚内炼至第8天，苗高在2～3cm左右，而实施例1的苗高能达到3.5～4cm(图9～13)。
6.4移栽情况
本对比例1中，移栽上袋后，总体其生长情况较慢，在苗圃中培育15天后，平均高度为2.5cm，比实施低1cm；平均成活率为74.5％，比实施例1低11.2个百分点。
对比例2
此对比例为按参考文献(林文革，陈国彪等.托里桉组培快繁技术初步研究[J].《桉树科技》，2015,32(4)))中培养基配方进行试验，具体步骤如下：
1.外植体采集及消毒(地点：福建漳州，8～12月进行)
托里桉外植体的采集及消毒方法同实施例1。
2.繁殖材料诱导培养(地点：福建漳州，8～12月进行)
繁殖材料诱导培养方法同实施例1。
3.繁殖材料增殖培养
3.1配制培养基
①MS改良培养基：同实施例1中2.1；
②增殖培养基(L1)：MS改良培养基、0.2mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA、6g/L的卡拉胶、30g/L的白糖；
③增殖培养基(L2)：MS改良培养基、0.3mg/L的6-BA、0.2mg/L的NAA、6g/L的卡拉胶、30g/L的白糖。
3.2增殖培养
在超净台中，将长出的新芽用刀片切下来，保留一小部分(4～5mm)芽段(注：不把芽段全部剔除，是为了让新芽在增殖培养基中有一个缓冲期)，再把新芽挨个分别接入增殖培养基(L1)和增殖培养基(L2)中，每瓶增殖培养基只接入一个新芽，在光照充足的培养架上静置培养20～30天，观察其芽丛分化生长情况。更换2～3次增殖培养基后，芽丛长到密集一些，就可以把芽段全部剔除，只保留新长出来的芽丛。同实施例1，培养至第20天，观察其芽丛分化生长情况，此时无菌苗表现正常，有活力，但是植株较矮，芽条较小，芽条未达到切生根苗标准；继续培养至第24天，少量出现顶梢枯萎，叶片脱落的情况；所以以20天为最优周转日期，培养至9～10代以后，但芽条较细弱，在周转期内容易出现玻璃化。
4.繁殖材料生根培养
4.1配制培养基
①MS改良培养基：同实施例1中4.1；
②生根培养基(L1)：MS改良培养基、0.2mg/L的IBA、0.6mg/L的ABT生根粉、9.6mg/L的VB1、0.05g/L的活性炭粉、7g/L的卡拉胶、20g/L的白糖。
4.2生根培养
按实施例1步骤1-3中的方法进行诱导和增殖培养后，当无菌苗瓶苗增殖到500～800瓶左右，在超净台中用刀片取下每瓶增殖苗中长1～1.5cm的芽枝，用镊子各取27根芽枝接入一瓶生根培养基(L1)中。在光照不强的培养架上静置，同实施例1先暗培养7～8天，发现没有生根迹象，只在茎基部出现稍微膨大状态，继续培养至第10～14天直至长出根须，再换到光照充足的培养架上继续培养到20天，温度保持在25～28℃，再转入炼苗大棚中继续静置培养10～12天，直至瓶内苗木高度达到4cm，可洗苗上袋。
5.炼苗、苗木移栽上袋及苗期管理(地点：福建漳州，10～11月进行)
具体步骤同实施例1。
6.组培育苗结果
6.1增殖情况
在增殖9～10代以后，托里桉芽丛在增殖培养基(L1)和增殖培养基(L2)中育苗20天，随机挑选出各100瓶无菌苗，可以观察到大部分无菌苗表现正常，有活力，植株较矮，芽条较细弱，平均每瓶无菌苗40～45根生根芽条，叶片未完全展开，1/3无菌苗出现玻璃化。
6.2生根情况
随机挑选出70瓶生根瓶苗同实施例1培养至第8天，发现没有生根迹象，只在茎基部出现稍微膨大状态(图14、图15)，继续培养至第14天，长出根须，再换到光照充足的培养架上继续培养到20天，温度保持在25～28℃，从70瓶生根瓶苗中随机挑选出14瓶，编号为1-14，统计其生根情况，结果如表4所示。瓶内所有生根苗各只有1～2根根须，根系稀疏，平均生根率为75.40％。
表4
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 |
| 生根数 | 19 | 21 | 21 | 18 | 24 | 11 | 23 | 16 | 23 | 21 | 22 | 24 | 16 | 26 |
6.3大棚炼苗情况
大棚内炼至第6天，观察发现苗木长势停滞，部分趋于死亡，叶片干枯，同实施例1对比明显；大棚内炼至第8天苗高在1.5～2cm左右，而实施例1中的苗高达到3.5～4cm。
6.4移栽情况
移栽上袋15天、30天、45天的根系和植株生长情况如图16～18所示。与实施例1中的结果对比，可以看到：实施例1中的苗木在相同时间(15天、30天、45天)测定根系长度和植株高度，均明显高于本对比例；然后统计1890株根系和植株生长情况：在15、30、45天根系长度和植株高度分别为2、4.5、8cm和2、5、9cm，而实施例1中的苗木在15、30、45天根系长度和植株高度分别为3.5、7、13cm和4、7、15cm。本对比例移栽上袋后，15天成活率48.60％，明显低于实施例1。实施例1比本对比例中的苗期生长速度更快、根系更旺盛，更有利于提高苗木上山造林后的成活率。
对比例3
本对比例中，采用实施例1中的增殖培养基和生根培养基作为大花序桉的增殖培养基和生根培养基，来验证配方对托里桉组培育苗独特性。
1.外植体采集及消毒(地点：福建漳州，8～9月进行)
大花序桉的外植体材料来源于2年生超级苗，在采穗母株上选取顶芽饱满，无病虫害的嫩芽，剪除叶片，保留每个芽点，剪成4～5cm大小的枝条，用流水冲洗掉表面灰尘；加200g/L的洗衣粉水浸泡10～12min；用流水冲洗干净残留的洗衣粉水；将已处理枝条放置超净台内用无菌水浸泡1min；倒掉无菌水，加入适量的升汞消毒液(浸没外植体材料，升汞消毒液：0.5g升汞+500ml水+20滴吐温-20)，摇晃浸泡6～7min；然后用无菌水浸泡冲洗三遍，分别是2min、5min、8min；
2.繁殖材料诱导培养(地点：福建漳州，8～9月进行)
繁殖材料诱导培养方法同实施例1。
3.繁殖材料增殖培养(地点：福建漳州，9～10月进行)
3.1配制培养基
①MS改良培养基：同实施例1中2.1；
②增殖培养基：MS改良培养基、6mg/L的L-半胱氨酸、0.83mg/L的KI、4.8mg/L的核黄素、0.4mg/L的6-BA、0.3mg/L的NAA、1mg/L的维C、6g/L的卡拉胶、30g/L的白糖。
3.2增殖培养
增殖培养方法同实施例1。
4.繁殖材料生根培养(地点：福建漳州，9～10月进行)
4.1配制培养基
①MS改良培养基：同实施例1中2.1；
②生根培养基：MS改良培养基、1mg/L的L-半胱氨酸、1mg/L的IBA、0.4mg/L的ABT、9.6mg/L的VB1、0.05g/L的活性炭粉、7g/L的卡拉胶、20g/L的白糖。
4.2生根培养
生根培养方法同实施例1。
5.炼苗、苗木移栽上袋及苗期管理(地点：福建漳州，10～11月进行)
具体步骤同实施例1。
6.组培育苗结果
6.1增殖情况
在增殖材料培养过程中，可以观察到按照实施例配方培育的大花序桉无菌苗70％发生变异，叶片较小，与正常大花序桉无菌苗对比明显，增殖速度缓慢，部分出现玻璃化(图19)。
6.2生根情况
选用正常的无菌苗(大花序桉)，接到生根培养基中，培养至第八天，茎基部出现稍微膨大状态，培养至第12天，部分长出根须，继续育苗至第二十天，统计生根率为25.66％，根系稀疏，几乎没有二级根。
表5
6.3大棚炼苗情况
大棚内炼苗至第6天，观察发现部分苗木长势停滞，部分趋于死亡，叶片干枯，同实施例1对比明显；大棚内炼至第8天苗高在1.5～2cm左右，而实施例则苗高达到3.5～4cm。
6.4移栽情况
对比例3中，大花序桉生根苗移栽上袋后，总体其生长情况缓慢，在苗圃中培育15天后，平均高度为2.5cm，比实施例低1cm；平均成活率为60.85％。
对比例4
本对比例中采用其他木本树种(台湾牛樟)的增殖培养基和生根培养基(经测定：此培养基针对台湾牛樟继代培养系数超过3.3，瓶苗生根率达到95％)对托里桉组培育苗的增殖培养生根培养，验证实施例1中的培养基配方对托里桉组培育苗的效果。
1.外植体采集及消毒(地点：福建漳州，8～9月进行)
托里桉的外植体采集及消毒方法同实施例1。
2.繁殖材料诱导培养(地点：福建漳州，8～9月进行)
繁殖材料诱导培养方法同实施例1。
3.繁殖材料增殖培养(地点：福建漳州，9～10月进行)
3.1配制培养基
①MS培养基：KNO3 1.9g/L、NH4NO3 1.65g/L、KI 0.00083g/L、CoCl*6H2O0.000025g/L、CaCl2 0.3322g/L、MgSO4*7H2O 0.37g/L、MnSO4*H2O 0.0169g/L、ZnSO4*7H2O0.0086g/L、CuSO4*5H2O 0.000025g/L、KH2PO4 0.17g/L、Na2MoO4*2H2O 0.000025g/L、NaH2PO40.192g/L、H3BO30.0062 g/L；
②增殖培养基：MS培养基、6mg/L半胱氨酸、0.24mg/L生物素、4mg/L核黄素、2mg/L维生素C、1.5mg/L6-BA、0.6mg/LNAA、0.6mg/LIBA、花宝一号1g/L、30g/L蔗糖、6g/L卡拉胶。
3.2增殖培养
增殖培养方法同实施例1。
4.繁殖材料生根培养(地点：福建漳州，9～10月进行)
4.1配制培养基
①1/2MS培养基：为上述3.1中的MS培养基用量的1/2。
②生根培养基：1/2MS培养基、0.05mg/LNAA、0.9mg/LIBA、0.05g/L活性炭粉、20g/L蔗糖、6g/L卡拉胶。
4.2生根培养
生根培养方法同实施例1。
5.炼苗、苗木移栽上袋及苗期管理(地点：福建漳州，10～11月进行)
具体步骤同实施例1。
6.组培育苗结果
6.1增殖情况
在增殖材料培养过程中，可以观察到托里桉无菌苗在周转周期内65％发生顶芽枯萎，叶片脱落，增殖速度较快，但容易出现玻璃化(图20)。
6.2生根情况
选用正常的无菌苗(托里桉)，接到生根培养基中，培养至第八天，部分长出根须，继续育苗至第二十天，统计生根率为79.365％，明显低于实施例1(表6)。
表6
6.3大棚炼苗情况
大棚内炼苗至第8天，观察发现托里桉瓶苗生长缓，同实施例1对比明显；大棚内炼至第10天苗高在1～2.5cm左右，而实施例1则苗高达到3.5～4cm。
6.4移栽情况
托里桉生根苗移栽上袋后，前15天苗木生长高度慢于实施例1，平均高度为2.7cm，比实施例1低接近1cm；培育到45天，平均高度为10cm，比实施例1低5cm左右，平均成活率为60.85％。
综上所述：
1.通过对实施例1与对比例1～4进行比较，发现由实施例1增殖培养基育出的无菌瓶苗中芽丛增殖较快，20天就能达到切生根标准，而且茎秆较粗壮，而由对比例1和对比2增殖培养基和增殖培养基育出的无菌瓶苗，增殖较慢，植株较矮，芽条较细弱，而且一旦超出周转时间，容易出现顶梢枯萎，叶片脱落的情况。所以就当前实验条件下，实施例1中增殖培养基为托里桉的最佳增殖培养基。
2.通过对实施例1与对比例1和对比例2进行比较，实施例1生根培养基中育苗生根较生根培养基提前6天，且生根时间集中，生根率均达到95％以上，根系浓密，通过炼苗观察发现苗木茎秆变得粗壮，根系更加浓密，叶片展开变大，长势很好；而对比例1生根培养基中育苗生根时间较长，根系稀疏，部分瓶苗生根率在50％以下，炼苗之后长势较差，几乎没有长高，根系没有生长，部分趋于死亡，叶片干枯，同实施例1对比明显。所以就当前实验条件下，实施例1选择的生根培养基为托里桉的最佳生根培养基。
3.通过实施例1与对比例3、4比较，实施例1的配方能够对托里桉继代增殖和生根培养起到明显效果，移栽上袋成活率和生长效果也远高于对比例3、4，实施例1继代培养基和生根培养基配方的组成及各药剂的用量对于托里桉组培育苗具有明显的针对性和独创性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种托里桉组培育苗体系的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)托里桉外植体采集及消毒
在托里桉母株上选取顶芽饱满、无病虫害的嫩芽，剪除叶片，保留每个芽点，剪成4～5cm大小的枝条，用流水冲洗掉表面灰尘；然后利用洗衣粉水和升汞消毒液消毒，并用无菌水浸泡冲洗，得到托里桉外植体；
(2)脱毒培养、诱导培养和生根培养
将步骤(1)中得到的托里桉外植体用刀片切成1～2cm大小的芽段，每个芽段必须保留一个芽点，接入到脱毒培养基中培养10～15天进行脱毒处理，然后将脱毒成功的外植体切掉底部2～3mm后接入到诱导培养基中培养20～30天，待其长出新芽；接着将长出的新芽切下4～5mm接入到增殖培养基中，以20天为周转日期，培养至9～10代；再取长1～1.5cm的芽枝接入生根培养基中培养7～8天，使其长出根须，继续培养到20天，转入炼苗大棚继续培养10～12天，获得无菌苗；其中，培养基配方如下：
脱毒培养基：MS改良培养基、5mg/L的L-半胱氨酸、0.83mg/L的KI、4mg/L的核黄素、0.5mg/L的6-BA、0.35mg/L的NAA、6g/L的卡拉胶、30g/L的白糖；
诱导培养基：MS改良培养基、5mg/L的L-半胱氨酸、0.83mg/L的KI、4mg/L的核黄素、0.45mg/L的6-BA、0.35mg/L的NAA、6g/L的卡拉胶、30g/L的白糖；
增殖培养基：MS改良培养基、6mg/L的L-半胱氨酸、0.83mg/L的KI、4.8mg/L的核黄素、0.4mg/L的6-BA、0.3mg/L的NAA、1mg/L的维生素C、6g/L的卡拉胶、30g/L的白糖；
生根培养基：MS改良培养基、1mg/L的L-半胱氨酸、1mg/L的IBA、0.4mg/L的ABT生根粉、9.6mg/L的VB1、0.05g/L的活性炭粉、7g/L的卡拉胶、20g/L的白糖；
(3)炼苗、移栽和苗期管理
将步骤(2)中得到的无菌苗放置在温室中，进行高温炼苗，当苗木高度达到或超过4㎝时，用净水反复将培养基清洗干净，然后将洗净的苗木移栽到培养袋中，移栽完成后立即浇定根水，覆盖薄膜并加遮阴网保温保湿，于遮阴度70～80％、湿度80～90％和温度15～28℃条件下进行培养；移栽后第5～7天后去掉薄膜，并对幼苗进行第1次消毒，之后每7～10天消毒1次，移栽20～25天喷施第1次复合肥水溶液，此后每7～10天喷施复合肥水溶液一次，苗高15～25cm时出圃造林。
2.根据权利要求1所述的托里桉组培育苗体系的建立方法，其特征在于：
步骤(2)中，脱毒培养基、诱导培养基和增殖培养基中的MS改良培养基配方如下：KNO31.8g/L、NH4NO3 0.504g/L、KH2PO4 0.324g/L、Ca(NO3)2*4H2O 0.66g/L、MgSO4*7H200.3625g/L；
步骤(2)中，生根培养基中的MS改良培养基配方如下：KNO3 0.288g/L、NH4NO3 0.36g/L、KH2PO4 0.27g/L、Ca(NO3)2*4H2O 0.6g/L、MgSO4*7H20 0.3625g/L。
3.根据权利要求1所述的托里桉组培育苗体系的建立方法，其特征在于，步骤(1)中所述的用洗衣粉水和升汞消毒液消毒通过如下步骤实现：
将枝条用200g/L的洗衣粉水浸泡15min，边浸泡边用毛笔刷洗，然后用流水冲洗干净残留的洗衣粉水；再将处理后的枝条用无菌水浸泡1min，倒掉无菌水后，加入升汞消毒液并滴入三滴吐温-20摇晃浸泡7min，用无菌水浸泡冲洗三遍，分别是2min、5min、8min；
所述的升汞消毒液的配制方法如下：将0.5g升汞和500ml水混合后，再滴加20滴吐温-20。
4.根据权利要求1所述的托里桉组培育苗体系的建立方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的第1次消毒为采用多菌灵水溶液进行喷雾消毒；
步骤(3)中所述的7～10天消毒一次为采用甲基托布津水溶液、百菌清水溶液和多菌灵水溶液中的至少一种进行消毒。
5.根据权利要求4所述的托里桉组培育苗体系的建立方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的第1次消毒为采用采用多菌灵1000倍液进行喷雾消毒；
步骤(3)中所述的7～10天消毒一次为采用甲基托布津800倍液、百菌清800倍液和多菌灵1000倍液交替进行消毒。
6.根据权利要求1所述的托里桉组培育苗体系的建立方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的脱毒培养、诱导培养和生根培养的温度为25～28℃。
7.根据权利要求1所述的托里桉组培育苗体系的建立方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的高温炼苗的温度为30～33℃。
8.根据权利要求1所述的托里桉组培育苗体系的建立方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的复合肥水溶液的浓度为0.5～1.0wt‰的复合肥水溶液。
9.根据权利要求1所述的托里桉组培育苗体系的建立方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的托里桉母株来源于超级或优选种子苗、和/或中龄林树干基部环剥萌芽。
10.根据权利要求1所述的托里桉组培育苗体系的建立方法，其特征在于：
步骤(3)中，移栽后以及苗期管理在遮阴薄膜或玻璃棚中进行；
步骤(3)中所述的苗期管理还包括水分管理：移栽后50天内使用喷雾设备或喷壶浇水，每日早晚各一次，棚内空气湿度控制在80％～90％，保证基质保持湿润；移栽50天后根据培养袋中的基质表面的干燥情况确定浇灌，以确保移栽苗不萎蔫，晴或阴天揭开遮阴网炼苗。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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