CN113598055B - 一种杏香兔耳风种质改良方法 - Google Patents

一种杏香兔耳风种质改良方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种中药材的种质改良方法，步骤包括：A种质选择、B种质改良、C改良种质鉴定与筛选、D改良种质生根、E生根苗驯化和F改良种质种子获得；本发明利用秋水仙素对杏香兔耳风无菌不定芽进行多倍体诱导，后通过形态学鉴别法和染色体压片法筛选并纯化培养获得改良杏香兔耳风种质，获得率为19％；本发明所获得改良杏香兔耳风种质，茎具有明显增粗，叶具有明显增厚表现，且单株生物量较原母本高1.9倍，亩产较原母本高1.6倍，同时，绿原酸含量较母本高1.3倍，原儿茶酸含量较原母本高2.2倍；本发明所获得的优质种质，具有遗传稳定性，通过种子种植出的植株仍具有可育性。

Description

一种杏香兔耳风种质改良方法
技术领域
本发明涉及一种中药材的种质改良方法，属于植物作物育种及中药材种植领域，特别涉及杏香兔耳风种质改良方法。
背景技术
香兔耳风Ainsliaea fragrans Champ为菊科兔耳风属植物，以全草入药，具有清热解毒，利湿，止血的功效，主要用于治肺痈，乳腺炎，疳积，骨髓炎，毒蛇咬伤。杏香兔耳风主要分布于台湾、福建、浙江、安徽、江苏、江西、湖北、四川、湖南、广东、广西、云南等省，生于海拔30～850米的山坡灌木林下或路旁、沟边草丛中，云南在海拔2000米附近亦有分布。杏香兔耳风内含绿原酸、芹菜素、槲皮素、木犀草素、3,5-二咖啡酰奎宁酸等，其中，一般制药企业的内检药材标准，将绿原酸含量高低作为杏香兔耳风的质量的核心指标，同时，其含量愈高，在临床上的药效越佳。然而目前，杏香兔耳风主要来源于野生资源，各批次其含量差异极大，使得各相关药企、科研单位开始进行杏香兔耳风的选种育种工作。
多倍体是普遍存在于自然界中，是生物自身体细胞中具有三组或三组以上的染色体，常见于高等植物中，许多植物在进化的过程都经历了“多倍体化”与“二倍体化”，具资料统计，种子植物中的528个属1171个种中约38.71％是多倍体，其中被子植物约50％是多倍体。
由于多倍体具有茎叶增大增厚、抗逆性强、次生代谢产物增多等特点，使得多倍体逐渐成为作物育种的重要方式，如多倍体的草莓，比普通的二倍体大2～4倍，三倍体的西瓜，一方面其果实较二倍体大，且含糖量比二倍体高10％以上，同时因为三倍体，造成不育，形成无籽西瓜，更加方便食用。而在药用植物的育种上，由于多倍体的优良特性，药用植物多倍体人工育种将是药用植物品种改良的重要方式。如潘中华等发表的《金银花新品种“九丰1号”及栽培技术》，报道了多倍体金银花(九丰一号)，经测定其绿原酸含量较二倍体增加了30％，且产量增加了58.7％；杜弢等发表的《四倍体黄芩D20引种实验报告》，报道了四倍体黄芩产量高于普通二倍体52.5％，黄芩苷含量、浸出物等均高于二倍体。
虽目前部分制药企业筛选了高含量的杏香兔耳风品种，意在进行推广种植，但由于种植产量极低，推广种植成为难点。本发明团队成员于2018年进行了未改良种质的杏香兔耳风进行了栽植测产，亩栽植2万株未改良种质的杏香兔耳风组培苗，栽植一年后测产为亩产约90公斤，产量极低。
发明内容
本发明针对现有品种杏香兔耳风产量低，有效成分含量不特别突出等缺点，特利用现代生物育种技术，对杏香兔耳风染色体进行加倍，提高了杏香兔耳风的单株产量以及绿原酸与原儿茶酸等活性成分含量。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种杏香兔耳风种质改良方法，包括如下步骤，
A、种质筛选：选择有效成分含量高，单株生物量大的优质种质作为母本；
B、种质改良；
B1材料清洗：选取健壮、无病虫害幼嫩茎段进行清洗；
B2无菌体系建立：将清洗完成的材料，转移至超净工作台，消毒后去掉两端伤口，将其剪成1.0～2.0cm大小的带芽小段，按极性接种于不定芽培养基上，温度23～27℃、光照强度2000～3000Lux，单日光照时间12h环境下培养30～40天；
B3多倍体诱导：将培养出的无菌不定芽剪成单芽，置于无菌诱导液中，在23～27℃下黑暗浸泡48～60h进行诱导；
B4、嵌合体培养：诱导的嵌合体置于分离培养基上，在温度23～27℃、光照强度2000～3000Lux，单日光照时间12h环境下培养60～90天；
C、改良种质的鉴定与筛选：嵌合体分离培养成5cm以上的带茎叶植株后，根据形态学鉴定法，以株为单位，选茎叶明显增粗增厚植株，取幼嫩叶，进行染色体染色镜检，筛选出染色体具有两对以上的多倍体作为改良种质；
D、改良种质生根：将获得的改良种质苗剪成具1～2cm的带芽茎段，接种于生根培养基中，在温度23～27℃、光照强度2000～3000Lux，单日光照时间12h环境下培养25～30天；
E、生根苗驯化：将具2～3条根系的改良杏香兔耳风生根苗，栽植于具75％遮阴率大棚基质中，栽植后在苗床上覆小拱棚，每2天进行一次喷雾；
F、改良种质种子获得：驯化60天后，按15×30cm行距移栽于具75％遮阴率的大棚内，至种子成熟后进行种子收集。
进一步的，步骤B1中，所述清洗步骤为：先用肥皂水漂洗20min，清水涮洗4～5次，滴2～3滴吐温-80震摇10～15min，自来水冲洗60～80min。
进一步的，步骤B2中，所述消毒步骤为：先用75％酒精消毒10～15s，无菌水涮洗2～3次，具2滴吐温-80的0.1％升汞溶液消毒6～7min，无菌水涮洗6～7次。
进一步的，步骤B2中，所述不定芽培养基配方为MS+2,4-D 0.2～0.4mg/L+ZT 0.6～1.0mg/L+KT 2.0～3.0mg/L。
进一步的，步骤B3中，所述单芽为0.1～0.3cm的具芽小段。
进一步的，步骤B3中，所述无菌诱导液为秋水仙素溶液和二甲基亚砜，其中秋水仙素溶液的质量浓度为0.03-0.06％，二甲基亚砜的质量浓度为0.2％。
进一步的，步骤B4中，所述分离培养基配方为MS+2,4-D 0.2～0.4mg/L+ZT0.6～1.0mg/L+KT 2.0～3.0mg/L。
进一步的，步骤D中，所述生根培养基配方为1/2MS+NAA 0.5～1.0mg/L+多效唑0.5～0.8mg/L+活性炭1.0g/L。
进一步的，步骤E中，所述基质组成为泥炭土、椰糠和田园土，其质量比例为3:4:7。
本发明的有益技术效果是：
1、本发明利用秋水仙素对杏香兔耳风无菌不定芽进行多倍体诱导，后通过形态学鉴别法和染色体压片法筛选并纯化培养获得改良杏香兔耳风种质，获得率为19％；
2、本发明所获得改良杏香兔耳风种质，茎具有明显增粗，叶具有明显增厚表现，且单株生物量较原母本高1.9倍，亩产较原母本高1.6倍，同时，绿原酸含量较母本高1.3倍，原儿茶酸含量较原母本高2.2倍；
3、本发明所获得的优质种质，具有遗传稳定性，通过种子种植出的植株仍具有可育性。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种杏香兔耳风种质改良方法，包括如下步骤，
A、种质筛选：选择有效成分含量高，单株生物量大的优质种质作为母本；
B、种质改良；
B1材料清洗：选取健壮、无病虫害幼嫩茎段，用肥皂水漂洗20min，清水涮洗4次，滴2滴吐温-80震摇10min，自来水冲洗60min；
B2无菌体系建立：将清洗完成的材料，转移至超净工作台，先用75％酒精消毒10s，无菌水涮洗2次，具2滴吐温-80的0.1％升汞溶液消毒6min，无菌水涮洗6次，无菌滤纸上吸去表面水分，消毒后去掉两端伤口，将其剪成1.0cm大小的带芽小段，按极性接种于不定芽培养基(配方为MS+2,4-D 0.2mg/L+ZT0.6mg/L+KT 2.0mg/L)上，温度23℃、光照强度2000Lux，单日光照时间12h环境下培养30天；
B3多倍体诱导：将培养出的无菌不定芽剪成0.1cm的具芽小段，置于无菌诱导液中，在23℃下黑暗浸泡48h进行诱导；无菌诱导液为秋水仙素溶液和二甲基亚砜，其中秋水仙素溶液的质量浓度为0.03％，二甲基亚砜的质量浓度为0.2％；
B4、嵌合体培养：诱导的嵌合体置于分离培养基(配方为MS+2,4-D 0.2mg/L+ZT0.6mg/L+KT 2.0mg/L)上，在温度23℃、光照强度2000Lux，单日光照时间12h环境下培养60天；
C、改良种质的鉴定与筛选：嵌合体分离培养成5cm以上的带茎叶植株后，根据形态学鉴定法，以株为单位，选茎叶明显增粗增厚植株，取幼嫩叶，进行染色体染色镜检，筛选出染色体具有两对以上的多倍体作为改良种质；
D、改良种质生根：将获得的改良种质苗剪成具1cm的带芽茎段，接种于生根培养基(配方为1/2MS+NAA0.5mg/L+多效唑0.5mg/L+活性炭1.0g/L)中，在温度23℃、光照强度2000Lux，单日光照时间12h环境下培养25天；
E、生根苗驯化：将具2条根系的改良杏香兔耳风生根苗，栽植于具75％遮阴率大棚基质中，栽植后在苗床上覆小拱棚，每2天进行一次喷雾；其中，基质组成为泥炭土、椰糠和田园土，其质量比例为3:4:7；
F、改良种质种子获得：驯化60天后，按15×30cm行距移栽于具75％遮阴率的大棚内，至种子成熟后进行种子收集。
实施例2
一种杏香兔耳风种质改良方法，包括如下步骤，
A、种质筛选：选择有效成分含量高，单株生物量大的优质种质作为母本；
B、种质改良；
B1材料清洗：选取健壮、无病虫害幼嫩茎段，用肥皂水漂洗20min，清水涮洗5次，滴3滴吐温-80震摇15min，自来水冲洗80min；
B2无菌体系建立：将清洗完成的材料，转移至超净工作台，先用75％酒精消毒15s，无菌水涮洗3次，具2滴吐温-80的0.1％升汞溶液消毒7min，无菌水涮洗7次，无菌滤纸上吸去表面水分，消毒后去掉两端伤口，将其剪成2.0cm大小的带芽小段，按极性接种于不定芽培养基(配方为MS+2,4-D 0.4mg/L+ZT1.0mg/L+KT 3.0mg/L)上，温度27℃、光照强度3000Lux，单日光照时间12h环境下培养40天；
B3多倍体诱导：将培养出的无菌不定芽剪成0.3cm的具芽小段，置于无菌诱导液中，在27℃下黑暗浸泡60h进行诱导；无菌诱导液为秋水仙素溶液和二甲基亚砜，其中秋水仙素溶液的质量浓度为0.06％，二甲基亚砜的质量浓度为0.2％；
B4、嵌合体培养：诱导的嵌合体置于分离培养基(配方为MS+2,4-D 0.4mg/L+ZT1.0mg/L+KT 3.0mg/L)上，在温度27℃、光照强度3000Lux，单日光照时间12h环境下培养90天；
C、改良种质的鉴定与筛选：嵌合体分离培养成5cm以上的带茎叶植株后，根据形态学鉴定法，以株为单位，选茎叶明显增粗增厚植株，取幼嫩叶，进行染色体染色镜检，筛选出染色体具有两对以上的多倍体作为改良种质；
D、改良种质生根：将获得的改良种质苗剪成具2cm的带芽茎段，接种于生根培养基(配方为1/2MS+NAA 1.0mg/L+多效唑0.8mg/L+活性炭1.0g/L)中，在温度25℃、光强2500Lux，单日光照时间12h环境下培养28天；
E、生根苗驯化：将具3条根系的改良杏香兔耳风生根苗，栽植于具75％遮阴率大棚基质中，栽植后在苗床上覆小拱棚，每2天进行一次喷雾；其中，基质组成为泥炭土、椰糠和田园土，其质量比例为3:4:7；
F、改良种质种子获得：驯化60天后，按15×30cm行距移栽于具75％遮阴率的大棚内，至种子成熟后进行种子收集。
实施例3
一种杏香兔耳风种质改良方法，包括如下步骤，
A、种质筛选：选择有效成分含量高，单株生物量大的优质种质作为母本；
B、种质改良；
B1材料清洗：选取健壮、无病虫害幼嫩茎段，用肥皂水漂洗20min，清水涮洗4次，滴2滴吐温-80震摇13min，自来水冲洗70min；
B2无菌体系建立：将清洗完成的材料，转移至超净工作台，先用75％酒精消毒13s，无菌水涮洗3次，具2滴吐温-80的0.1％升汞溶液消毒6.5min，无菌水涮洗7次，无菌滤纸上吸去表面水分，消毒后去掉两端伤口，将其剪成1.5cm大小的带芽小段，按极性接种于不定芽培养基(配方为MS+2,4-D 0.3mg/L+ZT0.8mg/L+KT 2.5mg/L)上，温度25℃、光照强度2500Lux，单日光照时间12h环境下培养35天；
B3多倍体诱导：将培养出的无菌不定芽剪成0.2cm的具芽小段，置于无菌诱导液中，在25℃下黑暗浸泡55h进行诱导；无菌诱导液为秋水仙素溶液和二甲基亚砜，其中秋水仙素溶液的质量浓度为0.05％，二甲基亚砜的质量浓度为0.2％；
B4、嵌合体培养：诱导的嵌合体置于分离培养基(配方为MS+2,4-D 0.3mg/L+ZT0.8mg/L+KT 2.5mg/L)上，在温度25℃、光照强度2500Lux，单日光照时间12h环境下培养75天；
C、改良种质的鉴定与筛选：嵌合体分离培养成5cm以上的带茎叶植株后，根据形态学鉴定法，以株为单位，选茎叶明显增粗增厚植株，取幼嫩叶，进行染色体染色镜检，筛选出染色体具有两对以上的多倍体作为改良种质；
D、改良种质生根：将获得的改良种质苗剪成具1.5cm的带芽茎段，接种于生根培养基(配方为1/2MS+NAA 0.7mg/L+多效唑0.6mg/L+活性炭1.0g/L)中，在温度27℃、光强3000Lux，单日光照时间12h环境下培养30天；
E、生根苗驯化：将具3条根系的改良杏香兔耳风生根苗，栽植于具75％遮阴率大棚基质中，栽植后在苗床上覆小拱棚，每2天进行一次喷雾；其中，基质组成为泥炭土、椰糠和田园土，其质量比例为3:4:7；
F、改良种质种子获得：驯化60天后，按15×30cm行距移栽于具75％遮阴率的大棚内，至种子成熟后进行种子收集。
对比实施例4
A、春季，在梳林下，理成宽1.2～1.3m的墒，在墒面按20cm的行距开5～10cm浅沟，施40千克复合肥(15:15:15)后覆土2～3cm；
B、称取实施例1-3收集的种子、改良前的杏香兔耳风母本种子各200g，按1:20的质量比，与细沙土均匀混合，条播于墒面沟内后覆1～2cm细土，并覆地膜，期间保持墒面土壤湿度；
C、出苗80％以上揭开地膜；
D、苗发齐后，浇灌0.05％的尿素溶液，提苗；
E、于7～8月，杏香兔耳风生长旺盛期，每隔15天，用0.1％水溶性复合肥(20:10:15)兑水浇根，连续3次；
F、于12月，进行杏香兔耳风全株采挖，洗净泥土后晒干；
G、对晒干后的杏香兔耳测定亩产量，绿原酸和原儿茶酸含量，结果如下表所示：
表1杏香兔耳测定亩产量、绿原酸和原儿茶酸含量测定结果
母产量(kg) 绿原酸含量(％) 原儿茶酸含量(％)
实施例1 161 1.92 2.13
实施例2 158 1.95 2.12
实施例3 165 1.89 2.16
对照组 102 1.49 0.97
由上表可知，经过改良后的杏香兔耳风亩产量比对比组高1.6倍，绿原酸含量比对比例高1.3倍、原儿茶酸含量比对比例高2.2倍。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (5)

1.一种杏香兔耳风种质改良方法，其特征在于，包括如下步骤，
A、种质筛选：选择有效成分含量高，单株生物量大的优质种质作为母本；
B、种质改良；
B1、材料清洗：选取健壮、无病虫害幼嫩茎段进行清洗；
B2、无菌体系建立：将清洗完成的材料，转移至超净工作台，消毒后去掉两端伤口，将其剪成1.0～2.0cm大小的带芽小段，按极性接种于不定芽培养基上，温度23～27℃、光照强度2000～3000Lux，单日光照时间12h环境下培养30～40天；
所述不定芽培养基配方为MS+2,4-D 0.2～0.4 mg/L +ZT 0.6～1.0 mg/L +KT 2.0～3.0 mg/L；
B3、多倍体诱导：将培养出的无菌不定芽剪成单芽，置于无菌诱导液中，在23～27℃下黑暗浸泡48～60h进行诱导；
所述无菌诱导液为秋水仙素溶液和二甲基亚砜，其中秋水仙素溶液的质量浓度为0.03-0.06%，二甲基亚砜的质量浓度为0.2%；
B4、嵌合体培养：诱导的嵌合体置于分离培养基上，在温度23～27℃、光照强度2000～3000Lux，单日光照时间12h环境下培养60～90天；
所述分离培养基配方为MS+2,4-D 0.2～0.4 mg/L +ZT 0.6～1.0 mg/L +KT 2.0～3.0mg/L
C、改良种质的鉴定与筛选：嵌合体分离培养成5cm以上的带茎叶植株后，根据形态学鉴定法，以株为单位，选茎叶明显增粗增厚植株，取幼嫩叶，进行染色体染色镜检，筛选出染色体具有两对以上的多倍体作为改良种质；
D、改良种质生根：将获得的改良种质苗剪成1～2cm的带芽茎段，接种于生根培养基中，在温度23～27℃、光照强度2000～3000Lux，单日光照时间12h环境下培养25～30天；
所述生根培养基配方为1/2MS+NAA 0.5～1.0mg/L +多效唑 0.5～0.8mg/L +活性炭1.0g/L；
E、生根苗驯化：将具备2～3条根系的改良杏香兔耳风生根苗，栽植于具备75%遮阴率大棚基质中，栽植后在苗床上覆小拱棚，每2天进行一次喷雾；
F、改良种质种子获得：驯化60天后，按15×30cm行距移栽于具备75%遮阴率的大棚内，至种子成熟后进行种子收集。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤B1中，所述清洗步骤为：先用肥皂水漂洗20min，清水涮洗4～5次，滴2～3滴吐温-80震摇10～15min，自来水冲洗60～80min。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤B2中，所述消毒步骤为：先用75%酒精消毒10～15s，无菌水涮洗2～3次，具备2滴吐温-80的0.1%升汞溶液消毒6～7min，无菌水涮洗6～7次。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤B3中，所述单芽为0.1～0.3cm的小段。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤E中，所述基质组成为泥炭土、椰糠和田园土，其质量比例为3:4:7。
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