CN110393150A

CN110393150A - 一种杏香兔耳风组培技术繁育方法

Info

Publication number: CN110393150A
Application number: CN201810376597.8A
Authority: CN
Inventors: 杨建云; 邓清; 曾祥飞; 曾琼; 赵露琴
Original assignee: Yunnan Yunlong Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Yunnan Yunlong Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2018-04-25
Filing date: 2018-04-25
Publication date: 2019-11-01

Abstract

本发明公开了一种杏香兔耳风组培技术繁育方法，包括外植体的选择、外植体的清洁与消毒、丛生芽诱导、丛生芽增殖及生根等步骤。本发明对杏香兔耳风的组织培养技术展开了探索，确立了无菌材料的获得、愈伤组织的诱导、愈伤的分化成芽、生根等理想培养条件，最终成功建立了杏香兔耳风组培苗的无性繁殖体系，为实现对杏香兔耳风野生资源的保护、栽培、对种苗的需求以及基因库的建立奠定了技术基础，解决野生珠子参产量低、供应少和自然栽培周期长的问题。

Description

一种杏香兔耳风组培技术繁育方法

技术领域

本发明涉及一种中药材的组织培养方法，属于植物组织培养及中药材种植领域，特别涉及杏香兔耳风的组织培养方法。

背景技术

杏香兔耳风Ainsliaea fragrans Champ 为菊科兔耳风属植物，以全草入药，具有清热解毒，利湿，止血的功效，主要用于治肺痈，乳腺炎，疳积，骨髓炎，毒蛇咬伤。杏香兔耳风主要分布于台湾、福建、浙江、安徽、江苏、江西、湖北、四川、湖南、广东、广西、云南等省，生于海拔30~850米的山坡灌木林下或路旁、沟边草丛中，云南在海拔2000米附近亦有分布。目前以本植物作为药材的来源全部为野生资源，整株采集，野生资源繁殖方式以种子繁殖为主，种子成熟时间一般为12月~次年1月，而药材采收时间一般为生殖生长前期（8~10月），致使野生资源的后代繁殖遭到切割，从而导致野生资源蕴藏量逐年降低。近年来有部分企事业单位开展了杏香兔耳风种植技术的研究，但限于种子采种与药材采收的时间矛盾，杏香兔耳风的种植处于发展初期阶段，尚未形成规模。同时，杏香兔耳风虽分布较广，但各地区所产药材中有效成分含量存在较大区别，不同批次甚至同一批次药材存在质量差异较大情况，究其原因在于杏香兔耳风品种较杂，需要选育特定高质品种用于药材生产。

发明内容

本发明针对以上所述的传统繁殖方法的不足，发明了一种组分简单、操作简便、生产周期短、可为规模化种植短期内快速提供高质品种的优质种苗的组培技术繁育方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

1．外植体的选择：将健壮植株，栽植于实验室内，每隔3天用75%多菌灵500倍液，于早上十点左右喷施5次以上，选取无病斑幼嫩叶及幼嫩茎段；

2．外植体的清洁：将选取的外植体剪成约2~3cm大小，用饱和肥皂水溶液涮洗10~15min，然后用自来水冲洗3-4次至无肥皂液残留，然后加适量水，再加2~3滴吐温-80，振摇10~15min，用自来水冲淋50~60min。

3．外植体的消毒：将清洗好的外植体倒出全部水分，转移至超净工作台内，加入75%酒精振摇20~25s，无菌水涮洗3~4次，在加入饱和漂白粉溶液振摇15~20min，无菌水涮洗3~4次，最后加入0.1%升汞溶液+1滴吐温-80振摇7~8min，无菌水涮洗5~6次，污染率为40~50%。

4．丛生芽诱导培养：将消毒好的外植体剪取边缘伤口，接种于WPM+1.0~2.0mg/L2，4-D+0.1-0.2mg/L NAA+ 0.5~1.0mg/L TDZ的培养基中，在温度23-27℃，光照强度1000-2000lux，单日光照时间为8h的环境条件下培养，约培养15天左右开始出愈，再培养25天左右开始长丛生芽，诱导率为50~60%;

5．丛生芽的增殖培养：杏香兔耳风经诱导产生丛生芽后，将其愈伤带丛生芽切成约0.5m2的小块，接种于MS+0.05~0.20mg/L NAA+1.0~2.0mg/LBA +5.0-7.0mg/L KT的增殖培养基中，在温度23-27℃，光照强度3000-4000lux，单日光照时间为12h的条件下培养，培养约30天后可获得大量较大丛生芽，增殖系数为6~7；

6．丛生芽的生根培养：将增殖后的丛生芽切成单芽，接种于WPM+2.0~3.0mg/L NAA+0~2.0mg/LIBA+1.0g/L C*的生根培养基中，在温度23-27℃，光照强度3000-4000lux，单日光照时间为12h的环境下培养，培养约30天后，可产生2~3条2~3cm的粗壮根，生根率为95%以上。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明所述杏香兔耳风组培技术繁育方法，在外植体的采集时间为4月至10月，可采集周期长，经采集后可继续生长，到收获季节亦可同其他未采集的植株同时收获且不影响产量及品质；

（2）本发明所述杏香兔耳风组培技术繁育方法，组分简单，操作简便，成本低廉，繁育过程不受地域及季节限制；

（3）本发明所述杏香兔耳风组培技术繁育方法，繁殖速度快、繁殖率高。按一株杏香兔耳风植株计算，一株植株可采集5~6个外植体，经诱导培养40天以、每代30天的增殖培养7代，以及30天的生根培养，可获得约500万组培生根苗，历时不到一年，若继续增殖培养，将可获得上千万甚至上亿株组培生根苗。可为规模化种植短期内提供大量种苗；

（4）本发明所述杏香兔耳风组培技术繁育方法，属于用体细胞繁殖的无性繁殖范畴，能最大程度的保持亲本性状，相比传统的种子繁殖存在杂交变异的情况，更有利于药材优良性状的保存。

具体实施方式

下面结合实例，对本发明做进一步的说明。本发明的实施方式包括但不限于下列实施实例。

实施实例一

1．于4月采集野生杏香兔耳风野生植株，移栽于实验室内，于10天左右返青后，于早上十点左右喷施75%多菌灵500倍液，每隔3天喷施一次，于移栽后约30天，取幼嫩茎段，将其剪成2~3cm大小；

2．将外植体用饱和肥皂水溶液涮洗10min，后清水冲洗4次至无肥皂水残留，加2滴吐温-80振摇15min，用自来水冲淋1h，倒出自来水，转移至超净工作台内，用75%酒精消毒25s，无菌水涮洗3次，再用饱和漂白粉溶液消毒20min，无菌水涮洗3次，最后用0.1%升汞溶液消毒7min，无菌水涮洗6次；

3．用无菌滤纸吸干已消毒好的外植体表面水分，剪去两头伤口，将其剪成约1cm左右大小的茎段，按极性斜插于WPM+1.0~2.0mg/L 2，4-D+0.1-0.2mg/L NAA+ 0.5~1.0mg/L TDZ的诱导培养基中，在温度23-27℃，光照强度1000-2000lux，单日光照时间为8h的环境条件下培养，约培养10天左右外植体表层开始萌动，15天左右开始出愈并同时出现丛生芽，40天左右有大量丛生芽，诱导率为50~55%，丛生芽率量为10芽/株；

4．将诱导出的丛生芽切成约0.5~1cm大小，平置于MS+0.05~0.20mg/L NAA+1.0~2.0mg/LBA +5.0-7.0mg/L KT增殖培养基中，在温度23-27℃，光照强度3000-4000lux，单日光照时间为12h的条件下培养，培养约5天左右，原丛生芽长大，培养约10天左右，新丛生芽逐渐开始出现并增大，培养约30天左右，达到最佳生长量，增殖率为7~8，培养约60天左右，丛生芽停止生长；

5．将经增殖培养的较大丛生芽切下，直立插入WPM+2.0~3.0mg/L NAA+0~2.0mg/LIBA+1.0g/L C*的生根培养基中，在温度23-27℃，光照强度3000-4000lux，单日光照时间为12h的环境下培养，培养约15天左右，基部有培养基根系萌动，培养30天后，可产生2~3条2~3cm的粗壮根，生根率为95%以上。

实施实例二

1．于6月采集野生杏香兔耳风野生植株，移栽于实验室内，于10天左右返青后，于早上十点左右喷施75%多菌灵500倍液，每隔4天喷施一次，于移栽后约50天，取幼嫩叶片，将其剪成3~4cm2大小；

2．将材料用饱和肥皂水溶液涮洗15min，后清水冲洗3次至无肥皂水残留，加3滴吐温-80振摇20min，用自来水冲淋80min，倒出自来水，转移至超净工作台内，用75%酒精消毒20s，无菌水涮洗3次，再用饱和漂白粉溶液消毒15min，无菌水涮洗3次，最后用0.1%升汞溶液+2滴吐温-80消毒8min，无菌水涮洗8次；

3．用无菌滤纸吸干已消毒好的外植体表面水分，剪去边缘伤口，将其剪成约1cm2左右大小，并用刀片在叶表皮为造成人为伤口，按极性平铺于WPM+1.0~2.0mg/L 2，4-D+0.1-0.2mg/L NAA+ 0.5~1.0mg/L TDZ的诱导培养基中，在温度23-27℃，光照强度1000-2000lux，单日光照时间为8h的环境条件下培养，约培养15天左右外植体表层开始萌动，20天左右开始出愈，30天左右开始产生丛生芽，40天左右有大量丛生芽，诱导率为40~45%，丛生芽率量为5芽/叶；

4．将诱导出的丛生芽切成约0.5~1cm大小，平置于MS+0.05~0.20mg/L NAA+1.0~2.0mg/LBA +5.0-7.0mg/L KT增殖培养基中，在温度23-27℃，光照强度3000-4000lux，单日光照时间为12h的条件下培养，培养约7天左右，原丛生芽长大，培养约15天左右，新丛生芽逐渐开始出现并增大，培养约35天左右，达到最佳生长量，培养约60天左右，丛生芽停止生长，增殖率为4~4.5；

Claims

1.一种杏香兔耳风组培技术繁育方法，其特征在于以下步骤和方法进行的：

(1)外植体的选择：将健壮植株，栽植于实验室内，每隔3天用75％多菌灵500倍液喷施5次以上，选取幼嫩叶及幼嫩茎段；

(2)外植体的清洁消毒：将选取的外植体用饱和肥皂水溶液涮洗后冲淋，在超净工作台上依次用酒精、漂白粉溶液及升汞溶液消毒；

(3)丛生芽诱导培养：将消毒好的外植体接种在以WPM为基本培养基，添加2,4-D、NAA、TDZ等激素的诱导培养基上，在一定温度、光照强度和光周期环境下培养；

(4)丛生芽增殖培养：将诱导出的丛生芽或愈伤组织剪成单芽或小块，接种在以MS为基本培养基，添加NAA、6-BA、KT等激素的增殖培养基上，在一定温度、光照强度和光周期的环境下培养；

(5)丛生芽生根培养：将增殖的无根苗，接种在以WPM为基本培养基，添加NAA、IBA等激素的生根培养基上，在一定温度、光照强度和光周期的环境下培养。

2.根据权利要求1所述的杏香兔耳风组培育苗方法，其特征在于步骤(2)所述的外植体的最佳消毒方法为75％酒精消毒20～25s、，饱和漂白粉溶液消毒15～20min，0.1％升汞溶液消毒7～8min。

3.根据权利要求1所述的杏香兔耳风组培育苗方法，其特征在于步骤(3)所述的丛生芽诱导培养基为WPM+1.0～2.0mg/L 2，4-D+0.1-0.2mg/L NAA+0.5～1.0mg/L TDZ培养环境为温度23-27℃，光照强度1000-2000lux，单日光照时间为8h的条件下培养。

4.根据权利要求1所述的杏香兔耳风组培育苗方法，其特征在于步骤(4)所述的丛生芽增殖培养基为MS+0.05～0.20mg/L NAA+1.0～2.0mg/LBA+5.0-7.0mg/L KT，培养环境为温度23-27℃，光照强度3000-4000lux，单日光照时间为12h的条件下培养。

5.根据权利要求1所述的杏香兔耳风组培育苗方法，其特征在于步骤(5)所述的丛生芽生根培养基为WPM+2.0～3.0mg/L NAA+0～2.0mg/LIBA+1.0g/L C*，培养环境为温度23-27℃，光照强度3000-4000lux，单日光照时间为12h的环境下培养。