CN117296711B - 一种仙茅多倍体育苗方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种仙茅多倍体育苗方法，属于植物作物育种及中药材种植领域，育苗方法包括以下步骤：无菌体系的建立、多倍体的诱导、诱导材料的分化培养、形态学鉴定、倍性鉴定，多倍体的诱导步骤具体为：培养出的无菌苗，将其叶片剪成长0.2～0.4cm小段，置于无菌诱导液中，进行多倍体诱导，所述的无菌诱导液为以0.2%二甲基亚砜水溶液为溶剂，配置浓度为0.10%～0.12%的秋水仙素和浓度为0.02～0.03%的安磺灵混合溶液；本发明诱导产生的仙茅多倍体，经种植比较，仙茅单株全株生物量较原母本提高2.1倍，单位面积药材产量提高了30～50千克。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药材的多倍体培养方法，属于植物作物育种及中药材种植领域，特别涉及一种仙茅多倍体育苗方法。
背景技术
仙茅（Cruculigo orchioides Gaertn.）为石蒜科仙茅属草本植物，以根茎入药，有补肾阳，强筋骨，祛湿寒的功效，主要用于治疗阳痿精冷，筋骨痿软，腰膝冷痛，阳虚冷泻等症。不论是2020版《中国药典》，还是各制药企业内部标准，都有对仙茅苷的含量检测指标，而各产区仙茅药材的仙茅苷含量参差不齐，特别是东南亚各国的进口仙茅药材，几乎不能达标，另一方面，仙茅苷作为仙茅药材的有效成分，其含量的高低，直接影响各相关制剂及饮片的药效，使得仙茅含量的检测成为仙茅药材质量评价的最重要指标。近年来，云南、四川、贵州等地的中药材贸易企业及个人以及相关制药企业，纷纷开始开展了仙茅的种植技术研究，但在种植过程中，仙茅药材普遍存在产量低，仙茅苷含量不能达到市场价值需求。
多倍体是普遍存在于自然界中，是生物自身体细胞中具有三组或三组以上的染色体，常见于高等植物中，许多植物在进化的过程都经历了“多倍体化”与“二倍体化”，具资料统计，种子植物中的528个属1171个种中约38.71%是多倍体，其中被子植物约50%是多倍体。
由于多倍体具有茎叶增大增厚、抗逆性强、次生代谢产物增多等特点，使得多倍体逐渐成为作物育种的重要方式，如多倍体的草莓，比普通的二倍体大2～4倍，三倍体的西瓜，一方面其果实较二倍体大，且含糖量比二倍体高10%以上，同时因为三倍体，造成不育，形成无籽西瓜，更加方便食用。而在药用植物的育种上，由于多倍体的优良特性，药用植物多倍体人工育种将是药用植物品种改良的重要方式。如多倍体金银花（九丰一号），经测定其绿原酸含量较二倍体增加了30%，且产量增加了58.7%；四倍体黄芩产量高于普通二倍体52.5%，黄芩苷含量、浸出物等均高于二倍体。
发明内容
本发明针对仙茅上述普遍存在的单位面积种植产量低、仙茅苷含量普遍偏低等不足，特发明了一种仙茅多倍体育苗方法，以提高单株生物量、单位面积产量以及仙茅苷含量。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种仙茅多倍体育苗方法，步骤包括：
（1）无菌体系的建立：选择健壮无病虫害的仙茅带芽根茎，经消毒后，接种于诱导培养基上培养，培养出无菌苗；
（2）多倍体的诱导：培养出的无菌苗，将其叶片剪成长0.2～0.4cm小段，置于无菌诱导液中，进行多倍体诱导，所述无菌诱导液为以0.2%二甲基亚砜水溶液为溶剂，配置浓度为0.10%～0.12%的秋水仙素和浓度为0.02～0.03%的安磺灵混合溶液；
（3）诱导材料的分化培养：将完成诱导的叶片，置于分化培养基上培养；
（4）形态学鉴定：分化培养成带茎叶植株后，以株为单位，观察植株形态，筛选出叶明显增厚增宽植株，茎明显增粗的植株，根系明显增粗的植株为拟多倍体；
（5）倍性鉴定：取拟多倍体的根尖，进行染色体镜检，筛选出染色体数量为四对及以上的植株，即得仙茅多倍体。
进一步的，更详细的步骤如下：
1、优质种质的筛选：选择仙茅苷含量在0.12%以上的仙茅优质种质作为多倍体诱导母本；
2、优质种质的前期处理：将选择出的优质种质，移栽于室内，每隔7天进行一次50%多菌灵800倍液灌根；
3、优质种质的选择与清洗：选择健壮无病虫害的仙茅，从茎基部剪去地上茎叶，并去花去果去须根，留约3～4cm带芽根茎，用清水去除表面泥土后用牙刷蘸肥皂水刷洗深层泥土，后滴2～3滴吐温-80，涮洗10～20min，最后用自来水冲淋60～80min；
4、无菌体系的建立：将清洗完成的仙茅根茎，转移至超净台，依次用75%酒精溶液消毒10～15s、饱和漂白粉溶液消毒20～30min、0.05%升汞溶液消毒10～15min，后用无菌滤纸吸去表面水分，将其剪成2～3cm带芽根茎，按极性斜插于MS+GA3 1.0mg/L的诱导培养基上，置于温度25±2℃，光照强度2000～3000lux，单日光照时间12h的环境下培养40～50d，培养出无菌苗；
3、多倍体的诱导：将培养出的无菌苗，在叶片中脉用刀片轻轻划伤表皮，后将其剪成长0.2～0.4cm小段，置于无菌诱导液培养，无菌诱导液为以0.2%二甲基亚砜水溶液为溶剂，配置浓度为0.10%～0.12%的秋水仙素和浓度为0.02～0.03%的安磺灵混合溶液，在温度为30±2℃（非水浴，水浴易导致污染），震摇频率为60～70r/min的摇床上，全黑暗无光条件下诱导24～36h；
4、诱导材料的分化培养：将完成诱导的叶片，平铺于MS+2,4-D 0.8～1.0mg/L+6-BA 3.0～4.0mg/L的分化培养基上，在温度25±2℃，光照强度2000～3000lux，单日光照时间12h环境下培养60～70d；
5、形态学筛选：诱导后的材料经分化培养成带根茎叶植株后，以株为单位，观察植株形态，筛选出叶明显增厚增宽，茎以及根系明显增粗的植株为拟多倍体；
6、倍性鉴定：将拟多倍体的根尖，进行染色体染色镜检，筛选出染色体数量为四对及以上的植株，即得仙茅多倍体；
7、多倍体扩增：将筛选出的多倍体植株，叶片剪成具0.5～1cm长的小段，平铺于MS+NAA 0.1～0.5mg/L+TDZ 0.1～0.7mg/L的增殖培养基上，在温度25±2℃，光照强度2000～3000lux，单日光照时间12h环境下培养；
8、多倍体的驯化及种植：将扩增后的多倍体，栽植于泥炭土与珍珠岩按照质量比10:3混合基质中，驯化3～6个月，移栽于大田或者疏林下。
本发明的有益效果在于
1、本发明是结合仙茅组织培养技术建立的多倍体，通过少量诱导后获得的多倍体，可再次利用组培技术进行复制生产，可短期内大量繁育出遗传稳定多倍体种苗。
2、在现有多倍体诱导技术中，大多采用一定浓度的秋水仙素进行诱导，但在仙茅多倍体诱导过程中，单一的秋水仙素在高浓度或长时诱导时，可使诱导的材料出现死亡，而未死亡后期进行分化培养时，几乎不能分化，而当浓度使用过低或诱导时间过短时，几乎不能诱导出多倍体（诱导率在0～3.6%）且诱导重现性极差，当采用其他单一的非常规多倍体诱导剂时也存在秋水仙素诱导同样的结果，有的诱导剂甚至完全不能诱导，而本发明团队创造性的采用秋水仙素和其他非常规多倍体诱导剂进行组合（在多倍体诱导中极为少见），可将仙茅多倍体诱导率提高至47%以上，且诱导时死亡率在2%以下，86%以上诱导后的材料均可正常分化成完整植株。
3、本发明诱导产生的仙茅多倍体，经种植比较，仙茅单株全株生物量较原母本提高2.1倍，单位面积药材产量提高了30～50千克。
4、本发明诱导的仙茅多倍体经种植比较，仙茅苷含量较原母本提高了1.3倍，而其他有效次生代谢产物如总黄酮、总皂苷以及总多酚均有一定程度的提高。
附图说明
图1：诱导出的多倍体（左）和二倍体（右）对比图；（多倍体茎明显增粗、叶片明显增宽增厚，根明显增粗）
图2：实施例1（左）和对比例3（右）种植一年后的对比图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明做进一步的说明。本发明的实施方式包括但不限于下列实施例。本发明中所使用的试剂，未经特别说明，均可以从市场购买。
实施例1
1、优质种质的筛选：选择仙茅苷含量高于0.12%的仙茅优质种质作为多倍体诱导母本；
2、优质种质的前期处理：将选择出的优质种质，移栽于室内，每隔7天进行一次50%多菌灵800倍液灌根；
3、优质种质的选择与清洗：选择健壮无病虫害的仙茅，从茎基部剪去地上茎叶，并去花去果去须根，留约3～4cm带芽根茎，用清水去除表面泥土后用牙刷蘸肥皂水刷洗深层泥土，后滴3滴吐温-80，涮洗15min，最后用自来水冲淋60min；
4、无菌体系的建立：将清洗完成的仙茅根茎，转移至超净台，依次用75%酒精溶液消毒10s、饱和漂白粉溶液消毒20min、0.05%升汞溶液消毒10min，后用无菌滤纸吸去表面水分，将其剪成2～3cm带芽根茎，按极性斜插于MS+GA3 1.0mg/L的诱导培养基上，置于温度25±2℃，光照强度2000～3000lux，单日光照时间12h的环境下培养40d，培养获得无菌苗；
3、多倍体的诱导：将培养出的无菌苗，在叶片中脉用刀片轻轻划伤表皮，后将其剪成长0.2～0.4cm小段，置于无菌诱导液中，无菌诱导液为：以0.2%二甲基亚砜水溶液为溶剂，配置秋水仙素浓度为0.10%%和安磺灵浓度为0.02%的混合溶液，在温度为30±2℃（非水浴，水浴易导致污染），震摇频率为60r/min的摇床上，全黑暗无光条件下诱导36h；
4、诱导材料的分化培养：将完成诱导的叶片，平铺于MS+2,4-D 0.8mg/L+6-BA3.0mg/L的分化培养基上，在温度25±2℃，光照强度2000～3000lux，单日光照时间12h环境下培养60d；
5、形态学筛选：诱导后的材料经分化培养成带根茎叶植株后，以株为单位，观察植株形态，筛选出叶明显增厚增宽，茎以及根系明显增粗的植株为拟多倍体。
6、倍性鉴定：将拟多倍体的根尖，进行染色体染色镜检，筛选出染色体数量为四对及以上的植株，即得仙茅多倍体；
7、多倍体扩增：将筛选出的多倍体，叶片剪成0.5～1cm长的小段，平铺于MS+NAA0.1mg/L+TDZ 0.1mg/L的增殖培养基上，在温度25±2℃，光照强度2000～3000lux，单日光照时间12h环境下培养；
8、多倍体的驯化及种植：将扩增后的多倍体，栽植于泥炭土与珍珠岩按照质量比10:3混合基质中，驯化6个月，后移栽于大田或者疏林下。
实施例2
1、优质种质的筛选：选择仙茅苷含量高于0.12%的仙茅优质种质作为多倍体诱导母本；
2、优质种质的前期处理：将选择出的优质种质，移栽于室内，每隔7天进行一次50%多菌灵800倍液灌根；
3、优质种质的选择与清洗：选择健壮无病虫害的仙茅，从茎基部剪去地上茎叶，并去花去果去须根，留约3～4cm带芽根茎，用清水去除表面泥土后用牙刷蘸肥皂水刷洗深层泥土，后滴3滴吐温-80，涮洗20min，最后用自来水冲淋80min；
4、无菌体系的建立：将清洗完成的仙茅根茎，转移至超净台，依次用75%酒精溶液消毒15s、饱和漂白粉溶液消毒30min、0.05%升汞溶液消毒15min，后用无菌滤纸吸去表面水分，将其剪成2～3cm带芽根茎，按极性斜插于MS+GA3 1.0mg/L的诱导培养基上，置于温度25±2℃，光照强度2000～3000lux，单日光照时间12h的环境下培养50d，培养出无菌苗；
3、多倍体的诱导：将培养出的无菌苗，在叶片中脉用刀片轻轻划伤表皮，后将其剪成长0.2～0.4cm小段，置于无菌诱导液中，无菌诱导液为：0.2%二甲基亚砜水溶液为溶剂，配置秋水仙素浓度为0.12%和安磺灵浓度为0.03%的混合溶液，在温度为30±2℃（非水浴，水浴易导致污染），震摇频率为70r/min的摇床上，全黑暗无光条件下诱导36h；
4、诱导材料的分化培养：将完成诱导的叶片，平铺于MS+2,4-D 1.0mg/L+6-BA4.0mg/L的分化培养基上，在温度25±2℃，光照强度2000～3000lux，单日光照时间12h环境下培养60～70d；
5、形态学筛选：诱导后的材料经分化培养成带根茎叶植株后，以株为单位，观察植株形态，筛选出叶明显增厚增宽，茎以及根系明显增粗的植株为拟多倍体；
6、倍性鉴定：将拟多倍体的根尖，进行染色体染色镜检，筛选出染色体数量为四对及以上的植株，即得仙茅多倍体。
7、多倍体扩增：将筛选出的多倍体，叶片剪成具0.5～1cm长的小段，平铺于MS+NAA0.5mg/L+TDZ 0.7mg/L的增殖培养基上，在温度25±2℃，光照强度2000～3000lux，单日光照时间12h环境下培养；
8、多倍体的驯化及种植：将扩增后的多倍体，栽植于泥炭土与珍珠岩按照质量比10:3混合基质中，驯化6个月，后移栽于大田或者疏林下。
对比例1
1、优质种质的筛选：选择仙茅苷含量高于0.12%的仙茅优质种质作为多倍体诱导母本；
2、优质种质的前期处理：将选择出的优质种质，移栽于室内，每隔7天进行一次50%多菌灵800倍液灌根；
3、优质种质的选择与清洗：选择健壮无病虫害的仙茅，从茎基部剪去地上茎叶，并去花去果去须根，留约3～4cm带芽根茎，用清水去除表面泥土后用牙刷蘸肥皂水刷洗深层泥土，后滴2滴吐温-80，涮洗10min，最后用自来水冲淋60min；
4、无菌体系的建立：将清洗完成的仙茅根茎，转移至超净台，依次用75%酒精溶液消毒10s、饱和漂白粉溶液消毒20min、0.05%升汞溶液消毒10min，后用无菌滤纸吸去表面水分，将其剪成2～3cm带芽根茎，按极性斜插于MS+GA3 1.0mg/L的诱导培养基上，置于温度25±2℃，光照强度2000～3000lux，单日光照时间12h的环境下培养40d，培养出无菌苗；
3、多倍体的诱导：将培养出的无菌苗，在叶片中脉用刀片轻轻划伤表皮，后将其剪成长0.2～0.4cm小段，置于无菌诱导液中，无菌诱导液为：0.2%二甲基亚砜水溶液为溶剂，配置秋水仙素浓度为0.10%的溶液，在温度为30±2℃（非水浴，水浴易导致污染），震摇频率为60r/min的摇床上，全黑暗无光条件下诱导36h；
4、诱导材料的分化培养：将完成诱导的叶片，平铺于MS+2,4-D 0.8mg/L+6-BA3.0mg/L的分化培养基上，在温度25±2℃，光照强度2000～3000lux，单日光照时间12h环境下培养60d。
5、形态学筛选：诱导后的材料经分化培养成带根茎叶植株后，以株为单位，观察植株形态，筛选出叶明显增厚增宽，茎以及根系明显增粗的植株为拟多倍体。
6、倍性鉴定：将拟多倍体的根尖，进行染色体染色镜检，筛选出染色体数量为四对及以上的植株，即得仙茅多倍体。
7、多倍体扩增：将筛选出的多倍体，叶片剪成具0.5～1cm长的小段，平铺于MS+NAA0.1mg/L+TDZ 0.1mg/L的增殖培养基上，在温度25±2℃，光照强度2000～3000lux，单日光照时间12h环境下培养；
8、多倍体的驯化及种植：将扩增后的多倍体，栽植于泥炭土与珍珠岩按照质量比10:3混合基质中，驯化6个月，后移栽于大田或者疏林下。
对比例2
1、优质种质的筛选：选择仙茅苷含量高于0.12%的仙茅优质种质作为多倍体诱导母本；
2、优质种质的前期处理：将选择出的优质种质，移栽于室内，每隔7天进行一次50%多菌灵800倍液灌根；
3、优质种质的选择与清洗：选择健壮无病虫害的仙茅，从茎基部剪去地上茎叶，并去花去果去须根，留约3～4cm带芽根茎，用清水去除表面泥土后用牙刷蘸肥皂水刷洗深层泥土，后滴2滴吐温-80，涮洗10min，最后用自来水冲淋80min；
4、无菌体系的建立：将清洗完成的仙茅根茎，转移至超净台，依次用75%酒精溶液消毒10s、饱和漂白粉溶液消毒20min、0.05%升汞溶液消毒10min，后用无菌滤纸吸去表面水分，将其剪成2～3cm带芽根茎，按极性斜插于MS+GA3 1.0mg/L的诱导培养基上，置于温度25±2℃，光照强度2000～3000lux，单日光照时间12h的环境下培养40d，培养出无菌苗；
3、多倍体的诱导：将培养出的无菌苗，在叶片中脉用刀片轻轻划伤表皮，后将其剪成长0.2～0.4cm小段，置于无菌诱导液中，无菌诱导液为：0.2%二甲基亚砜水溶液为溶剂，配置安磺灵浓度为0.02%的混合溶液，在温度为30±2℃（非水浴，水浴易导致污染），震摇频率为60r/min的摇床上，全黑暗无光条件下诱导24h。
4、诱导材料的分化培养：将完成诱导的叶片，平铺于MS+2,4-D 0.8mg/L+6-BA3.0mg/L的分化培养基上，在温度25±2℃，光照强度2000～3000lux，单日光照时间12h环境下培养60d；
5、形态学筛选：诱导后的材料经分化培养成带根茎叶植株后，以株为单位，观察植株形态，筛选出叶明显增厚增宽，茎以及根系明显增粗的植株为拟多倍体；
6、倍性鉴定：将拟多倍体的根尖，进行染色体染色镜检，筛选出染色体数量为四对及以上的植株，即得仙茅多倍体；
7、多倍体扩增：将筛选出的多倍体，叶片剪成具0.5～1cm长的小段，平铺于MS+NAA0.1mg/L+TDZ 0.1mg/L的增殖培养基上，在温度25±2℃，光照强度2000～3000lux，单日光照时间12h环境下培养；
8、多倍体的驯化及种植：将扩增后的多倍体，栽植于泥炭土与珍珠岩按照质量比10:3混合基质中，驯化6个月，后移栽于大田或者疏林下。
对比例3
1、优质种质的筛选：选择实施例1的种质；
2、优质种质的前期处理：将选择出的优质种质，移栽于室内，每隔7天进行一次50%多菌灵800倍液灌根；
3、优质种质的选择与清洗：选择健壮无病虫害的仙茅，从茎基部剪去地上茎叶，并去花去果去须根，留约3～4cm带芽根茎，用清水去除表面泥土后用牙刷蘸肥皂水刷洗深层泥土，后滴2滴吐温-80，涮洗10min，最后用自来水冲淋70min；
4、无菌体系的建立：将清洗完成的仙茅根茎，转移至超净台，依次用75%酒精溶液消毒10s、饱和漂白粉溶液消毒20min、0.05%升汞溶液消毒10min，后用无菌滤纸吸去表面水分，将其剪成2～3cm带芽根茎，按极性斜插于MS+GA3 1.0mg/L的丛生芽诱导培养基上，置于温度25±2℃，光照强度2000～3000lux，单日光照时间12h的环境下培养40d，培养出无菌苗；
5、分化培养：将诱导出的丛生芽的叶片，剪成具0.5～1cm长的小段，平铺于MS+2,4-D 0.8mg/L+6-BA 3.0mg/L的分化培养基上，在温度25±2℃，光照强度2000～3000lux，单日光照时间12h环境下培养60d；
6、驯化及种植：将分化后所得生根苗，栽植于泥炭土与珍珠岩的10:3混合基质中，驯化6个月，后移栽于大田或者疏林下。
由表1可以看出，诱导液诱导后材料死亡率：实施例1、实施例2与对比例1和对比例2无明显差异，且死亡率均较低，几乎可忽略不计。
诱导液诱导后材料分化率：实施例1、实施例2与对比例1和对比例2无明显差异，且诱导后大多都能分化。
多倍体诱导率：实施例1、实施例2多倍体诱导率显著高于对比例1和对比例2，且对比例1和对比例2从数据上看几乎不能诱导，没有实际应用价值。
参看图1，诱导出的多倍体（左）和二倍体（右）对比图，可见，多倍体茎明显增粗、叶片明显增宽增厚，根明显增粗。
参看图2，种植一年后单株生物量,不论是实施例1、实施例2还是对比例1和对比例2的诱导的多倍体，其产量较对比例3没有经过多倍体诱导的仙茅高近2倍。
种植一年后仙茅苷含量测定方法参考2020版中国药典：仙茅药材标准检验操作规范，由检测效果，不论是实施例1、实施例2还是对比例1和对比例2的诱导的多倍体，其仙茅苷含量较对比例3没有经过多倍体诱导的仙茅高1.4倍左右，显然多倍体诱导后的仙茅可以显著增加其生物活性成分含量。
表1不同处理效果对比表
| 处理 | 诱导液诱导后材料死亡率 | 诱导液诱导后材料分化率 | 多倍体诱导率 | 种植一年后单株生物量 | 种植一年后仙茅苷含量 |
| 实施例1 | 1.74% | 88.3% | 47.4% | 11.7g | 0.073% |
| 实施例2 | 1.96% | 87.9% | 49.3% | 10.9g | 0.076% |
| 对比例1 | 1.14% | 90.6% | 1.9% | 11.2g | 0.068% |
| 对比例2 | 0.79% | 94.0% | 0.4% | 11.8g | 0.071% |
| 对比例3 | —— | —— | —— | 6.1g | 0.052% |
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (5)
1.一种仙茅多倍体育苗方法，其特征在于，以下步骤：
（1）无菌体系的建立：选择健壮无病虫害的仙茅带芽根茎，经消毒后，接种于诱导培养基上培养，培养出无菌苗；
（2）多倍体的诱导：培养出的无菌苗，将其叶片剪成长0.2～0.4cm小段，置于无菌诱导液中，进行多倍体诱导，所述无菌诱导液为以0.2%二甲基亚砜水溶液为溶剂，配置浓度为0.10%～0.12%的秋水仙素和浓度为0.02～0.03%的安磺灵混合溶液；
（3）诱导材料的分化培养：将完成诱导的叶片，置于分化培养基上培养；
（4）形态学鉴定：分化培养成带茎叶植株后，以株为单位，观察植株形态，筛选出叶明显增厚增宽植株，茎明显增粗的植株，根系明显增粗的植株为拟多倍体；
（5）倍性鉴定：取拟多倍体的根尖，进行染色体镜检，筛选出染色体数量为四对及以上的植株，即得仙茅多倍体；
步骤（1）中，所述诱导培养基为MS+GA3 1.0mg/L；
步骤（1）中，分化培养环境为温度25±2℃，光照强度2000～3000lux，单日光照时间12h，培养40～50d；
步骤（2）中，多倍体诱导环境为温度30±2℃，摇床震摇频率60～70r/min，全黑暗无光条件；
步骤（2）中多倍体诱导的时间为24～36h。
2.根据权利要求1所述的育苗方法，其特征在于，步骤（1）中，消毒方法为：将清洗完成的仙茅带芽根茎，转移至超净台，依次用75%酒精溶液消毒10～15s、饱和漂白粉溶液消毒20～30min和0.05%升汞溶液消毒10～15min后用无菌滤纸吸去表面水分。
3.根据权利要求1所述的育苗方法，其特征在于，步骤（3）中分化培养基为MS+2,4-D0.8～1.0mg/L+6-BA 3.0～4.0mg/L。
4.根据权利要求3所述的育苗方法，其特征在于，步骤（3）中培养环境为温度25±2℃，光照强度2000～3000lux，单日光照时间12h，培养60～70d。
5.根据权利要求1所述的育苗方法，其特征在于，还包括以下步骤：
S1：多倍体扩增，将筛选出的仙茅多倍体，叶片剪成具0.5～1cm长的小段，平铺于MS+NAA 0.1～0.5mg/L+TDZ 0.1～0.7mg/L的增殖培养基上，在温度25±2℃，光照强度2000～3000lux，单日光照时间12h环境下培养；
S2：多倍体的驯化及种植，将扩增后的仙茅多倍体，栽植于泥炭土与珍珠岩按照质量比10:3混合基质中，驯化3～6个月，移栽于大田或者疏林下。
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