CN105063206A - 一种利用植物抗病基因富集簇的分子育种方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用植物抗病基因富集簇的分子育种方法及其应用，利用植物抗病基因富集簇的分子育种方法包括如下步骤：(1)抗稻瘟病基因富集簇的挖掘与功能验证；(2)挑选抗病基因位点；(3)培育中介品种；(4)筛选目的品种；(5)定位选育抗病品种。本发明所述的含多个抗病基因的富集簇，其包含的稻瘟病抗性基因的核苷酸序列分别如SEQ？ID？NO:1-15所示。本发明含有所述的稻瘟病抗性基因的载体。本发明所述的稻瘟病抗性基因所编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO:16-30。本发明所述的稻瘟病抗性基因在制备转基因抗稻瘟病水稻的应用。本发明的分子育种方法得到的水稻的稻瘟病性强并能保持优良农艺性状。
Description
技术领域
本发明属于植物抗病育种领域，具体涉及一种利用植物抗病基因富集簇的分子育种方法。
背景技术
由于植物病害每年给农、林生产带来巨大的损失，合理有效地防治植物病害是保障农、林可持续发展所必须解决的关键问题之一。大量实践证明，开发和利用已有的植物抗病种质资源是防治植物病害最为有效的方法之一，其中又以植物抗病基因的开发与利用最为经济有效。
但到目前为止，国际、国内传统的抗病育种主要有两种途径：途径一，常规育种方法，即将优质高产的品种与抗病性强的材料杂交，然后通过不断的回交选育，最后得到抗病且优质的新品种。这一过程尽管有效，但极其耗时，因此当新品种培育出来之后，极可能对病原菌新进化产生的株系或小种表现为感病。途径二：利用基因定位、克隆、转基因的途径，目前利用最多的克隆方式为经典的图位克隆方法，即将抗病和感病的品种杂交，然后对大量的分离后代接种病菌、鉴定抗性、遗传作图等，最后在精确遗传定位的基础上进行克隆；这种方法虽然取得了一定的效果，但同样存在克隆周期长、费时费力、分离和鉴定困难，难于找到用于农业生产的有效基因。以水稻抗稻瘟病基因为例，到目前为止，全世界共克隆了20多个抗稻瘟病基因，且尚无用于生产实际的报道。追溯其主要原因，我们认为，缺乏对植物抗病基因抗病机制及田间持久抗性机制的认知所致。
植物抗病基因是植物与病原菌长期相互作用的结果，在植物的进化过程中扮演着十分重要的角色。近年来，植物抗病分子机制的研究取得了突破性进展，但从生产实践的角度看，目前植物抗病基因的研究存在三个根本问题：一是能否发现抗病基因的高效克隆方法；二是究竟能否找到广谱高抗的基因；三是多少抗病基因才能使一个品种具有田间抗性，从而使这些基因用于育种实践。由于克隆的抗病基因数量太少，因而尚不知道一个基因组有多少抗病基因？在高抗品系中是否存在广谱高抗的基因？决定品种抗性的究竟是几个主效抗病基因，还是许多个抗不同病菌小种基因的组合？这些基本问题不清楚，就不知道抗病基因抗性变化及其在基因组中分布的规律性，很难实现抗病基因的实用化。
我们另辟新径，提出了以植物与病菌共进化为基础的抗病基因克隆方法，专利申请号：201210453400.9。该方法的基本假设为，为了对付快速进化的病菌，寄主的抗病基因位点的进化也更快。反之，植物对付进化较慢的病菌(或病菌的基因)，其相应抗病基因进化也较慢。我们以水稻稻瘟病的抗性为例进行了研究，通过各种遗传参数的计算，从而估计每一个基因位点的进化速度，在水稻基因组500多个NBS-LRR基因位点中，选出了130多个进化快的位点；在10个高抗品系中系统的克隆这些位点的基因，共克隆了约1000个候选抗病基因；通过遗传转化到感病品系，最后用不同小种的稻瘟病菌鉴定其抗性。最终，我们一共获得168个功能性抗稻瘟病基因，其中含27个抗谱广、抗性强的抗稻瘟病基因。
通过对抗病基因在各个品种基因组的遗传定位分析，发现多个高抗广谱的基因位于某个高抗品种的同一个基因簇中，即抗稻瘟病基因的富集簇。这些抗病基因的富集簇，不仅为指导我们利用抗病基因富集簇进行分子抗病育种提供了理论基础，同时由于我们非常清楚这些富集簇的染色体位置、序列、来源品系等，为我们进行快速的抗病育种提供了可靠的原材料。
目前克隆的基因，还没有用于生产的成功例子。一个突出的问题是：从抗性很好的水稻供体品系中克隆的基因，其抗谱和抗性均欠佳。抗稻瘟病的基因Pi2/9就是突出的例子，其供体抗谱很广，但克隆的pi2/9单个基因的抗性则相对有限。这种现象暗示，一个抗病品种中可能含有多个抗稻瘟病基因。要使抗稻瘟病基因用于实际生产，不仅需要一定数量的广谱高抗基因，而且需要把他们组合到一起。因此，定位育成的品种，多了5-10个广谱高抗的基因，抗性强或抗性得到加强，使之可以在生产上继续使用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种稻瘟病性强的利用植物抗病基因富集簇的分子育种方法及其应用。
为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：本发明提供了一种利用植物抗病基因富集簇的分子育种方法，包括如下步骤：
(1)抗稻瘟病基因富集簇的挖掘与功能验证：筛选含抗稻瘟病基因的候选基因簇,选择15-20个高抗稻瘟病的水稻品系；
对候选富集簇的每一个基因进行克隆，通过遗传转化这些基因到感病品系，最后用不同小种的稻瘟病菌鉴定其抗性；筛选2个或多于2个抗病基因的富集簇，其中包括广谱高抗的基因；
(2)挑选抗病基因位点：挑选可靠的抗病基因富集簇，只需一个标记，即一个单位，就代表了2个或更多的抗病基因，选择1个或多个富集簇作为导入对象；
(3)培育中介品种：每一个富集簇，都来源于一个特定抗源品系，不同的富集簇，来源于同一抗源或来自不同抗源；
这些抗源与数个具备优良农艺性状的水稻品种杂交获得“中介品种”，使每一个中介品种含有1个或多个富集簇，平均5个以上抗稻瘟病基因；
中介品种的富集簇区段要保证纯合，其余则无需纯合，可以自交繁殖；
对中介品种和抗源亲本均需全基因组测序来获取高密度标记；
优良的中介品种也可直接作为抗病的优良品种；
(4)筛选目的品种：在广泛推广的高产优质但抗稻瘟病欠佳；或开始丧失抗性的优良品种中；或在区试中表型优异但抗稻瘟病欠佳的品系中，选择数十个目的品种作为抗病性改造对象，对每一个目的品种全基因组测序并与中介品种比较，从而在每一个Mb的染色体上找到3-5个特定遗传标记；
(5)定位选育抗病品种：对每一个目的品种都与1-2个中介品种杂交并回交，对回交子代幼苗提取DNA，用PCR检测96遗传标记，大约每3个Mb一个标记；
选择具有富集簇标记，但其余标记均为目的品种的株系；再回交1-2次，用更多标记进行检测，保证除了富集簇标记而外，均为目的品种的遗传标记；
同时，观察育成品种优良农艺性状是否保持；最后，观察育成品种的表型是否抗性变强。
进一步地，在步骤(1)中，筛选含抗稻瘟病基因的候选基因簇，根据NBS-LRR基因簇数量、进化速率、品种间同一基因簇拷贝数量变化及核苷酸差异度遗传特征来进行挑选。
进一步地，在步骤(1)中，水稻品系为Tetep，谷梅2号，Moroberekan、LAC23或PAIKANTAO。
更进一步地，在步骤(3)中，挑选具备优良性状的水稻品种，将其与含富集簇的抗源品系进行杂交，得到富集簇区段纯合的中介品种。
进一步地，在步骤(4)中，目的品种和中介品种每Mb染色体上为特定遗传标记。
本发明所述的含多个抗病基因的富集簇，其包含的稻瘟病抗性基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO:1-15所示。
本发明含有所述的稻瘟病抗性基因的载体。
本发明所述的稻瘟病抗性基因所编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:16-30。
本发明所述的稻瘟病抗性基因在制备转基因抗稻瘟病水稻的应用。
本发明所述的载体用于转化水稻从而制备转基因抗稻瘟病水稻中的应用。
有益效果：本发明的分子育种方法得到的水稻的稻瘟病性强并能保持优良农艺性状，选育成的仅含富集簇标记和目的品种遗传标记的抗病品种，最终育成的高产、优质、抗病的新水稻品系。利用植物抗病基因富集簇的分子育种，可望与高产优质品种相结合，避开转基因技术，实现作物抗病育种方法的突破，形成一套全新、高效的作物育种体系。可以供其他农艺性状精准定位育种借鉴与应用；抗病基因在育种中的直接应用，具有重大的经济价值和生态效应。
本发明与现有技术的区别在于，具有如下优点：
(1)该方法以水稻抗稻瘟病育种为例，对高抗品种中快速变异的基因簇，进行大量的克隆和抗病性鉴定，筛选出含有2-6个广谱高抗基因的富集簇；借助高密度的分子标记，把1个或多个抗病基因富集簇，通过杂交、回交、标记筛选的方法，集中到适应不同环境的优良品种或中介品种中，同时用多个广谱高抗的基因改良优良品种的抗病性；通过中介品种作为桥梁，可更容易的改造优良品种的抗病性。
(2)本发明以高抗稻瘟病的品系为材料，对富含抗稻瘟病基因的候选富集簇进行大量的克隆和抗病行鉴定，再借助高密度的分子标记，把1个或多个抗病基因富集簇，每个富集簇含有2-8个抗病基因，其中多个为广谱高抗基因，通过杂交、回交、标记筛选的方法，集中到适应不同环境的中介品种中或直接获得应用品种；或再通过中介品种作为桥梁，改造优良品种的抗病性，从而形成新的抗性的优良品种。
(3)本发明只需检测富集簇的特有标记，同时最大程度保留优良目的品种的标记，本发明只需检测富集簇的特有标记，同时最大程度保留目的品种的标记，仅最后一代做抗病鉴定，从而大大提高育种效率、缩短育种年限、精确实现育种目标。仅最后一代做抗病性鉴定，从而大大提高育种效率、缩短育种年限、实现分子精确定位育种目标。
附图说明
图1为本发明流程示意图；
图2为实施例1中利用抗稻瘟病富集簇育成抗病新品系的流程示意图；
图3为水稻稻瘟病的感性和抗性表型图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，这些实施例是本发明的阐释和举例，并不以任何形式限制本发明的范围。
下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。
如图1所示，本发明提供了一种利用植物抗病基因富集簇的分子育种方法，包括如下步骤：
(1)抗稻瘟病基因富集簇的挖掘与功能验证：筛选含抗稻瘟病基因的候选基因簇,选择15-20个高抗稻瘟病的水稻品系；
对候选富集簇的每一个基因进行克隆，通过遗传转化这些基因到感病品系，最后用不同小种的稻瘟病菌鉴定其抗性；筛选2个或多于2个抗病基因的富集簇，其中包括广谱高抗的基因；筛选含抗稻瘟病基因的候选基因簇，根据NBS-LRR基因簇数量、进化速率、品种间同一基因簇拷贝数量变化及核苷酸差异度遗传特征来进行挑选。水稻品系为Tetep，谷梅2号，Moroberekan、LAC23或PAIKANTAO。
(2)挑选抗病基因位点：挑选可靠的抗病基因富集簇，只需一个标记，即一个单位，就代表了2个或更多的抗病基因，选择1个或多个富集簇作为导入对象；
(3)培育中介品种：每一个富集簇，都来源于一个特定抗源品系，不同的富集簇，来源于同一抗源或来自不同抗源；
这些抗源与数个具备优良农艺性状的水稻品种杂交获得“中介品种”，使每一个中介品种含有1个或多个富集簇，平均5个以上抗稻瘟病基因；
中介品种的富集簇区段要保证纯合，其余则无需纯合，可以自交繁殖；
对中介品种和抗源亲本均需全基因组测序来获取高密度标记；
优良的中介品种也可直接作为抗病的优良品种；挑选具备优良性状的水稻品种，将其与含富集簇的抗源品系进行杂交，得到富集簇区段纯合的中介品种。
(4)筛选目的品种：在广泛推广的高产优质但抗稻瘟病欠佳；或开始丧失抗性的优良品种中；或在区试中表型优异但抗稻瘟病欠佳的品系中，选择数十个目的品种作为抗病性改造对象，对每一个目的品种全基因组测序并与中介品种比较，从而在每一个Mb的染色体上找到3-5个特定遗传标记；
(5)定位选育抗病品种：对每一个目的品种都与1-2个中介品种杂交并回交，对回交子代幼苗提取DNA，用PCR检测96遗传标记，大约每3个Mb一个标记；
选择具有富集簇标记，但其余标记均为目的品种的株系；再回交1-2次，用更多标记进行检测，保证除了富集簇标记而外，均为目的品种的遗传标记；目的品种和中介品种每Mb染色体上为特定遗传标记。
同时，观察育成品种优良农艺性状是否保持；最后，观察育成品种的表型是否抗性变强。抗稻瘟病基因的DNA序列及编码的蛋白质序列，抗稻瘟病基因的富集簇信息，培育成的含有抗稻瘟病基因富集簇的中介品种，
选育的抗病品种，要求该品种除了抗病基因的富集簇标记而外，其余均为目的品种的遗传标记。选育的抗病品种，要求其稻瘟病抗性变强并能保持优良农艺性状。
本发明所述的含多个抗病基因的富集簇，其包含的稻瘟病抗性基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO:1-15所示。
本发明含有所述的稻瘟病抗性基因的载体。
本发明所述的稻瘟病抗性基因所编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:16-30。
本发明所述的稻瘟病抗性基因在制备转基因抗稻瘟病水稻的应用。
本发明所述的载体用于转化水稻从而制备转基因抗稻瘟病水稻中的应用。
本发明的分子育种方法得到的水稻的稻瘟病性强并能保持优良农艺性状。选育成的仅含富集簇标记和目的品种遗传标记的抗病品种，最终育成的高产、优质、抗病的新水稻品系。利用植物抗病基因富集簇的分子育种，可望与高产优质品种相结合，避开转基因技术，实现作物抗病育种方法的突破，形成一套全新、高效的作物育种体系。可以供其他农艺性状精准定位育种借鉴与应用；抗病基因在育种中的直接应用，具有重大的经济价值和生态效应。
本发明与现有技术的区别在于，具有如下优点：
(1)该方法以水稻抗稻瘟病育种为例，对高抗品种中快速变异的基因簇，进行大量的克隆和抗病性鉴定，筛选出含有2-6个广谱高抗基因的富集簇；借助高密度的分子标记，把1个或多个抗病基因富集簇，通过杂交、回交、标记筛选的方法，集中到适应不同环境的优良品种或中介品种中，同时用多个广谱高抗的基因改良优良品种的抗病性；通过中介品种作为桥梁，可更容易的改造优良品种的抗病性。
(2)本发明以高抗稻瘟病的品系为材料，对富含抗稻瘟病基因的候选富集簇进行大量的克隆和抗病行鉴定，再借助高密度的分子标记，把1个或多个抗病基因富集簇，每个富集簇含有2-8个抗病基因，其中多个为广谱高抗基因，通过杂交、回交、标记筛选的方法，集中到适应不同环境的中介品种中或直接获得应用品种；或再通过中介品种作为桥梁，改造优良品种的抗病性，从而形成新的抗性的优良品种。
(3)本发明只需检测富集簇的特有标记，同时最大程度保留优良目的品种的标记，本发明只需检测富集簇的特有标记，同时最大程度保留目的品种的标记，仅最后一代做抗病鉴定，从而大大提高育种效率、缩短育种年限、精确实现育种目标。仅最后一代做抗病性鉴定，从而大大提高育种效率、缩短育种年限、实现分子精确定位育种目标。
实施例1
如图2和图3所示，本发明提供了一种利用植物抗病基因富集簇的分子育种方法，包括如下步骤：
(1)抗稻瘟病基因富集簇的挖掘与功能验证：挑选抗稻瘟病基因富集簇：在前期的研究中，专利申请号：201210453400.9，我们已经获得了168个功能性抗稻瘟病基因，其中包含27个抗谱广、抗性强的基因。经分析获得5个抗稻瘟病基因的富集簇。每个富集簇含2-5个抗病基因，其中广谱高抗基因1-2个。其中有4个富集簇来自于广谱高抗的水稻品种Tetep，我们分别将其命名为RMg-C1(cluster1ofgenesresistanttoMagnaporthegrisea)-RMg-C4。RMg-C1包含5个抗稻瘟病基因(Os11g44960，Os11g44970，Os11g45090，Os11g45160，Os11g45190)，其中有2个是广谱高抗基因(Os11g44960和Os11g45190)；RMg-C2包含4个抗稻瘟病基因(Os11g39320，Os11g39330，Os11g39340，Os11g39730)，其中有2个是广谱高抗基因(Os11g39320和Os11g39730)；RMg-C3包含2个广谱高抗的基因(Os06g06380和Os06g06390)；RMg-C4包含2个抗稻瘟病基因(Os06g15730和Os06g15750)，其中Os06g15750具有广谱抗性。有一个富集簇来自于新育成的抗性栽培种Q2436，包含1个抗稻瘟病基因(Os08g07340和Os08g07390)，其中08g07340具有广谱抗性，我们将这个抗病基因富集簇命名为RMg-C5RMg-C1,C2,C3,C4和C5所含抗病基因的核苷酸序列见序列表SEQIDNO:1-15，所述基因编码的蛋白质的氨基酸序列表分别如SEQIDNO:16-30所示。挑选其中两个富集簇RMg-C1和RMg-C5为实例进行后续的抗病育种。C5来自Q2436；
在前期的研究中，我们已经获得了168个功能性抗稻瘟病基因，其中包含27个抗谱广、抗性强的基因。经分析获得5个抗稻瘟病基因的富集簇。专利申请号：201210453400.9，提到了前期研究。
(2)抗病基因富集簇位点的确定：对两个抗源品种Tetep和Q2436进行全基因组测序。用生物信息学的方法(包括序列比对，遗传参数的计算等)分析RMg-C1和RMg-C5这两个基因簇的序列特征，及其遗传标记。
(3)培育中介品种：将含RMg-C1的Tetep与我们挑选的优良品种“武运粳24”杂交，获得F1-1；将含RMg-C5的Q2436与优良品种“武运粳24”杂交，获得F1-2；将F1-1与F1-2杂交再自交，通过遗传标记的鉴定，筛选出同时含RMg-C1和RMg-C5的中介品种，而且保证导入的富集簇区段纯合。对获得的中介品种利用二代测序的方法进行全基因组测序。
(4)筛选目的品种：挑选高产、优质、推广潜力大，但抗稻瘟病较差或抗病性开始丧失的推广品种或优良品种作为抗病性改造对象即目的品种，本实施例采用“空育131”。从全国各地挑选这些品种：高产、优质、推广潜力大，但抗稻瘟病较差或抗病性开始丧失的推广品种或优良品种，任何一种都可以作为我们的改造对象。对挑选的目的品种进行全基因组测序，同时与培育的中介品种的基因组序列进行比较，在每一个Mb的染色体上找到3-5个特定的遗传标记。
(5)定位选育抗病品种：将空育131与培育的中介品种进行杂交并回交，对回交子代幼苗提取DNA，用PCR检测96遗传标记，大约每3个Mb一个标记。选择具有富集簇标记，但其余标记均为目的品种的株系；再回交1-2次，用足够的遗传标记进行检测，保证除了富集簇标记而外，均为目的品种的遗传标记。同时，在田间种植育成的品种，观察其表型是否抗性变强、优良农艺性状是否保持。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
Claims (10)
1.一种利用植物抗病基因富集簇的分子育种方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)抗稻瘟病基因富集簇的挖掘与功能验证：筛选含抗稻瘟病基因的候选基因簇,选择15-20个高抗稻瘟病的水稻品系；
对候选富集簇的每一个基因进行克隆，通过遗传转化这些基因到感病品系，最后用不同小种的稻瘟病菌鉴定其抗性；筛选2个或多于2个抗病基因的富集簇，其中包括广谱高抗的基因；
(2)挑选抗病基因位点：挑选可靠的抗病基因富集簇，只需一个标记，即一个单位，就代表了2个或更多的抗病基因，选择1个或多个富集簇作为导入对象；
(3)培育中介品种：每一个富集簇，都来源于一个特定抗源品系，不同的富集簇，来源于同一抗源或来自不同抗源；
这些抗源与数个具备优良农艺性状的水稻品种杂交获得“中介品种”，使每一个中介品种含有1个或多个富集簇，平均5个以上抗稻瘟病基因；
中介品种的富集簇区段要保证纯合，其余则无需纯合，可以自交繁殖；
对中介品种和抗源亲本均需全基因组测序来获取高密度标记；
优良的中介品种也可直接作为抗病的优良品种；
(4)筛选目的品种：在广泛推广的高产优质但抗稻瘟病欠佳；或开始丧失抗性的优良品种中；或在区试中表型优异但抗稻瘟病欠佳的品系中，选择数十个目的品种作为抗病性改造对象，对每一个目的品种全基因组测序并与中介品种比较，从而在每一个Mb的染色体上找到3-5个特定遗传标记；
(5)定位选育抗病品种：对每一个目的品种都与1-2个中介品种杂交并回交，对回交子代幼苗提取DNA，用PCR检测96遗传标记，大约每3个Mb一个标记；
选择具有富集簇标记，但其余标记均为目的品种的株系；再回交1-2次，用更多标记进行检测，保证除了富集簇标记而外，均为目的品种的遗传标记；
同时，观察育成品种优良农艺性状是否保持；最后，观察育成品种的表型是否抗性变强。
2.根据权利要求1所述的利用植物抗病基因富集簇的分子育种方法，其特征在于：在步骤(1)中，筛选含抗稻瘟病基因的候选基因簇，根据NBS-LRR基因簇数量、进化速率、品种间同一基因簇拷贝数量变化及核苷酸差异度遗传特征来进行挑选。
3.根据权利要求1所述的利用植物抗病基因富集簇的分子育种方法，其特征在于：在步骤(1)中，水稻品系为Tetep，谷梅2号，Moroberekan、LAC23或PAIKANTAO。
4.根据权利要求1所述的利用植物抗病基因富集簇的分子育种方法，其特征在于:在步骤(3)中，挑选具备优良性状的水稻品种，将其与含富集簇的抗源品系进行杂交，得到富集簇区段纯合的中介品种。
5.根据权利要求1所述的利用植物抗病基因富集簇的分子育种方法，其特征在于:在步骤(4)中，目的品种和中介品种每Mb染色体上为特定遗传标记。
6.权利要求1所述的含多个抗病基因的富集簇，其包含的稻瘟病抗性基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO:1-15所示。
7.含有权利要求6所述的稻瘟病抗性基因的载体。
8.权利要求6所述的稻瘟病抗性基因所编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:16-30。
9.权利要求6所述的稻瘟病抗性基因在制备转基因抗稻瘟病水稻的应用。
10.权利要求7所述的载体用于转化水稻从而制备转基因抗稻瘟病水稻中的应用。
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