CN105368927A - 与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记genSSR3000及获取、应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记genSSR3000及获取方法和应用。与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记genSSR3000，具有序列表中的SEQ？ID？NO:1～2的至少一个的核苷酸碱基序列。所述分子标记应用辣椒材料中cr基因的检测，所述检测包括辣椒材料基因组DNA提取、PCR扩增反应、分析等步骤。本发明直接将筛选获得的PCR引物作为分子标记使用，可以准确地检测到辣椒材料是否含有cr基因，本发明方法方便、快捷、节约成本。

Description

与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记genSSR3000及获取、应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记genSSR3000及获取方法和应用。

背景技术

辣椒(CapicumannuumL.)是世界范围内广泛栽培的重要蔬菜作物。黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)是一种毁灭性病害，是危害辣椒的主要病毒之一。CMV常引起辣椒叶型畸形皱缩，严重时植株萎缩，果实小而发硬，导致产量下降，品质降低。CMV可严重影响辣椒的产量和品质，一般年份可造成辣椒减产20％-30％，严重时可达50％-60％。在栽培生产过程中为防治辣椒CMV病害而频繁施用的化学农药，已经影响到辣椒产品的食用安全，对人体健康构成了严重威胁，也对生态环境造成了污染。实践表明，培育抗病品种是防治病害最经济有效的方法。同时发掘辣椒种质资源的优异抗CMV基因，对其进行分子水平的遗传解析，对于明确抗病基因作用的分子机理和抗病育种具有重要意义。

辣椒CMV抗性遗传规律复杂，不同的抗原材料抗病遗传模式不同。根据系列研究报道和发明人课题组做过的遗传规律研究，绝大多数CMV抗性材料抗性表现为数量性状遗传模式，大家纷纷针对手中的CMV抗性材料进行了QTL定位，但由于抗性材料不同或CMV毒源不同，QTL定位结果相互间差异很大，难以比较。根据以往研究报道，仅有极少数材料CMV抗性由单基因控制，如韩国报道Bukang的CMV抗性由单显性基因控制，并针对此单显性基因开发出了紧密连锁的分子标记。然而至今，尚未有与辣椒CMV抗性单隐性基因紧密连锁的分子标记的相关研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记genSSR3000。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记genSSR3000，所述分子标记具有序列表中的SEQIDNO:1～2的至少一个的核苷酸碱基序列。

所述分子标记应用辣椒材料中cr基因的检测。

与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记genSSR3000的应用，其特征在于：

所述检测包括以下步骤：

辣椒材料基因组DNA提取步骤：对辣椒材料进行提取处理，得到辣椒材料基因组DNA；

PCR扩增反应步骤：以所述分子标记作为PCR引物，以该辣椒材料基因组DNA作为模板，进行PCR扩增反应，得到扩增产物；

分析步骤：将所述扩增产物进行电泳分离处理，显色处理，再统计分析所述辣椒材料是否含有cr基因。

在上述检测优选的实施方式中，所述PCR扩增反应步骤中，PCR标记反应体系中含有：

模板DNA0.5-2.0ng/μL，正向、反向引物各1-10ng/μL，dNTP各100-500μmol/L，MgCl₂1-5mmol/L，TaqDNA聚合酶0.1-0.5U/μL，体积百分比为10-20％的10×TaqBuffer；

示例性地，所述PCR标记反应体系中各个成分的含量可以为以下任意值或任意值之间的范围：

模板DNA0.5ng/μL、1ng/μL、1.5ng/μL、2ng/μL，正向、反向引物各1ng/μL、2ng/μL、6ng/μL、8ng/μL、10ng/μL，dNTP各100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、400μmol/L、500μmol/L，MgCl₂1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L，TaqDNA聚合酶0.1U/μL、0.2U/μL、0.3U/μL、0.4U/μL、0.5U/μL，10×TaqBuffer：10％、12％、15％、18％、20％；

优选地，所述PCR标记反应体系中含有：

模板DNA1.6ng/μL，正向、反向引物各5ng/μL，dNTP各100μmol/L，MgCl₂1mmol/L，TaqDNA聚合酶0.1U/μL，体积百分比为10％的10×TaqBuffer。

在上述检测优选的实施方式中，所述PCR扩增反应步骤中，PCR标记反应体系中含有：

体积百分含量为10-50％的模板DNA(2.5ng/μL)，正向、反向引物(50ng/μL)的体积百分含量各5-15％，体积百分含量为40-60％的GoGreenMastermix；

示例性地，所述PCR标记反应体系中各个成分的含量可以为以下任意值或任意值之间的范围：

模板DNA(2.5ng/μL)：10％、20％、30％、40％、50％，正向、反向引物(50ng/μL)各：5％、10％、12％、15％，GoGreenMastermix：40％、45％、50％、55％、60％；

优选地，PCR标记反应体系中含有：

体积百分含量为30％的模板DNA(2.5ng/μL)，正向、反向引物(50ng/μL)的体积百分含量各10％，体积百分含量为50％的GoGreenMastermix；

更优选地，10μL的PCR标记反应体系中含有：

3μL的模板DNA(2.5ng/μL)，正向、反向引物(50ng/μL)各1μL，5μL的GoGreenMastermix。

在上述检测优选的实施方式中，所述PCR扩增反应步骤中，PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环；72℃保温5min。

与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记genSSR3000的获取方法，包括以下步骤：

将辣椒供试材料进行苗期抗病接种鉴定，以明确CMV抗性由单隐性基因cr控制；再利用SSR引物和InDel引物进行筛选和分离，得到所述与辣椒CMV抗性基因cr紧密连锁的分子标记genSSR3000。

本发明的有益效果为：

本发明直接将筛选获得的PCR引物作为分子标记使用，可以准确地检测到辣椒材料是否含有cr基因，本发明方法方便、快捷、节约成本。

附图说明

图1为实施例1中CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料Q132的选育方法的流程示意图。

图2为实施例1中花药培养步骤中得到的胚状体的照片。

图3为实施例1中再生植株培养步骤中得到的再生株的照片。

图4为实施例1中驯化移栽步骤中得到的植株的照片。

图5为实施例2中辣椒幼苗单株CMV病情7级的植株的照片。

图6为实施例2中辣椒幼苗单株CMV病情5级的植株的照片。

图7为实施例2中辣椒材料Q132CMV抗性连锁分析示意图。

图8为实施例2中与辣椒cr基因连锁的genSSR分子标记的验证结果电泳图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。

实施例1：

本实施例为CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料Q132的选育方法和鉴定方法。在获得CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料Q132的基础上，才有可能进行与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记的获取开发。

其中，上述选育方法包括以下步骤，如图1所示。

(1)选取杂交材料：选取从国内外引进的四份优良辣椒杂交种：“37-74”、“喜洋洋”、“帕沃尔”、“圣保罗”。

其中，“37-74”购自瑞克斯旺(中国)种子有限公司，“喜洋洋”购自昌乐新盛种业有限公司，“帕沃尔”购自日本坂田种苗(苏州)有限公司，“圣保罗”购自纽内姆(北京)种子有限公司。

(2)杂交：对上述四份杂交材料进行两两杂交：“37-74”与“喜洋洋”杂交得到单交杂种1，“帕沃尔”与“圣保罗”杂交得到单交杂种2；再将单交杂种1和单交杂种2杂交，得到双交杂种。

(3)单倍体培育：将该双交杂种进行花药培养，再经过CMV人工接种抗性鉴定，得到高抗CMV的DH株系Q132(即为高抗CMV的辣椒材料Q132)。

①选取花蕾：在上述双交杂种中，选择长势良好、无病虫害的植株作为供体植株，严格按镜检结果选取小孢子发育处于单核靠边期—双核早期的花蕾。

②花蕾预处理：4℃低温预处理花蕾1-3天。

③花蕾消毒：取合适大小的预处理后的花蕾，剥去花萼后，先用75％的酒精浸泡30s，再用8-10％的次氯酸钠振荡消毒10-20min，最后用无菌水清洗3次，每次3-5min，得到消毒后的花蕾。

④接种：取消毒后的花蕾，于超净工作台上将花药完好无损的剥离，以每60mm直径培养皿12-18枚花药的密度接种于N4-3培养基上。

该N4-3培养基为固液双层培养基，其中，固体层包括：NTH基本培养基的基础上，添加：质量百分比为3-6％的蔗糖、质量百分比为0.5％的活性炭、质量百分比为0.8％的琼脂粉，于121℃高压灭菌；

液体层包括：NTH基本培养基的基础上，添加：质量百分比为3-6％的蔗糖、IAA0.5-1.5mg/L、6-BA0.1-0.6mg/L、戊炔草胺0.1-0.5mg/L，抽滤灭菌；

该NTH基本培养基的原料包括：

硝酸氨825mg/L，硝酸钾950mg/L，二水氯化钙166mg/L，七水硫酸镁185mg/L，磷酸二氢钾680mg/L，硼酸6.20mg/L，四水硫酸锰25mg/L，七水硫酸锌10mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，五水流酸铜0.025mg/L，六水氯化钴0.03mg/L，肌醇100mg/L，烟酸5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L，甘氨酸2mg/L，叶酸5mg/L，生物素0.5mg/L。

⑤花药培养：花药先在28-35℃条件下黑暗培养1-10天，再转移到25-28℃条件下继续黑暗培养；培养4-7周时间，即可看到大量胚状体发生，如图2所示。

⑥再生株培养：选取子叶型胚状体，转移到不加激素的MS基本培养基上，培育壮苗，得到再生株，如图3所示。

⑦鉴定倍性：待再生株长至3-4片真叶，切取叶片，通过流式细胞仪或保卫细胞叶绿体计数法，从细胞染色体的水平鉴定再生株的倍性。

⑧驯化移栽：将鉴定为二倍体的上述再生株移栽至培养土中，进行驯化培养；其中，该培养土由蛭石和草炭按质量比1:1混合制成，并经过高压灭菌；培养条件为：光照时间为16小时/天，强度为2000lx光照，温度为22-25℃；培养得到驯化后的二倍体再生株(如图4所示)。

⑨CMV人工接种抗性鉴定：

采收上述驯化后二倍体再生株系的种子并培养长成植株，再对该植株进行CMV人工接种抗性鉴定，以确定步骤⑦中鉴定为二倍体的再生株的CMV抗性。该抗性鉴定包括如下步骤：

A、CMV毒源繁殖：将CMV毒源在“心叶烟”上繁殖，温度20-28℃，自然光照。

B、人工接种：约9-11天，“心叶烟”发病后，采摘发病的叶片，加入5倍于鲜病叶重量的0.03mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)，捣碎后双层纱布过滤，滤液立即用于接种于上述六世代联合群体的辣椒幼苗；待辣椒幼苗长至2-3片真叶时，叶面撒布一薄层600目的金刚砂，人工摩擦接种：接种2次，2-3天后重复接种一次。整个接种鉴定工作都在防虫控温温室内进行，保证室温22-28℃和自然光照。

C、调查和分析：

接种后20天，调查上述植株的发病情况，2人同时调查以确保结果的准确性，记录病株数和病级，并计算病情指数，进行抗性归类，得到由单隐性基因控制的辣椒材料。

a、辣椒幼苗单株CMV病情分级标准为：

0级：无任何症状；

1级：心叶明脉或少数嫩叶花叶；

3级：中上部叶片呈现花叶；

5级：多数叶片花叶，少数叶片畸形，植株轻度矮化；

7级：重花叶，多数叶片畸形、蕨叶，植株矮化；

9级：植株严重矮化、停止生长，甚至死亡。

病情指数(DI)计算公式为：

病情指数＝∑(各病级数值×该病级株数)/(最高病级数值×调查总株数)×100％

植株疫病抗病性分级标准：

高抗(HR)：DI值≤10；抗病(R)：10≤DI值≤20；中抗(MR)：20≤DI值≤40；感病(S)：DI值＞40。

b、分析结果如下：

上述植株中，病级≤3的单株，鉴定为抗病，其它均以感病统计。通过本步骤鉴定出来的抗病植株，及其所对应的步骤⑥的再生株，可以确定为具有CMV抗性的辣椒材料：高抗CMV的辣椒材料Q132。

接下来，要对上述高抗CMV的辣椒材料Q132进行重复的CMV人工接种抗性鉴定，高抗CMV的辣椒材料Q132CMV抗性是由单隐性基因控制的。

其中，CMV接种毒源为危害我国甜辣椒生产的黄瓜花叶病毒主流株系，即CMV-重花叶株系，毒源购自中国农科院蔬菜花卉研究所植物保护研究室。

上述抗性鉴定方法包括以下步骤：

(1)六联合世代群体的构建：以实施例1获得的高抗CMV的辣椒材料Q132、高感CMV的甜椒自交系FS871为亲本，构建P₁、P₂、F₁、B₁、B₂、F₂六联合世代群体。

构建方法如下：

F₁代：2013年春季，于北京市农林科学院蔬菜研究中心农场以Q132为母本，FS871为父本进行杂交，得到F₁代种子；

F₂、B₁、B₂代：2013年冬季，于中心海南三亚农场，F₁代自交、并分别与Q132、FS871回交，分别获得F₂、B₁和B₂代的种子。

2014年春季和秋季，六个世代的种子经消毒后，播种于无菌培养土，温室内育苗。

2014年春季P₁、P₂、F₁、B₁、B₂、F₂六个世代的样本容量分别为：27、24、29、131、129、251。2014年秋季P₁、P₂、F₁、B₁、B₂、F₂六个世代的样本容量分别为：20、23、30、79、76、262。

分别设2012-Z52、FS871为抗感对照。

(2)CMV人工接种抗性鉴定：将六联合世代群体进行CMV接种处理，得到接种后的六联合时代群体。

①CMV毒源繁殖：将CMV毒源在“心叶烟”上繁殖，温度20-28℃，自然光照。

②人工接种：约9-11天，“心叶烟”发病后，采摘发病的叶片，加入5倍于鲜病叶重量的0.03mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)，捣碎后双层纱布过滤，滤液立即用于接种于上述六世代联合群体的辣椒幼苗；待辣椒幼苗长至2-3片真叶时，叶面撒布一薄层600目的金刚砂，人工摩擦接种：接种2次，2-3天后重复接种一次。整个接种鉴定工作都在防虫控温温室内进行，保证室温22-28℃和自然光照。

(3)调查和分析：

接种后20天，调查上述六联合世代群体发病情况，2人同时调查以确保结果的准确性，记录病株数和病级，并计算病情指数，进行抗性归类，得到由单隐性基因控制的辣椒材料。

①辣椒幼苗单株CMV病情分级标准为：

0级：无任何症状；

1级：心叶明脉或少数嫩叶花叶；

3级：中上部叶片呈现花叶；

5级：多数叶片花叶，少数叶片畸形，植株轻度矮化，如图6所示；

7级：重花叶，多数叶片畸形、蕨叶，植株矮化，如图5所示；

9级：植株严重矮化、停止生长，甚至死亡。

病情指数(DI)计算公式为：

病情指数＝∑(各病级数值×该病级株数)/(最高病级数值×调查总株数)×100％

植株疫病抗病性分级标准：

高抗(HR)：DI值≤10；抗病(R)：10≤DI值≤20；中抗(MR)：20≤DI值≤40；感病(S)：DI值＞40。

②分析结果如下：

上述植株中，病级≤3的单株，鉴定为抗病，其它均以感病统计。计算分离比，采用MicrosoftExcel2003软件进行数据统计分析，SAS8.0对结果进行卡方测验。

综合两个季节的CMV抗性鉴定结果，实施例1获得的二倍体再生株(代号为Q132)和FS871的CMV病指平均分别为4.20和65.3；Q132×FS871的F₁正反交CMV病指分别平均为5.36和7.64。2014年春季在F₂群体中，CMV病级＞3(感病)的单株有152株，CMV病级≤3(抗病)的单株有49株，感CMV与抗CMV植株数量的分离比例经卡方检验符合3﹕1(表1)。由此可知，实施例1获得的具有CMV抗性的辣椒材料Q132的CMV抗性由1对隐性核基因控制，其CMV抗性对感性为隐性。

表1：Q132×FS871后代群体CMV抗性分离情况统计

因此，本发明的研究人员对通过双杂交和单倍体培育方法获得的数份DH株系进行CMV人工接种抗性鉴定，筛选出了CMV抗性材料——Q132；并利用P₁、P₂、F₁、B₁、B₂、F₂六联合世代群体进行了至少两个季节的遗传规律研究，最终明确材料Q132CMV抗性由单隐性基因控制，命名为cr。由单基因控制的CMV抗性遗传材料的获得对于辣椒CMV抗性育种，以及之后的分子标记的开发均具有重要意义。

实施例2：

在实施例1中已经获得CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料Q132的基础上，本实施例是与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记genSSR3000的获取方法，包括以下步骤。

(1)连锁标记分析：

①基因组DNA的提取：

采用天根植物基因组DNA提取试剂盒(DP305-2)提取双亲、F₂、B₁群体各单株基因组DNA，提取方法详见试剂盒的操作说明，得到各个植株的基因组DNA。

②大量SSR引物和InDel引物的开发：

以辣椒CM334的基因组序列(Version1.55)(Kimetal.2014)为参考序列，开发SSR位点，利用Perl程序在蛋白质编码基因区域及其上下游各500bps的区域开发SSR位点，要求二核苷酸的最低重复次数为6，三核苷酸和四核苷酸的最低重复次数为5；

应用MUMmer3.23软件对CM334和Zunla-1的基因组序列(Qinetal.2014)进行比对，利用Perl进行分析，剔除小于5bps或两个InDel位点间隔小于100bps的InDel位点；

经上述开发，共开发稳定可靠的177587个SSR位点和4497个InDel位点。

根据上述SSR位点和InDel位点，采用Primer3.0软件设计SSR引物和InDel引物序列。

③引物的初步筛选：

以双亲的基因组DNA为模板，应用平均分布于辣椒12条染色体的1200对SSR引物(标为genSSR)和2400对InDel引物(标为GI)通过PCR扩增反应，对辣椒双亲进行多态性筛选，得到双亲间具有多态性的引物，即为初步筛选后的SSR引物和InDel引物。

SSR和InDelPCR标记反应体系均为10μL：

3μLDNA(2.5ng/μL)，正向、反向引物(50ng/μL)各1μL，5μLGoGreenMastermix(Promega，Wisconsin,USA)；PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环；72℃保温5min，得到扩增产物；得到的扩增产物用6.0％非变性聚丙烯酰胺凝胶，150V恒功率电泳分离1h；

电泳结束后，利用银染法显色：先将凝胶放入固定液(包括：450mlH₂O，50ml无水乙醇，2.5ml冰醋酸)在摇床上轻摇12min，之后倒掉固定液并回收，取出凝胶待用；再向凝胶中加入银染液(包括：500mlH₂O，1g硝酸银)，轻摇12min；再倒掉银染液，将凝胶用500ml蒸馏水洗30s，清洗2次；清洗后，倒掉蒸馏水，向凝胶中加入显色液(包括：500mlH₂O，7.5gNaOH，1500μl甲醛)，轻摇至条带显出为止；当条带清晰时，倒掉显色液，向凝胶中加入固定液，固定2分钟；倒掉固定液，用蒸馏水漂洗凝胶5分钟；胶片观察灯下对凝胶上的条带进行带型统计分析。

分析的方法为：a.共显性标记的统计方法：按照Joinmap4.0的要求与母本FS871一致的带型记为A，与父本PM702一致的带型记为B，杂合带型记为H。b.显性标记的统计方法：若母本为显性标记，则分离群体中和母本带型一致的单株记为D，和父本带型一致的记为B；若父本为显性标记，则分离群体中和母本带型一致的单株记为A，和父本带型一致的记为C；

分析的结果为：其中592对SSR和InDel引物(具体包括352对SSR引物和240对InDel引物)表现为多态，多态率为16.44％。

④抗、感池的构建：

利用BSA方法，在F₂群体中各选7个高抗CMV、高感CMV单株的DNA，构建CMV抗、感基因池，以筛选多态性引物。

本步骤中，根据目标性状的两个极端将多个样本的DNA混合后，在之后的步骤中再做PCR扩增反应，这样就可以初步获得与目标性状连锁的标记。

⑤引物的进一步筛选：

利用上述筛选出的592对SSR和InDel引物，通过PCR扩增反应，对辣椒CMV抗、感池的DNA进行BSA分析，筛选获得9对多态性引物，具体包括5个SSR引物和4个InDel引物，即为进一步筛选出的SSR引物和InDel引物。

SSR和InDelPCR标记反应体系为10μL：

3μLDNA(2.5ng/μL)，正向、反向引物(50ng/μL)各1μL，5μLGoGreenMastermix(Promega，Wisconsin,USA)；

PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环；72℃保温5min，得到扩增产物；得到的扩增产物用6.0％非变性聚丙烯酰胺凝胶，150V恒功率电泳分离1h，银染显色后在胶片观察灯下进行带型统计分析。

分析的方法，即统计分析DNA条带在DNA抗感池间和双亲间的分离是否一致，结果发现其中9对引物(具体包括5个SSR引物和4个InDel引物)在抗感基因池和双亲间表现为一致的多态性。

⑥引物的分离分析：

再利用上述9对多态性引物，通过PCR扩增反应，对秋季F₂群体进行分离分析。

PCR标记反应体系为10μL：

3μLDNA(2.5ng/μL)，正向、反向引物(50ng/μL)各1μL，5μLGoGreenMastermix(Promega，Wisconsin,USA)；

PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环；72℃保温5min，得到扩增产物；得到的扩增产物用6.0％非变性聚丙烯酰胺凝胶，150V恒功率电泳分离1h，银染显色(参见步骤③)后在胶片观察灯下进行带型统计分析。

分析的方法，即共显性标记和显性标记的统计方法(参见步骤③)，将9对引物在F₂群体的分离情况进行统计分析。

⑦针对上述9个SSR和InDel分子标记(即上述9对SSR和InDel多态性标记)，利用JoinMap4.0软件绘制连锁图：先用Calculate命令计算相关参数，在Groupings(tree)命令下，在LOD≥3.0的状态下进行连锁群分组，然后用CreateGroupsforMapping命令作图，用Map命令构建框架图，并进行图距的计算。

结果为：将9个标记中的5个分子标记(具体包括2个SSR标记、3个InDel标记)和cr基因定位到了第5条染色体上(LOD＝8)，距离cr基因最近的分子标记为genSSR3000(表2)，遗传距离为0.3cM(图7)，此分子标记即为与cr基因紧密连锁的分子标记genSSR3000。

表2：genSSR3000引物序列

(2)侧翼标记验证

以Q132与FS871为亲本构建的24份B₁株系作为验证材料，以该验证材料的基因组DNA为模板，以上述分子标记genSSR3000为引物，对上述与cr基因紧密连锁的分子标记genSSR3000进行验证，确定标记用于MAS育种的准确性。

PCR标记反应体系为10μL：

3μLDNA(2.5ng/μL)，正向、反向引物(50ng/μL)各1μL，5μLGoGreenMastermix(Promega，Wisconsin,USA)；

PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环；72℃保温5min，得到扩增产物；得到的扩增产物用6.0％非变性聚丙烯酰胺凝胶，150V恒功率电泳分离1h，银染显色后在胶片观察灯下进行带型统计分析。

结果表明：针对分子标记genSSR3000，24份材料中有2份材料带型与表型结果不相符，正确率为91.7％(见图8，表3)。

表3：利用24份以Q132与FS871为亲本构建的B₁株系对标记genSSR3000进行准确性验证(B₁群体为(Q132×FS871)×Q132)。图8中的条带由左自右分别为QB1-QB24、Q132、FS871。

实施例3：

本实施例是上述与cr基因紧密连锁的分子标记genSSR3000在鉴别不同遗传背景的辣椒材料中是否含有cr基因的应用。

上述分子标记genSSR3000作为PCR引物，对于不同辣椒材料的基因组DNA进行PCR扩增反应，得到扩增产物，再将该扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色后，进行带型统计分析，以确定辣椒材料是否含有cr基因。

上述与cr基因紧密连锁的分子标记genSSR3000应用于鉴定辣椒材料中是否含有cr基因的方法，包括以下步骤：

(1)辣椒材料基因组DNA提取：采用天根植物基因组DNA提取试剂盒(DP305-2)提取辣椒材料的基因组DNA，提取方法详见试剂盒的操作说明，得到辣椒材料基因组DNA。

上述辣椒材料为对CMV表现为感病的辣椒材料：茄门、YOLOWONDER，对CMV表现为抗病的辣椒材料：湘301、Tombak(中抗)；

上述感病辣椒材料的直接来源于北京市农林科学院蔬菜研究中心辣椒种质资源库。

(2)PCR扩增反应：以该分子标记genSSR3000作为PCR引物，以该辣椒材料基因组DNA作为模板，进行PCR扩增反应，得到扩增产物。

优选地，该PCR扩增反应的体系中包括：

模板DNA0.5-2.0ng/μL，正向、反向引物各1-10ng/μL，dNTP各100-500μmol/L，MgCl₂1-5mmol/L，TaqDNA聚合酶0.1-0.5U/μL，体积百分比为10-20％的10×TaqBuffer；

更优选地，该PCR扩增反应体系中包括：

模板DNA1.6ng/μL，正向、反向引物各5ng/μL，dNTP各100μmol/L，MgCl₂1mmol/L，TaqDNA聚合酶0.1U/μL，体积百分比为10％的10×TaqBuffer；

其中，上述TaqDNAPolymerase及其Buffer购自北京全式金生物技术有限公司，dNTPs购自TaKaRa公司；

作为一种优选的方案，该PCR扩增反应采用以下的10μL体系：

3μL的模板DNA(2.5ng/μL)，正向、反向引物(50ng/μL)各1μL，5μL的GoGreenMastermix(Promega，Wisconsin,USA)；上述GoGreenMastermix购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，目录号为M7122。

该PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环；72℃保温5min，得到扩增产物。

(3)电泳和染色：将该扩增产物用6.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于150V恒功率电泳分离1h；再银染显色(参见实施例2的步骤③)后，在胶片观察灯下进行带型统计分析(参见实施例2的步骤③)。

结果表明：针对分子标记genSSR3000，4份抗感明确的辣椒材料中均不含有cr基因，正确率为100％。因此，该分子标记genSSR3000可以应用于检测辣椒材料是否含有cr基因。

本发明中，所采用的试剂和仪器均为市场常规产品。

显然，本发明的上述实施方式仅仅是为清楚地说明本发明所做的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (7)

1.与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记genSSR3000，其特征在于：所述分子标记具有序列表中的SEQIDNO:1～2的至少一个的核苷酸碱基序列。

2.与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记genSSR3000的应用，其特征在于：所述分子标记应用辣椒材料中cr基因的检测。

3.根据权利要求2所述与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记genSSR3000的应用，其特征在于：

所述检测包括以下步骤：

辣椒材料基因组DNA提取步骤：对辣椒材料进行提取处理，得到辣椒材料基因组DNA；

PCR扩增反应步骤：以所述分子标记作为PCR引物，以所述辣椒材料基因组DNA作为模板，进行PCR扩增反应，得到扩增产物；

分析步骤：将所述扩增产物进行电泳分离处理，显色处理，再统计分析所述辣椒材料是否含有cr基因。

4.根据权利要求3所述与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记genSSR3000的应用，其特征在于：

所述PCR扩增反应步骤中，PCR标记反应体系中含有：

模板DNA0.5-2.0ng/μL，正向、反向引物各1-10ng/μL，dNTP各100-500μmol/L，MgCl₂1-5mmol/L，TaqDNA聚合酶0.1-0.5U/μL，体积百分比为10-20％的10×TaqBuffer；

优选地，所述PCR标记反应体系中含有：

模板DNA1.6ng/μL，正向、反向引物各5ng/μL，dNTP各100μmol/L，MgCl₂1mmol/L，TaqDNA聚合酶0.1U/μL，体积百分比为10％的10×TaqBuffer。

5.根据权利要求3所述与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记genSSR3000的应用，其特征在于：

所述PCR扩增反应步骤中，PCR标记反应体系中含有：

体积百分含量为10-50％的模板DNA(2.5ng/μL)，正向、反向引物(50ng/μL)的体积百分含量各5-15％，体积百分含量为40-60％的GoGreenMastermix；

优选地，PCR标记反应体系中含有：

体积百分含量为30％的模板DNA(2.5ng/μL)，正向、反向引物(50ng/μL)的体积百分含量各10％，体积百分含量为50％的GoGreenMastermix。

6.根据权利要求3或4所述与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记genSSR3000的应用，其特征在于：

所述PCR扩增反应步骤中，PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环；72℃保温5min。

7.与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记genSSR3000的获取方法，其特征在于：

所述获取方法包括以下步骤：

将辣椒供试材料进行苗期抗病接种鉴定，以明确CMV抗性由单隐性基因cr控制；再利用SSR引物和InDel引物进行筛选和分离，得到所述与辣椒CMV抗性基因cr紧密连锁的分子标记genSSR3000。