CN105309302B - Cmv抗性由单隐性基因控制的辣椒材料的选育和鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于蔬菜品种鉴定领域，具体涉及CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料的选育和鉴定方法。本发明包括：杂交步骤：将四份杂交材料两两杂交，分别得到单交杂种；再将两个所述单交杂种杂交，得到双交杂种；单倍体培育步骤：将所述双交杂种进行花药培养，再经过CMV人工接种抗性鉴定，得到高抗CMV的辣椒材料Q132。该高抗CMV的辣椒材料Q132再通过六联合世代群体构建、接种和分析步骤，得到由单隐性基因控制的辣椒材料。本发明针对现有的市场优良品种，利用反向育种的思路培育优良育种材料；方法简便、快捷，大大地缩短了育种时间和降低了育种成本。

Description

CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料的选育和鉴定方法

技术领域

本发明属于蔬菜品种鉴定领域，具体涉及CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料的选育和鉴定方法。

背景技术

辣椒(Capicum annuum L.)是世界范围内广泛栽培的重要蔬菜作物。黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是一种毁灭性病害，是危害辣椒的主要病毒之一。CMV常引起辣椒叶型畸形皱缩，严重时植株萎缩，果实小而发硬，导致产量下降，品质降低。CMV可严重影响辣椒的产量和品质，一般年份可造成辣椒减产20％-30％，严重时可达50％-60％。在栽培生产过程中为防治辣椒CMV病害而频繁施用的化学农药，已经影响到辣椒产品的食用安全，对人体健康构成了严重威胁，也对生态环境造成了污染。实践表明，培育抗病品种是防治病害最经济有效的方法。同时发掘辣椒种质资源的优异抗CMV基因，对其进行分子水平的遗传解析，对于明确抗病基因作用的分子机理和抗病育种具有重要意义。

辣椒CMV抗性遗传规律复杂，不同的抗原材料抗病遗传模式不同。根据系列研究报道和发明人课题组做过的遗传规律研究，绝大多数CMV抗性材料抗性表现为数量性状遗传模式，大家纷纷针对手中的CMV抗性材料进行了QTL定位，但由于抗性材料不同或CMV毒源不同，QTL定位结果相互间差异很大，难以比较。根据以往研究报道，仅有极少数材料CMV抗性由单基因控制，如韩国报道Bukang的CMV抗性由单显性基因控制。然而至今，尚未有CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料的相关研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料的选育和鉴定方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料Q132的选育方法，其特征在于：该选育方法包括以下步骤：

杂交步骤：将四份杂交材料两两杂交，分别得到单交杂种；再将两个所述单交杂种杂交，得到双交杂种；

单倍体培育步骤：将所述双交杂种进行花药培养，再经过CMV人工接种抗性鉴定，得到高抗CMV的辣椒材料Q132。

在一种优选的实施方式中，所述杂交步骤中，四份杂交材料分别为“37-74”、“喜洋洋”、“帕沃尔”、“圣保罗”；将“37-74”与“喜洋洋”杂交，“帕沃尔”与“圣保罗”杂交。

在一种优选的实施方式中，所述单倍体培育步骤中，花蕾于4℃低温预处理1-3天。

在一种优选的实施方式中，所述单倍体培育步骤中，将所述花药接种于N4-3培养基；

所述N4-3培养基为固液双层培养基，固体层包括：NTH基本培养基的基础上，添加：质量百分比为3-6％的蔗糖、质量百分比为0.5％的活性炭、质量百分比为0.8％的琼脂粉；液体层包括：NTH基本培养基的基础上，添加：质量百分比为3-6％的蔗糖、IAA 0.5-1.5mg/L、6-BA 0.1-0.6mg/L、戊炔草胺0.1-0.5mg/L，抽滤灭菌；

示例性地，所述固体层中，所述蔗糖的质量百分比可以为3％、4％、5％、6％中任意值或任意值二者之间的范围，优选为5％；液体层中，所述蔗糖的质量百分比可以为3％、4％、5％、6％中任意值或任意值二者之间的范围，优选为5％，所述IAA的含量可以为0.5mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L、1.2mg/L、1.5mg/L中任意值或任意值二者之间的范围，优选为1mg/L；所述6-BA的含量可以为0.1mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L、0.6mg/L中任意值或任意值二者之间的范围，优选为0.3mg/L；所述戊炔草胺的含量可以为0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L中任意值或任意值二者之间的范围，优选为0.3mg/L。

在一种优选的实施方式中，所述单倍体培育步骤中，所述花药培养中，所述花药先在28-35℃条件下黑暗培养1-10天，再转移到25-28℃条件下黑暗培养4-7周。

在一种优选的实施方式中，六联合世代群体构建步骤：以所述高抗CMV的辣椒材料Q132、高感CMV的甜椒自交系FS871为亲本，构建P₁、P₂、F₁、B₁、B₂、F₂六联合世代群体。

接种和分析步骤：再将所述六联合世代群体进行多个季节的接种处理后，进行抗性统计分析，得到由单隐性基因控制的辣椒材料。

在一种优选的实施方式中，所述六联合世代群体构建步骤中，构建方法包括以下步骤：

F₁代：春季，以所述高抗CMV的辣椒材料Q132为母本，高感CMV的甜椒自交系FS871为父本进行杂交，得到F₁代种子；

F₂、B₁、B₂代：同年冬季，所述F₁代自交、并分别与所述高抗CMV的辣椒材料Q132、高感CMV的甜椒自交系FS871回交，分别获得F₂、B₁和B₂代的种子。

本发明的有益效果为：

1、本发明选取市场现有的优良品种的辣椒材料，进行杂交和单倍体培育，之后进行抗性鉴定，得到CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料Q132；本发明是采用针对现有的市场优良品种，利用反向育种的思路培育优良育种材料的方法。

2、本发明方法简便、快捷，大大地缩短了育种时间和降低了育种成本。

附图说明

图1为CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料Q132的选育方法的流程示意图。

图2为实施例1中花药培养步骤中得到的胚状体的照片。

图3为实施例1中再生植株培养步骤中得到的再生株的照片。

图4为实施例1中驯化移栽步骤中得到的植株的照片。

图5为实施例2中辣椒幼苗单株CMV病情7级的植株的照片。

图6为实施例2中辣椒幼苗单株CMV病情5级的植株的照片。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。

实施例1：

本实施例为CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料Q132的选育方法，包括以下步骤，如图1所示。

(1)选取杂交材料：选取从国内外引进的四份优良辣椒杂交种：“37-74”、“喜洋洋”、“帕沃尔”、“圣保罗”。

其中，“37-74”购自瑞克斯旺(中国)种子有限公司，“喜洋洋”购自昌乐新盛种业有限公司，“帕沃尔”购自日本坂田种苗(苏州)有限公司，“圣保罗”购自纽内姆(北京)种子有限公司。

(2)杂交：对上述四份杂交材料进行两两杂交：“37-74”与“喜洋洋”杂交得到单交杂种1，“帕沃尔”与“圣保罗”杂交得到单交杂种2；再将单交杂种1和单交杂种2杂交，得到双交杂种。

(3)单倍体培育：将该双交杂种进行花药培养，再经过CMV人工接种抗性鉴定，得到高抗CMV的DH株系Q132(即为高抗CMV的辣椒材料Q132)。

①选取花蕾：在上述双交杂种中，选择长势良好、无病虫害的植株作为供体植株，严格按镜检结果选取小孢子发育处于单核靠边期—双核早期的花蕾。

②花蕾预处理：4℃低温预处理花蕾1-3天。

③花蕾消毒：取合适大小的预处理后的花蕾，剥去花萼后，先用75％的酒精浸泡30s，再用8-10％的次氯酸钠振荡消毒10-20min，最后用无菌水清洗3次，每次3-5min，得到消毒后的花蕾。

④接种：取消毒后的花蕾，于超净工作台上将花药完好无损的剥离，以每60mm直径培养皿12-18枚花药的密度接种于N4-3培养基上。

该N4-3培养基为固液双层培养基，其中，固体层包括：NTH基本培养基的基础上，添加：质量百分比为3-6％的蔗糖、质量百分比为0.5％的活性炭、质量百分比为0.8％的琼脂粉，于121℃高压灭菌；

液体层包括：NTH基本培养基的基础上，添加：质量百分比为3-6％的蔗糖、IAA0.5-1.5mg/L、6-BA0.1-0.6mg/L、戊炔草胺0.1-0.5mg/L，抽滤灭菌；

该NTH基本培养基的原料包括：

硝酸氨825mg/L，硝酸钾950mg/L，二水氯化钙166mg/L，七水硫酸镁185mg/L，磷酸二氢钾680mg/L，硼酸6.20mg/L，四水硫酸锰25mg/L，七水硫酸锌10mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，五水流酸铜0.025mg/L，六水氯化钴0.03mg/L，肌醇100mg/L，烟酸5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L，甘氨酸2mg/L，叶酸5mg/L，生物素0.5mg/L。

⑤花药培养：花药先在28-35℃条件下黑暗培养1-10天，再转移到25-28℃条件下继续黑暗培养；培养4-7周时间，即可看到大量胚状体发生，如图2所示。

⑥再生株培养：选取子叶型胚状体，转移到不加激素的MS基本培养基上，培育壮苗，得到再生株，如图3所示。

⑦鉴定倍性：待再生株长至3-4片真叶，切取叶片，通过流式细胞仪或保卫细胞叶绿体计数法，从细胞染色体的水平鉴定再生株的倍性。

⑧驯化移栽：将鉴定为二倍体的上述再生株移栽至培养土中，进行驯化培养；其中，该培养土由蛭石和草炭按质量比1:1混合制成，并经过高压灭菌；培养条件为：光照时间为16小时/天，强度为2000lx光照，温度为22-25℃；培养得到驯化后的二倍体再生株(如图4所示)。

⑨CMV人工接种抗性鉴定：

采收上述驯化后二倍体再生株系的种子并培养长成植株，再对该植株进行CMV人工接种抗性鉴定，以确定步骤⑦中鉴定为二倍体的再生株的CMV抗性。该抗性鉴定包括如下步骤：

A、CMV毒源繁殖：将CMV毒源在“心叶烟”上繁殖，温度20-28℃，自然光照。

B、人工接种：约9-11天，“心叶烟”发病后，采摘发病的叶片，加入5倍于鲜病叶重量的0.03mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)，捣碎后双层纱布过滤，滤液立即用于接种于上述六世代联合群体的辣椒幼苗；待辣椒幼苗长至2-3片真叶时，叶面撒布一薄层600目的金刚砂，人工摩擦接种：接种2次，2-3天后重复接种一次。整个接种鉴定工作都在防虫控温温室内进行，保证室温22-28℃和自然光照。

C、调查和分析：

接种后20天，调查上述植株的发病情况，2人同时调查以确保结果的准确性，记录病株数和病级，并计算病情指数，进行抗性归类，得到由单隐性基因控制的辣椒材料。

a、辣椒幼苗单株CMV病情分级标准为：

0级：无任何症状；

1级：心叶明脉或少数嫩叶花叶；

3级：中上部叶片呈现花叶；

5级：多数叶片花叶，少数叶片畸形，植株轻度矮化；

7级：重花叶，多数叶片畸形、蕨叶，植株矮化；

9级：植株严重矮化、停止生长，甚至死亡。

病情指数(DI)计算公式为：

病情指数＝∑(各病级数值×该病级株数)/(最高病级数值×调查总株数)×100％

植株疫病抗病性分级标准：

高抗(HR)：DI值≤10；抗病(R)：10≤DI值≤20；中抗(MR)：20≤DI值≤40；感病(S)：DI值＞40。

b、分析结果如下：

上述植株中，病级≤3的单株，鉴定为抗病，其它均以感病统计。通过本步骤鉴定出来的抗病植株，及其所对应的步骤⑥的再生株，可以确定为具有CMV抗性的辣椒材料：高抗CMV的辣椒材料Q132。

实施例2：

本实施例是对实施例1获得高抗CMV的辣椒材料Q132进行重复的CMV人工接种抗性鉴定，高抗CMV的辣椒材料Q132CMV抗性是由单隐性基因控制的。

其中，CMV接种毒源为危害我国甜辣椒生产的黄瓜花叶病毒主流株系，即CMV-重花叶株系，毒源购自中国农科院蔬菜花卉研究所植物保护研究室。

上述抗性鉴定方法包括以下步骤：

(1)六联合世代群体的构建：以实施例1获得的高抗CMV的辣椒材料Q132、高感CMV的甜椒自交系FS871为亲本，构建P₁、P₂、F₁、B₁、B₂、F₂六联合世代群体。

构建方法如下：

F₁代：2013年春季，于北京市农林科学院蔬菜研究中心农场以Q132为母本，FS871为父本进行杂交，得到F₁代种子；

F₂、B₁、B₂代：2013年冬季，于中心海南三亚农场，F₁代自交、并分别与Q132、FS871回交，分别获得F₂、B₁和B₂代的种子。

2014年春季和秋季，六个世代的种子经消毒后，播种于无菌培养土，温室内育苗。

2014年春季P₁、P₂、F₁、B₁、B₂、F₂六个世代的样本容量分别为：27、24、29、131、129、251。2014年秋季P₁、P₂、F₁、B₁、B₂、F₂六个世代的样本容量分别为：20、23、30、79、76、262。

分别设2012-Z52、FS871为抗感对照。

(2)CMV人工接种抗性鉴定：将六联合世代群体进行CMV接种处理，得到接种后的六联合时代群体。

①CMV毒源繁殖：将CMV毒源在“心叶烟”上繁殖，温度20-28℃，自然光照。

②人工接种：约9-11天，“心叶烟”发病后，采摘发病的叶片，加入5倍于鲜病叶重量的0.03mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)，捣碎后双层纱布过滤，滤液立即用于接种于上述六世代联合群体的辣椒幼苗；待辣椒幼苗长至2-3片真叶时，叶面撒布一薄层600目的金刚砂，人工摩擦接种：接种2次，2-3天后重复接种一次。整个接种鉴定工作都在防虫控温温室内进行，保证室温22-28℃和自然光照。

(3)调查和分析：

接种后20天，调查上述六联合世代群体发病情况，2人同时调查以确保结果的准确性，记录病株数和病级，并计算病情指数，进行抗性归类，得到由单隐性基因控制的辣椒材料。

①辣椒幼苗单株CMV病情分级标准为：

0级：无任何症状；

1级：心叶明脉或少数嫩叶花叶；

3级：中上部叶片呈现花叶；

5级：多数叶片花叶，少数叶片畸形，植株轻度矮化，如图6所示；

7级：重花叶，多数叶片畸形、蕨叶，植株矮化，如图5所示；

9级：植株严重矮化、停止生长，甚至死亡。

病情指数(DI)计算公式为：

病情指数＝∑(各病级数值×该病级株数)/(最高病级数值×调查总株数)×100％

植株疫病抗病性分级标准：

高抗(HR)：DI值≤10；抗病(R)：10≤DI值≤20；中抗(MR)：20≤DI值≤40；感病(S)：DI值＞40。

②分析结果如下：

上述植株中，病级≤3的单株，鉴定为抗病，其它均以感病统计。计算分离比，采用Microsoft Excel 2003软件进行数据统计分析，SAS8.0对结果进行卡方测验。

综合两个季节的CMV抗性鉴定结果，实施例1获得的二倍体再生株(代号为Q132)和FS871的CMV病指平均分别为4.20和65.3；Q132×FS871的F₁正反交CMV病指分别平均为5.36和7.64。2014年春季在F₂群体中，CMV病级＞3(感病)的单株有152株，CMV病级≤3(抗病)的单株有49株，感CMV与抗CMV植株数量的分离比例经卡方检验符合3﹕1(表1)。由此可知，实施例1获得的具有CMV抗性的辣椒材料Q132的CMV抗性由1对隐性核基因控制，其CMV抗性对感性为隐性。

表1：Q132×FS871后代群体CMV抗性分离情况统计

因此，本发明的实施例1中，研究人员对通过双杂交和单倍体培育方法获得的数份DH株系进行CMV人工接种抗性鉴定，筛选出了CMV抗性材料——Q132；并在实施例2中利用P₁、P₂、F₁、B₁、B₂、F₂六联合世代群体进行了至少两个季节的遗传规律研究，最终明确材料Q132CMV抗性由单隐性基因控制，命名为cr。由单基因控制的CMV抗性遗传材料的获得对于辣椒CMV抗性育种具有重要意义。

本发明中，所采用的试剂和仪器均为市场常规产品。

显然，本发明的上述实施方式仅仅是为清楚地说明本发明所做的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (6)

1.CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料Q132的选育方法，其特征在于：该选育方法包括以下步骤：

杂交步骤：将四份杂交材料两两杂交，分别得到单交杂种；再将两个所述单交杂种杂交，得到双交杂种；

单倍体培育步骤：将所述双交杂种进行花药培养，再经过CMV人工接种抗性鉴定，得到高抗CMV的辣椒材料Q132；

所述杂交步骤中，四份杂交材料分别为“37-74”、“喜洋洋”、“帕沃尔”、“圣保罗”；其中，将“37-74”与“喜洋洋”杂交，“帕沃尔”与“圣保罗”杂交。

2.根据权利要求1所述CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料Q132的选育方法，其特征在于：

所述单倍体培育步骤中，花蕾于4℃低温预处理1-3天。

3.根据权利要求1所述CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料Q132的选育方法，其特征在于：

所述单倍体培育步骤中，将所述花药接种于N4-3培养基；

所述N4-3培养基为固液双层培养基，固体层包括：NTH基本培养基的基础上，添加：质量百分比为3-6％的蔗糖、质量百分比为0.5％的活性炭、质量百分比为0.8％的琼脂粉；液体层包括：NTH基本培养基的基础上，添加：质量百分比为3-6％的蔗糖、IAA 0.5-1.5mg/L、6-BA 0.1-0.6mg/L、戊炔草胺0.1-0.5mg/L，抽滤灭菌。

4.根据权利要求1或3所述CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料Q132的选育方法，其特征在于：

所述单倍体培育步骤中，所述花药培养中，所述花药先在28-35℃条件下黑暗培养1-10天，再转移到25-28℃条件下黑暗培养4-7周。

5.根据权利要求1-4中任一项所述CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料Q132的鉴定方法，其特征在于：所述鉴定方法包括以下步骤：

六联合世代群体构建步骤：以所述高抗CMV的辣椒材料Q132、高感CMV的甜椒自交系FS871为亲本，构建P₁、P₂、F₁、B₁、B₂、F₂六联合世代群体；

接种和分析步骤：再将所述六联合世代群体进行多个季节的接种处理后，进行抗性统计分析，得到由单隐性基因控制的辣椒材料。

6.根据权利要求5所述CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料Q132的鉴定方法，其特征在于：所述六联合世代群体构建步骤中，构建方法包括以下步骤：

F₁代：春季，以所述高抗CMV的辣椒材料Q132为母本，高感CMV的甜椒自交系FS871为父本进行杂交，得到F₁代种子；

F₂、B₁、B₂代：同年冬季，所述F₁代自交、并分别与所述高抗CMV的辣椒材料Q132、高感CMV的甜椒自交系FS871回交，分别获得F₂、B₁和B₂代的种子。