CN106069738A - 花药黄色性状由单隐性基因控制的辣椒的选育及鉴定方法 - Google Patents

花药黄色性状由单隐性基因控制的辣椒的选育及鉴定方法 Download PDF

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张晓芬
耿三省
陈斌
杜和山
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    • A01H1/02—Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility

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Abstract

本发明公开了一种花药黄色性状由单隐性基因控制的辣椒的选育及鉴定方法。该选育方法包括如下步骤：1)将“巴欧”、“玛丽莲”、“博收一号”和“博收二号”这四份辣椒品种两两杂交，得到两个单交杂种；再将两个单交杂种杂交，得到双交杂种；2)将双交杂种进行单倍体培育、加倍，得到系列DH株系；3)从系列DH株系中选择花药黄色的株系，即为花药黄色性状由单隐性基因控制的辣椒材料。本发明采用上述方法获得了花药黄色由单隐性基因控制的辣椒材料DH121；本发明是采用针对现有的市场优良品种，利用反向育种的思路培育优良育种材料的方法。本发明方法简便、快捷，大大地缩短了育种时间和降低了育种成本。

Description

花药黄色性状由单隐性基因控制的辣椒的选育及鉴定方法
技术领域
本发明属于蔬菜品种鉴定领域，涉及一种花药黄色性状由单隐性基因控制的辣椒的选育及鉴定方法。
背景技术
辣椒(Capicum annuum L.)是世界范围内广泛栽培的重要蔬菜作物。辣椒杂种优势明显，利用杂种优势可有效解决辣椒市场需求。目前辣椒市场上主要应用的是F1代杂交种。而种子纯度的高低直接影响一代杂交种的产量及产品质量。在辣椒杂交制种过程中，母本自交种子的产生会显著降低杂交种的纯度。在利用辣椒雄性不育两用系制种过程中，若不能完全拔出50％的可育株，同样会大大降低杂交种子的质量。同时无论是雄性不育两系、三系中的任何一个系的混杂都将引起辣椒生产用种的不纯而导致混杂退化。而且不育系本身育性易受环境条件影响，不育性不稳定，易自交结实而影响制种纯度。
隐性标记性状的利用可有效解决上述问题。将易于识别的隐性标记性状转育给辣椒母本和辣椒雄性不育系，通过目测及标记性状连锁标记分析进行选择，可有效解决常规辣椒杂种鉴定方法繁琐、耗时、费财，及辣椒雄性不育系、保持系的选育周期较长、费力等问题。
辣椒花药的颜色有多种，有黄色、绿色、紫色和粉色等等。然而至今还没有辣椒花药颜色遗传分析和基因定位的相关研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种辣椒育种的方法。
本发明所提供的辣椒育种方法是利用单隐性基因控制“花药黄色”性状的原理进行辣椒育种。
本发明还提供了选育具有由单隐性基因控制的“花药黄色”这一性状的辣椒材料DH121的方法，具体可包括如下步骤：
(1)将四份用于杂交的辣椒品种两两进行杂交，得到两个单交杂种；再将两个所述单交杂种进行杂交，得到双交杂种；
所述四份用于杂交的辣椒品种为“巴欧”、“玛丽莲”、“博收一号”和“博收二号”；
(2)将所述双交杂种进行单倍体培育，加倍后得到系列DH株系；
(3)从系列所述DH株系中选择花药为黄色的株系，即为具有由单隐性基因控制的“花药黄色”这一性状的辣椒材料DH121。
在所述方法的步骤(1)中，所述“将四份用于杂交的辣椒品种两两进行杂交”为将“巴欧”与“博收一号”进行杂交，“玛丽莲”与“博收二号”进行杂交。
在所述方法的步骤(2)中，所述系列DH株系可为：将所述双交杂种进行单倍体培育所得的若干自然加倍的双单倍体，和/或将所述双交杂种进行单倍体培育所得的若干单倍体进行人工染色体加倍后得到的若干人工加倍的双单倍体。
在所述方法的步骤(2)中，所述进行的单倍体培育为花药培养。
进一步，进行所述花药培养时的花药为取自于4℃低温预处理1-3天(如2天)的花蕾中的花药，其中的所述花蕾可为小孢子发育处于单核靠边期—双核早期的花蕾。
进一步，进行所述花药培养时采用的培养基为N4-3培养基；所述N4-3培养基为固液双层培养基(固体层在下，液体层在上)；固体层为在NTH基本培养基的基础上添加蔗糖至在所述固体层的质量百分比为3-6％(如3％)，添加活性炭至在所述固体层的质量百分比为0.5％，添加琼脂粉至在所述固体层的质量百分比为0.8％，pH值调为5.8；液体层为在NTH基本培养基的基础上添加蔗糖至在所述液体层的质量百分比为3-6％(如6％)，添加IAA至在所述液体层的浓度为0.5-1.5mg/L(如1.0mg/L)，添加6-BA至在所述液体层的浓度为0.1-0.6mg/L(如0.6mg/L)，添加戊炔草胺至在所述液体层的浓度为0.1-0.5mg/L(如0.5mg/L)，pH值调为5.8。其中，所述NTH基本培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：硝酸氨825mg/L，硝酸钾950mg/L，二水氯化钙166mg/L，七水硫酸镁185mg/L，磷酸二氢钾680mg/L，硼酸6.20mg/L，四水硫酸锰25mg/L，七水硫酸锌10mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，六水氯化钴0.03mg/L，肌醇100mg/L，烟酸5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L，甘氨酸2mg/L，叶酸5mg/L，生物素0.5mg/L。另外，培养时的接种密度为每60mm直径培养皿12-18枚(如12枚)花药。
进一步，进行所述花药培养时，所述花药先在28-35℃(如28℃)条件下黑暗培养1-10天(如8天)，再转移到25-28℃(如25℃)条件下黑暗培养4-8周(如8周)，得到胚状体；将所述胚状体转移到不加激素的MS基本培养基上，培育壮苗，得到再生株。
在所述方法的步骤(3)中，从系列所述DH株系中选择花药为黄色的株系，是通过在辣椒门椒始花期采用目测法观察已盛开花朵花药的颜色来完成选择的。
在所述方法的步骤(3)中，所选的株系除了具有“花药黄色”这一性状外，最好同时其他综合性状优良(如植株生长健壮、座果连续性好、抗病性好)。
在本发明所提供的“选育具有由单隐性基因控制的“花药黄色”这一性状的辣椒材料DH121的方法”中，还可包括对所述辣椒材料DH121的“花药黄色”这一性状由单隐性基因控制的鉴定步骤，所述鉴定步骤具体为下文所述的“一种确定辣椒‘花药黄色’这一性状由单隐性基因控制的方法”。
利用所述方法获得的所述辣椒材料DH121在确定辣椒“花药黄色”这一性状由单隐性基因控制中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种确定辣椒“花药黄色”这一性状由单隐性基因控制的方法，包括如下步骤：
(a)将所述方法获得的所述辣椒材料DH121与具有“花药紫色”这一性状的辣椒自交系12-Z65作为两亲本构建P1、P2、F1、BC1、BC2、F2六联合世代群体；
所述P1为作为亲本的所述辣椒材料DH121；所述P2为作为亲本的所述辣椒自交系12-Z65；
所述F1为将所述P1和所述P2进行杂交所得后代；
所述BC1为将所述F1和所述P1进行回交所得后代；
所述BC2为将所述F1和所述P2进行回交所得后代；
所述F2为将所述F1进行自交所得后代；
(b)种植并观察统计所述六联合世代群体的辣椒花药颜色，根据统计分析结果确定辣椒“花药黄色”这一性状由单隐性基因控制。
在步骤(b)中，所述统计分析结果为所述F1群体全部具有“花药紫色”这一性状；所述BC1群体中1/2具有“花药紫色”这一性状，1/2具有“花药黄色”这一性状；所述BC2群体全部具有“花药紫色”这一性状；所述F2群体中3/4具有“花药紫色”这一性状，1/4具有“花药黄色”这一性状。
利用所述方法获得的所述辣椒材料DH121在辣椒育种中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明具有以下优势：1、本发明选取市场现有的优良品种的辣椒材料，进行杂交、单倍体培育并加倍，之后进行花药颜色筛选鉴定，得到花药黄色由单隐性基因控制的辣椒材料DH121；本发明是采用针对现有的市场优良品种，利用反向育种的思路培育优良育种材料的方法。2、本发明方法简便、快捷，大大地缩短了育种时间和降低了育种成本。
保藏说明
建议分类命名：辣椒
拉丁名：(Capsicum annuum)
参椐的生物材料：12-Z65
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2016年6月1日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.12548
附图说明
图1为具有由单隐性基因控制的“花药黄色”这一性状的辣椒材料DH121的选育流程图。
图2为实施例1中花药培养步骤中得到的胚状体的照片。
图3为实施例1中再生植株培养步骤中得到的再生株的照片。
图4为实施例1中驯化移栽步骤中得到的植株的照片。
图5为辣椒材料DH121的黄色花药(右)和12-Z65的紫色花药(左)图片。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
辣椒品种“巴欧”为上海种都种业科技有限公司产品。辣椒品种“玛丽莲”为先正达生物科技中国有限公司产品。辣椒品种“博收一号”和“博收二号”为北京博收种子有限公司产品。
实施例1、具有由单隐性基因控制的“花药黄色”这一性状的辣椒材料DH121的选育及鉴定
一、具有由单隐性基因控制的“花药黄色”这一性状的辣椒材料DH121的选育
选育具有由单隐性基因控制的“花药黄色”这一性状的辣椒材料DH121的方法，如图1所示。
(1)选取杂交材料：四份用于杂交的优良辣椒品种“巴欧”、“玛丽莲”、“博收一号”和“博收二号”。
(2)杂交：将“巴欧”与“博收一号”进行杂交，得到单交杂种1；将“玛丽莲”与“博收二号”进行杂交，得到单交杂种2。再将单交杂种1和单交杂种2杂交，得到双交杂种。
(3)单倍体培育并加倍：将所述双交杂种进行单倍体培育，得到若干自然加倍的双单倍体(DH株系)和若干单倍体；从若干所述DH株系中选择花药为黄色(最好同时其他综合农艺性状优良)的株系，即为具有由单隐性基因控制的“花药黄色”这一性状的辣椒材料DH121。其中，所述DH株系除了为若干自然加倍的双单倍体外，也可以为对所述若干单倍体进行人工染色体加倍后得到若干人工加倍的双单倍体。
①选取花蕾：在上述双交杂种中，选择长势良好、无病虫害的植株作为供体植株，严格按镜检结果选取小孢子发育处于单核靠边期—双核早期的花蕾。
②花蕾预处理：4℃低温预处理花蕾2天。
③花蕾消毒：取合适大小的预处理后的花蕾，剥去花萼后，先用75％的酒精浸泡30s，再用8％的次氯酸钠振荡消毒15min，最后用无菌水清洗3次，每次5min，得到消毒后的花蕾。
④接种：取消毒后的花蕾，于超净工作台上将花药完好无损的剥离，以每60mm直径培养皿12枚花药的密度接种于N4-3培养基上。
该N4-3培养基为固液双层培养基(固体层在下，液体层在上)，固体层为在NTH基本培养基的基础上添加蔗糖至在所述固体层的质量百分比为3％，添加活性炭至在所述固体层的质量百分比为0.5％，添加琼脂粉至在所述固体层的质量百分比为0.8％，pH值调为5.8；液体层为在NTH基本培养基的基础上添加蔗糖至在所述液体层的质量百分比为6％，添加IAA至在所述液体层的浓度为1.0mg/L，添加6-BA至在所述液体层的浓度为0.6mg/L，添加戊炔草胺至在所述液体层的浓度为0.5mg/L，pH值调为5.8。
其中，NTH基本培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：硝酸氨825mg/L，硝酸钾950mg/L，二水氯化钙166mg/L，七水硫酸镁185mg/L，磷酸二氢钾680mg/L，硼酸6.20mg/L，四水硫酸锰25mg/L，七水硫酸锌10mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，六水氯化钴0.03mg/L，肌醇100mg/L，烟酸5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L，甘氨酸2mg/L，叶酸5mg/L，生物素0.5mg/L。
⑤花药培养：花药先在28℃条件下黑暗培养8天，再转移到25℃条件下继续黑暗培养；培养8周时间，即可看到大量胚状体发生，如图2所示。
⑥再生株培养：选取子叶型胚状体，转移到不加激素的MS基本培养基上，培育壮苗，得到再生株，如图3所示。
⑦鉴定倍性：待再生株长至3-4片真叶，切取叶片，通过保卫细胞叶绿体计数法，从细胞染色体的水平鉴定再生株的倍性。
⑧驯化移栽：将鉴定为二倍体的上述再生株移栽至培养土中，进行驯化培养；其中，该培养土由蛭石和草炭按质量比1:1混合制成，并经过高压灭菌；培养条件为：光照时间为16小时/天，强度为2000lx光照，温度为22-25℃；培养得到驯化后的二倍体再生株，即DH株系(如图4所示)。
⑨性状调查：在辣椒门椒始花期，采用目测法观察已盛开花朵花药的颜色，根据观测结果，与Royal Horticultural Society比色卡(北京东方诺贝科技发展有限公司产品)上相应代码(如下1-6)的颜色进行比对，按照最大相似度原则，确定所观察的辣椒材料的花药颜色。1：白(FAN4 155C)；2：浅黄(FAN1 6C)；3：黄(FAN1 12A)；4：浅蓝(FAN2 110A)；5：蓝(FAN2 110A)；6：紫(FAN2N89CD)。从系列所述DH株系中选择花药为黄色(对应比色卡上的“3：黄(FAN1 12A)”)、植株生长健壮、座果连续性好、抗病性好的优良株系)，即为具有由单隐性基因控制的“花药黄色”这一性状的辣椒材料DH121。
二、具有由单隐性基因控制的“花药黄色”这一性状的辣椒材料DH121的鉴定
以经步骤一四亲杂交、单倍体培育选育出的其它综合性状优良、花药为黄色的辣椒双单倍体材料DH121与花药为紫色的辣椒12-Z65 CGMCC No.12548为亲本(图5)，构建P1、P2、F1、BC1、BC2、F2六联合世代。
2013年春季，于北京市农林科学院蔬菜研究中心农场将DH121(P1)与12-Z65(P2)杂交，得到F1代种子，2013年冬季，于中心海南三亚农场，F1代自交、并分别与DH121、12-Z65回交，分别获得F2、BC1和BC2代的种子。
2014年春季和秋季，将六个世代的种子播种，温室内育苗。2014年春季P1、P2、F1、BC1、BC2、F2六个世代的样本容量分别为：25、26、30、126、130、253。2014年秋季P1、P2、F1、BC1、BC2、F2六个世代的样本容量分别为：21、25、24、84、86、243(表1)。
在辣椒门椒始花期，采用目测法观察已盛开花朵花药的颜色。根据观测结果，与标准卡上相应代码的颜色进行比对，按照最大相似度原则，确定种质的颜色。
1：白(FAN4 155C)；
2：浅黄(FAN1 6C)；
3：黄(FAN1 12A)；
4：浅蓝(FAN2 110A)；
5：蓝(FAN2 110A)；
6：紫(FAN2N89CD)。
2人同时调查以确保结果的准确性。花药为黄色的单株(即符合比色卡上“3：黄(FAN1 12A)”的单株)，鉴定为花药黄色，其它尽管紫色深浅有差异，均统计为花药非黄色。计算分离比，采用Microsoft Excel 2003软件进行数据统计分析，利用SAS8.0对结果进行卡方测验。
综合两个季节的花药颜色鉴定结果，2014年春季，在F1群体和BC2群体中，全部为非黄色花药植株；在F2群体中，花药为非黄色的单株有184株，花药为黄色的单株有69株，非黄色花药与黄色花药植株数量的分离比例经卡方检验符合3﹕1；在BC1群体中，花药为非黄色的单株有65株，花药为黄色的单株有61株，非黄色花药与黄色花药植株数量的分离比例经卡方检验符合1﹕1(表1)。2014年秋季，在F1群体和BC2群体中，全部为非黄色花药植株；在F2群体中，花药为非黄色的单株有186株，花药为黄色的单株有57株，非黄色花药与黄色花药植株数量的分离比例经卡方检验也符合3﹕1；在BC1群体中，花药为非黄色的单株有43株，花药为黄色的单株有41株，非黄色花药与黄色花药植株数量的分离比例经卡方检验符合1﹕1(表1)。由此可知，辣椒“花药黄色”这一性状由1对单隐性基因控制。
表1 DH121×12-Z65后代群体CMV抗性分离情况统计

Claims (10)

1.一种辣椒育种的方法，是利用单隐性基因控制“花药黄色”性状的原理进行辣椒育种。
2.一种选育具有由单隐性基因控制的“花药黄色”这一性状的辣椒材料DH121的方法，包括如下步骤：
(1)将四份用于杂交的辣椒品种两两进行杂交，得到两个单交杂种；再将两个所述单交杂种进行杂交，得到双交杂种；
所述四份用于杂交的辣椒品种为“巴欧”、“玛丽莲”、“博收一号”和“博收二号”；
(2)将所述双交杂种进行单倍体培育，加倍后得到系列DH株系；
(3)从系列所述DH株系中选择花药为黄色的株系，即为具有由单隐性基因控制的“花药黄色”这一性状的辣椒材料DH121。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述“将四份用于杂交的辣椒品种两两进行杂交”为将“巴欧”与“博收一号”进行杂交，“玛丽莲”与“博收二号”进行杂交。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述进行单倍体培育为花药培养。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：进行所述花药培养时的花药为取自于4℃低温预处理1-3天的花蕾中的花药；和/或
进行所述花药培养时，采用的培养基为N4-3培养基；所述N4-3培养基为固液双层培养基；固体层为在NTH基本培养基的基础上添加蔗糖至在所述固体层的质量百分比为3-6％，添加活性炭至在所述固体层的质量百分比为0.5％，添加琼脂粉至在所述固体层的质量百分比为0.8％；液体层为在NTH基本培养基的基础上添加蔗糖至在所述液体层的质量百分比为3-6％，添加IAA至在所述液体层的浓度为0.5-1.5mg/L，添加6-BA至在所述液体层的浓度为0.1-0.6mg/L，添加戊炔草胺至在所述液体层的浓度为0.1-0.5mg/L。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：进行所述花药培养时，所述花药先在28-35℃条件下黑暗培养1-10天，再转移到25-28℃条件下黑暗培养4-8周。
7.利用权利要求2-6中任一所述方法获得的所述辣椒材料DH121在确定辣椒“花药黄色”这一性状由单隐性基因控制中的应用。
8.一种确定辣椒“花药黄色”这一性状由单隐性基因控制的方法，包括如下步骤：
(a)将利用权利要求2-6中任一所述方法获得的所述辣椒材料DH121与具有“花药紫色”这一性状的辣椒自交系12-Z65作为两亲本构建P1、P2、F1、BC1、BC2、F2六联合世代群体；
所述P1为作为亲本的所述辣椒材料DH121；所述P2为作为亲本的所述辣椒自交系12-Z65；
所述F1为将所述P1和所述P2进行杂交所得后代；
所述BC1为将所述F1和所述P1进行回交所得后代；
所述BC2为将所述F1和所述P2进行回交所得后代；
所述F2为将所述F1进行自交所得后代；
(b)种植并观察统计所述六联合世代群体的辣椒花药颜色，根据统计分析结果确定辣椒“花药黄色”这一性状由单隐性基因控制。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(b)中，所述统计分析结果为所述F1群体全部具有“花药紫色”这一性状；所述BC1群体中1/2具有“花药紫色”这一性状，1/2具有“花药黄色”这一性状；所述BC2群体全部具有“花药紫色”这一性状；所述F2群体中3/4具有“花药紫色”这一性状，1/4具有“花药黄色”这一性状。
10.利用权利要求2-6中任一所述方法获得的所述辣椒材料DH121在辣椒育种中的应用。
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