CN114277175A - 一种快速高效的小麦抗赤霉病分子设计育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速高效的小麦抗赤霉病分子设计育种方法，包括在小麦主栽品种背景下，选择携带抗赤霉病基因Fhb1、抗赤霉病/穗粒数增效位点QFhb/GNS.yaas‑Y5‑2D和抗赤霉病/粒重增效位点QFhb/GW.yaas‑Y5‑5A的位点互补的亲本，将选择出的亲本进行杂交或者复交，收获杂交或者复交后种子。然后结合分子标记及综合农艺性状进行多世代鉴定筛选，获得抗赤霉病的小麦品种(系)。利用本发明方法选育的抗赤霉病小麦品种(系)，赤霉病抗性稳定，携有多个抗病和高产相关的分子模块/位点，本研究育成的品种(系)和育种技术可逐步推广，减少生产过程中病害防治药剂的使用，保证生产原粮安全卫生，实现小麦生产绿色高效、生态环保。

Description

一种快速高效的小麦抗赤霉病分子设计育种方法

技术领域

本发明属于小麦分子育种技术领域，涉及一种快速高效的小麦抗赤霉病分子设计育种方法。

背景技术

我国在世界上最早开展小麦抗赤霉病遗传改良工作，上世纪70年代就育成了高抗品种苏麦3号；80年代，我国小麦赤霉病研究协作组鉴定了3万多份材料，筛选出中抗以上材料1000多份，但只有极少材料达高抗水平。此后我国开展了以苏麦3号、望水白和小麦近缘种属为抗源的抗赤霉病育种工作，虽然选育出一些赤霉病抗性强而稳定的品种(系)如宁7840等，但是农艺性状较差，如植株偏高不抗倒、产量三要素不协调等，未能在生产上推广应用。此后，程顺和提出采用综合丰产性好、赤霉病轻的亲本进行配组，后代注重综合丰产性，兼顾抗病和抗逆性选择的抗赤霉病育种新策略，以此技术路线陆续育成了一批中抗赤霉病的大面积丰产小麦品种，如扬麦4号、扬麦5号、扬麦158、宁麦9号、生选6号和宁麦13等品种，显著提升了长江中下游麦区抗赤霉病总体水平。江苏省是我国最大的赤霉病重发区，抗赤霉病一直是小麦重要育种目标。2009～2020年国审小麦品种中仅有28个赤霉病抗性达到中抗(MR)，其中23个来自江苏省；而此期间江苏省能达到抗(R级)的品种仅有个别品种，也未能在生产上大面积推广应用，表明江苏省小麦品种的赤霉病抗性仍停留在中抗水平，抗赤霉病育种未取得明显突破，抗赤霉病品种的培育仍是制约小麦安全生产的“卡脖子”问题。

小麦的赤霉病抗性是典型的的数量性状，易受包括环境在内的多因素影响，而且不是单基因控制；育种低世代和高世代的赤霉病抗性鉴定非常复杂繁琐，需要投入大量的人力物力财力，往往还不能保证结果的稳定性和准确性。大多数育种单位采用的是田间自然发病筛选抗赤霉病材料的方法，这种方法对自然环境的依赖性很强，年份和地点之间差异很大，不具有参考性。仅有少数单位具有温室或者大棚条件进行抗赤霉病的精准鉴定，但是如何控制好温室和大棚的环境依旧是一个难题，温度过高会导致小麦生长过快，抽穗不理想，穗子太小不能用于鉴定赤霉病，而且结实困难；温度过低会导致小麦抽穗太晚甚至不抽穗，即使抽穗但是后面扬花期温度未达到赤霉病发病条件依然不能筛选出真实的抗赤霉病材料。因此，积极的因地制宜地创造一个适宜小麦生长且发病的环境尤为重要。

自21世纪以来，一些与小麦产量、品质和抗病基因紧密连锁的分子标记的开发为分子标记辅助选择(MAS)育种提供了技术支撑。美国2001年成立由20多个小麦育种项目参与的MAS协会，把27个不同的病虫害抗性基因、20个面包和饼干品质有益位点通过MAS回交转入美国主要小麦产区的约180个品系中。国际玉米小麦改良中心(CIMMYT)成功将25个与病虫害、品质、农艺性状相关的标记应用在MAS育种项目中。中国农科院、四川省农科院等通过MAS育成农艺性状优良的兼抗白粉病、锈病等育种新材料100多份。分子设计育种能够彰显出比传统杂交育种更为突出的优越性。分子设计育种时代即将到来，它的标志是能够快速、合理和精确地将任何已知的优良等位基因组合到理想的背景中。一般来说,重要农艺性状是由多个数量位点控制,并且不同农艺性状之间存在一定程度的相关性,并经常发生模块化调控。这种复杂性造成了传统杂交育种的主要障碍，而分子设计育种的最大挑战之一是打破不同性状之间不必要的连锁,特别是作物产量和非生物或生物抗逆性相关的性状。未来育种4.0时代的关键方案就是合理设计具有高产、优质、高抗等综合性状优良的作物。为了实现这一目标,阐明农艺性状形成的枢纽基因及其调控网络是极其重要的。小麦抗赤霉病是作物最复杂的数量性状之一，国内外定位了大量的抗赤霉病QTL，小麦赤霉病主效抗性基因Fhb1和Fhb7已被克隆，但由于抗病基因/QTL效应复杂，同时对与产量相关的农艺性状可能存在不利影响，实现赤霉病抗性和丰产性的结合非常困难。《江苏省农作物品种审定标准》中抗赤霉病小麦品种审定标准：淮南麦区抗性达到抗、淮北麦区抗性达到中抗及以上的品种。淮南麦区春性品种接种鉴定和自然鉴定抗性均达到抗，产量比对照减产≤5.0％，可以被推荐进入下一轮抗赤霉病鉴定和多点产量试验。目前审定的小麦品种中能达到“抗”的水平的品种很罕见。

因此，急需挖掘与抗赤霉病和农艺性状相关的关键基因/位点，解析调控机制，开发相应的分子标记，进行小麦抗赤霉病分子设计育种研究，寻求利用标记辅助选择聚合不同抗性基因培育抗赤霉病品种的有效途径。

发明内容

为了克服上述技术问题，本发明提供了一种快速高效的小麦抗赤霉病分子设计育种方法，分别采用含有抗赤霉病基因Fhb1、抗赤霉病/穗粒数增效位点QFhb/GNS.yaas-Y5-2D和抗赤霉病/粒重增效位点QFhb/GW.yaas-Y5-5A的性状和位点互补的亲本进行杂交或者复交，收获杂交或者复交后杂交种；并结合抗病性和农艺性状的精准鉴定，可以快速有效获得抗性和产量具有明显突破的小麦品种。

本发明提供了一种小麦抗赤霉病分子设计育种方法，所述方法包括以下步骤：

步骤S1，在小麦主栽品种背景下，选择携带抗赤霉病基因Fhb1、抗赤霉病/穗粒数增效位点QFhb/GNS.yaas-Y5-2D和抗赤霉病/粒重增效位点QFhb/GW.yaas-Y5-5A的位点互补的亲本，将选择出的亲本进行杂交或者复交，收获杂交或者复交后杂交种F₁；

步骤S2，种植F₁代杂交种，收获自交种F₂；

步骤S3，在温室种植F₂代进行抗白粉病、抗倒伏和分蘖性的筛选，淘汰自然条件下感病、易倒伏、株高大于80cm或发育不良的单株，收获中选单株种子；

步骤S4，在温室大棚种植F₃世代，进行抗白粉病、抗倒伏和分蘖性的筛选，在扬花期喷赤霉病菌孢子液淘汰平均严重度≥25％、易倒伏、株高大于80cm或发育不良的单株，剩下的按照单株收种子；

进一步地，种植时上一代收的每1单株种子种成1行，行长1.6米，行距0.23米；

步骤S5，在田间种植F₄，种成株行，首先在苗期利用分子标记筛选保留同时携有Fhb1、QFhb/GNS.yaas-Y5-2D和QFhb/GW.yaas-Y5-5A三个位点含杂合阳性的株行，挂牌标记，在扬花期对挂牌株行单花滴注接种赤霉病病原菌保留鉴定结果为“抗”的株行，然后根据育种目标，全面考察中选株行的综合农艺性状和其他抗病性等，选择优良的株行，其中收5～6个性状一致的单株，收获后进行产量鉴定，选择产量水平高于对照的株行种子；

进一步地，种植时上一代收的每1单株种子种成2行，行长1.6米，行距0.23米；

步骤S6，在田间种植F₅，种成株系，首先在苗期利用分子标记筛选保留同时携有Fhb1、QFhb/GNS.yaas-Y5-2D和QFhb/GW.yaas-Y5-5A三个位点纯合的阳性株系，挂牌标记，在扬花期对挂牌株系单花滴注接种赤霉病病原菌保留鉴定结果为“抗”的株系，然后根据育种目标，全面考察中选株系的综合农艺性状和其他抗病性等，选择优良的株系，中选株系混收，收获后进行产量和粒重鉴定，选择产量和粒重均高于对照的株系；

步骤S7，在田间种植F₆，根据育种目标，全面考察小区品系的综合农艺性状和其他抗病性，收获后进行产量鉴定，选择产量水平与对照相比高出5％的小区，进入下一代多点产量鉴定。

在某些实施例中，所述抗赤霉病基因Fhb1的特异性检测引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

在某些实施例中，所述抗赤霉病/穗粒数增效位点QFhb/GNS.yaas-Y5-2D的特异性检测引物序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

在某些实施例中，所述抗赤霉病/粒重增效位点QFhb/GW.yaas-Y5-5A的特异性检测引物序列为SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

在某些实施例中，所述步骤S3和S4中种植F₂代和F₃代进行抗白粉病、抗倒伏和分蘖性的筛选，淘汰感病、易倒伏、株高大于80cm或发育不良的单株具体为：以苏麦3号为感白粉病对照，扬麦18为抗白粉病对照，在温室中单株与单株的间隔处提前正常播种4-6天均匀种植苏麦3号诱发白粉病；分蘖性好坏的判断以扬麦25为对照，淘汰每单株穗数少于扬麦25的单株。

在某些实施例中，所述步骤S5和S6中在扬花期对挂牌株行单花滴注接种赤霉病病原菌保留鉴定结果为“抗”的株行具体为：制备赤霉菌孢子悬浮液4×10⁵～5×10⁵孢子/mL，大田里，在小麦开花期，采用单花滴注法接种，每个株行或者株系随机选择20个穗子，在每穗的中部张开的小花处接种，并做上标记，接种后每天7:00～18:00，每隔2小时对接种穗喷一次水，均匀且充分地喷到小麦穗部，每次喷10分钟，小麦开花20天后立即停止喷水；接种21天后，调查被接种的穗子发病情况，数每穗发病小穗数和总小穗数，赤霉病严重度PSS＝发病小穗数/总小穗数×100％，保留PSS小于25％、与苏麦3号“抗”水平接近的株行或者株系，苏麦3号和安农8455分别作为抗病和感病对照，扬麦25作为中抗对照，扬麦13作为中感对照。

在某些实施例中，所述步骤S4中温室大棚里扬花期进行喷孢子液淘汰PSS大于或者等于25％的单株具体为：自小麦抽穗开始，玻璃温室里面的小麦材料外围罩上塑料膜保温，每天8:00到18:00揭开塑料膜透气。制备赤霉菌孢子悬浮液2×10⁵～3×10⁵孢子/mL，小麦开花期一到，中午12:00到14:00，用喷壶对着每行每个单株上中部的小花均匀喷孢子液，1～2次，直至中部的小花均被喷到，每次接种完，将塑料膜放下保温保湿，创造赤霉病发病条件，增大选择压，15天后，调查被喷过(接种)的穗子发病情况，数每穗发病小穗数和总小穗数，赤霉病严重度PSS＝发病小穗数/总小穗数×100％，淘汰PSS大于或者等于25％的单株，保留PSS小于25％的单株，人工去除每个单株上的病粒后保留剩余的种子。苏麦3号和安农8455分别作为抗病和感病对照，扬麦25作为中抗对照，扬麦13作为中感对照。

在某些实施例中，所述步骤S5、S6和S7中其他抗病性的鉴定具体为：黄花叶病、白粉病和锈病的鉴定采用自然发病鉴定；选择黄花叶病、白粉病和锈病的抗病鉴定结果均呈抗病(R)级的株行挂牌标记。

在某些实施例中，所述步骤S5、S6和S7中黄花叶病、白粉病和锈病的鉴定中还包括种植扬麦16和宁麦13分别为黄花叶病感病(S)和抗病(R)对照；苏麦3号和镇麦9号为白粉病感病(S)和抗病(R)对照；宁麦13和周麦18为锈病感病(S)和抗病(R)对照。

在某些实施例中，所述步骤S5、S6和S7中全面考察中选株行、株系和品系的综合农艺性状具体为：选择株高小于90cm，抗倒性好，单株穗数大于或等于5，每穗粒数大于或等于45，每穗小穗数大于或等于20的株行。

在某些实施例中，所述步骤S5、S6和S7中对照为指扬麦25。

本发明相对于现有技术，具有以下技术效果：

1)本发明首次利用不同于已知抗源例如苏麦3号、望水白等的普通小麦品种扬麦5号为抗赤霉病位点来源，其不携带Fhb1，农艺性状优良，也携有多个优良性状位点，经过研究发现其抗赤霉病位点与产量相关的增效位点存在“一因多效”的关系，可以协同提高抗性和产量，有利于在育种中广泛利用。

2)本发明在小麦品种选育中前期以特定的基因/位点组合品种分别作为亲本杂交，即选择携带抗赤霉病基因Fhb1、抗赤霉病/穗粒数增效位点QFhb/GNS.yaas-Y5-2D和抗赤霉病/粒重增效位点QFhb/GW.yaas-Y5-5A互补的亲本，通过分子标记检测和表型鉴定发现在单独QFhb/GNS.yaas-Y5-2D或者单独QFhb/GW.yaas-Y5-5A或者QFhb/GNS.yaas-Y5-2D+QFhb/GW.yaas-Y5-5A的背景下，Fhb1的加入能够显著加强赤霉病的抗性，接近苏麦3号的抗性水平，又因为QFhb/GNS.yaas-Y5-2D和QFhb/GW.yaas-Y5-5A分别对产量具有正向效应，相对于Fhb1本身对产量的不利效应具有补偿作用，两者同时导入可以克服Fhb1对产量的不利影响。因此，在育种中选择携有Fhb1+QFhb/GNS.yaas-Y5-2D+QFhb/GW.yaas-Y5-5A的增效基因型，既可以使赤霉病抗性显著提高，又可以同时提高产量。这种分子设计的育种方法能够快速及准确有效的选育出既抗赤霉病又高产的小麦品种，相关育种技术可以成为抗赤霉病分子设计育种的典范被推广应用。利用本发明方法选育的小麦品种赤霉病抗性与产量均可取得突破，有望成为新一代主导品种，有利于农民节本增支、环境可持续发展和乡村振兴。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明选育方法的流程图。

图2为实施例2中Fhb1位点紧密连锁分子标记在亲本和后代中的扩增结果示意图，箭头所指为抗赤霉病基因阳性条带。

图3为实施例3中两个标记的定位结果示意图，其中左侧为实施例3中利用RIL群体构建的2D染色体连锁图和QFhb/GNS.yaas-Y5-2D定位结果示意图，右侧为实施例3中利用RIL群体构建的5A染色体连锁图和QFhb/GW.yaas-Y5-5A定位结果示意图。

图4为QFhb/GW.yaas-Y5-2D位点相关扩增检测结果示意图，其中左侧为实施例4和实施例5中QFhb/GW.yaas-Y5-2D位点紧密连锁分子标记在鉴定圃品种(系)中扩增检测结果示意图，右侧为实施例6中利用Q2D-KAS P分子标记辅助筛选阳性中选材料的扩增检测结果示意图。

图5为QFhb/GW.yaas-Y5-5A位点相关扩增检测结果示意图，其中左侧为实施例4和实施例5中QFhb/GW.yaas-Y5-5A位点紧密连锁分子标记在鉴定圃品种(系)中扩增检测结果示意图，右侧为实施例6中利用Q5A-KASP分子标记辅助筛选阳性中选材料的扩增检测结果示意图。

图6为玻璃温室里面小麦材料外围加塑料膜保温保湿情况。

图7为中选和淘汰小麦示意图，其中左侧为大棚接种鉴定中选和淘汰的F₃世代示意图，右侧为大田接种鉴定中选和淘汰的F₄世代示意图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

实施例1一种快速高效的小麦抗赤霉病分子设计育种方法

按照图1所示流程，包括以下步骤，

1)步骤S1，亲本选择：选择小麦鉴定圃中102份全国主栽品种(系)及其衍生品种(系)为对象，用CTAB法提取种子或者苗期叶片DNA，选择携带抗赤霉病基因Fhb1、抗赤霉病/穗粒数增效位点QFhb/GNS.yaas-Y5-2D和抗赤霉病/粒重增效位点QFhb/GW.yaas-Y5-5A的位点互补的品种(系)为亲本，选择出携带抗赤霉病基因Fhb1的扬11G18，携带抗赤霉病/穗粒数增效位点QFhb/GNS.yaas-Y5-2D和抗赤霉病/粒重增效位点QFhb/GW.yaas-Y5-5A的扬麦16。

扬11G18是宁麦13与宁麦12杂交自交后的F₅选系，亲本之一宁麦13是江苏省农科院选育出的高产抗黄花叶病小麦品种，连续多年高产创建示范红麦区单产第一，是长江中下游主导品种之一；扬麦16是江苏里下河地区农科所选育的高产多抗大穗小麦品种，赤霉病、白粉病和锈病等综合抗病性好，2009年～2015年连续七年被农业部列为长江中下游地区农业主导品种，获得中华农业科技一等奖。将选择出的亲本2015年8月在温室种植，12月进行杂交配组，6月收获F₁代杂交种；

2)步骤S2，2016年1月温室种植F₁代杂交种，6月收获自交种F₂；

3)步骤S3，2016年8月在温室种植F₂代，在温室种植F₂代进行抗白粉病、抗倒伏和分蘖性等的筛选，淘汰感病、易倒伏、株高大于80cm和发育不良的单株：以苏麦3号为感白粉病对照，扬麦18为抗白粉病对照，在温室的走道(单株与单株的间隔处)提前正常播种5天左右均匀种植苏麦3号诱发白粉病；分蘖性好坏的判断以扬麦25为对照，每单株穗数少于扬麦25的淘汰。12月收获中选单株种子；

4)步骤S4，2017年1月在温室大棚种植F₃世代，上一世代收的每1单株种1行，自小麦4月初抽穗开始，玻璃温室里面小麦材料外围全部罩上塑料膜保温，每天8:00到18:00揭开塑料膜透气。制备赤霉菌孢子悬浮液2×10⁵～3×10⁵孢子/mL，小麦4月中旬开花期一到，中午12:00到14:00，用喷壶对着每行每个单株中部的小花均匀喷孢子液，1～2次，直至中部的小花均匀被喷到，每次接种完，将塑料膜放下保温保湿，创造赤霉病发病条件，增大选择压，15天后，调查被喷过(接种)的穗子发病情况，数每穗发病小穗数和总小穗数，赤霉病严重度PSS＝发病小穗数/总小穗数×100％，淘汰PSS大于或者等于25％的单株，保留PSS小于25％的单株，人工去除每个单株上的病粒后保留剩余的种子。苏麦3号和安农8455分别作为抗病和感病对照，扬麦25作为中抗对照，扬麦13作为中感对照。在筛选出的单株中淘汰易倒伏、株高大于80cm和发育不良的单株。6月收获最终中选单株；

5)步骤S5，2017年10月在大田种植F₄世代，种成株行，上一代收的每个单株种2行，行长1.6m，行距0.23m，每行40粒，首先在苗期，随机挑选每个株行10个单株的叶片混合，提取DNA，分子标记鉴定保留同时携有Fhb1、QFhb/GNS.yaas-Y5-2D和QFhb/GW.yaas-Y5-5A三个位点阳性(含杂合)的株行，挂牌标记，制备赤霉菌孢子悬浮液4×10⁵～5×10⁵孢子/mL，2019年大田，4月10～13日小麦开花期时，采用单花滴注法接种，每个株行随机选择20个穗子，在每穗的中部张开的小花处接种，并做上标记，接种后每天7:00～18:00，每隔2小时对接种穗喷一次水，均匀喷到小麦穗部，每次喷10分钟，小麦开花20天后立即停止喷水。接种21天后，调查被接种的穗子发病情况，数每穗发病小穗数和总小穗数，赤霉病严重度PSS＝发病小穗数/总小穗数×100％，保留PSS小于25％、抗性水平与苏麦3号接近的达到“抗”的株行，苏麦3号和安农8455分别作为抗病和感病对照，扬麦25作为中抗对照，扬麦13作为中感对照。然后根据育种目标，全面考察中选株行的综合农艺性状和其他抗病性等：黄花叶病、白粉病和锈病(叶锈)的鉴定采用自然发病鉴定，扬麦16和宁麦13分别为黄花叶病感病(S)和抗病(R)对照；苏麦3号和镇麦9号为白粉病感病(S)和抗病(R)对照；宁麦13和周麦18为锈病感病(S)和抗病(R)对照。选择黄花叶病、白粉病和锈病的抗病鉴定结果均呈抗病(R)级的株行考察农艺性状，以扬麦25为基本对照，选择株高小于90cm，抗倒性好，单株穗数大于或等于13，每穗粒数大于或等于45，每穗小穗数大于或等于21的株行挂牌标记。对中选的优良株行，混收5～6个性状一致的单株，6月收获后进行产量鉴定。选择产量水平高于对照品种扬麦25的株行。

6)步骤S6，2018年10月在田间种植F₅，种成株系，6行区，行长2m，行距0.23m，每行40粒，首先在苗期，每株系随机挑选10个单株的叶片混合，提取DNA，分子标记鉴定保留同时携有Fhb1、QFhb/GNS.yaas-Y5-2D和QFhb/GW.yaas-Y5-5A三个位点阳性(纯合)的株系，挂牌标记，制备赤霉菌孢子悬浮液4×10⁵～5×10⁵孢子/mL，2019年4月～5月大田里，在小麦开花期，采用单花滴注法接种，每个株系随机选择20个穗子，在每穗的中部张开的小花处接种，并做上标记，接种后每天7:00～18:00，每隔2小时对接种穗喷一次水，均匀喷到小麦穗部，每次喷10分钟，小麦开花20天后立即停止喷水。接种21天后，调查被接种的穗子发病情况，数每穗发病小穗数和总小穗数，赤霉病严重度PSS＝发病小穗数/总小穗数×100％，保留PSS小于25％的、抗性水平与苏麦3号“抗”水平接近的株系，苏麦3号和安农8455分别作为抗病和感病对照，扬麦25作为中抗对照，扬麦13作为中感对照，有6个株系的平均严重度低于25％。然后根据育种目标，全面考察中选株系的综合农艺性状和其他抗病性等：黄花叶病、白粉病和锈病(叶锈)的鉴定采用自然发病鉴定，扬麦16和宁麦13分别为黄花叶病感病(S)和抗病(R)对照；苏麦3号和镇麦9号为白粉病感病(S)和抗病(R)对照；宁麦13和周麦18为锈病感病(S)和抗病(R)对照。选择黄花叶病、白粉病和锈病(叶锈)的抗病鉴定结果均呈R级的株行考察农艺性状，以扬麦25为基本对照，选择株高低于90cm，抗倒性好，单株穗数大于或等于13，每穗粒数大于或等于45，每穗小穗数大于或等于21的株系挂牌标记。对中选的优良株系，收15个左右性状一致的单株，6月收获后进行产量和粒重鉴定，产量水平全部转化为每亩产量的数值，当年扬麦25的平均产量和粒重分别为529.7kg/亩和40.4g，选择产量和粒重均显著高于对照扬麦25的株系，中选株系有3个，分别为17-11、17-25和17-35，产量分别为549.8kg/亩、540.1kg/亩和557.7kg/亩，粒重分别为44.5g、43.9g和45.2g。这三个系的赤霉病严重度分别为16.68％，9.09％和9.38％，均显著低于25％，与当年苏麦3号的严重度(6.69％)接近。根据发病平均情况转化成平均严重度。抗病调查和鉴定标准按照《中华人民共和国农业行业标准NY/T 2954-2016：小麦区域试验品种抗赤霉病鉴定技术规程》，病小穗率小于25％的即严重度小于2级的视为R级。

步骤S7，2019年10月在田间种植F₆，每个中选株系种成10行区，行长3.2米，行距0.23米，根据育种目标，全面考察小区品系的综合农艺性状和其他抗病性等，黄花叶病、白粉病和锈病的鉴定采用自然发病鉴定，扬麦16和宁麦13分别为黄花叶病感病(S)和抗病(R)对照；苏麦3号和镇麦9号为白粉病感病(S)和抗病(R)对照；宁麦13和周麦18为锈病感病(S)和抗病(R)对照。选择黄花叶病、白粉病和锈病的抗病鉴定结果均呈R级的品系考察农艺性状，以扬麦25为基本对照，选择抗倒性好，单株穗数大于或等于5，每穗粒数大于或等于45，每穗小穗数大于或等于21的品系挂牌标记。2020年6月收获后进行产量鉴定，产量水平全部转化为每亩产量的数值，选择产量水平与对照扬麦25相比高出5％的品系扬17-35，产量达到559.34kg/亩，进入下一年多点产量鉴定。2020年10月在江苏南京、镇江、高邮和湖北荆州、恩施共五地种植，2021年6月主要进行该品系的多点产量鉴定。利用本发明方法选育的抗赤霉病小麦品种(系)，赤霉病抗性稳定达到“抗”的水平，携有多个抗病和产量相关的分子模块，产量比对照显著高，未来这些品种(系)和这个育种技术可逐步推广，减少生产过程中病害防治药剂的使用，保证生产原粮安全卫生，实现小麦生产绿色高效、生态环保。

2020年10月推荐该品系参加多点产量试验，5点表现如表1，扬17-35的5点平均亩产量543.1kg，比对照品种扬麦25平均亩产量511.9kg增幅6.1％，增产点率100％。

表1 2020—2021年长江中下游部分试验点扬17-35产量表现

试验地点	扬17-35产量kg/亩	扬麦25产量kg/亩	增产幅度％
				南京(江苏)	536.1	510.5	5.0
镇江(江苏)	559.9	528.2	6.0
				高邮(江苏)	579.2	540.9	7.1
荆州(湖北)	522.7	490.6	6.5
				恩施(湖北)	517.8	489.2	5.8
平均	543.1	511.9	6.1

可见，通过本发明的方法能够通过抗病、产量相关性状的分子设计和精准表型鉴定，大幅度提高育种效率和性状改良精准性。

实施例2分子标记辅助选择抗赤霉病基因Fhb1方法的建立

采用CTAB法提取实施例1涉及的候选亲本材料、F₄株行叶片和F₅株系混合叶片的基因组DNA，经稀释得到DNA浓度为约30ng/μL的模板溶液，检测小麦的抗赤霉病基因Fhb1的连锁GSM标记。

分子标记检测抗赤霉病基因Fhb1的连锁GSM标记的特异性引物组的序列见表2：

表2抗赤霉病基因Fhb1连锁标记引物序列信息

采用PCR扩增的方法检测抗赤霉病主效基因Fhb1的对应连锁标记TaHRC-GSM，所述PCR扩增的方法为：所述PCR扩增的体系为10μL，包含30ng/μL小麦基因组DNA 1.0μL、10×PCR buffer 1.0μL、10Mm dNTP 0.2μL、10Mm MgCl₂ 1.0μL、5U Taq聚合酶0.2μL、5μM的上游引物0.4μL、5μM的下游引物0.4μL和无菌去离子水5.8μL；所述PCR扩增程序为：(1)94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火20s，68℃延伸2～3.5min；(2)94℃变性20s，57℃退火20s，72℃延伸1min，32个循环；(3)72℃延伸5分钟；4℃保存。

采用TaHRC-GSM引物在1％琼脂糖电泳液中检测实施例1涉及小麦材料，目标基因型与宁麦13相同，为中选材料。附图2为Fhb1位点紧密连锁分子标记在亲本和后代中的扩增结果示意图，箭头所示即为扩增阳性的目标条带。

实施例3挖掘稳定的对小麦抗赤霉病和穗粒数显著增效的位点QFhb/GNS.yaas-Y5-2D和抗赤霉病和粒重显著增效的位点QFhb/GW.yaas-Y5-5A并且验证

以205份来源于“扬麦5号×偃展1号”的重组自交系(F₁₁)为材料，2013年和2014年连续2个生长季将该重组自交系及其亲本种植于江苏里下河地区农业科学研究所万福试验基地赤霉病鉴定圃(江苏扬州)和湖北荆州长江大学赤霉病鉴定基地，试验当年扬州和荆州的小麦播期设为10月20日，试验采用随机区组设计，2行区，2次重复，每行30粒，行长1.5m，行距0.23m。田间施肥及管理参照当地大田栽培生产，及时防治虫草害，制备赤霉菌孢子悬浮液4×10⁵～5×10⁵孢子/mL，2014年和2015年的4月—5月，在小麦开花期，采用单花滴注的方法接种赤霉病，在每穗中部1个小花处接种10μl孢子液，每行随机标记20个穗子，每个家系总共调查40个穗子，21天后，调查被接种穗子发病情况，数每穗发病小穗数和总小穗数，赤霉病严重度PSS＝发病小穗数/总小穗数×100％，最终取2次重复的平均值为该家系平均严重度PSS。

同时以205份来源于“扬麦5号×偃展1号”的重组自交系(F₁₁)为材料，2013年和2014年连续2个生长季将该重组自交系及其亲本种植于江苏里下河地区农业科学研究所万福试验基地产量鉴定圃(江苏扬州)和湖北荆州长江大学产量鉴定基地，试验当年扬州和荆州的小麦播期设为10月20日，试验采用随机区组设计，2行区，2次重复，每行30粒，行长1.5m，行距0.23m。田间施肥及管理参照当地大田栽培生产，及时防治病虫草害，于小麦的灌浆后期-成熟期调查每穗粒数，每家系随机标记10个单株，调查每单株穗数、每单株总粒数，每单株的穗粒数＝每单株总的粒数/每单株穗数，最终取2次重复的平均值为该家系每单株穗粒数(GNS)。待成熟时收获这10个单株，脱粒，去除病粒，大小粒保留，考察3个300粒的重量，取平均值，最后换算成1000粒的重量即为千粒重，最终取2次重复的平均值为该家系平均千粒重(GW)。

采用CTAB法提取基因组DNA，利用小麦Wheat55K芯片获取基因型，利用IciMappingv4.1软件(http://www.isbreeding.net)的SNP和BIN功能过滤和去冗余基因型数据，利用MAP功能初步构建遗传连锁图谱，利用JoinMap v4.0校正遗传图谱，利用MapChart2.3(https://www.wur.nl/en/show/Mapchart.htm)绘制遗传图谱。利用IciMapping v4.1软件的完备区间作图法(Inclusive composite interval mapping，ICIM)检测与PSS、GNS和GW显著相关的QTL，LOD阈值设为3.0。为了与前人结果比较，将连锁标记或者基因序列与中国春参考基因组序列的EnsemblPlants数据库(http://plants.ensembl.org/)进行比对。

能够在2个及以上环境下检测到的位点一般被称为“稳定有效”的QTL。实验获得对小麦抗赤霉病显著增效位点QFhb.yaas-Y5-2D、QFhb.yaas-Y5-5A、穗粒数显著增效的位点QGNS.yaas-Y5-2D和粒重显著增效的位点QGW.yaas-Y5-5A，增效基因均来源于扬麦5号，如表3和4。

表3抗赤霉病QTL的遗传效应及其侧翼标记

表4穗粒数和粒重QTL的遗传效应及其侧翼标记

经过查阅文献和与小麦参考基因组比对发现对小麦抗赤霉病显著增效位点QFhb.yaas-Y5-2D与穗粒数显著增效的位点QGNS.yaas-Y5-2D在相同的遗传和物理区间；对小麦抗赤霉病显著增效位点QFhb.yaas-Y5-5A与粒重显著增效的位点QGW.yaas-Y5-5A在相同的遗传和物理区间，增效基因均来源于扬麦5号。在2D和5A上挖掘到的增效来源一致的与抗赤霉病和产量相关性状均显著相关的QTL是难能可贵的在抗赤霉病育种中可以被有效利用的分子模块，QTL定位结果如附图3。经过与以往研究和中国春2.1公布序列比对，未见类似的性状在相同或者相近物理位置有相关报道，申请人进一步根据连锁图谱的质量、密度和亲本重测序的结果从QTL区间中依据标记特异性初步筛选SNP标记，选择区间中特异性好、与性状相关性最高的SNP标记进行KASP标记转化。如表5、表6所示：

表5 QTL位点的连锁标记侧翼序列信息

表6三个QTL位点的KASP引物序列

小麦育种来说，抗赤霉病、穗粒数多、粒重高是优势等位变异，扬麦5号携有两个1因多效位点的优势等位变异C和A。就2D位点来说，携有优势等位变异C的材料赤霉病抗性和粒重显著高于携有T的材料。就5A位点来说，携有优异等位变异A的材料赤霉病抗性和穗粒数要显著高于携有G的材料。

KASP标记引物工作液的制备：分别取上游引物30μL(100μM)，取下游引物各12μL(100μM)，用无菌超纯水补充至100μL，充分混匀，作为KASP标记的引物工作液，备用。

PCR扩增反应体系：待测小麦DNA模板2.2μL(约30ng/μL)、引物工作液0.06μL、KASPMaster Mix 2.5μL(LGC公司，KBS-1016-002)，用无菌超纯水补充至5μL；

PCR反应程序：(1)95℃预变性10min；(2)95℃变性20s、61–55℃(每个循环下降0.6℃)45s，共10个循环；(3)95℃变性20s、55℃复性45s，34个循环；20℃保存。实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC)，每个板设置1个或多个空白对照。

取小麦幼苗，采用CTAB法提取待测小麦基因组DNA。

以待测小麦基因组DNA为模板，采用如上KASP引物组、PCR试剂进行PCR扩增，获得PCR扩增产物。PCR反应在ABI Veriti 384 PCR仪(Thermo Fisher)上进行，用Omega F SNP分型检测仪(LGC Genomics Ltd，KBS-0024-002)对PCR扩增产物进行扫描读取荧光值。FAM激发波长为485nm，发射波长为520nm；VIC激发波长为535nm，发射波长为556nm，系统参比荧光ROX激发波长为575nm，发射波长为610nm。采用Kluster CallerTM(KBioscience)进行基因分型，根据分析结果确定QSN-Y5位点的基因型。将部分“扬麦5号×偃展1号的重组自交系”连同两个亲本按照如上方法进行扩增，扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在分型结果荧光信号坐标系中靠近X轴的位置(蓝色)，与扬麦5号相同，即证明这些小麦在KASP标记侧翼核苷酸序列(如SEQ ID NO.3和4)的第36位碱基(SNP位点)的基因型分别为C和A；而扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在坐标系中靠近Y轴的位置(红色)，与扬麦5号分型不同，则证明这些家系在该SNP位点的基因型分别为T和G。205个家系连同两个亲本的KASP检测结果、2014年和2015年扬州和荆州大田试验中测定赤霉病严重度性状的平均结果和抗赤霉病QTL不同等位变异组合的T测验结果如表7、8和9所示。

表7扬麦5号/偃展1号群体的抗赤霉病QTL的KASP标记检测结果和平均严重度(PSS％)

注：Q2D代表QFhb.yaas-Y5-2D，Q5A代表QFhb.yaas-Y5-5A。

表8携带两个抗赤霉病QTL不同基因型的RIL家系赤霉病平均值与SNP等位变异的T测验结果

表9携带两个抗赤霉病QTL不同基因型组合的RIL家系赤霉病平均值与SNP等位变异的T测验结果

注：Q2D代表QFhb.yaas-Y5-2D，Q5A代表QFhb.yaas-Y5-5A；

就2D位点来说，携有与扬麦5号相同的基因型C是优势等位变异。就5A位点来说，携有与扬麦5号相同的基因型A是优势等位变异。

由表7可见，2D位点上，含有等位基因T的小麦赤霉病严重度平均值总体上显著高于含有等位基因C的小麦，表8所示利用Excel 2019的双样本T测验205个RIL家系的基因型和表型，结果表明：90个家系与扬麦5号基因型相同为C，115个家系与偃展1号基因型相同为T，205个家系中基因型为C的家系比基因型为T的家系赤霉病严重度平均值降低34.39％，在p<0.01水平上有显著差异，说明QFhb.yaas-Y5-2D的KASP标记Q2D-KASP的引物组及基因型检测体系可以应用于小麦抗赤霉病分子标记辅助育种中。表7和表8显示材料分型结果良好，说明KASP标记开发成功，可进一步用于育种材料检测和筛选。

由表7可见，5A位点上，含有等位基因C的小麦赤霉病严重度平均值总体上显著高于含有等位基因A的小麦，表8所示利用Excel 2019的双样本T测验205个RIL家系的基因型和表型，结果表明：94个家系与扬麦5号基因型相同为A，111个家系与偃展1号基因型相同为G，205个家系中基因型为A的家系比基因型为G的家系赤霉病严重度平均值降低22.96％，在p<0.01水平上有显著差异，说明QFhb.yaas-Y5-5A的KASP标记Q5A-K ASP的引物组及基因型检测体系可以应用于小麦抗赤霉病分子标记辅助育种中。表7和表8显示材料分型结果良好，说明KASP标记开发成功，可进一步用于育种材料检测和筛选。

小麦抗赤霉病是典型的数量性状，这一性状由多基因控制，本研究定位到的2个抗赤霉病QTL位点还分别位于不同的染色体上，有利于我们进一步研究，因此我们还分析了QFhb.yaas-Y5-2D和QFhb.yaas-Y5-5A位点在排除彼此的情况下发挥的效应和聚合在一起能够发挥的效应，如表9，在205个RIL家系中，当2D和5A上均不携有与扬麦5号相同的优势等位变异时，即T和G的等位变异，家系的赤霉病平均严重度是50.24％，当2D的基因型是和扬麦5号相同的优势等位变异C，5A的基因型是和扬麦5号不同的等位变异G时，家系的平均严重度是32.97％，比T+G的组合降低34.38％，在p<0.01水平上有显著差异；当2D的基因型是和扬麦5号不同的等位变异T，5A的基因型是和扬麦5号相同的优势等位变异A时，家系的平均严重度是38.80％，比T+G的组合降低22.77％；在p<0.01水平上有显著差异，当2D的基因型是和扬麦5号相同的优势等位变异C，5A的基因型是和扬麦5号相同的优势等位变异A时，家系的平均严重度是25.69％，比比T+G的组合降低最多，达到48.87％，在p<0.01水平上有显著差异。因此说明聚合QFhb.yaas-Y5-2D和QFhb.yaas-Y5-5A位点抗赤霉病优势等位变异可以比单独利用其中1个位点的优势等位变异显著加强赤霉病抗性。

同时，对205个家系连同两个亲本的KASP检测结果、2014年和2015年扬州和荆州大田试验中测定穗粒数和粒重性状的平均结果和相关QTL不同等位变异组合的T测验结果如表10和11所示。

表10扬麦5号/偃展1号群体的穗粒数增效位点和粒重增效位点的KASP标记检测结果和性状平均值

注：Q2D代表QGNS.yaas-Y5-2D，Q5A代表QGW.yaas-Y5-5A。

表11携带穗粒数增效位点和粒重增效位点不同基因型的RIL家系性状平均值与SNP等位变异的T测验结果

就2D位点来说，携有与扬麦5号相同的基因型C是优势等位变异，对穗粒数具有增效作用。就5A位点来说，携有与扬麦5号相同的基因型A是优势等位变异，对粒重具有增效作用。由表10可见，2D位点上，含有等位基因C的小麦穗粒数平均值总体上显著高于含有等位基因T的小麦，表11所示利用Excel 2019的双样本T测验205个RIL家系的基因型和表型平均值，结果表明：90个家系与扬麦5号基因型相同为C，115个家系与偃展1号基因型相同为T，205个家系中基因型为C的家系比基因型为T的家系穗粒数平均值提高8.14％，在p<0.01水平上有显著差异，说明QGN S.yaas-Y5-2D的KASP标记Q2D-KASP的引物组及基因型检测体系可以应用于小麦穗粒数的分子标记辅助育种中。表10和表11显示材料分型结果良好，说明KASP标记开发成功，可进一步用于育种材料检测和筛选。

同理，由表10可见，5A位点上，含有等位基因A的小麦粒重平均值总体上显著高于含有等位基因C的小麦，表11所示利用Excel 2019的双样本T测验205个RIL家系的基因型和表型平均值，结果表明：94个家系与扬麦5号基因型相同为A，111个家系与偃展1号基因型相同为G，基因型为A的家系比基因型为G的家系粒重平均值提高4.99％，在p<0.01水平上有显著差异，说明QGW.yaas-Y5-2D的KASP标记Q2D-KASP的引物组及基因型检测体系可以应用于小麦粒重的分子标记辅助育种中。表10和表11显示材料分型结果良好，说明KASP标记开发成功，可进一步用于育种材料检测和筛选。

实施例4抗赤霉病位点的KASP引物组育种应用

田间试验：本实施例以于2014年种植于湾头实验基地鉴定圃的小麦品种(系)共110份为材料，试验当年扬州的小麦播期设为10月20日，试验采用随机区组设计，3行区，2次重复，每行40粒，行长1.5m，行距0.23m。田间施肥及管理参照当地大田栽培生产，及时防治虫草害。2015年，制备赤霉菌孢子悬浮液4×10⁵～5×10⁵孢子/mL，4月中旬，在小麦开花期，采用单花滴注的方法接种赤霉病，在每穗中部1个小花处接种10μl孢子液，每行随机标记20个穗子，每个家系总共调查40个穗子，21天后，调查被接种穗子发病情况，数每穗发病小穗数和总小穗数，赤霉病严重度PSS＝发病小穗数/总小穗数×100％，最终取2次重复的平均值为该家系平均严重度PSS。利用实施例3获得的KASP引物组对上述110份材料进行基因分型。扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在分型结果荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集与扬麦5号相同，即证明这些小麦品系在分子标记Q2D-KASP和Q5A-KASP的基因型为C和A；若小麦品系的扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集与扬麦5号分型不同，则证明这些小麦品系在该SNP位点的基因型为T和G(表12)。

表12 110份品种(系)的赤霉病严重度平均值和基因型检测结果

注：Q2D代表QFhb.yaas-Y5-2D，Q5A代表QFhb.yaas-Y5-5A。

表13携带不同基因型的品种(系)的赤霉病严重度平均值T测验结果

注：Q2D代表QFhb.yaas-Y5-2D，Q5A代表QFhb.yaas-Y5-5A。

因此我们还分析了QFhb.yaas-Y5-2D和QFhb.yaas-Y5-5A位点在排除彼此的情况下发挥的效应和聚合在一起能够发挥的效应，如表12和表13所示，在110个鉴定圃品种(系)中，当2D和5A上均不携有与扬麦5号相同的优势等位变异时，即携有与偃展1号相同的等位变异T和G时，家系的赤霉病平均严重度是44.48％，当2D上携有与扬麦5号相同的优势等位变异C，5A上携有与偃展1号相同的等位变异G时，家系的平均严重度是29.25％，比T+G的组合降低34.25％，在p<0.01水平上有显著差异；当2D上携有与偃展1号相同的等位变异T，5A上携有与扬麦5号相同的优势等位变异A时，家系的平均严重度是31.94％，比T+G的组合降低28.20％，在p<0.01水平上有显著差异；当2D和5A上分别携有与扬麦5号相同的优势等位变异C和A时，即同时聚合了两个抗赤霉病增效位点的基因型时，家系的平均严重度是23.98％，比T+G的组合降低最多，达到46.09％，在p<0.01水平上有显著差异，比C+G和T+A的组合也分别降低18.02％和24.92％，在p<0.01水平上也有显著差异。因此说明我们在育种中如果同时聚合QFhb.yaas-Y5-2D和QFhb.yaas-Y5-5A位点抗赤霉病优势等位变异可以比单独利用其中1个位点的优势等位变异显著加强赤霉病抗性。说明上述KASP标记引物组及基因型检测体系可以应用于小麦抗赤霉病的分子标记辅助选择育种中。

实施例5穗粒数和粒重位点的KASP引物组育种应用

田间试验：本实施例以于2014年种植于湾头实验基地鉴定圃的小麦品种(系)共110份为材料，试验当年扬州的小麦播期设为10月20日，单独种植在产量鉴定圃中，试验采用随机区组设计，3行区，2次重复，每行40粒，行长1.5m，行距0.23m。田间施肥及管理参照当地大田栽培生产，及时防治病虫草害。于小麦的灌浆后期-成熟期调查每穗粒数，每家系随机标记10个单株，调查每单株穗数、每单株总粒数，每单株的穗粒数＝每单株总的粒数/每单株穗数，最终取2次重复的平均值为该家系每单株穗粒数(GNS)。待成熟时收获这10个单株，脱粒，去除病粒，大小粒保留，考察3个300粒的重量，取平均值，最后换算成1000粒的重量即为千粒重，最终取2次重复的平均值为该家系平均千粒重(GW)。

表14 110份品种(系)的穗粒数和粒重平均值和基因型检测结果

注：Q2D代表QGNS.yaas-Y5-2D，Q5A代表QGW.yaas-Y5-5A。

表15携带不同基因型的品种(系)的穗粒数和粒重平均值T测验结果

就2D位点来说，携有与扬麦5号相同的基因型C是优势等位变异，对穗粒数具有增效作用。就5A位点来说，携有与扬麦5号相同的基因型A是优势等位变异，对粒重具有增效作用。

由表14可见，2D位点上，含有等位基因C的小麦穗粒数平均值总体上显著高于含有等位基因T的小麦，表15所示利用Excel 2019的双样本T测验110个品种(系)的基因型和表型平均值，结果表明：79个品种(系)与扬麦5号基因型相同为C，31个品种(系)与偃展1号基因型相同为T，110个品种(系)中基因型为C的品种(系)比基因型为T的品种(系)穗粒数平均值提高7.88％，在p<0.01水平上有显著差异，说明QGNS.yaas-Y5-2D的KASP标记Q2D-KASP的引物组及基因型检测体系可以应用于小麦穗粒数的分子标记辅助育种中。

同理，由表14可见，5A位点上，含有等位基因A的小麦粒重平均值总体上显著高于含有等位基因C的小麦，表11所示利用Excel 2019的双样本T测验110个品种(系)的基因型和表型平均值，结果表明：69个品种(系)与扬麦5号基因型相同为A，41个品种(系)与偃展1号基因型相同为G，110个品种(系)中基因型为A的品种(系)比基因型为C的品种(系)粒重平均值提高3.69％，在p<0.01水平上有显著差异，说明QGW.yaas-Y5-2D的KASP标记Q5A-KASP的引物组及基因型检测体系可以应用于小麦粒重的分子标记辅助育种中。

KASP检测结果见附图4，如图中左侧图显示，Q2D位点的扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在分型结果荧光信号坐标系中靠近X轴的位置(蓝色)，与扬麦5号相同，即证明这些材料在分子标记Q2D-KASP的扩增的基因型为C；而扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在坐标系中靠近Y轴的位置(红色)，与扬麦5号分型不同，则证明这些材料在分子标记Q2D-KASP的扩增的基因型为T。如图中右侧图显示，Q5A位点的扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在分型结果荧光信号坐标系中靠近X轴的位置(蓝色)，与扬麦5号相同，即证明这些材料在分子标记Q5A-KASP的扩增的基因型为A；而扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在坐标系中靠近Y轴的位置(红色)，与扬麦5号分型不同，则证明这些材料在分子标记Q5A-KASP的扩增的基因型为G。

实施例6分子标记辅助选择QFhb/GNS.yaas-Y5-2D和QFhb/GW.yaas-Y5-5A位点方法的建立

用分子标记Q2D-KASP和Q5A-KASP的引物组检测实施例1中亲本、F₄株行混合叶片、F₅株系混合叶片材料是否携带性状的优势等位变异。

1、以提取的亲本基因组DNA为模板，采用实施例3所述用于检测小麦的抗赤霉病/穗粒数增效位点的连锁KASP标记Q2D-KASP引物组和抗赤霉病/粒重增效位点的连锁KASP标记Q5A-KASP引物组进行PCR扩增，得到扩增产物，确定这两个位点与扬麦5号基因型相同的目标材料携有对赤霉病抗性和穗粒数、赤霉病抗性和粒重分别具有增效作用的优势等未变异。

2、采用CTAB法提取亲本、F₄株行混合叶片、F₅株系混合叶片的基因组DNA，经稀释得到DNA浓度为约30ng/μL的模板溶液。

将实施例1中步骤1)，4)，5)和6)中的材料连同两个亲本按照如上方法进行扩增。结果如图5所示，其中如左侧图显示，对QFhb/GNS.yaa s-Y5-2D位点扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在分型结果荧光信号坐标系中靠近X轴的位置(蓝色)，与扬麦5号相同，即证明这些小麦在分子标记Q2D-KASP侧翼核苷酸序列(如SEQ ID NO.3)的第36位碱基(SNP位点)的基因型为C，是中选材料；而扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析聚集在坐标系中靠近Y轴的位置(红色)，与扬麦5号分型不同，则证明这些小麦在该SNP位点的基因型为T，要淘汰这种材料。如右侧图显示，对QFhb/GW.yaas-Y5-5A位点扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在分型结果荧光信号坐标系中靠近X轴的位置(蓝色)，与扬麦5号相同，即证明这些小麦在分子标记Q5A-KASP侧翼核苷酸序列(如SEQ ID NO.3)的第36位碱基(SNP位点)的基因型为A，是中选材料；而扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在坐标系中靠近Y轴的位置(红色)，与扬麦5号分型不同，则证明这些小麦在该SNP位点的基因型为G，要淘汰这种材料。

实施例7F₅世代的分子标记辅助筛选

我们分析了F₅世代15个株系的基因型、平均赤霉病严重度和产量相关性状的情况，产量采用换算成每亩产量的数值。

表16 15个的株系的赤霉病、产量和基因型检测结果一览表

注：Q2D代表QFhb/GNS.yaas-Y5-2D，Q5A代表QFhb/GW.yaas-Y5-5A；“+”表示携有该位点的优势等位变异，即对赤霉病抗性(Fhb1、Q2D、Q5A)和产量相关性状(Q2D、Q5A)具有增效作用的基因型，“-”表示不携有该位点的优势等位变异。表中“产量”是转化为每亩产量的数值。

表17不同QTL/基因组合的平均赤霉病严重度和产量的统计学分析结果

注：Q2D代表QFhb/GNS.yaas-Y5-2D，Q5A代表QFhb/GW.yaas-Y5-5A；表中数字后面不同字母代表具有显著性差异，p<0.05

如表16和表17所示，由于我们在F₄世代的分子标记辅助选择过程中，保留基因型检测结果为阳性(含杂合)的材料，因此，在F₅世代中，存在7种QTL/基因的组合，其中携有3个QTL/基因的材料占多数，有5个。从赤霉病接种鉴定结果和产量水平来看，赤霉病平均严重度最低的是组合Fhb1+Q2D+Q5A，显著低于最终我们确定的筛选标准(25％)，组合Fhb1+Q2D的扬17-18、扬17-23和组合Fhb1+Q5A的扬17-06的平均赤霉病严重度也能低于25％，但是他们的产量均低于对照品种扬麦25；单纯携有Fhb1的产量水平和单纯携有Q2D和Q5A的株系的产量水平与对照相比都有所降低，其中单纯携有Fhb1的产量水平最低；同时携有Q2D和Q5A的株系和同时携有3个位点的株系的产量水平比对照品种均显著提高，但是同时携有Q2D和Q5A的株系的赤霉病严重度大于25％，并且高于对照品种扬麦25，要被淘汰。

为了进一步明确Fhb1和Q2D、Q5A对赤霉病抗性、产量的影响，我们对另三个组合扬麦23/扬12-22，扬麦16/扬12-22和扬麦17/扬12-22的F₅世代进行了三个位点的分子标记检测和赤霉病抗性、产量的鉴定，产量采用换算成每亩产量的数值。扬12-22是扬麦18和郑麦9023杂交自交后的F₅选系，郑麦9023是河南省农科院育成的高产优质抗病小麦品种，在长江中下游乃至全国大面积种植，经分子标记检测，扬麦23、扬麦16和扬麦17均携有Q2D和Q5A位点，均不携有Fhb1，扬12-22携有Fhb1。

表18三个组合的赤霉病、产量和基因型检测结果一览表

注：Q2D代表QFhb/GNS.yaas-Y5-2D，Q5A代表QFhb/GW.yaas-Y5-5A；“+”表示携有该位点的优势等位变异，即对赤霉病抗性(Fhb1、Q2D、Q5A)和产量相关性状(Q2D、Q5A)具有增效作用的基因型，“-”表示不携有该位点的优势等位变异。表中“产量”是转化为每亩产量的数值。

表19三个组合不同QTL/基因组合的平均赤霉病严重度和产量的统计学分析结果

注：Q2D代表QFhb/GNS.yaas-Y5-2D，Q5A代表QFhb/GW.yaas-Y5-5A；表中数字后面不同字母代表具有显著性差异，p<0.05

如表18和表19所示，从赤霉病接种鉴定结果来看，携有Q2D+Q5A组合的株系赤霉病严重度显著低于单纯携有Q2D或者Q5A的株系，说明Q2D+Q5A的组合是可以显著提高赤霉病抗性的。赤霉病平均严重度最低的组合是Fhb1+Q2D+Q5A，显著低于25％，进一步证实在Q2D+Q5A背景下导入Fhb1可以显著加强赤霉病抗性。综合分析产量和赤霉病抗性水平，组合Fhb1+Q2D和组合Fhb1+Q5A的平均赤霉病严重度与25％接近，但是他们的产量均低于对照品种(扬麦25)和单独携带Q2D或者Q5A的株系；单纯携有Fhb1株系的产量水平和单纯携有Q2D或者Q5A的株系的产量水平与对照相比都有所降低，其中单纯携有Fhb1的产量水平最低，减产幅度最大，与本试验实施例1和7的扬麦16/扬11G18组合的结果一致，说明Fhb1本身对产量具有不利的影响，仅依靠单独导入Q2D或者Q5A还不能克服这种不利影响；在Fhb1基础上，同时导入Q2D和Q5A既可以提高赤霉病抗性水平，又可以克服Fhb1本身对产量的不利效应。

综上，说明在Q2D或者Q5A单独存在或者Q2D+Q5A的背景下，Fhb1的加入的确能够显著加强赤霉病的抗性，又因为Q2D和Q5A分别对产量具有正向效应，且相互独立，相对于Fhb1对产量的不良效应具有补偿作用，两者同时导入可以克服Fhb1对产量的不利影响，因此，在育种中选择携有Fhb1+Q2D+Q5A的增效基因型，既可以使赤霉病抗性显著提高，又可以同时提高产量。最终，我们在下一代的产量鉴定圃里选择出扬17-35这个比对照稳定增产5％以上，赤霉病抗性接近苏麦3号的品系参加多点试验。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏里下河地区农业科学研究所

<120> 一种快速高效的小麦抗赤霉病分子设计育种方法

<130> 2021

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

attcctacta gccgcctggt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 2

actggggcaa gcaaacattg 20

<210> 3

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (36)..(36)

<223> R为[C/T]

<400> 3

tcgattattc taagaaaatg aagcggtagt ttgatrgatt ggctgcgcac gttcagtttc 60

tccagaaaac c 71

<210> 4

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (36)..(36)

<223> R为[A/G]

<400> 4

aagcgagttt gtcggacagg gccgcaacag tattgrcctt cccagaagtg ttccaagctt 60

cagtgaccac a 71

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 5

gaaggtgacc aagttcatgc tagaaaatga agcggtagtt tgatc 45

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 6

gaaggtcgga gtcaacggat tagaaaatga agcggtagtt tgatt 45

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 7

gagaaactga acgtgcgcag 20

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 8

gaaggtgacc aagttcatgc tagggccgca acagtattga 40

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 9

gaaggtcgga gtcaacggat tagggccgca acagtattgg 40

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 10

gggagcggga tccaagttc 19

Claims (10)

1.一种小麦抗赤霉病分子设计育种方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤S1，在小麦主栽品种背景下，选择携带抗赤霉病基因Fhb1、抗赤霉病/穗粒数增效位点QFhb/GNS.yaas-Y5-2D和抗赤霉病/粒重增效位点QFhb/GW.yaas-Y5-5A的位点互补的亲本，将选择出的亲本进行杂交或者复交，收获杂交或者复交后杂交种F₁；

步骤S2，种植F₁代杂交种，收获自交种F₂；

步骤S3，在温室种植F₂代进行抗白粉病、抗倒伏和分蘖性的筛选，淘汰自然条件下感病、易倒伏、株高大于80cm或发育不良的单株，收获中选单株种子；

步骤S4，在温室大棚种植F₃世代，进行抗白粉病、抗倒伏和分蘖性的筛选，在扬花期喷赤霉病菌孢子液淘汰平均严重度≥25％、易倒伏、株高大于80cm或发育不良的单株，剩下的按照单株收种子；

步骤S5，在田间种植F₄，种成株行，首先在苗期利用分子标记筛选保留同时携有Fhb1、QFhb/GNS.yaas-Y5-2D和QFhb/GW.yaas-Y5-5A三个位点含杂合阳性的株行，挂牌标记，在扬花期对挂牌株行单花滴注接种赤霉病病原菌保留鉴定结果为“抗”的株行，然后根据育种目标，全面考察中选株行的综合农艺性状和其他抗病性等，选择优良的株行，其中收5～6个性状一致的单株，收获后进行产量鉴定，选择产量水平高于对照的株行种子；

步骤S6，在田间种植F₅，种成株系，首先在苗期利用分子标记筛选保留同时携有Fhb1、QFhb/GNS.yaas-Y5-2D和QFhb/GW.yaas-Y5-5A三个位点纯合的阳性株系，挂牌标记，在扬花期对挂牌株系单花滴注接种赤霉病病原菌保留鉴定结果为“抗”的株系，然后根据育种目标，全面考察中选株系的综合农艺性状和其他抗病性等，选择优良的株系，中选株系混收，收获后进行产量和粒重鉴定，选择产量和粒重水平均高于对照的株系；

步骤S7，在田间种植F₆，根据育种目标，全面考察小区品系的综合农艺性状和其他抗病性，收获后进行产量鉴定，选择产量水平与对照相比高出5％的小区，进入下一代多点产量鉴定。

2.根据权利要求1所述的小麦抗赤霉病分子设计育种方法，其特征在于，所述抗赤霉病基因Fhb1的特异性检测引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的小麦抗赤霉病分子设计育种方法，其特征在于，所述抗赤霉病/穗粒数增效位点QFhb/GNS.yaas-Y5-2D的特异性检测引物序列为SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7所示。

4.根据权利要求1所述的小麦抗赤霉病分子设计育种方法，其特征在于，所述抗赤霉病/粒重增效位点QFhb/GW.yaas-Y5-5A的特异性检测引物序列为SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10所示。

5.根据权利要求1所述的小麦抗赤霉病分子设计育种方法，其特征在于，所述步骤S3和S4中种植F₂代和F₃代进行抗白粉病、抗倒伏和分蘖性的筛选，淘汰感病、易倒伏、株高大于80cm或发育不良的单株具体为：以苏麦3号为感白粉病对照，扬麦18为抗白粉病对照，在温室中单株与单株的间隔处提前正常播种4-6天均匀种植苏麦3号诱发白粉病；分蘖性好坏的判断以扬麦25为对照，淘汰每单株穗数少于扬麦25的单株。

6.根据权利要求1所述的小麦抗赤霉病分子设计育种方法，其特征在于，所述步骤S5和S6中在扬花期对挂牌株行单花滴注接种赤霉病病原菌保留鉴定结果为“抗”的株行具体为：制备赤霉菌孢子悬浮液4×10⁵～5×10⁵孢子/mL，大田里，在小麦开花期，采用单花滴注法接种，每个株行或者株系随机选择20个穗子，在每穗的中部张开的小花处接种，并做上标记，接种后每天7:00～18:00，每隔2小时对接种穗喷一次水，均匀且充分地喷到小麦穗部，每次喷10分钟，小麦开花20天后立即停止喷水；接种21天后，调查被接种的穗子发病情况，数每穗发病小穗数和总小穗数，赤霉病严重度PSS＝发病小穗数/总小穗数×100％，保留PS S小于25％、与苏麦3号“抗”水平接近的株行或者株系，苏麦3号和安农8455分别作为抗病和感病对照，扬麦25作为中抗对照，扬麦13作为中感对照。

7.根据权利要求1所述的小麦抗赤霉病分子设计育种方法，其特征在于，所述步骤S5、S6和S7中其他抗病性的鉴定具体为：黄花叶病、白粉病和锈病的鉴定采用自然发病鉴定；选择黄花叶病、白粉病和锈病的抗病鉴定结果均呈抗病(R)级的株行挂牌标记。

8.根据权利要求7所述的小麦抗赤霉病分子设计育种方法，其特征在于，所述步骤S5、S6和S7中黄花叶病、白粉病和锈病的鉴定中还包括种植扬麦16和宁麦13分别为黄花叶病感病(S)和抗病(R)对照；苏麦3号和镇麦9号为白粉病感病(S)和抗病(R)对照；宁麦13和周麦18为锈病感病(S)和抗病(R)对照。

9.根据权利要求7所述的小麦抗赤霉病分子设计育种方法，其特征在于，所述步骤S5、S6和S7中全面考察中选株行、株系和品系的综合农艺性状具体为：选择株高小于90cm，抗倒性好，单株穗数大于或等于5，每穗粒数大于或等于45，每穗小穗数大于或等于20的株行。

10.根据权利要求1所述的小麦抗赤霉病分子设计育种方法，其特征在于，所述步骤S5、S6和S7中对照为指扬麦25。

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