CN102766627A - 一种与油菜含油量性状紧密连锁的分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与油菜含油量性状紧密连锁的分子标记及应用，一种与油菜含油量性状紧密连锁的分子标记BrSF34-123，筛选步骤为：1）甘蓝型油菜品种zy036和51070杂交获得DH代分离群体；2）设计引物对亲本进行多态性筛选，构建遗传连锁图谱；3）通过对DH分离群体进行田间实验和考种获得含油量的表型数据；4）结合开发的高密度分子标记遗传连锁图谱，以及分离群体的基因型和含油量表型数据进行QTL检测，获得一种与油菜含油量性状紧密连锁的分子标记。因此利用该标记进行辅助选择，可以快速筛选高含油量株系用于油菜含油量育种，育种选择目标明确，节约成本。

Description

一种与油菜含油量性状紧密连锁的分子标记及应用

技术领域

本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域。更具体涉及一种与油菜含油量性状紧密连锁的分子标记，同时还涉及分子标记在油菜含油量育种中的应用。

背景技术

油菜是最重要的油料和可再生能源作物之一，其脂肪酸碳链长度和结构接近化石柴油，是一种适宜于生产生物柴油的植物油。在当前和今后相当长的时间内，全世界都将面临食用植物油和化石能源短缺的严峻局面，因此大幅度增加菜籽油供应总量，是保障全球食物和能源安全的重大需求。作为世界四大油料作物之一，油菜生产对保障我国食用植物油脂和饲用蛋白质的有效供给，对改善食物结构，促进养殖业和加工业发展等诸方面均有重要影响。虽然我国油菜种植面积和产量均居世界第一，但远不能满足国内的消费需求，63%左右的食用植物油依赖进口。尽管油料市场需求如此，农民种植油菜的积极性却不高。造成这种局面的主要原因之一是我国的油菜籽比主要出口国加拿大生产的油菜籽含油量5个百分点左右，且成本高，市场竞争力相对较弱。因此，从保障食物油供给安全和增加农民收入的角度考虑，较大幅度增加单位面积菜籽油的产出量是解决目前状况的对策之一。

我国油菜研究和育种工作具有较深厚的基础,一些领域处于世界领先地位。油菜高油分育种的途径主要有多世代的单株选择、种间杂交、黄籽油菜育种和诱变选育。近年来，随着基因组学研究取得一系列突破，以分子标记选择、转基因和品种分子设计为代表的分子育种技术的成功应用，大大提高了作物遗传育种水平。与常规育种相比，该技术可以通过分析与目标性状基因紧密连锁的分子标记判断目的基因的存在与否，并进行精细定位。同时，利用分子标记进行辅助选择育种，减少了盲目性，缩短育种年限，大大提高了选择效率。分子标记辅助选择育种技术的关键是与重要农艺性状紧密连锁的DNA分子标记的鉴定。美国、日本、西欧各国等国家近年都投入巨资开展这方面的工作。伴随着水稻，小麦、玉米、棉花、大豆等重要作物的一些农艺性状的分子标记的开发，利用鉴定到的分子标记进行辅助选择育种主要包括种质资源的鉴定、基因定位、基因累加或聚合、异源目的基因的筛选和鉴定以及遗传图谱的构建等，育种目标包括抗病、抗虫、抗旱、高产、品质改良等各个方面。随着生物技术的发展，油菜分子标记的研究日渐受到关注，研究的领域涉及遗传图谱的构建、基因标记和基因定位、亲缘关系分析、品种纯度鉴定、标记辅助选择等多方面，并取得了重要进展。但与发达国家相比，我国的油菜分子育种研究工作还有较大差距，主要体现在：不能有效地发掘和利用种质资源中的有利基因，缺乏有自主知识产权及育种价值的基因和标记等。

目前常用的分子标记技术大致可分为两种，一种是基于southern杂交技术，另一种则以PCR技术为核心。Grodzicker等（1974）创立了限制性片段长度多态性(RFLP)标记技术。Botstein等(1980)首先提出用限制性片段长度多态性(RFLP)作为遗传标记构建遗传图谱的设想,从而开创了利用分子标记作为遗传标记的新时期。随后几十种基于分子杂交（如RFLP和微阵列技术等）或PCR（如SSR、IFLP、SNP和InDel等）的DNA分子标记技术陆续建立，大大提高了人们对基因组多样性、遗传作图等的研究效率，并广泛的应用于植物科学的研究中。

大多数重要的农艺性状均表现数量性状的遗传特点，如产量性状、成熟期、品质、抗旱性等。数量性状易受环境条件的影响，因此选择效果不好。传统育种方法周期长，主要是由数量性状造成的。由于分子标记技术和数量遗传学的发展，人们已可将复杂的数量性状分解为单个的数量性状基因位点（QTL），然后像研究质量性状一样对控制数量性状的多个基因进行研究。QTL是在遗传分离群体的基础上，借助分子标记和遗传图谱，利用QTL作图软件对分离群体的数量性状表型数据进行分析，从而确定数量性状基因在染色体上的位置和效应。目前对油菜种子含油量的QTL定位研究也有一些报道，通常检测出的QTL数目较多，但效应值较小且重复性不好，较难在油菜育种中应用。本研究通过遗传分析及QTL定位，旨在筛选对种子含油量具有正向效应的QTL，找到QTL区间内与油菜含油量性状紧密连锁的分子标记，同时将分子标记用于油菜含油量育种中。

发明内容

本发明目的是在于提供了一种与油菜含油量性状紧密连锁的分子标记，该分子标记不仅有助于辅助筛选含油量材料，同时也为今后主效QTL的精细定位及克隆奠定基础，对今后zy036及其衍生品系的含油量性状育种提供了极大的便利。

本发明的另一个目的在于一种油菜含油量性状的主效基因位点的分子标记的引物，通过该引物扩增得到的分子标记，此分子标记所在的含油量的QTL的贡献率为21.75%-22.91%，加性效应为1.23-2.05。

本发明还有一个目的在于提供了一种与油菜含油量性状紧密连锁的分子标记在油菜高含油量性状育种中的应用。通过此与油菜含油量性状紧密连锁的分子标记，可以在苗期预测含油量的高低并进行淘汰，进而可以快速筛选高含油量株系用于油菜含油量育种，辅助育种选择目标明确，节约成本。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种与油菜含油量性状紧密连锁的分子标记，其筛选步骤是：

a)利用在含油量上有极显著差异的油菜品种zy036（50%）和51070（36%）进行杂交，在杂种F1代利用小孢子技术产生加倍单倍体（DH）代分离群体；

b)采用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB法）提取亲本zy036和51070及DH代分离群体的叶片总DNA，过程中所用到的试剂包括提取液（1.4M NaCl，100mM Tris,pH 8.0，20mM EDTA,pH 8.0，2%CTAB）、苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）、氯仿：异戊醇（24：1）、无水乙醇、75%乙醇；

c)搜集油菜公开数据库（http://www.ukcrop.net/Brassica DB）的SSR并自主开发SSR、IFLP、SNP和InDel引物，对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色和显影后对条带的大小进行判别，筛选多态性引物。过程中所用到的主要试剂包括Taq酶、dNTP、Tris-base、EDTA、硼酸、尿素、丙烯酰胺、亚甲双丙烯酰胺、无水乙醇、冰醋酸、反硅化剂、硅化剂、硝酸银、甲醛、碳酸钠、硫代硫酸钠等：

d)利用多态性引物对DH分离群体进行分子标记基因型分析，利用Joinmap3.0软件（商业途径获得）进行遗传图谱的构建，作图参数设为重组率<0.4，LOD>1.0。结合其在武汉、阳逻和青海的三个实验的含油量性状数据，利用WinQTL Cartographer 2.5软件（商业途径获得）进行数量性状位点（QTL）定位，LOD阈值用1000次的置换测验确定，概率水平P＝0.05，最后确定在武汉、阳逻和青海的三个实验的LOD分别为3.54、2.93和2.05。检测到1个位于染色体A2(油菜第2连锁群)控制含油量的QTL。此含油量性状基因位点（QTL）在武汉和青海的两个实验能重复检测到，而且加性效应和贡献率都很大，在此QTL峰值（140.5cM）附近检测到了一种与油菜含油量性状紧密连锁的分子标记BrSF34-123（位于染色体A2的140.6cM处）。

本研究中所用的亲本材料为含油量相差近14个百分点的zy036（50%）和51070（36%），均由中国农科院油料所生物技术育种课题组技术人员在王汉中研究员带领下育成（所有权归本课题组所有,在公开发表的文章上已介绍，Hu etal.2009，Plant Cell Rep 28:541–549）。

利用上述技术措施，申请人最终获得了一种与油菜含油量性状紧密连锁的分子标记，具体如下：

BrSF34-123(自主开发的分子标记命名），该分子标记为SSR标记，位于甘蓝型油菜第2连锁群A2的一个控制含油量的QTL峰值（140.5cM）附近的140.6cM处，其引物序列为BrSF34-123F：5’-CCCCTGCAATTTGTAACCAC-3’，即SEQ ID NO.1，BrSF34-123R：5’-CCCTTTTGAACAAGGTACGC-3’，即SEQ ID NO.2。此SSR标记在zy036的扩增片段为129个碱基对(bp),其片段核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。利用WinQTL Cartographer 2.5软件分析，此分子标记所在的含油量的QTL的贡献率为21.75%-22.91%，加性效应为1.23-2.05。

与油菜含油量性状紧密连锁的分子标记BrSF34-123在油菜含油量育种中的应用,其步骤是：

（1）利用zy036高油品系与另一含油量仅为33%左右的品系93275（所有权归本课题组所有,在公开发表的文章上已介绍，Hu et al.2009，Plant Cell Rep 28:541–549）杂交后种植F2代；

（2）在F2代苗期，用CTAB法提取两亲本zy036、93275及其F2代分离群体的叶片DNA；

（3）用此F2群体的两亲本zy036和93275筛选BrSF34-123的多态性，此分子标记是一个共显性标记；

（4）利用分子标记BrSF34-123对F2代分离群体的基因型进行分子标记辅助(MAS)选择，保留有zy036条带的植株；

（5）上述保留的油菜植株种子收获后，用近红外分析仪测定其含油量。

通过鉴定上述主效基因位点，利用分子标记辅助(MAS)选择得到的高含油量品种，可迅速提高油菜高含油量品种的育种进程。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明首次定位了一种与油菜含油量性状紧密连锁的分子标记BrSF34-123。传统育种方法中，表型鉴定要等到收获种子测定含油量，且受环境影响较大。因此含油量育种不仅费时，而且难度大，成本高。通过此与油菜含油量性状紧密连锁的分子标记，可以在苗期预测含油量的高低并进行淘汰，进而可以快速筛选高含油量株系用于油菜含油量育种，辅助育种选择目标明确，节约成本。

附图说明

图1为一种zy036×51070构建的DH群体的含油量表型变异在2010年在武汉、2011年在阳逻和青海的频率分布图。结果表明含油量表现分布呈连续性分布，变异分布呈正态分布，且变异范围很宽，证明含油量属于数量性状。

图2一种甘蓝型油菜第2连锁群A2示意图。左半部分指示每个标记对应的遗传图距，右半部分指示该连锁群上的标记名称。

图3一种QTLCart2.5软件扫描的在甘蓝型油菜第2连锁群A2上含油量主效基因位点(QTL)扫描的LOD曲线图。此含油量QTL是2010年在武汉和2011年在青海收获的油菜含油量共同扫描到的QTL。

图4为利用分子标记BrSF34-123(共显性)对两亲本zy036、93275及其F2代分离群体的单株进行基因型分析和筛选图。图中前两个P1和P2分别代表亲本zy036和93275，1-46为F2单株编号。

具体实施方式

实施例1.油菜含油量分离群体的构建及性状测定

本实施例中使用的群体为高低含油量亲本（含油量分别为50%的zy036和36%的51070）杂交后代－DH群体。DH分离群体分别2010年在武汉、2011年在阳逻和青海收获。亲本和DH群体种子含油量由近红外分析仪测定。含油量数据分布结果表明：三个实验的含油量均呈连续性正态分布，且变异范围很宽，证明含油量属于数量性状（图1）。

实施例2.亲本zy036、51070和DH分离群体叶片总DNA的提取

利用CTAB法提取叶片总DNA，具体步骤如下：

A．取0.1克叶片鲜样放入研磨，加700微升提取液研磨，随即装入1.5毫升离心管中置于65°C恒温水浴60分钟，其间混合2-3次；

B．加等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1，体积比），轻轻颠倒使其充分混匀；12000rpm离心10分钟使其分层，轻轻吸取上清液转入另一1.5毫升离心管；加等体积的氯仿：异戊醇（24：1，体积比）重新抽提一次；

C．加入1毫升的-20°C预冷无水乙醇，置于-20°C冷冻不超过30分钟让DNA析出；12000rpm离心10分钟，倒掉离心管中乙醇溶液；用75%乙醇（体积比）清洗2－3次；倒掉浸泡液，打开离心管盖置于通风橱内吹干；

D．干燥后加入TE（10mM Tris,pH 8.0;1mM EDTA,pH 8.0）溶解DNA；紫外分光光度计测定DNA的浓度，于-20℃冰箱中保存备用。

实施例3.引物的开发及多态性的筛选

申请人采用的引物包括三类：第一类是已发表文章和芸苔属数据库中公开的简单重复序列（SSR）引物序列（http://www.brassica.info/resource/markers/ssr-exchange.php），包括BN、BnEMS、BnGMS、BoGMS、BrGMS、BRAS、CB、CNU、EJU、ENA、FITO、IGF、MR、Na、Ni、Ol、Ra、niab、sN、sR和sS等许多系列；第二类是申请人根据白菜、甘蓝和甘蓝型油菜的测序结果,利用MISA软件对白菜、甘蓝和甘蓝型油菜全基因组序列进行SSR位点查找,开发简单重复序列（SSR）引物。利用SOAP软件的SNP功能对白菜、甘蓝和甘蓝型油菜全基因组序列进行SNP位点预测,开发单核苷酸多态性（SNP）引物，分别命名为BrSF、BrBAC、P、BoSF、SF、snap、pr和ns系列；第三类是申请人根据甘蓝型油菜的差异表达基因，分别利用MISA软件、Primer3软件、SOAP软件的SNP功能和InDel功能,开发简单重复序列（SSR）、内含子片段长度多态性（IFLP）、单核苷酸多态性（SNP）和插入/缺失（InDel）引物，别命名为GSSR、GIFLP、GSNP和GInDel系列，然后用Primer3.0软件设计引物。申请人已经通过生物公司合成了引物8631对。筛选结果表明，有13.80％引物的扩增产物在双亲间存在长度多态性差异。多态性筛选程序如下：

（1）从亲本中各随机选择10株DNA等量混合，作为筛选引物的模板。

（2）PCR反应体系：

（3）PCR反应程序：

a.SSR引物

b.IFLP、SNP和InDel引物

凝胶电泳

试剂配制：

（15×TBE

Tris-base   53.9克

EDTA        3.72克

硼酸        27.5克

用超纯水定容至1升。

（2）6%变性聚丙烯酰胺（PAGE）的配制

用超纯水定容至1升。

（3）8%非变性聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶

5×TBE          100毫升

丙烯酰胺        80克

亚甲双丙烯酰胺  2.76克

用超纯水定容至1升。

（4）粘剂

无水乙醇        500毫升

冰醋酸          5毫升

反硅化剂(Me-T)  5毫升

（5）不粘剂

无水乙醇        500毫升

硅化剂(Dichlordiemthylsilan)14毫升

（6)50×上样缓冲液

甲酰胺         100毫升

二甲苯箐        1.25克

溴酚蓝          1.25克

1×上样缓冲液（用于加到扩增产物中）：2毫升的50×上样缓冲液加上2毫升的0.5摩尔／升的EDTA，再用甲酰胺稀释到100毫升。

（7）固定液

冰醋酸150毫升，用纯水稀释到1.5升

（8）染色液

硝酸银    1.5克

甲醛      2.0毫升

用纯水稀释到1.5升。

（9）显影液

碳酸钠      45克

硫代硫酸钠(10mg/ml)  200微升

甲醛（37%）          2.0毫升

用纯水稀释到1.5升。

凝胶胶制备：

（1）玻璃板用10%（质量比）NaOH溶液浸泡24小时，洗净，凉干。粘板和不粘板分别用滤纸均匀涂抹粘剂和不粘剂。把封条齐平的放在粘板边缘，然后将不粘板放在粘板上面，并在靠近玻璃板底部三分之一处夹上两个卡夹以起到固定的作用。

（2）在烧杯中倒入50毫升变性聚丙烯酰胺，再分别加入350微升过硫酸胺（10%）和25微升TEMED，快速搅拌均匀；

（3）将配制好的凝胶溶液到入注射器中，沿点样口缓缓注入，凝胶注入后，在凝胶顶面插上有齿的梳子（背部插入），在离灌胶口三分之一的玻璃板两侧对称处分别夹上卡夹固定，以保证凝胶聚合后玻璃板、封条以及梳子间紧密接触。

电泳：

（4）移去卡夹和梳子，将玻璃板擦净后固定在电泳槽上，上下槽各加500毫升0.5×TBE缓冲液，接通电源1500伏60瓦预热30分钟。在PCR产物中加入等体积的1×上样缓冲液，95℃变性5分钟，冰浴冷却，上样2.5微升，2000伏60瓦电泳。当二甲苯青达到可视面最底端时即可停止电泳。

染色和显影：

（1）取出粘板面向上放入固定液盆中固定30分钟左右至胶板无色，在蒸馏水盆中漂洗两次，每次2-3分钟。

（2）取出粘板面向上放入染色液盆中染色30分钟。取出粘板，在蒸馏水盆中漂洗10秒钟。

（3）取出粘板面向上放入预冷（4℃）的显影液盆中，轻轻摇动至条带清晰可见。

（4）取出粘板面向上放入固定液盆中，以终止显影。在蒸馏水盆中漂洗3分钟，室温（20－25℃以下相同）下自然凉干，拍照保存。

实施例4.多态性引物在DH群体中的分布及连锁性分析

挑选出在两个亲本中显示出的引物对DH分离群体92个单株进行分子标记基因型分析，获得分子标记基因型数据。利用Joinmap3.0软件对DH群体的分子标记基因型数据进行连锁分析以构建分子标记遗传连锁图谱，获得19个连锁群（含527个分子标记），恰好对应甘蓝型油菜的19条染色体。基于该遗传图谱、DH群体的基因型数据以及两群体的含油量性状数据，利用WinQTL Cartographer 2.5软件进行QTL定位，在A2锁群（图2）上1个分子标记BrSF34-123附近（表1），检测到了1个控制油菜含油量的QTL（图3），其LOD值、贡献率和加性效应都较大（表2）。

表1A2连锁群上与含油量紧密连锁的分子标记的引物序列

连锁群	标记	正向引物	反向引物
				A2	BrSF34-123	CCCCTGCAATTTGTAACCAC	CCCTTTTGAACAAGGTACGC

表2A2连锁群上控制油菜含油量的主效基因位点（QTL）的基本信息

实施例5.一种与油菜含油量紧密连锁的分子标记BrSF34-123在油菜含油量育种中的应用，其步骤是：

（1）利用zy036高油品系与另一含油量仅为33%左右的品系93275杂交后种植F2代；

（2）在F2代苗期，用CTAB法提取两亲本zy036、93275及其F2代分离群体的叶片DNA；

（3）用此F2群体的两亲本zy036和93275筛选BrSF34-123的多态性，此分子标记是一个共显性标记；

（4）利用分子标记BrSF34-123对F2代分离群体的基因型进行分子标记辅助(MAS)选择，保留有zy036条带的植株；

（5）上述保留的油菜植株种子收获后，用近红外分析仪测定其含油量。具体步骤与上述统计多态性引物在DH群体中的分布过程类似，包括F2分离群体叶片总DNA的提取（见实施例2）、聚丙烯酰胺凝胶电泳及分布统计（实施例3和4）等。

例如：利用共显性标记BrSF34-123对F2不同单株进行基因型分析，仅保留携带zy036有利标记的单株（图4）。种子收获后的含油量测试结果表明，通过分子标记辅助选择得到的植株，82.4%的植株含油量超过46%（表3）。通过检测与含油量性状相关的分子标记，即可以预测含油量的高低，在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率，进而可以快速筛选高含油量株系用于油菜含油量育种。

表3利用共显性标记BrSF34-123辅助选择得到的F2单株的含油量数据

注：P1和P2分别代表亲本zy036和93275。A、B、H分别代表来源于P1、P2和杂合的分子标记带型。

  SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国农业科学院油料作物研究所

 

<120>  一种与油菜含油量性状紧密连锁的分子标记及应用

 

<130>  一种与油菜含油量性状紧密连锁的分子标记及应用

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  甘蓝型油菜zy036

 

<400>  1

cccctgcaat ttgtaaccac                                                 20

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  甘蓝型油菜zy036

 

<400>  2

cccttttgaa caaggtacgc                                                 20

 

 

<210>  3

<211>  129

<212>  DNA

<213>  甘蓝型油菜zy036

 

<400>  3

cccctgcaat ttgtaaccac tagctagatt cagacaactt cgaaacacca tgtttcacat     60

 

aaacgctata tatatatata tatatatata tataaacgat cttgtatatg cgtaccttgt    120

 

tcaaaaggg                                                            129

 

 

Claims (3)

1.一种与油菜含油量性状紧密连锁的分子标记，其筛选步骤是：

a)油菜品种zy036和51070进行杂交，在杂种F1代利用小孢子技术产生加倍单倍体代分离群体；

b) 采用十六烷基三甲基溴化铵法提取亲本zy036和51070及DH代分离群体的叶片总DNA；

c) 搜集油菜公开数据库的SSR并自主开发SSR、IFLP、SNP和InDel引物，对亲本DNA进行  PCR扩增，产物在变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色和显影后对条带的大小进行判别，筛选多态性引物；

d) 利用多态性引物对DH分离群体进行分子标记基因型分析，利用Joinmap3.0软件进行遗传图谱的构建，作图参数设为重组率<0.4，LOD>1.0；利用WinQTL Cartographer 2.5软件进行数量性状位点定位，LOD阈值用1000次的置换测验确定，概率水平P＝0.05，检测到1个位于油菜第2连锁群 A2控制含油量的QTL，与其性状紧密连锁的SSR标记为BrSF34-123，该分子标记位于甘蓝型油菜第2连锁群A2的140.6cM处，其引物序列为BrSF34-123F：5’-CCCCTGCAATTTGTAACCAC-3’，BrSF34-123R：5’-CCCTTTTGAACAAGGTACGC-3’；此SSR标记在zy036的扩增片段为129个bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的油菜含油量性状主效基因位点的分子标记，其特征在于：所述的QTL位点位于甘蓝型油菜第2连锁群A2，对油菜含油量性状的贡献率为21.75%-22.91%，加性效应为1.23-2.05。

3.权利要求1所述的分子标记在油菜高含油量性状育种中的应用。

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