CN102911941B - 根特异性启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及根特异性启动子及其应用，属于生物技术领域。根特异表达启动子，具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本发明在花生根部克隆得到该根特异表达启动子，实验证明，该启动子驱动的基因在拟南芥、烟草和花生的根部特异表达。该根部特异表达启动子对于植物根部病虫害防治具有重要的意义。

Description

根特异性启动子及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及根部特异表达启动子，其克隆、功能验证其应用。

背景技术

花生是中国重要的油料作物和经济作物，2011年，我国的花生种植面积为470万公顷，产量为1620万吨，居世界首位，占世界花生产量的47.9%（USDA,World Agricultural Production,United States Department of Agriculture,2010）。随着中国大豆面积逐年萎缩，“优化食用油结构，发展花生产业，保证中国食用油战略安全”的呼声越来越高，花生病虫害防治和品质改良应给予足够的重视。花生的品质及产量易受地下害虫、真菌及细菌病害的影响（Vargas GilS,Haro R,Oddino C,et a1.Crop management practices in the control of peanut diseases caused bysoilborne fungi.Crop Protection,2008,27:1-9.），尽管传统的杂交育种可以得到一些抗虫抗病的花生品系（Garcia G，Tallury S,Stalker H,et al.Molecular analysis of Arachis interspecific hybrids.Theoretical and Applied Genetics,2006,112:1342-1348.），但是花生栽培品种遗传多样性低（Kochert G，Halward T,Branch W D,et al.RFLP variability in peanut(Arachis hypogaea L.)cultivars and wild species[J].Theor Appl Genet,1991,81:565-570.），杂交育种周期长，育成的抗病性状通常与其他非预期的性状连锁，因此，借助基因工程育种技术培育花生品种，改良花生品质具有明显的优势。

组织特异性启动子，可以避免蛋白合成的浪费，使基因只在某些特定的器官或组织中表达。目前相继发现的组织特异性启动子主要有根部特异、果实特异、维管组织特异、花粉管特异、韧皮部特异、种子特异和块茎特异等组织特异启动子，是研究基因功能及表达特性的重要工具，尤其在植物基因工程育种中发挥重要作用。

根是植物体的重要器官，除了吸收土壤中的水分及养分、贮存合成有机物质，还和土壤中的微生物有密切的互作关系。花生根系容易受蛴螬等地下害虫的啃食，继而感染根腐病、茎腐病等细菌真菌病害的几率增加，造成部分产区的减产绝收。花生抗病虫基因工程的研究已经在我国陆续的展开，克隆根部特异表达启动子，对于保证抗病虫外源基因在花生根中特异、稳定、高效表达及增加转基因生物安全性具有重要意义。目前已克隆到的植物根特异性启动子主要在拟南芥、水稻、烟草、大豆、玉米、松树、胡萝卜、番茄中，这些启动子驱动的基因多与根系分泌、次生代谢有关，花生根特异性启动子在国内外还未见报道。

随着新一代测序技术454、Solexa高通量测序的诞生，测序成本大幅度降低，这直接促进了数字基因表达谱（Digital gene expression profile）技术的发展。该技术可以快速地检测某一物种特定组织在特定时期的基因表达情况，并将表达水平数字化，突破传统的mRNA差异显示PCR、代表性差异分析、抑制性消减杂交等基因表达差异分析方法样品用量大、操作繁琐、假阳性高的弱点。Solexa高通量测序的核心技术是DNA“簇”和“可逆性末端终止”，通过对样本中数以百万的EST同时进行序列测定，Genome Analyzer系统可以对整个转录组进行数字化的分析。无需设计特异性杂交探针及基因组的注释信息，可以同时进行全基因组转录子的发掘与定量分析。采用边合成边测序的方法，反应可以同时检测上亿个核苷酸片段，比芯片技术效率高、成本低。

发明内容

本发明提供一种根特异表达启动子，确保外源基因在根部特异、稳定表达，对于植物根部病虫害防治具有重要的意义。

一种根特异表达启动子AhRootSP，具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。

一种表述载体，其含有上述根特异表达启动子。

所述表述载体为pRGFP或pRGUSplus，如图1中所述。

根特异表达启动子AhRootSP的应用，为将含有转化基因的表达载体转化植物，使转化基因在根部特异表达。

所述植物为花生，拟南芥或烟草。

所述转化基因为具有杀虫效果的外源基因。

本研究利用Illumina公司Solexa技术对花生根、幼胚及叶片转录组测序，构建基因数字表达谱，结合半定量RT-PCR快速对数字表达谱结果进行验证，确定根部特异表达基因。通过Genome walking方法获得该基因的启动子序列，并通过根癌农杆菌介导的遗传转化系统验证了AhRootSP启动子的功能，发现由该启动子驱动的基因在拟南芥、烟草和花生的根部特异表达。

附图说明

图1植物表达载体构建流程图

图2不同PCR循环数时扩增18SrDNA结果

M：DM2000分子量(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)；1：阴性对照（ddH₂O）；

2-6；分别为循环数为10、15、20、25和30时18SrDNA的扩增结果；

图3不同PCR循环数时扩增18SrDNA结果

M：DM2000分子量(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)；7：阴性对照（ddH₂O）；

8-13：分别为循环数为20、21、22、23、24和25时18SrDNA的扩增结果

图4不同组织扩增18S rDNA的内参调平结果

图5根部特异表达候选EST的RT-PCR验证结果

图6AhSymRK上游序列的获得

A：AhSymRK上游序列的基因组步移结果，B：以DNA为模板扩增ATG上游序列的结果；

M1、M2：DL2000DNA marker；1-3：分别为以Dra Ⅰ、EcoRⅤ和PvuⅡ酶切的DNA库为模板的PCR扩增产物；4-5：560bp的ATG上游序列扩增产物

图7PAhSymRK启动子区核酸序列分析

启动子中的增强子区域；

水杨酸应答元件；

根特异表达元件；CNAATG motif：组织特异性转录因子结合位点

图8pRGFP及pRGUSplus酶切鉴定

M1：BM10000Marker；M2：DM2000Marker；1：pRGFP；2：pRGUSplus

图9转化农杆菌LBA4404的PCR鉴定

M：DM2000Marker；1：负对照(ddH₂O)；2：阳性对照(plasmid DNA)；3-6：p2300GFP转化农杆菌的PCR检测结果；7-11：p2300GUSplu转化农杆菌的PCR检测结果

图10烟草的遗传转化

A：叶盘；B：诱导芽；C：抗性芽伸长：D：抗性芽生根

图11烟草抗性苗的GFP观察

A、C和E：明场；B、D和F：暗场

A和B：两片叶展开；C和D：4片叶展开；E和F：生长旺盛期

图12拟南芥的GUS染色鉴定

A：真叶期；B：幼苗；C：抽薹；D：莲座叶

图13花生的遗传转化

A：去胚子叶；B：诱导芽；C和D：抗性芽伸长；E和F：抗性芽生根

图14花生抗性苗的GUS染色鉴定

A：对照植株（未侵染含根特异表达启动子载体）；B：抗性植株（载体pRGUSplus）；

C：抗性植株叶片；D：抗性植株根部

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

材料和方法

1.材料

1.1质粒及菌株

基础载体pCAMBIA2300、克隆菌株DH5α和根癌农杆菌为LBA4404均为本实验室保存，可以对外公开发放。

1.2植物材料

供试栽培花生（Arachis hypogaea L.）品种白沙1016由山东省花生研究所提供，烟草（Nicotiana benthamiana）和野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana）哥伦比亚（Columbia）生态型为本实验室保存，可以对外公开发放。

1.3试剂

Ex-Taq高保真聚合酶、T4DNA连接酶及限制性内切酶等购自TaKaRa公司；2×Taq MixPCR购自北京博迈德生物技术公司；质粒小量提取试剂盒、DNA回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒等购自Axygen公司；其他均为市售国产、进口分析纯试剂。

1.4DNA分子量

λ/EcoR130Ⅰ：19329bp、7743bp、6223bp、4254bp、3472bp、2690bp、1882bp、1489bp、925bp；

DM2000：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp、50bp。

2方法

2.1候选EST表达特性的RT-PCR验证

2.1.1花生各组织RNA的提取及反转录成第一条链cDNA

TRizol法提取花生根、茎、叶和幼胚的总RNA，反转录体系：在0.2ml RNase-free EP管中，取约1μg的RNA加入0.5μL oligo d(T)₂₅，混均，70℃4min使RNA的二级结构打开，迅速置于冰上，5分钟后待混合物彻底冷却，加入4μL5×M-MLV Buffer，1μL dNTP(2.5mMeach)，2μL RNase Inhibitor，1μLM-MLV反转录酶，RNase-free ddH₂O补至20μL，混均后于PCR仪中42℃90min，72℃7min，4℃终止。

2.1.2内参基因调平

1)先确定18S rDNA进入平台期的循环范围：

以18S rDNA作为内参基因，扩增产物长度400bp，引物序列如下：

18SF：5'-GAAACGGCTACCACATCCAAG-3'

18SR：5'-CCAACCCAAGGTCCAACTACG-3'

PCR反应体系:25μL 2×taq Mix（Promega），1.5μL 18S-F Primer(10μmol/L)，1.5μL18S-R Primer(10μmol/L)，1μL根cDNA作为模板，ddH₂O补足体积50μL。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，61℃退火1min，30个循环，分别在10、15、20及25循环时处分别取出5μL保存，全部程序运行结束后，进行电泳检测，并用ImageJ软件分析电泳结果。

2)确定18S rDNA进入平台期的具体循环数：

PCR反应体系同上，PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，61℃退火1min，25个循环，在每一个循环时处分别取出5μL保存，共取样5次，全部程序运行结束后，进行电泳检测，并用ImageJ软件分析电泳结果。

3)18S rDNA扩增不同组织的cDNA进行内参基因调平

反应体系及条件同上，模板为根、茎、叶和幼胚的cDNA，循环数为步骤（2）中确定的结果，PCR结束后各取5μL进行电泳检测，并用ImageJ软件分析电泳结果。通过稀释模板来调平内参基因的亮度，直至内参基因亮度一致。

2.1.3花生根特异性表达候选EST的RT-PCR验证

根据筛选到的根特异表达候选EST序列设计引物，见表1。

表1RT-PCR验证根部特异表达候选EST引物序列

模板为经调平浓度后的根、茎、叶和幼胚cDNA，PCR反应体系同上，反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火1min，30个循环，72℃10min。

2.2根部特异表达启动子的克隆

2.2.1CTAB法提取花生基因组

1)称取0.4g的花生叶片放入1.5ml的离心管，用液氮研磨，迅速加入500μl预热至65℃的2×CTAB提取缓冲液（2％CTAB，100mM Tris·Cl，50mM EDTA，1.4M NaCl，pH 8.0，使用之前加0.1％巯基乙醇），颠倒混匀，置于65℃水浴温浴10min。

2)取出离心管，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），12,000rpm室温离心10min。

3)轻轻吸取上清，加入0.6倍体积的异丙醇，充分混匀，放置10min沉淀基因组。

4)4℃，12,000rpm离心10min，弃去残液，用70％乙醇洗涤两次，真空干燥DNA后，加入35μl无菌ddH₂O溶解，-20℃保存备用。

2.2.2花生DNA“library”的构建

1)人工接头的制备：浓度为50μmol/L Long-Adaptor和Short-Adaptor在Tris-HCl缓冲液（250μmol/L，pH 7.5）中退火，退火条件如下：95℃变性5min，然后2h内逐步降到室温，室温放置1h后4℃过夜。接头和引物的合成由上海生工生物技术有限公司完成，引物见表2-1。

表2引物名称及序列

2)花生基因组DNA的酶切及纯化：

取3个1.5ml的离心管，分别用能产生平末端接头的限制性内切酶Dra I、EcoR V、Pvu II酶切基因组，酶切体系如下：

于37℃培养箱，过夜酶切（10-12h）；从每个试管中取5μl于0.7%琼脂糖凝胶上电泳，检测基因组是否酶切完全。PCR产物纯化试剂盒回收纯化内切酶消化后的DNA。纯化后的酶切产物与人工接头连接体系如下：

16℃连接过夜，70℃水浴10min终止反应。

3)花生根特异表达EST的启动子克隆

选择根部特异表达的contig236389，根据其已知半长cDNA序列在5'端设计两个嵌套式特异引物236389GSP1和236389GSP2（序列见表2）。参照

2PCRKit说明书的要求进行2轮PCR。

第一轮PCR反应体系为：

分别从Dra Ⅰ、EcoRⅤ、Pvu Ⅱ3种酶切调平后的DNA文库中取1μL作模板，建立3个平行的50μL PCR反应体系。PCR扩增程序：95℃预变性3min，95℃变性25s，68℃5min，7个循环；95℃变性25s，65℃5min，32个循环，72℃延伸10min，16℃终止反应。第二轮PCR反应体系同第一轮PCR，只是将AP1和236389GSP1都用AP2和236389GSP2代替，第一轮PCR反应产物稀释10倍取1μL作为模板。PCR产物经电泳检测，将目的的条带克隆到pMD19-T Vector，经PCR鉴定正确后送华大基因测序。

4)花生contig236389的启动子分析及预测

利用Plantcare在线数据库（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）及PLACE Signal Scan program（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html）对克隆的启动子进行预测和分析。

2.3根部特异表达启动子的功能验证

2.3.1含根特异启动子的植物表达载体构建

将本实验室保存的p2300GFP载体和p2300GUSplus及T-PahSymRK（可以对公众发放）用BamH I和Hind III酶切，连接转化，构建由根特异性启动子AhRootSP驱动的含报告基因的表达载体pRGUS及pRGFP。构建过程如图1所示。

2.3.2根癌农杆菌介导的花生遗传转化

1)挑取根癌农杆菌LBA4404（含有相应的植物表达载体）的单菌落至5ml含有卡那霉素、利福平及链霉素的LB液体培养基中，220rpm，28℃培养36小时。取500μL菌液接种于50mL液体LB培养基中，200rpm，28℃培养至OD₆₀₀=0.8。。

2)花生去壳，进行表面消毒，75%乙醇中放置1min，弃乙醇，0.1%升汞中放置4min，灭菌水洗4次，放置于无菌纸上吹干；

3)用手术刀，将花生两个子叶分开，切去胚后，将去胚子叶在含有TDZ的蒸馏水中浸泡8小时或过夜，用无菌水洗3次。

4)将活化的根癌农杆菌离心，弃上清，用等体积的无菌水重悬沉淀，用重悬液浸泡去胚子叶。黑暗220rpm，28℃培养过夜。

5)用无菌水洗外植体4次，将外植体正置放在含有50μmol l^-1乙酰丁香酮的培养基上暗培养2天；

6)再将去胚子叶转移到芽诱导培养基（20mg l^-16-BA，50mg l^-1卡那霉素）上，两周后有抗性芽产生；

7)将抗性芽转移到伸长培养基（5mg l-16-BA，30mg l-1卡那霉素）上，两周左右，抗性芽伸长；

8)将伸长的抗性芽转移到生根培养基（0.5mg l-1NAA，30mg l-1卡那霉素）上，一周左右生根。

2.3.3烟草遗传转化

1)挑取含有相应植物表达载体的根癌农杆菌LBA4404的单菌落至5mL含有卡那霉素、链霉素及利福平的LB液体培养基中，220rpm，28℃培养36小时。取500μl培养物接种于50mL液体LB培养基中（容器为500mL三角瓶），200rpm，28℃培养至OD₆₀₀=0.8。

2)烟草叶片剪成直径1cm的叶盘，浸泡于制备好的农杆菌中15min。

3)用无菌水洗外植体3次，将外植体正置放在含有50μmol/L l-1乙酰丁香酮的共培养培养基上暗培养2天；

4)选择分化培养基（MS+2mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+500mg/L Cb+50mg/L Km）上光照培养，每十天更换一次培养基；

5)叶盘分化出小芽，等其长到1cm左右，把小芽转移到选择生根培养基中（MS+0.2mg/LNAA+300mg/L Cb+50mg/L Km）继续培养，每二十天更换一次培养基。

2.3.4拟南芥浸花侵染

1)将拟南芥根部和小盆一起用保鲜膜罩上，只露出地上半部分，将其拢成一束，螺旋式浸入农杆菌重悬液中，轻轻摇动侵染30s。

2)侵染后的拟南芥植株平躺放在苗盘中，用保鲜罩罩上，保湿2d后正常培养，约3周左右即收取种子。。

3)收获的种子先用变色硅胶干燥，1周左右才能进行筛选；

4)用牙签将种子均匀的播在含30mg·L^-1Km的1/2MS固体培养基上，暗培养10d后，挑取能正常生长的幼苗移至新的培养基上培养，待生根后检测。

2.3.5GUS染色鉴定

1)染液(10mL)配制方法：10mg X-luc溶于100μL N，N-二甲基酰胺，5mmol·L^-1铁氰化钾，5mmol·L^-1亚铁氰化钾，10mmol·L^-1EDTA(PH 8.0)，用100mmol·L^-1磷酸钠缓冲液（pH 7.0）定容。

2)将准备好的植物组织放入1.5mL的离心管，加入染色液浸没试材，封好盖子；

3)37℃培养箱中温育1小时至过夜；

4)将浸染过的试材转入70%或95%乙醇中脱色2-3次（除去叶绿素），至阴性对照材料呈白色为止。

2.3.6GFP观察

使用奥林巴斯体式显微镜SZX16观察。

3实验结果

3.1根部特异表达候选EST的确定

3.1.1花生根部特异表达候选EST的半定量RT-PCR验证

根据实验室对花生幼胚、根和叶片转录组测序的结果，发现contig236389在叶片和幼胚中都没有表达，只在根部表达。通过NCBI上Blast的结果显示，contig236389（2895bp）与花生栽培品种JL24的共生受体激酶（Genbank登录号：FJ969396）碱基相似性达到94%，氨基酸相似性90%，而该基因在植物和根瘤菌的互作中起重要作用。因此，用半定量RT-PCR验证该EST的表达模式。

进行半定量RT-PCR验证之前，利用18S rDNA作为内参基因对cDNA进行了调平。首先确定18S rDNA进入平台期的循环范围，扩增结果如图3A所示，20和25个循环的扩增产物呈指数增长，25和30个循环的亮度一致，说明18S rDNA是在20-25个循环之间进入平台期，最终确定内参调平时循环数设为20，即进入平台期扩增的前一个循环（图3B）。用不同组织cDNA扩增18S rDNA，根据内参基因的扩增亮度稀释模板，反复进行PCR扩增，直至内参基因亮度一致，不同组织的cDNA浓度即调平（图4）。

半定量RT-PCR的结果显示，contig236389确实只在根部表达，在茎、叶片和幼胚中都没有表达，证明该EST是根部特异表达。(见图5所示)

3.2根部特异表达启动子的克隆

经过基因组步移，以Dra I、EcoRV、Pvu II酶切的DNA文库样品为模板进行的PCR都能得到明显的扩增条带（图6A），回收特异性条带。经测序，3'端与已知的contig236389序列5'端有729bp相同，经比对获得550bp的启动子片段，该启动子命名为AhRootSP。设计引物扩增ATG上游序列（图6B），测序验证与步移结果完全一致。

通过对AhRootSP启动子序列的分析，克隆的启动子含有有3个根部特异表达元件，该顺式元件广泛存在于番茄和拟南芥等植物根特异表达启动子中；此外还发现一个水杨酸应答元件、7个启动子中的增强子区域和3个组织特异性转录因子结合位点（图7）。

3.3根部特异表达启动子的功能验证

3.3.1含报告基因表达载体的构建

将含有报告基因的载体p2300GFP及p2300GUSplu和AhRootSP启动子用BamH I和HindШ双酶切后连接，构建了含有由根特异表达启动子驱动的报告基因的表达载体pRGFP及pRGUSplus（图8）。将构建好的载体转化农杆菌LBA4404，PCR鉴定阳性克隆（图9）。

3.3.2根部特异表达启动子在烟草、拟南芥及花生中的功能验证

用农杆菌LBA4404（含有载体pRGFP）侵染烟草叶盘（图10A），7天左右有诱导芽产生（图10B），4周左右将诱导芽转移到新的分化培养基上（图10C），两周左右烟草生根（图10D），获得用于分子检测的卡那抗性苗。通过奥林巴斯体式显微镜SZX16观察，发现只有根部能观察到绿色荧光（图11B，D和F），叶片、叶脉和茎部均未发现荧光，证明该启动子在烟草中为根部特异表达；并且，从两片叶展开（图11B）到生长旺盛期（图11F）GFP都持续表达，但幼苗期的表达量低于生长旺盛期。

用农杆菌LBA4404（含有载体pRGUSplus）浸花侵染拟南芥，收获种子后筛选抗性苗用于GUS染色鉴定。发现从只有真叶的幼苗（图12A）到抽薹的植株（图12C）只有根部能被染成蓝色，叶片和茎部均未发现蓝色斑点，证明该启动子在拟南芥中为根部特异表达。

用农杆菌LBA4404（含有载体pRGUSplus）侵染花生去胚子叶（图13A），14天左右有诱导芽产生（图13B），4周左右将诱导芽转移到新的分化培养基上伸长培养（图13C和D），两周后幼苗生根（图13E和F），获得用于分子检测的卡那抗性苗。GUS染色结果显示，抗性苗只有根部显蓝色（图14B和D），而茎部和叶片都没有蓝点出现（图14C），对照植株也没有出现GUS蓝点，证明AhSRK启动子在花生中为根部特异表达。

4讨论

在植物中，组成型表达的启动子多指导管家基因的表达，但在转基因作物中，不仅造成能量的浪费，并且存在生物安全性的问题。它们的表达水平多存在时空差异，比如在根部的表达活性低于叶片，这就给通过基因工程育种防治作物地下病虫害带来了困难。传统的克隆组织特异表达启动子的方法有mRNA差异显示PCR、代表性差异分析、抑制性消减杂交等，样品用量大、操作繁琐、假阳性高。

随着454技术、solexa高通量测序的产生及测序成本的降低，新一代深度测序直接促进了数字基因表达谱技术的产生。该技术可以经济、快速地检测某一物种特定组织在特定状态下的基因表达情况，并将表达水平数字化。本研究利用数字表达谱，结合RT-PCR技术和基因组步移技术，克隆花生根部特异表达启动子，为高通量挖掘组织特异表达启动子奠定了基础。

contig236389（2895bp）与花生栽培品种JL24的共生受体激酶碱基相似性达到94%，氨基酸相似性90%。AhRootSP启动子驱动的GFP基因在烟草根中从两片叶展开到生长旺盛期都持续表达，并且活性增加；该启动子驱动的GUS基因在拟南芥中从只有真叶的幼苗到抽薹都持续表达，为花生根部病虫害防治的分子育种奠定了坚实的基础。

实验结论：

通过构建花生的根、叶和幼胚的数字表达谱挖掘根部特异表达的启动子，随机验证的14个候选EST中有13个EST是根部特异表达的。其中，contig236389与花生栽培品种JL24的共生受体激酶碱基相似性达到94%，而该基因在植物和根瘤菌共生中起重要作用，克隆了该候选EST的启动子。通过转化拟南芥、烟草和花生，证明该启动子在3种植物指导的报告基因在根部特异表达。

Claims (2)

1.根特异表达启动子AhRootSP的应用，其特征在于：用含有根特异表达启动子AhRootSP和转化基因的表达载体转化植物，使转化基因在根部特异表达，所述根特异表达启动子AhRootSP核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，

所述植物为花生，拟南芥或烟草。

2.根据权利要求1所述的应用，所述转化基因为具有杀虫效果的外源基因。

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