CN103966221B - 种子及根尖特异表达启动子的克隆及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“种子及根尖特异表达启动子的克隆及应用”，属于生物技术领域。本申请从花生中克隆到种子及根尖特异性表达的启动子，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO3、SEQ？ID？NO4或SEQ？ID？NO5所示，通过瞬时表达验证，能在种子和/或侧根中特异表达，该启动子可用于构建带有抗虫基因的表达载体，转入植物后可使植物抗地下害虫。

Description

种子及根尖特异表达启动子的克隆及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及种子及根部特异表达启动子，其克隆、功能验证其应用。

背景技术

花生是中国重要的油料作物和经济作物，2011年，我国的花生种植面积为470万公顷，产量为1620万吨，居世界首位，占世界花生产量的47.9％(USDA,WorldAgriculturalProduction,UnitedStatesDepartmentofAgriculture,2010)。随着中国大豆面积逐年萎缩，“优化食用油结构，发展花生产业，保证中国食用油战略安全”的呼声越来越高，花生病虫害防治和品质改良应给予足够的重视。花生的品质及产量易受地下害虫、真菌及细菌病害的影响(VargasGilS,HaroR,OddinoC,eta1.Cropmanagementpracticesinthecontrolofpeanutdiseasescausedbysoilbornefungi.CropProtection,2008,27:1-9.)，尽管传统的杂交育种可以得到一些抗虫抗病的花生品系(GarciaG,TalluryS,StalkerH,etal.MolecularanalysisofArachisinterspecifichybrids.TheoreticalandAppliedGenetics,2006,112:1342-1348.)，但是花生栽培品种遗传多样性低(KochertG,HalwardT,BranchWD,etal.RFLPvariabilityinpeanut(ArachishypogaeaL.)cultivarsandwildspecies[J].TheorApplGenet,1991,81:565-570.)，杂交育种周期长，育成的抗病性状通常与其他非预期的性状连锁，因此，借助基因工程育种技术培育花生品种，改良花生品质具有明显的优势。

组织特异性启动子，可以避免蛋白合成的浪费，使基因只在某些特定的器官或组织中表达。目前相继发现的组织特异性启动子主要有根部特异、果实特异、维管组织特异、花粉管特异、韧皮部特异、种子特异和块茎特异等组织特异启动子，是研究基因功能及表达特性的重要工具，尤其在植物基因工程育种中发挥重要作用。

根是植物体的重要器官，除了吸收土壤中的水分及养分、贮存合成有机物质，还和土壤中的微生物有密切的互作关系。花生根系容易受蛴螬等地下害虫的啃食，继而感染根腐病、茎腐病等细菌真菌病害的几率增加，造成部分产区的减产绝收。花生抗病虫基因工程的研究已经在我国陆续的展开，克隆根部特异表达启动子，对于保证抗病虫外源基因在花生根中特异、稳定、高效表达及增加转基因生物安全性具有重要意义。目前已克隆到的植物根特异性启动子主要在拟南芥、水稻、烟草、大豆、玉米、松树、胡萝卜、番茄中，这些启动子驱动的基因多与根系分泌、次生代谢有关，花生根特异性启动子在国内外还很少见有报导。

植物种子，尤其是谷类作物和油料作物，含有丰富的淀粉、蛋白质及脂肪，是粮食和食用油的重要来源，与人们日常生活息息相关，种子也因此成为基因工程改良的重要目标。种子特异启动子的研究有利于人们对植物种子进行定向改造，提高种子营养或改善种子品质。另外，作为植物体的重要贮存组织，种子中可以稳定的贮存大量的蛋白质。基于这一特点，种子可用作理想的生物反应器，利用特异启动子安全、高效、廉价的表达目的蛋白。因此，种子特异启动子的研究为抗体、疫苗及生物药物的生产提供重要的理论基础和实际应用价值。

鉴于地下害虫如蛴螬啃食花生的种子和根部，因此克隆种子及根部特异表达的启动对于地下害虫的防治具有重要的意义。

发明内容

本发明提供一种从花生中克隆得到的种子及根尖特异性表达的启动子，对于植物防治地下害虫，特别是地下果实植物，具有重要的意义。

种子或/和根尖特异性表达启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO3、SEQIDNO4或SEQIDNO5所示。

一种表达载体，含有上述的特异性表达启动子。

上述表达载体在转基因植物中的应用。

所述的应用，为该表达载体中插入有抗虫基因，将该表达载体转入植物中，使其在种子或根尖中表达该抗虫基因，以防治地下害虫。

上述的种子或/和根尖特异性表达启动子在转基因植物中的应用。

所述的应用，为将上述的种子或/和根尖特异性表达启动子和抗虫基因的表达载体转入植物中，使其在种子或根尖表达该抗虫基因，以防治地下害虫。

本申请从花生中克隆到一个长度为1369bp启动子序列，对该启动子序列进行了3个截短的设计，通过瞬时表达验证，404bp的启动子能在种子及侧根中特异表达，1286bp和1074bp的启动子在种子中表达，在根尖中无表达。该三个启动子可用于构建带有抗虫基因的表达载体，转入植物后可使植物抗地下害虫。

附图说明

图1contig4796启动子及其系列缺失与GUS融合简图

图2contig4796基因及其上游序列的PCR扩增

其中A：contig4796基因上游序列的步移结果；B：contig4796基因上游序列PCR验证；

M1：DL10000DNAmarker；M2：DL5000DNAmarker；N：阴性对照(ddH₂O)；

1-4：第二轮巢式PCR扩增结果；5-6：contig4796基因上游序列PCR扩增结果

图3contig4796基因启动子序列与结构

标注*号的斜体字ATG为起始密码子；2个种子特异元件RY-element均用灰色背景的字标出

图4组织特异启动子植物表达载体构建流程图，

图5contig4796基因启动子5'缺失片段的PCR扩增

M：DL2000Marker；N：阴性对照(ddH₂O)；1、2：1286bp启动子序列PCR结果；

3、4：1074bp启动子序列PCR结果；5、6：404bp启动子序列PCR结果

图6种子特异启动子表达载体的酶切鉴定

M：DL15000DNAmarker；1：1286pb的启动子片段PCR扩增；2：p2300.1-27H₁₂₈₆/BamHI+HindIII；3：1074pb的启动子片段PCR扩增；4：p2300.1-27H₁₀₇₄/BamHI+HindIII；5：404pb的启动子片段PCR扩增；6：p2300.1-27H₄₀₄/BamHI+HindIII；

图7种子特异启动子表达载体转化农杆菌LBA4404的PCR鉴定

M：DL2000Marker；N：阴性对照(ddH₂O)；P：阳性对照(plasmidDNA)；1、2：p2300.1-27H₁₂₈₆转化农杆菌的PCR扩增结果；3、4：p2300.1-27H₁₀₇₄转化农杆菌的PCR扩增结果；5、6：p2300.1-27H₄₀₄转化农杆菌的PCR扩增结果。

图8种子特异启动子瞬时表达的GUS染色结果

其中Negative为负对照，侵染的不含表达载体的农杆菌LBA4404；35S为正对照，侵染的含有载体p2300.1的农杆菌LBA4404。

体实施方式：

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

下面所涉及的实验材料均为市售。

1实验方法和步骤

1.1基因组步克隆启动子。PCR引物由上海生工生物技术有限公司完成，根据课题组对花生转录组测序结果中Contig4796序列(见SEQIDNO1)设计引物序列如下：

SP1：5'-CCTGTTCCTCGCGTTCGTTCTCCCCCCTTAG-3'

SP2：5'-CAAGTTGGTTGTGGAAGCTGTCGGTGTGC-3'

SP3：5'-AGGACAACCGGGGAATATNNNNNNNNAGTACC-3'

SP4：5'-CCGGCACACCGGAATTCCTGACTCTTGGGG-3'

SP5：5'-CACCATGGGGCACCGCGATGAGATCACCC-3'

YZF：5'-GTCACAGAGCGAGCACTTC-3'

YZR：5'-GCTAACTCGCAGAAGCAGC-3'

1.1.1接头形成引物的加合反应，30μL反应体系：

反应条件：94℃90s→[35℃每个循环上升0.5℃]×20→45℃3min→0.2℃/s缓慢升温→70℃5min

1.1.2向反应体系中补加1.5μL2×LAGCBufferI以及1.5μL的SP1，反应条件如下：

1.1.3向反应体系中补加0.3μLLATaq及0.3μL2LA×GCBufferI，按如下反应条件进行PCR：

1.1.4巢式PCR方法扩增contig4796的上游序列

1)第一轮巢式PCR

2)第二轮巢式PCR

上述PCR反应结束后均用1％琼脂糖凝胶电泳检测结果，选择长度大于1kb的条带进行回收。

1.1.5PCR产物胶回收使用Axygen胶回收试剂盒

1.1.6将回收片段与TaKaRa公司的pMD19-T连接。连接体系为：5μL2×SolutionⅠ，0.5μLpMD19-T载体，4.5μL回收产物，总体积10μL，混匀后4℃过夜连接。

1.1.7大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及转化

DH5α感受态细胞的制备(CaCl₂法)

1)挑取E.coliDH5α单菌落于5mL液体LB培养基中，37℃震荡培养过夜；

2)按1％接种量接种于100mLLB液体培养基中，37℃，220rpm培养约2hr(OD₆₀₀＝0.5-0.6)；

3)4℃，5000转离心5min；

4)弃上清，加入25mL预冷的0.1mol/LCaCl₂悬浮细胞，置于冰上30min以上；

5)4℃，5600g离心5min，收集细胞；

6)弃上清，用5mL预冷的0.1mol/LCaCl₂重悬细胞，加5mL甘油混匀后分装成100μL/1.5mL离心管，于-70℃保存。

DH5α的转化

1)DH5α感受态细胞从-70℃冰箱取出后立即于冰上融解；

2)将10μL连接产物全部加入到100μL感受态细胞中，冰上放置30min；

3)42℃热击90s，迅速取出，冰上放置2min；

4)加入约600μL无抗性的LB液体培养基，将感受态置于37℃培养箱中复苏1h；

5)4500g离心5min，倒掉上清，余下约100μL的上清重悬菌体，涂于含相应抗性的LB固体培养基上，置于37℃培养箱中培养10～12h至有单菌落长出。

1.1.8菌液PCR法鉴定阳性转化子

1)挑取单菌落，于700μL/1.5mL离心管含相应抗生素的液体LB培养基中，37℃，220rpm培养5h即可利用菌液PCR法鉴定阳性转化子。

2)PCR鉴定体系及条件如下：

3)将PCR阳性克隆的菌液送交北京华大基因生物技术公司测序。

1.2启动子序列的验证

1.2.1根据测序结果，设计一对验证引物，用来验证contig4796上游序列，PCR反应体系及条件如下：

用1％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测。

1.2.2PCR产物回收加A尾

PCR胶回收方法同2.2.1.3，取回收产物30μL，加入30μL2×TaqMix，混匀，反应条件为：94℃变性5min→72℃延伸30min→16℃保温30min

1.2.3PCR产物纯化使用AXygenPCR产物纯化试剂盒

1.2.4连接pMD-19T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态，阳性转化子鉴定方法同上述1.8，PCR鉴定体系及条件如下：

将PCR阳性克隆的菌液送交北京华大基因生物技术公司测序。

1.3启动子植物表达载体的构建及转化农杆菌

1.3.1种子特异启动子不同长度缺失片段的获得

根据生物信息学分析结果，针对启动子序列中各组织特异元件所在位置，有目的的设计截短引物，在上下游引物的5'端分别加上HindIII和BamHI酶切位点。引物序列如下，小写部分为所加酶切位点：

PFH₁₂₈₆：5'-aagcttCCTACATGTGGAACTTGC-3'

PFH₁₀₇₄：5'-aagcttGCCACAACTGAATAAATAACG-3'

PFH₄₀₄：5'-aagcttCACATAATTATTGGTCTCTAAAAG-3'

PRB：5'-ggatccGGTGGTTGTTAGTTGTGGAG-3'

PCR扩增体系及条件如下：

1.3.2PCR产物纯化加A尾，再次纯化后连T载体，转化DH5α，阳性转化子鉴定方法同上1.1.8。鉴定引物对分别为：PFH₁₂₈₆/PRB、PFH₁₀₇₄/PRB和PFH₄₀₄/PRB，将阳性克隆送交测序。

1.3.3质粒提取使用Axygen质粒提取试剂盒

提取pCAMBIA2300.1、pMD-PFH₁₂₈₆、pMD-PFH₁₀₇₄和pMD-PFH₄₀₄的质粒。

1.3.4载体与目的片段的酶切

37℃酶切4h，产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.3.5目的片段回收同1.1.5

1.3.6将回收的目的基因与载体大片段连接，反应体系如下：

pCAMBIA2300.10.5μL

目的片段4.5μL

SolutionⅠ5μL

混匀后4℃过夜连接。

1.3.7连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态、PCR鉴定、质粒提取方法同上。

1.3.8对构建好的载体进行酶切鉴定，体系如下：

构建好的载体命名为p2300.1-27H₁₂₈₆、p2300.1-27H₁₀₇₄、p2300.1-27H₄₀₄如图1所示：

1.4种子特异启动子的瞬时表达

1.4.1样品的处理

参照Hu等的方法稍作改进。HuX,LiuS,GuoJ,etal.EmbryoandantherregulationofthemabinlinIIsweetproteingeneinCapparismasaikaiLévl[J].Functional&IntegrativeGenomics,2009,9(3):351-361.

1.MMA缓冲液(pH5.6)的配置：

MS液体培养基中加入10mmol/LMES，

200μmol/LLAS

2％蔗糖

2.挑取农杆菌单菌落，接于含100mg/LSm^r和100mg/LKm^r的5mL液体LB培养基中，28℃，220rpm，振荡培养40h；

3.将1mL活化的农杆菌菌液接种至50mL含相同抗生素的液体LB培养基中，28℃、220rpm培养5-6h，至OD₆₀₀＝0.8；

4.将活化的农杆菌4500g离心10min，弃上清，用MMA缓冲液重悬沉淀，使OD₆₀₀达到2.0；

5.将植物各组织浸没于菌液中，0.06MPa抽真空25min；

6.取出植物组织，用无菌水漂洗3遍，待表面多余水分晾干后放置于AS培养基上培养24h(光照14h，黑暗10h)后进行GUS组织化学染色。

1.4.2GUS组织化学染色及显微观察

1)GUS染液的配置：

10mgX-luc溶于100μLN，N-二甲基酰胺；

5mmol/L铁氰化钾；

5mmol/L亚铁氰化钾；

10mmol/LEDTA(pH8.0)；

0.5％TritonX-100；

用100mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)定容；

磷酸钠缓冲液(pH7.0)：0.2mol/L磷酸氢二钠62mL；

0.2mol/L磷酸二氢钠38mL；

2)剪取转基因植物的组织放入2.0mL的Ep管中，加入配好的染色液，使染色液浸没植物组织；

3)37℃培养箱中避光温育12h；

4)将染色后的组织转入FAA固定液中固定2h，再转入无水乙醇中脱色1天(去除叶绿素)，至阴性对照材料成白色或黄白色为止，FAA固定液(100mL)配方如下：

5)在SZX16型荧光体视显微镜及vhx-2000型超景深三维显微系统下观察GUS染色结果。

2、结果与分析

2.1花生启动子的克隆

经过两轮巢式PCR扩增后，基因组步移结果如图2A所示，以第一轮巢式PCR产物1/10稀释液为模板进行PCR获得长度约为2kb特异性条带。测序结果表明，该片段长度2129bp，其3'端与已知的contig4796序列5'端有202bp相同，说明通过基因组步移获得的片段是该基因的上游序列。根据测序结果设计引物，对步移获得的上游序列进行验证，能扩增获得约1.5kb和700bp的两个条带(图2B)，将1.5kb的条带连接T载体进行测序，结果表明该序列与步移结果较为一致，仅有几个碱基的差异。此次步移在已知序列的基础上向前步移了1369bp。(见SEQIDNO2)

图3为contig4796基因启动子序列与结构，其中标注*号的斜体字ATG为起始密码子；2个种子特异元件RY-element均用灰色背景的字标出。

2.2植物表达载体的构建及转化农杆菌

以pCAMBIA2300.1为基础载体，用基因组步移获得的组织特异启动子替换pCAMBIA2300.1上的CaMV35S启动子，构建成相应的组织特异表达基因启动子驱动的植物表达载体，表达载体构建流程如图4：

以花生基因组为模板，分别用引物对PFH₁₂₈₆/PRB、PFH₁₀₇₄/PRB、PFH₄₀₄/PRB扩增contig4796上游1286bp(SEQIDNO5)、1074bp(SEQIDNO4)和404bp(SEQIDNO3)的启动子片段(图5)，将PCR产物加A尾后连接pMD-19T载体进行测序，结果与已验证的序列完全一致。

将获得的pMD-PFH₁₂₈₆、pMD-PFH₁₀₇₄、pMD-PFH₄₀₄及基础载体p2300.1用BamHI和HindШ双酶切，将目的片段与基础载体连接，获得植物表达载体p2300.1-27H₁₂₈₆、p2300.1-27H₁₀₇₄和p2300.1-27H₄₀₄，用BamHI和HindШ分别对3个载体进行消化，分别获得1286bp、1074bp和404bp的条带，且条带大小与PCR产物一致(图6)，测序证明植物表达载体p2300.1-27H₁₂₈₆、p2300.1-27H₁₀₇₄和p2300.1-27H₄₀₄正确。将p2300.1-27H₁₂₈₆、p2300.1-27H₁₀₇₄和p2300.1-27H₄₀₄转化农杆菌LBA4404，PCR扩增分别获得1286bp、1074bp和404bp的启动子片段(图7)。

2.3种子特异启动子的瞬时表达

取花生种子和烟草的根、茎、叶，分别浸于含有p2300.1和p2300.1-27H₁₂₈₆、p2300.1-27H₁₀₇₄、p2300.1-27H₄₀₄质粒的农杆菌LBA4404菌液中。对侵染后的花生种子和烟草的根、茎、叶进行GUS染色，结果显示，转化p2300.1载体(阳性对照)的花生种子上有明显的蓝色斑点(图8)，并且烟草的根、茎、叶都被不同程度的染成蓝色(图8)，说明瞬时表达体系可用于对启动子功能的初步确定。转化p2300.1-27H₄₀₄载体的花生种子上有部分区域被染成蓝色(图8)，烟草的侧根和茎也呈现出蓝色，但烟草的主根和叶片没有被染成蓝色，说明404bp的截短启动子具有种子和侧根表达特异性。转化p2300.1-27H₁₂₈₆和p2300.1-27H₁₀₇₄载体的花生种子上有部分区域被染成蓝色(图8)，但烟草的根、茎和叶片没有被染成蓝色，说明1286bp的启动子和1074bp的启动子具有种子表达特异性。

Claims (6)

1.种子或/和根尖特异性表达启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO3、SEQIDNO4或SEQIDNO5所示。

2.一种表达载体，含有权利要求1所述的特异性表达启动子。

3.权利要求2所述的表达载体在转基因植物中的应用，该表达载体中插入有抗虫基因，将该表达载体转入植物中，使其在花生种子或烟草根尖中表达该抗虫基因，以防治地下害虫，所述表达载体中含有SEQIDNO3所述序列的特异性表达启动子。

4.权利要求2所述的表达载体在转基因植物中的应用，该表达载体中插入有抗虫基因，将该表达载体转入植物中，使其在花生种子中表达该抗虫基因，以防治地下害虫，所述表达载体中含有SEQIDNO4或SEQIDNO5所述序列的特异性表达启动子。

5.权利要求1所述的种子或/和根尖特异性表达启动子在转基因植物中的应用，为将含有权利要求1所述的种子或/和根尖特异性表达启动子和抗虫基因的表达载体转入植物中，使其在花生种子或烟草根尖表达该抗虫基因，以防治地下害虫，所述特异性表达启动子的核苷酸序列如SEQIDNO3所述。

6.权利要求1所述的种子或/和根尖特异性表达启动子在转基因植物中的应用，为将含有权利要求1所述的种子或/和根尖特异性表达启动子和抗虫基因的表达载体转入植物中，使其在花生种子表达该抗虫基因，以防治地下害虫，所述特异性表达启动子的核苷酸序列如SEQIDNO4或SEQIDNO5所述。