CN103966220B - 人工合成的根特异启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“人工合成的根特异启动子及其应用”，属于生物技术领域。人工合成的根特异性启动子，命名为SRS1，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，利用重叠PCR方法添加35S启动子部分区域及Omega序列，合成的序列为SRSO1，以pCAMB2300.1为基础载体(含有GUSplus报告基因)，分别用人工合成的启动子替换pCAMBIA2300.1上的CaMV35S启动子，得到表达载体p2300.1‑SRSO1，转化农杆菌后，转入烟草中验证，表明启动子SRS1具有根特异性表达特性。该人工合成的启动子SRS1，丰富了根特异表达启动子的种类，可用于植物抗虫基因的根部表达，防治地下害虫。

Description

人工合成的根特异启动子及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及根部特异表达启动子，其克隆、功能验证其应用。

背景技术

组织特异性启动子，可以避免蛋白合成的浪费，使基因只在某些特定的器官或组织中表达。目前相继发现的组织特异性启动子主要有根部特异、果实特异、维管组织特异、花粉管特异、韧皮部特异、种子特异和块茎特异等组织特异启动子，是研究基因功能及表达特性的重要工具，尤其在植物基因工程育种中发挥重要作用。

根是植物体的重要器官，除了吸收土壤中的水分及养分、贮存合成有机物质，还和土壤中的微生物有密切的互作关系。植物根系容易受地下害虫的啃食，继而感染根腐病、茎腐病等细菌真菌病害的几率增加，造成作物部分产区的减产绝收。植物抗病虫基因工程的研究已经在我国陆续的展开，根部特异表达启动子的获得，对于保证抗病虫外源基因在作物根中特异、稳定、高效表达及增加转基因生物安全性具有重要意义。目前已克隆到的植物根特异性启动子主要在拟南芥、水稻、烟草、大豆、玉米、松树、胡萝卜、番茄中，这些启动子驱动的基因多与根系分泌、次生代谢有关。

在植物基因工程应用中，由于所使用的天然启动子与植物内源基因启动子存在潜在的同源性，因此可能会造成外源基因的沉默(Thierry D,Vaucheret H.Sequence homologyrequirements for transcriptional silencing of 35S transgenes andpost-transcriptional silencing of nitrite reductase(trans)genes by the tobacco 271locus.Plant Molecular Biology,1996,32(6):1075-1083.)。而人工合成启动子不存在这一问题，可极大程度上避免由于启动子同源性造成的基因沉默。另外，与天然启动子相比，人工启动子可根据不同目的合成各种组织特异或广泛诱导型启动子，从而在基因表达时间和空间上进行更为精确的调控(彭舒,黄真池,欧阳乐军等.植物基因工程中人工启动子的研究进展.植物生理学报,2011,47(2):141-146.)。

发明内容

针对上述领域中的需求，本发明合成了两条启动子序列SRS1和SRS2，通过实验验证，人工合成的启动子序列SRS1具有根特异表达的特性，而SRS2并不具有该特性。该人工合成的根特异启动子SRS1可用于植物地下害虫防治。

人工合成的根特异性启动子，命名为SRS1，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。

合成的启动子，命名为SRSO1，其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。

一种表达载体，其含有上述根特异性启动子SRS1。

上述表达载体在转基因植物中的应用。

上述人工合成的根特异性启动子在转基因植物中的应用。

所述应用为将含有该根特异性启动子和抗虫基因的表达载体转入植物中，使其在植物根部表达该抗虫基因，以防治地下害虫。

本发明根据表达元件合成了两个启动子序列SRS1、SRS2(SEQ ID NO1、SEQ ID NO2)，利用重叠PCR方法添加35S启动子部分区域及Omega序列，合成的序列为SRSO1和SRSO2(SEQID NO3、SEQ ID NO4)，以pCAMB2300.1为基础载体(含有GUSplus报告基因)，分别用人工合成的启动子替换pCAMBIA2300.1上的CaMV 35S启动子，得到两个表达载体p2300.1-SRSO1/p2300.1-SRSO2，转化农杆菌后，转入烟草中验证，表明启动子SRS1具有根特异性表达特性，而启动子SRS2没有根特异表达的特性。

该人工合成的启动子SRS1，丰富了根特异表达启动子的种类，可用于植物抗虫基因的根部表达，防治地下害虫。

附图说明

图1利用重叠PCR合成人工启动子SRSO1，

其中A：SRS1、35S mini及Ω序列的PCR扩增；B：利用重叠PCR合成人工启动子SRSO1；M：DL500marker；N：阴性对照(ddH₂O)；1：SRS1片段的PCR扩增结果；2：35S-mini promoterPCR扩增结果；3：Ω序列PCR扩增结果；4：利用重叠PCR合成人工启动子SRSO1，

图2 p2300-SRSO1/p2300.1-SRSO2酶切鉴定，

其中M：DL15000marker；1：人工启动子SRSO1的PCR扩增；2：p2300.1-SRSO1/BamH I+HindIII；3：p2300.1-SRSO2/BamH I+Hind III，

图3 p2300.1-SRSO1/p2300.1-SRSO2转化农杆菌LBA4404的PCR鉴定

其中M：DL500marker；N：阳性对照(ddH₂O)；P：阳性对照(plasmid DNA)；1、2：p2300.1-SRSO1转化农杆菌的PCR检测结果；3、4：p2300.1-SRSO2转化农杆菌的PCR检测结果，

图4转p2300.1-SRSO1、p2300.1-SRSO2烟草的GUS染色结果，

其中A：烟草叶片(转化p2300.1-SRSO1载体)；B：根部(转化p2300.1-SRSO1载体)；C：烟草叶片(转化p2300.1-SRSO2载体)；D：根部(转化p2300.1-SRSO2载体)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

下面所涉及的实验材料均为己公开的或市售的材料。

1、实验步骤和方法

1.1人工启动子SRS1和SRS2的构建

人工合成两条启动子序列SRS1，SRS2，序列交由金维智生物科技(苏州)有限公司进行化学合成。

SEQ ID NO1：SRS1：

aagcttGATTATTTACTCTTGTAAATAAAAGAGAACGTGATTTACTCTTGTAAATAAAAGAGAACGTGACTGTGTAGCACTGTGTACATAACTGTGTACATTTGAAACTGTGTAAAGTTTTATCTTTAGTTTTTAATCTTTACTTTTAATCTTTTAATAAAGATTAGAGCCTTGAACGGCAAGTTTCACGCTGTCACTTGATAATTAATTCATATTTTAAAAATATTAAATAAATTAATTTTTAATATTTACCAGAAATGATAATTAATTCATATTTTTTTATCAAGCATGCTTCTTGC

SEQ ID NO2：SRS2：

aagcttCCATTAGATCTCTTCAATTTCAAAGAGAATCATCCAAACTCTTCAATTTCAAAGAGATTCCTACTGTGTAAGACTGTGTATCTAACTGTGTAGAAAGCAAACTGTGTATTGTAATATCTTTGGAATACAATCTTTCAATACGATCTTTATTTAAAGATAAGTTACTTGAACGGCAAGTTTCACGCTGTCACTCCATTATAACAACATATTTATTAAATATTATTTACATTAATAATTAATATTCAAACATTACGATAATTAATTCATATTTAATTATCAAGCATGCTTCTTGC

利用重叠PCR方法添加35S启动子部分区域及Omega序列，合成的序列为SRSO1和SRSO2，(见SEQ ID NO3、SEQ ID NO4)所用到的引物如下，小写部分为所加酶切位点：

proSRSFH1：5'-aagcttGATTATTTACTCTTGTAAAT-3'

proSRSFH2:5'-aagcttCCATTAGATCTCTTCAATTT-3'

proSRSRcd：5'-GAAGGATAGTGGGATTGCAAGAAGCATGCTT-3'

35SminiFcd：5'-AAGCATGCTTCTTGCAATCCCACTATCCTTC-3'

35SminiRcd：5'-AATTGTTGTAAAAATTCCTCTCCAAATGAAATG-3'

OmegaFcd：5'-CATTTCATTTGGAGAGGAATTTTTACAACAATT-3'

OmegaRB：5'-ggatccTGTAATTGTAAATAGTAATTG-3'

35S启动子部分区域及Omega序列扩增所用引物对分别为35sminiFcd/35sminiRcd和OmegaFcd/OmegaRB，PCR反应体系和反应条件如下：

用2％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测。

启动子扩增所用引物对为proSRSFH1、proSRSFH2/proSRSRcd，PCR扩增条件如下：

以proSRSFH1、proSRSFH2/OmegaRB为引物，利用重叠PCR方法合成人工启动子SRSO1和SRSO2，PCR反应体系及条件如下：

先不加上下游引物进行5轮PCR循环扩增，再加入上下游引物各0.5μL，进行25个循环扩增，产物用2％琼脂糖凝胶进行电泳检测。

PCR产物纯化加A尾，再次纯化后连T载体，转化DH5α。阳性转化子鉴定体系及条件如下：

将PCR阳性克隆的菌液送交北京华大基因生物技术公司测序。

1.2人工合成启动子SRSP植物表达载体的构建及转化农杆菌

以pCAMB2300.1为基础载体(含有GUSplus报告基因)，分别用人工合成的启动子替换pCAMBIA2300.1上的CaMV 35S启动子，酶切位点为BamH I和Hind III构建成分别由启动子SRSO1和SRSO2驱动的植物表达载体。

1.2.1根癌农杆菌电击感受态细胞制备

1)将农杆菌LBA4404划线接种于含链霉素抗性的固体LB培养基上，30℃培养约40h至有单菌落长出。

2)挑取单菌落，接种于5mL含有100mg/L Sm^r的液体LB培养基中，30℃，220rpm培养40h。

3)将1mL菌液接种至50mL含Sm^r的液体LB培养基中，28℃、220rpm培养5-6h，至OD₆₀₀＝0.8；

4)4℃，4500g离心10min，收集菌体；

5)用20mL预冷的无菌水洗涤菌体，4500g离心10min收集菌体，重复洗涤2次。

6)用2mL预冷的无菌水重悬菌体，加入等体积50％甘油轻柔混匀，分装100μL/管，-70℃存储备用。

1.2.2电击转化重组质粒到LBA4404感受态细胞

1)取3μL重组质粒p2300.1-SRSO1、p2300.1-SRSO2分别加入到100μL LBA4404感受态细胞中，轻柔混均，置于冰上约15min；

2)将菌液转移至0.2cm预冷的电击杯中，电击转化条件为：2000V、25μF、200Ω；

3)向电击杯中加入600μL预冷的液体LB培养基，轻柔混匀，转至新的1.5mL无菌离心管中，28℃培养8h；

4)4500转离心5min，倒掉约600μL上清，剩余约100μL悬浮菌体涂布于含100mg/LKm^r和100mg/L链霉素的固体LB培养基上；

5)将平板倒置于28℃温箱培养，约48h即会有单菌落长出。

1.3人工合成启动子在烟草中的功能验证

1.3.1烟草的培养

1)将烟草种子置于1.5mL离心管中，加入1mL 80％的乙醇浸泡2min。

2)倒掉乙醇，加入1mL 5％的NaClO溶液，轻摇浸泡5min。

3)倒掉NaClO溶液，用移液器尽量去除剩余液体，用无菌水冲洗2遍。

4)0.1％升汞浸泡5min，无菌水洗3次，置于无菌纸上晾干。

5)将灭菌的种子播种于MS基础培养基上，28℃，光照14h培养。

1.3.2农杆菌对烟草的侵染

1)从-70℃冰箱中取出分别含有p2300.1-SRSO1、p2300.1-SRSO2的农杆菌活化

2)将烟草叶片剪成直径1cm的叶盘，浸泡于制备好的农杆菌中，28℃，220rpm侵染20min。

3)用无菌水冲洗叶盘3次，将叶盘正置放在含有50μmol/L乙酰丁香酮的共培养培养基上暗培养2天；

4)将共培养后的叶盘转到选择分化培养基(MS+2mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+500mg/LCb+50mg/L Km)上，保证叶盘边缘与培养基充分接触，放置于28℃温室中光照培养，每十天更换一次培养基；

5)待叶盘分化出的小芽长至1cm左右，切下小芽并转移到选择生根培养基中(MS+0.2mg/L NAA+300mg/L Cb+50mg/L Km)继续培养，每15～20天更换一次培养基。

1.GUS染液的配置：

10mg X-luc溶于100μL N，N-二甲基酰胺；

5mmol/L铁氰化钾；

5mmol/L亚铁氰化钾；

10mmol/L EDTA(pH 8.0)；

0.5％TritonX-100；

用100mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.0)定容；

磷酸钠缓冲液(pH 7.0)：0.2mol/L磷酸氢二钠62mL；

0.2mol/L磷酸二氢钠38mL；

2.剪取转基因植物的组织放入2.0mL的Ep管中，加入配好的染色液，使染色液浸没植物组织；

3.37℃培养箱中避光温育12h；

4.将染色后的组织转入FAA固定液中固定2h，再转入无水乙醇中脱色1天(去除叶绿素)，至阴性对照材料成白色或黄白色为止，FAA固定液(100mL)配方如下：

5.在SZX16型荧光体视显微镜及vhx-2000型超景深三维显微系统下观察GUS染色结果。

结果分析

1、以启动子SRS1表达载体的构建为例：分别以SRS1、p2300.1-35S和Ω序列为模板，用引物对proSRSFH1/proSRSRcd、35SminiFcd/35SminiRcd、OmegaFcd/OmegaRB进行扩增，分别获得313bp的SRS片段、62bp的35S启动子片段和66bp的Ω序列片段(图1中的A)。然后以这三个片段为模板，用引物对proSRSFH/OmegaRB通过重叠PCR的方法，获得人工启动子SRSO1，大小为434bp(图1中的B)。将PCR产物连接pMD-19T载体测序，获得载体pMD-SRSO1，结果表明人工启动子构建正确，核酸序列见SEQ ID NO3，同法获得启动子SRSO2，大小为434bp，核酸序列见SEQ ID NO4。

SEQ ID NO3：SRSO1：

aagcttGATTATTTACTCTTGTAAATAAAAGAGAACGTGATTTACTCTTGTAAATAAAAGAGAACGTGACTGTGTAGCACTGTGTACATAACTGTGTACATTTGAAACTGTGTAAAGTTTTATCTTTAGTTTTTAATCTTTACTTTTAATCTTTTAATAAAGATTAGAGCCTTGAACGGCAAGTTTCACGCTGTCACTTGATAATTAATTCATATTTTAAAAATATTAAATAAATTAATTTTTAATATTTACCAGAAATGATAATTAATTCATATTTTTTTATCAAGCATGCTTCTTGCAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGAATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACTATTTACAATTACAggatcc

SEQ ID NO4：SRSO2：

aagcttCCATTAGATCTCTTCAATTTCAAAGAGAATCATCCAAACTCTTCAATTTCAAAGAGATTCCTACTGTGTAAGACTGTGTATCTAACTGTGTAGAAAGCAAACTGTGTATTGTAATATCTTTGGAATACAATCTTTCAATACGATCTTTATTTAAAGATAAGTTACTTGAACGGCAAGTTTCACGCTGTCACTCCATTATAACAACATATTTATTAAATATTATTTACATTAATAATTAATATTCAAACATTACGATAATTAATTCATATTTAATTATCAAGCATGCTTCTTGCAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGAATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACTATTTACAATTACAggatcc

将获得的pMD-SRSO1及基础载体pCAMB2300.1用BamH I和HindШ双酶切，将目的片段分别与两个基础连接，获得植物表达载体p2300.1-SRSO1，用BamH I和HindШ分别对2个载体进行消化，获得434bp的条带，且条带大小与PCR产物一致(图2)。测序结果表明2个植物表达载体正确。将这2个表达载体分别转化农杆菌LBA4404，PCR扩增获得434bp的启动子片段(图3)。

2、人工合成启动子SRS1及SRS2在烟草中的功能验证

将p2300.1-SRSO1和p2300.1-SRSO2两个植物表达载体，采用农杆菌介导的侵染叶盘法对野生型烟草进行遗传转化。目前2个载体已获得了部分抗性苗(表1)。

表1转p2300.1-SRSO1/p2300.1-SRSO2烟草的统计

结果表明，转化载体p2300.1-SRSO1的烟草中GUS基因仅在根部表达，根部为蓝色(图4中的A)，而叶片没有被染成蓝色，GUS基因在叶片中检测不到表达(图4中的B)，这说明启动子SRS1指导基因在烟草根部特异表达。而转化载体p2300.1-SRSO2的烟草根部及叶片都未被染成蓝色，GUS基因在根部、叶片都无表达，说明启动子SRS2不能指导基因在烟草中的表达。

Claims (6)

1.合成的启动子，命名为SRSO1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.一种表达载体，其含有权利要求1所述的启动子。

3.权利要求2所述表述载体在转基因植物中的应用,所述植物为烟草。

4.根据权利要求3所述的应用，所述表述载体中含有抗虫基因，将该载体转入植物，使其在植物根部表达该抗虫基因，以防治地下害虫。

5.权利要求1所述的启动子在转基因植物中的应用,所述植物为烟草。

6.权利要求5所述应用，为将含有权利要求1所述的启动子和抗虫基因的表达载体转入植物中，使其在植物根部表达该抗虫基因，以防治地下害虫。