CN104829702B

CN104829702B - 一种橡胶树木质素合成调控相关蛋白HbMYB85及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN104829702B
Application number: CN201510244287.7A
Authority: CN
Inventors: 仇键; 校现周; 罗世巧; 刘彤; 魏芳; 杨文凤; 高宏华
Original assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2015-05-14
Filing date: 2015-05-14
Publication date: 2017-12-19
Anticipated expiration: 2035-05-14
Also published as: CN104829702A

Abstract

本发明公开了一种橡胶树木质素合成调控相关蛋白HbMYB85及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，命名为HbMYB85蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物次生细胞壁厚度和/或木质素合成调控相关的由序列1衍生的蛋白质。HbMYB85基因也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将HbMYB85基因导入目的植物，得到次生细胞壁厚度和/或木质素含量高于所述目的植物的转基因植物。本发明对促进植物次生细胞壁增厚和木质素积累，特别是橡胶树木材品质遗传改良和抗风新品种培育具有重要意义。

Description

一种橡胶树木质素合成调控相关蛋白HbMYB85及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种橡胶树木质素合成调控相关蛋白HbMYB85及其编码基因与应用。

背景技术

林木是国民经济建设发展中不可或缺的重要工业原料，在生态环境建设中也发挥了巨大的生态效益。伴随公众对天然林过度开发和生物多样性损失的持续关注，发展可持续经营的人工林，保护现有天然森林资源，已逐渐成为现代林业发展的全球共识。我国作为一个森林资源严重匮乏的国家，木材供需矛盾尤为尖锐，因此加速优质速生人工林树种的遗传改良，提高我国自有人工林产量和品质，是保障我国林业可持续发展的必由之路。

橡胶树(Hevea brasiliensis)系热带乔木，是世界多数热带、亚热带地区种植的主要人工林树种，不但是天然橡胶(不可替代的工业原料)的主要来源，还是一种可持续的木材资源。据统计：全世界橡胶树种植面积已达900万公顷，每年可提供橡胶木2900万立方，其中制材原木800万立方；我国橡胶树种植面积也达到77.6万公顷，每年可获取木材50万立方左右，用于家具、模板、层合板等产品的制造。目前，橡胶木已逐渐成为我国南方重要的人工林商品材之一，不仅产生了显著的经济效益，而且对保障我国木材供应安全、缓解森林资源保护压力上都发挥了重要的作用。

虽然橡胶树木材经济和社会效益已得到了国际社会的广泛认可，但橡胶树属速生树种，其木材材质松脆，密度偏低，物理力学性能较差，并不能很好的满足市场需求，制约了橡胶树作为人工林木材资源的发展。因此，我国要实现橡胶树木材资源高效利用，充分体现橡胶树在国家木材供应安全和森林资源保护中的作用，就应从橡胶树木材的品质性能提升入手，注重橡胶树材性相关性状的遗传改良，培养一批胶乳产量高、木材质优、抗风性能强的新品种。

木材(即次生木质部)主要由木质部纤维、管状分子和薄壁细胞组成，是多年生木本植物维管形成层分化产生的次生木质部不断沉积、累加的结果，需经过细胞分裂、细胞增大、次生细胞壁增厚(即次生壁生物合成)、木质化和细胞程序性死亡等一系列严格的分化程序。从组成上看，木材主要由纤维素，木质素和半纤维素组成，其中木质素作为植物次生壁的重要组成成分，与林木的木材形成密切相关。研究橡胶树的木质素合成调控，对橡胶木材性改良和定向培育具有重要意义。木质素是维管植物细胞壁是中最主要的生物质之一，具有细胞壁加厚、机械支持、水分运输以及病虫害防御等重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种橡胶树木质素合成调控相关蛋白HbMYB85及其编码基因与应用。

本发明提供的蛋白质，来源于巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)，命名为HbMYB85蛋白，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物次生细胞壁厚度和/或植物木质素含量相关的由序列1衍生的蛋白质。

为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白质的基因(HbMYB85基因)也属于本发明的保护范围。

所述基因具体可为如下(1)或(2)或(3)或(4)的DNA分子：

(1)编码区如序列表的序列2自5’末端第69-902位核苷酸所示的DNA分子；

(2)序列表的序列2所示的DNA分子；

(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码植物次生细胞壁厚度和/或植物木质素合成调控相关蛋白的DNA分子；

(4)与(1)或(2)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码植物次生细胞壁厚度和/或植物木质素合成调控相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗。上述严格条件也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。

含有HbMYB85基因的表达盒、重组载体(如重组表达载体)、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于进行鉴定及筛选，可对所述重组表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。

所述重组载体具体可为将序列表的序列2所示的双链DNA分子插入PCXSN质粒的XcmⅠ酶切位点得到的重组质粒PCXSN-HbMYB85。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述HbMYB85基因导入目的植物中，得到次生细胞壁厚度和/或木质素含量高于所述目的植物的转基因植物。所述HbMYB85基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物。所述方法中，所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述HbMYB85基因具体可通过重组质粒PCXSN-HbMYB85导入所述目的植物。所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥。

本发明还保护HbMYB85蛋白、HbMYB85基因或含有HbMYB85基因的重组表达载体在培育次生细胞壁厚度和/或木质素含量增高的转基因植物中的应用。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥。

本发明还保护HbMYB85蛋白在促进植物细胞壁增厚和/或植物木质素积累中的应用。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥。

本发明对于培育高木质素含量的转基因植物，特别是高木质素含量的转基因橡胶树或转基因拟南芥具有重大的应用价值。本发明对促进植物次生细胞壁增厚和木质素合成积累，特别是橡胶树木材品质遗传改良和抗风新品种培育具有重要意义。

附图说明

图1为HbMYB85基因在橡胶树不同部位的表达水平比较。

图2为HbMYB85蛋白的亚细胞定位分析。

图3为HbMYB85蛋白的转录激活活性分析。

图4为PCXSN-HbMYB85的元件结构示意图。

图5为部分PCR鉴定结果。

图6为实时荧光定量PCR的结果。

图7为木质素分析的结果。

图8为次生细胞壁分析的结果。

图9为木质素含量检测的结果。

图10为木质代谢途径酶基因的表达分析的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

哥伦比亚生态型拟南芥(Col)：购自ABRC。pGBKT7载体：clontech。酵母Y2HGold菌株：clontech。EHA105农杆菌菌株：上海迈其生物科技有限公司，货号CH5002B。

pCAMBIA1205-GFP载体记载于如下文献：作物学报，2014,40(7):1174-1181。

PCXSN质粒记载于如下文献：Plant Physiology,2009,150,1111–1121。

实施例1、HbMYB85蛋白及其编码基因的发现

获得橡胶树的叶片、茎、根、花、胶乳的EST序列数据库，筛选出茎中高丰度表达DNA片段，并与现有DNA片段进行同源比较分析，确定一条1000bp左右的EST组装后序列(contig)。基于contig设计一对特异性引物：5’-GCATTAGTGGAACTTGTTCAT-3’和5’-TTTTCTCACTACGTACGTACG-3’。提取橡胶品种“热研7-33-97”的树皮的总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板，采用特异性引物进行PCR扩增，扩增产物进行1％琼脂糖电泳，回收目的条带并克隆到pMD18-T载体上测序。

测序结果表明，扩增产物中具有一个基因，编码一个新蛋白。

将发现的新蛋白命名为HbMYB85蛋白，如序列表的序列1所示，由277个氨基酸残基组成。将编码HbMYB85蛋白的基因命名为HbMYB85基因，如序列表的序列2所示，自5’末端第69-902位核苷酸为开放阅读框。

实施例2、HbMYB85基因在橡胶树不同部位的表达水平比较

分别提取橡胶品种“热研7-33-97”的叶片、茎顶端、茎中部、茎下部、皮层和木质部的总RNA，将总RNA反转录为cDNA。使用CFX96(Bio-Rad公司)实时荧光定量PCR检测系统分析HbMYB85基因在橡胶树不同部位的表达水平。

实时荧光定量PCR检测HbMYB85基因所用的引物如下：

HbMYB85-QTF：5′-AGAGGCCTTCTAACTGAAGCA-3′；

HbMYB85-QTR：5′-TTTATGGAAGGATTCATGCG-3′。

实时荧光定量PCR的扩增反应程序：95℃预变性3min；95℃变性10s、60℃退火10s、72℃延伸30s，39个循环。

HbMYB85基因的相对表达水平以18S基因为内参进行归一化，用2-△△CT法表示基因的相对定量。

结果见图1。HbMYB85基因在橡胶树的木质部表达水平最高，在橡胶树的叶片中表达水平最低。

实施例3、HbMYB85蛋白的亚细胞定位分析

将序列表的序列2自5’末端第69-899位核苷酸插入pCAMBIA1205-GFP载体的XbaI和EcoRI酶切位点之间，得到重组质粒pCAMBIA1205-GFP-HbMYB85。

将pCAMBIA1205-GFP载体或重组质粒pCAMBIA1205-GFP-HbMYB85分别导入EHA105农杆菌菌株，得到重组农杆菌。

将重组农杆菌用含有150μM乙酰丁香酮和10mM MgCl₂的MES缓冲液(pH5.6、10mM)重悬，调节OD_600nm＝0.8，然后注射到烟草叶片，培养2天后在激光共聚焦显微镜下488nm激发观察。

结果见图2。与GFP不同，HbMYB85-GFP的荧光主要集中在细胞核中。结果表明，HbMYB85蛋白具有核定位特性。

实施例4、HbMYB85蛋白的转录激活活性分析

将HbMYB85基因亚克隆于pGBKT7载体中，得到重组质粒pGBKT7-HbMYB85。

将pGBKT7载体或重组质粒pGBKT7-HbMYB85分别导入酵母Y2HGold菌株，得到重组酵母(pGBK7-Y2HGold或pGBK7-HbMYB85-Y2HGold)。酵母感受态制备及转化方法参照Matchmaker One-Hybrid Library Construction&Screening Kit(clontech)说明书进行。

结果见图3。图3中：1为酵母菌位置示意图；2为Trp-一缺培养基生长，酵母菌位置与示意图一致，其中生长的酵母菌为阳性对照、pGBK7-HbMYB85-Y2HGold和pGBK7-Y2HGold；3为三缺培养基上X-gal活性检测实验，酵母菌位置与示意图一致，其中生长的酵母菌为阳性对照和pGBK7-HbMYB85-Y2HGold，不生长的菌为pGBK7-Y2HGold。结果表明，重组质粒pGBKT7-HbMYB85转入酵母Y2HGold后，能够在缺陷型培养基SD/-Trp/-His/-Ade上生长，能够与X-gal反应显色，说明HbMYB85具有转录激活活性。

实施例5、HbMYB85基因的功能验证

一、构建重组质粒

1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。

2、取步骤1得到的双链DNA分子，进行加A反应，回收反应产物。

3、用限制性内切酶XcmⅠ单酶切PCXSN质粒，回收约10kb的载体骨架。

4、将步骤2回收的反应产物与步骤3回收的载体骨架连接，得到重组质粒PCXSN-HbMYB85。PCXSN-HbMYB85的元件结构示意图见图4。根据测序结果，对重组质粒PCXSN-HbMYB85进行结构描述如下：在PCXSN质粒的XcmⅠ酶切位点插入了序列表的序列2所示的双链DNA分子。

二、制备转基因植物

1、将重组质粒PCXSN-HbMYB85导入EHA105农杆菌菌株，得到重组农杆菌。

2、取重组农杆菌菌体，用含5g/100ml蔗糖的1/2MS液体培养基重悬，使OD_600nm＝0.8，然后加入Silwet L-77并使其体积百分浓度为0.02％，得到侵染液。

3、将步骤2得到的侵染液用小喷壶喷施于哥伦比亚生态型拟南芥的花序，然后套袋并28℃暗培养2d，然后在正常条件下培养(23℃、光照强度5000lx、16h光照/8h黑暗)，收获种子。

4、取步骤3得到的种子，表面消毒后铺洒在含25mg/L潮霉素的1/2MS固体培养基上，在正常条件下培养(23℃、光照强度5000lx、16h光照/8h黑暗)2-3周，然后将生长正常的植株(即生长出真叶和根的植株)移栽到装有培养基质(将蛭石与营养土等体积混合，得到培养基质基质)的花盆中继续在正常条件下培养。

5、取步骤4中正常生长的植株的叶片，提取基因组DNA，采用F1和R1组成的引物对进行PCR鉴定(靶片段为938bp)，PCR鉴定为阳性的植株即为T1代转基因植株。

F1：5’-GCATTAGTGGAACTTGTTCAT-3′；R1：5’-TTTTCTCACTACGTACGTACG-3′。

部分PCR鉴定结果见图5。图5中，泳道1-6为PCR鉴定为阳性的植株，泳道7为Col，M为标准分子量DL2000。

6、取步骤5中PCR鉴定为阳性的植株，提取茎的总RNA并反转录成cDNA，以cDNA为模板，通过实时荧光定量PCR检测HbMYB85基因的表达量。

实时荧光定量PCR检测HbMYB85基因所用的引物如下：

HbMYB85-QTF：5′-AGAGGCCTTCTAACTGAAGCA-3′；

HbMYB85-QTR：5′-TTTATGGAAGGATTCATGCG-3′。

结果见图6。图6中，1-6分别为不同的转基因植株。HbMYB85基因在转基因植株中均有表达，而在哥伦比亚生态型拟南芥中未检测到。结果表明，HbMYB85基因已成功转化拟南芥并得到表达。

7、将T1代转基因植株自交获得T2代植株，将T2代植株自交获得T3代植株。分别提取T1代植株、抽样的T2代植株的基因组DNA，采用F1和R1组成的引物对进行PCR鉴定。对于某一株T1代植株来说，如果该植株为PCR鉴定阳性且该植株自交得到的T2代植株均为PCR鉴定阳性，该植株及其后代为纯合的转基因株系。

三、染色分析

分别对2个转基因株系(转基因株系3和转基因株系5)的T3代植株和哥伦比亚生态型拟南芥进行如下染色分析：

1、取生长60天的拟南芥植株距基部0.6cm的花序茎。

2、将步骤1得到的花序茎切成0.6厘米左右,放入FAA固定液中，在真空抽气机中抽气两次(每次6min)，然后室温静置过夜。

3、完成步骤2后，取花序茎，依次用50％乙醇溶液、70％乙醇溶液、85％乙醇溶液、95％乙醇溶液和纯乙醇各处理1.5小时。

4、完成步骤3后，取花序茎，先用等体积混合的乙醇/二甲苯混合物处理1.5小时，然后用纯二甲苯处理两次(每次1.5小时)。

5、完成步骤4后，取花序茎，用等体积混合的二甲苯/石蜡混合物60℃透蜡过夜，然后用纯石蜡透蜡两次(每次1.5小时)，然后在包埋机上对透蜡拟南芥材料进行包埋，然后切片(厚度为8μm)。

6、木质素分析(间苯三酚染色)

按照如下步骤进行切片染色：先用二甲苯处理9分钟，再用新的二甲苯处理3分钟，再用乙醇处理6分钟，再用95％乙醇溶液处理3分钟，再用3％间苯三酚溶液(溶剂为95％乙醇溶液)染色6分钟，再用25％盐酸溶液处理2分钟，显微观察。

结果见图7(A、B、C为茎横切面；D、E、F为维管束；G、H、I为束间纤维；co：皮层；ph：韧皮部；if：维管束间纤维；xy：木质部；pf:韧皮纤维)。相对哥伦比亚生态型拟南芥，转基因拟南芥的茎横切面间苯三酚染色面积变大，这说明过表达HbMYB85基因能使木质素沉积范围扩大，能够促进木质素合成和积累。

7、次生细胞壁分析(甲苯胺蓝染色)

按照如下步骤进行切片染色：先用二甲苯处理10分钟，再用新的二甲苯处理5分钟，再用乙醇处理5分钟，再用95％乙醇溶液处理5分钟，再用75％乙醇溶液处理5分钟，再用50％乙醇溶液处理5分钟，再用20％乙醇溶液处理5分钟，再用水处理5分钟，再用0.2％甲苯胺蓝溶液染色30秒，然后在纯水中多次洗净浮色，封片剂封片，晾干显微观察。

结果见图8(A、B、C为维管束；D、E、F为束间纤维；ve为导管；xf为木质纤维)。相对哥伦比亚生态型拟南芥，转基因拟南芥的导管、木质纤维和维管束间纤维的细胞壁都有增加，这说明过表达HbMYB85基因能够正调控次生细胞壁加厚。

四、木质素含量检测

分别对6个转基因转基因株系的T3代植株(每个株系10株，结果取平均值)和哥伦比亚生态型拟南芥进行如下木质素含量检测：

1、称取30mg冷冻干燥的拟南芥花序茎，加到15ml玻璃管中，向该玻璃管中加入5ml乙酰溴溶液(将1体积份乙酰溴与3体积份冰乙酸混合)并小心涡旋，然后50℃加热4小时(不时摇晃)，自然冷却后3000rpm离心5min，取上清液。

2、将4ml步骤1得到的上清液加入已装有10ml 2M NaOH水溶液和12ml冰乙酸的50ml玻璃管中，加入1ml 0.5M盐酸羟胺水溶液结束反应，然后在在280nm下测定吸光值。

3、以碱性木素(购自sigma-aldrich，货号370959)为标准品，按照上述方法绘制吸光值和木质素含量的标准曲线。标准曲线方程为：X＝Y/17.12，X代表反应液中木质素含量(单位mg/mL)，Y代表吸光值。

4、将步骤2得到的吸光值代入步骤3得到的标准曲线方程，计算植株花序茎的木质素含量。

结果见图9(图9的纵坐标代表每克干重的花序茎中含有木质素的毫克数)。图9中，1-6代表分别代表6个不同的转基因株系。结果表明，转基因植株的木质素含量较哥伦比亚生态型拟南芥增加，即过表达HbMYB85基因可以促进木质素合成。

五、木质代谢途径酶基因的表达分析

分别对转基因株系的T3代植株和哥伦比亚生态型拟南芥进行如下分析：

利用荧光定量检测拟南芥中次生壁发育相关酶(CCoAOMT、4CL1、HCT和CCR1)的表达，以EF1α基因(延长因子1α)为内参基因。引物序列表2。CCoAOMT为咖啡酰辅酶A-3-O-甲基转移酶基因，4CL1为4-香豆酸辅酶A连接酶基因，HCT为莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶基因，CCR1为肉桂酰辅酶A还原酶基因。

表2用于检测各个基因的引物序列

	正向引物(5’→3’)	反向引物(5’→3’)
			CCoAOMT基因	TCGTTGATGCTGACAAAGACA	ACTGATCCGACGGCAGATAG
4CL1基因	GGTTACCTCAACAATCCGGCA	ACGCGACAACAGCAACATCAG
			HCT基因	GAGATATGAGAGCGTTAAGC	ACACAGGATGATGACAAGA
CCR1基因	CCAAGTGCAAGGACGAGAAGAACCC	AGCTCTTGACTGTGTCGTAGAGGCTT
			EF1α基因	GGTAAGGAGATTGAGAAGGA	CGCTCTTAATAACACCAACA

结果见图10。相对哥伦比亚生态型拟南芥，转基因植株中木质素合成相关基因的表达都上调了，说明过表达HbMYB85基因可以促进木质素合成，从而对次生壁发育产生影响。

Claims

1.一种蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(1)或(2)的DNA分子：

(2)序列表的序列2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体或重组菌。

5.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到次生细胞壁厚度和/或木质素含量高于所述目的植物的转基因植物；所述目的植物为拟南芥。

6.权利要求1所述蛋白质、权利要求2所述基因、权利要求3所述基因或权利要求4所述重组载体在培育次生细胞壁厚度和/或木质素含量增高的转基因植物中的应用；所述植物为拟南芥。

7.权利要求1所述的蛋白质在促进植物细胞壁增厚和/或植物木质素积累中的应用；所述植物为拟南芥。