CN106397558A - 蛋白质及其编码基因在调控植物抗黄萎病性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了蛋白质及其编码基因在调控植物抗黄萎病性中的应用。所述蛋白质自N末端至C末端依次包括N端元件和C端元件；所述N端元件的氨基酸序列如序列表中序列2自N末端起第1至158位所示；所述C端元件的氨基酸序列如序列表中序列2自N末端起第166至313位所示。实验证明，向拟南芥中导入所述蛋白质的编码基因，得到叶柄长度增加和抗黄萎病性增加的转基因植物；向徐州142或陆地棉TM‑1中导入抑制蛋白质表达的物质，得到株高减少、株型紧凑、棉纤维长度减少和抗黄萎病性降低的转基因植物。因此，本发明提供的蛋白质对培育抗黄萎病的植物具有重要的理论意义和实用价值。

Description

蛋白质及其编码基因在调控植物抗黄萎病性中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及蛋白质及其编码基因在调控植物抗黄萎病性中的应用。
背景技术
黄萎病是目前危害棉花生产的重要病害之一，被称为棉花的“癌症”，遍布世界各产棉区，其病原为大丽轮枝菌。棉花黄萎病是一种土传、沿维管束系统侵染的真菌性病害，严重危害棉花生长发育，导致棉花纤维的产量和品质大大降低，给棉花生产造成巨大经济损失，严重影响棉花产业的可持续发展。
棉花是世界性的重要纤维作物，同时也是一种重要的油料与生物能源作物，在国民经济和社会发展中占有重要地位。但是我国的基本国情是人多地少，粮棉争地矛盾非常突出，因此，培育抗病的棉花新品种对于棉花生产至关重要。仅靠单一的常规传统育种方法由于缺乏有效抗源等问题，很难达到理想效果。因此，分离控制棉花发育和/或提高棉花抗病性的相关基因，有助于加快通过分子育种手段培育新的优质棉花品种。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗黄萎病性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种蛋白质。
本发明所提供的蛋白质，自N末端至C末端依次包括N端元件和C端元件；
所述N端元件的氨基酸序列如序列表中序列2自N末端起第1至158位所示；
所述C端元件的氨基酸序列如序列表中序列2自N末端起第166至313位所示。
所述蛋白质，可为如下a1)或a2)或a3)或a4)或a5)或a6)：
a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
a2)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；
a3)氨基酸序列是序列表中序列6所示的蛋白质；
a4)氨基酸序列是序列表中序列8所示的蛋白质；
a5)在a1)或a2)或a3)或a4)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a6)将a1)或a2)或a3)或a4)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗病性和/或发育性状相关的蛋白质；所述发育性状为株型和/或叶柄长度和/或株高和/或器官大小。
其中，序列表中序列2可由313个氨基酸残基组成。序列表中序列4可由306个氨基酸残基组成。序列表中序列6可由312个氨基酸残基组成。序列表中序列8可由313个氨基酸残基组成。
为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
为了使a2)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列4所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
为了使a3)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列6所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
为了使a4)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列8所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述a6)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述a6)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述a6)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1、序列表中序列3、序列表中序列5或序列表中序列7所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
所述植物可为如下c1)至c8)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)棉花；c4)棉花品种陆地棉TM-1；c5)棉花品种徐州142；c6)十字花科植物；c7)拟南芥；c8)拟南芥bri1-5。
所述抗病性可为抗黄萎病。
所述抗病性可为抗黄萎病菌引起的病害。所述黄萎病菌具体可为黄萎病强致病菌临西2-1。
编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。
编码所述蛋白质的核酸分子，具体可为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)或(b6)所示的DNA分子：
(b1)核苷酸序列是序列表中序列1或序列表中序列1自5’末端起第1至939位所示的DNA分子；
(b2)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
(b3)核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；
(b4)核苷酸序列是序列表中序列7所示的DNA分子；
(b5)与(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质的DNA分子；
(b6)在严格条件下与(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
序列表中序列1由942个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。序列表中序列3由918个核苷酸组成，序列表中序列3的核苷酸编码序列表中序列4所示的氨基酸序列。序列表中序列5由936个核苷酸组成，序列表中序列5的核苷酸编码序列表中序列6所示的氨基酸序列。序列表中序列7由939个核苷酸组成，序列表中序列7的核苷酸编码序列表中序列8所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列2、序列表的序列4、序列表的序列6或序列表的序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。
所述重组载体为向载体插入所述核酸分子得到的重组质粒。
所述载体具体可为载体pENTR/SD/D-TOPO或载体pMDC83。
所述重组载体具体可为重组质粒pGW-GhBZR1。所述重组质粒pGW-GhBZR1可为向载体pENTR/SD/D-TOPO插入序列表中序列1所示的DNA分子。
所述重组载体具体可为重组质粒35S::GhBZR1-GFP。所述重组质粒35S::GhBZR1-GFP中含有序列表中序列1自5'末端起第1至939位所示的DNA分子，表达序列表中序列2所示的蛋白质。
所述重组载体具体可为重组质粒pGW-△GhBZR1或重组质粒35S::△GhBZR1-GFP。所述重组质粒pGW-△GhBZR1或重组质粒35S::△GhBZR1-GFP中均含有序列表中序列3所示的DNA分子，表达序列表中序列4所示的蛋白质。
所述重组载体具体可为重组质粒pGW-GhBZR1△I160或重组质粒pGW-GhBZR1△I160-GFP。所述重组质粒pGW-GhBZR1△I160或重组质粒pGW-GhBZR1△I160-GFP中均含有序列表中序列5所示的DNA分子，表达序列表中序列6所示的蛋白质。
所述重组载体具体可为重组质粒pGW-GhBZR1S163G或重组质粒pGW-GhBZR1S163G-GFP。所述重组质粒pGW-GhBZR1S163G或重组质粒pGW-GhBZR1S163G-GFP中含有序列表中序列7所示的DNA分子，表达序列表中序列8所示的蛋白质。
所述重组微生物为将所述重组载体导入出发微生物得到的重组菌。
所述重组微生物具体可为将所述重组质粒35S::GhBZR1-GFP、所述重组质粒35S::△GhBZR1-GFP、所述重组质粒pGW-GhBZR1△I160-GFP或所述重组质粒pGW-GhBZR1S163G-GFP导入出发微生物得到的重组菌。
所述出发微生物可为根癌农杆菌。
所述根癌农杆菌具体可为根癌农杆菌GV3101。
所述转基因细胞系均不包括繁殖材料。
d1)或d2)的应用也属于本发明的保护范围：
d1)所述蛋白质，或，所述核酸分子，或，含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在调控植物抗病性中的应用；
d2)所述蛋白质，或，所述核酸分子，或，含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育发育性状改变的转基因植物中的应用；所述发育性状为株型和/或叶柄长度和/或株高和/或器官大小。
上述应用中，所述植物可为如下c1)至c8)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)棉花；c4)棉花品种陆地棉TM-1；c5)棉花品种徐州142；c6)十字花科植物；c7)拟南芥；c8)拟南芥bri1-5。
上述应用中，所述抗病性可为抗黄萎病。
上述应用中，所述抗病性可为抗黄萎病菌引起的病害。所述黄萎病菌具体可为黄萎病强致病菌临西2-1。
为解决上述技术问题，本发明还提供了培育转基因植物的方法。
本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可为方法一，包括在受体植物中过表达所述蛋白质，得到转基因植物的步骤；与所述受体植物相比，所述转基因植物具有如下表型：抗病性增加和/或叶柄长度增加和/或株高增加。
本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可为方法二，包括向受体植物中导入抑制所述蛋白质表达的物质，得到转基因植物的步骤；与所述受体植物相比，所述转基因植物具有如下表型：抗病性降低和/或株高减少和/或第一节间距减小和/或第四节间距减小和/或第五节间距减小和/或株型紧凑和/或第一果枝夹角减小和/或第二果枝夹角减小和/或第三果枝夹角减小和/或叶柄长度减少和/或棉纤维长度减少。
所述株高减少具体体现在主茎的第一节间距、第四节间距和五节间距的减小。
所述株型紧凑具体体现在主茎的第一果枝夹角、第二果枝夹角和三果枝夹角减小。
上述方法中，编码所述蛋白质的核酸分子，具体可为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)或(b6)所示的DNA分子：
(b1)核苷酸序列是序列表中序列1或序列表中序列1自5’末端起第1至939位所示的DNA分子；
(b2)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
(b3)核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；
(b4)核苷酸序列是序列表中序列7所示的DNA分子；
(b5)与(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质的DNA分子；
(b6)在严格条件下与(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
序列表中序列1由942个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。序列表中序列3由918个核苷酸组成，序列表中序列3的核苷酸编码序列表中序列4所示的氨基酸序列。序列表中序列5由936个核苷酸组成，序列表中序列5的核苷酸编码序列表中序列6所示的氨基酸序列。序列表中序列7由939个核苷酸组成，序列表中序列7的核苷酸编码序列表中序列8所示的氨基酸序列。
上述方法一中，所述“在受体植物中过表达所述蛋白质”可通过向受体植物中导入编码所述蛋白质的核酸分子实现。所述“向受体植物中导入编码所述蛋白质的核酸分子”可通过向受体植物中导入重组载体甲实现；所述重组载体甲可为向载体插入编码所述蛋白质的核酸分子得到的重组质粒。
所述重组载体甲具体可为重组质粒35S::GhBZR1-GFP。所述重组质粒35S::GhBZR1-GFP中含有序列表中序列1自5'末端起第1至939位所示的DNA分子，表达序列表中序列2所示的蛋白质。
上述方法二中，所述“抑制所述蛋白质表达的物质”可为抑制编码所述蛋白质的核酸分子的表达的物质。所述“抑制编码所述蛋白质的核酸分子的表达的物质”可通过向受体植物中导入重组质粒PTRV2-GhBZR1和载体PTRV1实现。所述重组质粒PTRV2-GhBZR1具体可为向载体PTRV2的限制性内切酶PstⅠ的识别序列间插入序列表中序列1自5'末端起第231至531位所示的DNA分子。
上述方法中，所述受体植物可为如下c1)至c8)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)棉花；c4)棉花品种陆地棉TM-1；c5)棉花品种徐州142；c6)十字花科植物；c7)拟南芥；c8)拟南芥bri1-5。
上述方法中，所述抗病性可为抗黄萎病。
上述方法中，所述抗病性可为抗黄萎病菌引起的病害。所述黄萎病菌具体可为黄萎病强致病菌临西2-1。
上文中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述核酸分子转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖所述核酸分子，也可用常规育种技术将所述核酸分子转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
实验证明，利用本发明提供的蛋白质及其编码基因能调控植物抗黄萎病性和发育性状(如株型和/或叶柄长度和/或株高和/或器官大小)：向拟南芥中导入蛋白质的编码基因，得到叶柄长度增加和抗黄萎病性增加的转基因植物；向徐州142或陆地棉TM-1中导入抑制所述蛋白质表达的物质，得到株高减少、株型紧凑、棉纤维长度减少和抗黄萎病性降低的转基因植物。因此，本发明提供的蛋白质对培育抗黄萎病的植物具有重要的理论意义和实用价值。
附图说明
图1为实施例2步骤三中2的实验结果。
图2为实施例2步骤三中3的实验结果。
图3为实施例3步骤三中1的实验结果。
图4为实施例3步骤三中2的实验结果。
图5为实施例3步骤三中3的实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
拟南芥bri1-5记载于如下文献中：Xuelu Wang，Xiaoqing Li，Ji11Mwisenhelder，Tony Hunter，Shigeo Yoshida，Tadao Asami，and Joanne Chory.Autoregulation andHomodimerization Are Involved in the Activation of thePlant Steroid ReceptorBRI1.Deve1opment Ce11，2005年第8期855-865.公众可以从中国科学院植物研究所(即申请人处)获得，以重复本申请实验。在下文中，拟南芥bri1-5简称bri1-5。
陆地棉TM-1记载于如下文献中：Tronlinder NL et al，1989，Plant Cell Rep 8:133-136.。徐州142记载于如下文献中：于晓红等，2000，中国科学(C辑)，30(5)：517-522。陆地棉TM-1和徐州142均为国家棉花种质资源中期库的产品。在下文中，陆地棉TM-1简称为TM-1，徐州142简称为Xu-142。
根癌农杆菌GV3101记载于如下文献中：郑银英，崔百明，常明进，彭明.转拟南芥ICE1基因增强烟草抗寒性的研究.西北植物学报.2009年29卷1期.75-79.公众可以从中国科学院植物研究所(即申请人处)获得，以重复本申请实验。
载体PTRV1和载体PTRV2均记载于如下文献中：Dong Y，Burch-Smith TM，Liu Y，Mamillapalli P，Dinesh-Kumar SP.A ligation-independent cloning tobacco rattlevirus vector for high-throughput virus-induced gene silencing identifiesroles for NbMADS4-1and-2in floral development.Plant physiol.2007年145期.1161-1170.公众可以从中国科学院植物研究所(即申请人处)获得，以重复本申请实验。
载体pENTR/SD/D-TOPO和载体pMDC83均为Invitrogen公司产品。
PDA培养基：去皮的马铃薯200g切成小块，加入1L蒸馏水煮沸30分钟，过滤，向滤液中加入葡萄糖20g和琼脂1g，用蒸馏水定容至1L，pH值自然，121℃高压灭菌15min。
查氏液体培养基：将硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、MgSO4·7H2O 0.5g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g和琼脂15g溶于蒸馏水，用蒸馏水定容至1000mL。
黄萎病强致病菌临西2-1记载于如下文献中：王国宁，赵贵元，岳晓伟，李志坤，张艳，张桂寅，吴立强，王省芬，马峙英,河北省棉花黄萎病菌致病性与ISSR遗传分化，棉花学报，2012，24(4)：348-357.在下文中，黄萎病强致病菌临西2-1简称为临西2-1。
侵染溶液：含10mM MES、10mM MgCl2和200mM乙酰丁香酮的水溶液。
实施例1、蛋白GhBZR1的编码基因和GhBZR1突变蛋白的编码基因的克隆
一、蛋白GhBZR1的编码基因的克隆
本发明的发明人从陆地棉TM-1中克隆出蛋白GhBZR1的编码基因，即GhBZR1基因。
1、采用Trizo1法提取生长至14天的陆地棉TM-1幼苗的叶片的总RNA，然后利用反转录酶AMV反转录出第一链cDNA。
2、人工合成引物F：5'-CACCATGACGTCAGATGGGGCGACGT-3'和R：5'-ACATCGAGCTTTCCCACTTCCG-3'。
3、完成步骤1和2后，以步骤1提取的cDNA为模板，以F和R为引物进行PCR扩增，得到约940bp的双链DNA分子。
4、将双链DNA分子和载体pENTR/SD/D-TOPO进行连接，得到重组质粒pGW-GhBZR1。
根据测序结果，重组质粒pGW-GhBZR1含有序列表中序列1自5'末端起第1至939位所示的DNA分子，表达序列表中序列2所示的蛋白质(以下简称蛋白质GhBZR1或蛋白GhBZR1)。
二、GhBZR1突变蛋白的编码基因的克隆
GhBZR1突变蛋白具体为蛋白△GhBZR1、蛋白GhBZR1△I160和蛋白GhBZR1S163G。
1、蛋白△GhBZR1的编码基因的克隆
1)人工合成引物F△GhBZR：5'-TCGTCTCTGCCTCCTCTCGTGACACCACCACTTTCT-3'和R△GhBZR：5'-TCGTCTCTGCCTCCTCTCGTGACACCACCACTTTCT-3'。
2)完成步骤1)后，以重组质粒pGW-GhBZR1为模板，以R△GhBZR和步骤一中2合成的F为引物，进行PCR扩增，得到双链DNA分子1；以重组质粒pGW-GhBZR1为模板，以F△GhBZR和步骤一中2合成的R为引物，进行PCR扩增，得到双链DNA分子2。
3)将双链DNA分子1和双链DNA分子2按照摩尔比1：1混合并以此为模板，以步骤一中2合成的F和R为引物进行PCR扩增，得到约920bp的双链DNA分子。
4)将约920bp的双链DNA分子和载体pENTR/SD/D-TOPO进行连接，得到重组质粒pGW-△GhBZR1。
根据测序结果，重组质粒pGW-△GhBZR1含有序列表中序列3所示的DNA分子(以下简称突变体基因1)，表达序列表中序列4所示的蛋白质(以下简称突变体蛋白1或蛋白△GhBZR1)。序列表中序列3所示的DNA分子与序列表中序列1自5'末端起第1至939位所示的DNA分子的唯一不同在于将后者的第475至495位核苷酸进行了删除。序列表中序列4所示的蛋白质与序列表中序列2所示的蛋白质的唯一不同在于将后者的第159至165位的氨基酸残基进行了删除。
2、蛋白GhBZR1△I160的编码基因的克隆
1)人工合成引物F△I160：5'-TCTCTGCCTCCTCTCAGATCTAATAGTGCCCCCGTG-3'和R△I160：5'-CACGGGGGCACTATTAGATCTGAGAGGAGGCAGAGA-3'。
2)完成步骤1)后，以重组质粒pGW-GhBZR1为模板，以R△I160和步骤一中2合成的F为引物，进行PCR扩增，得到双链DNA分子3；以重组质粒pGW-GhBZR1为模板，以F△I160和步骤一中2合成的R为引物，进行PCR扩增，得到双链DNA分子4。
3)将双链DNA分子3和双链DNA分子4按照摩尔比1：1混合并以此为模板，以步骤一中2合成的F和R为引物进行PCR扩增，得到约940bp的双链DNA分子。
4)将约940bp的双链DNA分子和载体pENTR/SD/D-TOPO进行连接，得到重组质粒pGW-GhBZR1△I160。
根据测序结果，重组质粒pGW-GhBZR1△I160含有序列表中序列5所示的DNA分子(以下简称突变体基因2)，表达序列表中序列6所示的蛋白质(以下简称突变体蛋白2或蛋白GhBZR1△I160)。序列表中序列5所示的DNA分子与序列表中序列1自5'末端起第1至939位所示的DNA分子的唯一不同在于将后者的第478至480位核苷酸进行了删除。序列表中序列6所示的蛋白质与序列表中序列2所示的蛋白质的唯一不同在于将后者的第160位的异亮氨酸残基进行了删除。
3、蛋白GhBZR1S163G的编码基因的克隆
1)人工合成引物FS163G：5'-ATCTCTAATGGTGCCCCCGTG-3'和RS163G：5'-CACGGGGGCACCATTAGAGAT-3'。
2)完成步骤1)后，以重组质粒pGW-GhBZR1为模板，以RS163G和步骤一中2合成的F为引物，进行PCR扩增，得到双链DNA分子5；以重组质粒pGW-GhBZR1为模板，以F163G和步骤一中2合成的R为引物，进行PCR扩增，得到双链DNA分子6。
3)将双链DNA分子5和双链DNA分子6按照摩尔比1：1混合并以此为模板，以步骤一中2合成的F和R为引物进行PCR扩增，得到约940bp的双链DNA分子。
4)将约940bp的双链DNA分子和载体pENTR/SD/D-TOPO进行连接，得到重组质粒pGW-GhBZR1S163G。
根据测序结果，重组质粒pGW-GhBZR1S163G含有序列表中序列7所示的DNA分子(以下简称突变体基因3)，表达序列表中序列8所示的蛋白质(以下简称突变体蛋白3或蛋白GhBZR1S163G)。序列表中序列7所示的DNA分子与序列表中序列1自5'末端起第1至939位所示的DNA分子的唯一不同在于将后者的第487位的A替换为了G。序列表中序列8所示的蛋白质与序列表中序列2所示的蛋白质的唯一不同在于将后者的第163位的丝氨酸残基替换为了甘氨酸残基。
实施例2、转基因拟南芥的获得及鉴定
一、重组载体和重组农杆菌的构建
1、重组质粒35S::GhBZR1-GFP和GV3101/35S::GhBZR1-GFP的获得
将实施例1步骤一构建的重组质粒pGW-GhBZR1和载体pMDC83进行LR重组反应，得到LR反应产物。
将LR反应产物加入TOP10感受态细胞进行转化，得到的克隆即为目标克隆，该目标克隆中的质粒为目标质粒，将该目标质粒命名为重组质粒35S::GhBZR1-GFP。测序结果表明，重组质粒35S::GhBZR1-GFP中含有序列表中序列1自5'末端起第1至939位所示的DNA分子，表达序列表中序列2所示的蛋白GhBZR1。
将重组质粒35S::GhBZR1-GFP导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101/35S::GhBZR1-GFP。
2、重组质粒35S::△GhBZR1-GFP和GV3101/35S::△GhBZR1-GFP的获得
将实施例1步骤二中1构建的重组质粒pGW-△GhBZR1和载体pMDC83进行LR重组反应，得到LR反应产物。
将LR反应产物加入TOP10感受态细胞进行转化，得到的克隆即为目标克隆，该目标克隆中的质粒为目标质粒，将该目标质粒命名为重组质粒35S::△GhBZR1-GFP。测序结果表明，重组质粒35S::△GhBZR1-GFP中含有突变体基因1，表达突变体蛋白1。
将重组质粒35S::△GhBZR1-GFP导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101/35S::△GhBZR1-GFP。
3、重组质粒pGW-GhBZR1△I160-GFP和GV3101/pGW-GhBZR1△I160-GFP的获得
将实施例1步骤二构建的重组质粒pGW-GhBZR1△I160和载体pMDC83进行LR重组反应，得到LR反应产物。
将LR反应产物加入TOP10感受态细胞进行转化，得到的克隆即为目标克隆，该目标克隆中的质粒为目标质粒，将该目标质粒命名为重组质粒pGW-GhBZR1△I160-GFP。测序结果表明，重组质粒pGW-GhBZR1△I160-GFP中含有突变体基因2，表达突变体蛋白2。
将重组质粒pGW-GhBZR1△I160-GFP导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101/pGW-GhBZR1△I160-GFP。
4、重组质粒pGW-GhBZR1S163G-GFP和GV3101/pGW-GhBZR1S163G-GFP的获得
将实施例1步骤二构建的重组质粒pGW-GhBZR1S163G和载体pMDC83进行LR重组反应，得到LR反应产物。
将LR反应产物加入TOP10感受态细胞进行转化，得到的克隆即为目标克隆，该目标克隆中的质粒为目标质粒，将该目标质粒命名为重组质粒pGW-GhBZR1S163G-GFP。测序结果表明，重组质粒pGW-GhBZR1S163G-GFP中含有突变体基因3，表达突变体蛋白3。
将重组质粒pGW-GhBZR1S163G-GFP导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101/pGW-GhBZR1S163G-GFP。
5、GV3101/pMDC83的获得
将载体pMDC83导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101/pMDC83。
二、转基因拟南芥的获得
1、采用拟南芥花序浸花转化法(记载于如下文献中Clough，S.J.，and Bent，A.F..Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformationof Arabidopsis thaliana.Plant J.(1998)16，735-743.)，将步骤一中1获得的GV3101/35S::GhBZR1-GFP转至拟南芥bri1-5中，获得T1代转GhBZR1基因拟南芥种子。
2、将步骤1获得的T1代转GhBZR1基因拟南芥种子播种于含有30mg/L的潮霉素的1/2MS培养基上，能够正常生长的拟南芥(抗性苗)即为T1代转GhBZR1基因阳性苗，T1代转GhBZR1基因阳性苗收到的种子即为T2代转GhBZR1基因拟南芥种子。
3、将步骤2筛选出的不同株系的T2代转GhBZR1基因拟南芥种子播种于含有30mg/L的潮霉素的1/2MS培养基上进行筛选，如果某株系中能够正常生长的拟南芥(抗性苗)的数目与不能够正常生长的拟南芥(非抗性苗)的数目比例为3：1，则该株系为GhBZR1基因插入一个拷贝的株系，该株系中的抗性苗收到的种子即为T3代转GhBZR1基因拟南芥种子。
4、将步骤3筛选出的T3代转GhBZR1基因拟南芥种子再次播种于含有30mg/L的潮霉素的1/2MS培养基上进行筛选，均为抗性苗的即为T3代纯合转GhBZR1基因拟南芥。将其中2个T3代纯合转GhBZR1基因拟南芥株系分别命名为OEGhBZR11-2和OEGhBZR11-4，并进行后续实验。
按照上述方法，将GV3101/35S::GhBZR1-GFP替换为GV3101/35S::△GhBZR1-GFP，其它步骤均相同，得到T3代纯合转突变体基因1拟南芥，将其中2个T3代纯合转突变体基因1拟南芥株系分别命名为OE△GhBZR1 2-5和OE△GhBZR1 2-9，并进行后续实验。
按照上述方法，将GV3101/35S::GhBZR1-GFP替换为GV3101/pGW-GhBZR1△I160-GFP，其它步骤均相同，得到T3代纯合转突变体基因2拟南芥，将其中2个T3代纯合转突变体基因2拟南芥株系分别命名为OEGhBZR1△I160 3-22和OEGhBZR1△I160 3-26，并进行后续实验。
按照上述方法，将GV3101/35S::GhBZR1-GFP替换为GV3101/pGW-GhBZR1S163G-GFP，其它步骤均相同，得到T3代纯合转突变体基因3拟南芥，将其中2个T3代纯合转突变体基因3拟南芥株系分别命名为OEGhBZR1△S163G 4-7和OEGhBZR1△S163G 4-13，并进行后续实验。
按照上述方法，将GV3101/35S::GhBZR1-GFP替换为GV3101/pMDC83，其它步骤均相同，得到T3代纯合转空载体拟南芥的植株，简称转空载体拟南芥。
三、转基因拟南芥的鉴定
1、分别取OEGhBZR1 1-2的T3代种子、OEGhBZR1 1-4的T3代种子、OE△GhBZR1 2-5的T3代种子、OE△GhBZR1 2-9的T3代种子、OEGhBZR1△I160 3-22的T3代种子、OEGhBZR1△I1603-26的T3代种子、OEGhBZR1△S163G 4-7的T3代种子、OEGhBZR1△S163G 4-13的T3代种子、转空载体拟南芥的T3代种子和拟南芥bri1-5的种子，种植于营养土中，25℃培养4周，依次得到OEGhBZR1 1-2的幼苗、OEGhBZR1 1-4的幼苗、OE△GhBZR1 2-5的幼苗、OE△GhBZR1 2-9的幼苗、OEGhBZR1△I160 3-22的幼苗、OEGhBZR1△I1603-26的幼苗、OEGhBZR1△S163G 4-7的幼苗、OEGhBZR1△S163G 4-13的幼苗、转空载体拟南芥的幼苗和拟南芥bri1-5的幼苗。
2、转基因拟南芥的表型鉴定
(1)观察步骤1各幼苗的表型。
实验结果见图1中A。结果表明，转空载体拟南芥的幼苗和拟南芥bri1-5的幼苗的表型无显著差异。与转空载体拟南芥的幼苗相比，OE△GhBZR1 2-5的幼苗、OE△GhBZR1 2-9的幼苗、OEGhBZR1△S163G 4-7的幼苗和OEGhBZR1△S163G 4-13的幼苗的叶柄变长，OEGhBZR1△S163G 4-13的幼苗的叶柄最长。
(2)Real-Time PCR检测GhBZR1基因的表达量
实验重复三次，每次重复的步骤如下：
①样本的获得
取步骤1得到的OEGhBZR1 1-2的幼苗，放入液氮保存，得到样本1。
取步骤1得到的OEGhBZR1 1-4的幼苗，放入液氮保存，得到样本2。
取步骤1得到的OE△GhBZR1 2-5的幼苗，放入液氮保存，得到样本3。
取步骤1得到的OE△GhBZR1 2-9的幼苗，放入液氮保存，得到样本4。
取步骤1得到的OEGhBZR1△I160 3-22的幼苗，放入液氮保存，得到样本5。
取步骤1得到的OEGhBZR1△I160 3-26的幼苗，放入液氮保存，得到样本6。
取步骤1得到的OEGhBZR1△S163G 4-7的幼苗，放入液氮保存，得到样本7。
取步骤1得到的OEGhBZR1△S163G 4-13的幼苗，放入液氮保存，得到样本8。
取步骤1得到的拟南芥bri1-5的幼苗，放入液氮保存，得到样本9。
取步骤1得到的转空载体拟南芥的幼苗，放入液氮保存，得到样本10。
②Real-Time PCR检测GhBZR1基因的表达量
采用Trizo1法提取样本(样本1、样本2、样本3、样本4、样本5、样本6、样本7、样本8、样本9或样本10)的总RNA，然后利用反转录酶AMV反转录出第一链cDNA，将该cDNA作为模板，实时定量PCR检测GhBZR1基因的表达量。
鉴定GhBZR1基因的引物为5’-GAAAGGGATGTAAGCCACCT-3’和5’-GGAAGAGGAGGAAGGACTGA-3’，目的片段如序列表中序列1自5’末端第242至384位所示。
将样本1中GhBZR1基因的表达量作为1，其它样本中GhBZR1基因的相对表达量见图1中B：样本2中GhBZR1基因的相对表达量约为0.8，样本3中GhBZR1基因的相对表达量约为0.5，样本4中GhBZR1基因的相对表达量约为1.4，样本5中GhBZR1基因的相对表达量约为0.6，样本6中GhBZR1基因的相对表达量约为0.4，样本7中GhBZR1基因的相对表达量约为0.7，样本8中GhBZR1基因的相对表达量约为1.6，样本9中GhBZR1基因的相对表达量几乎检测不到。样本10和样本9中GhBZR1基因的表达量无显著差异。可见，步骤(1)中幼苗的叶柄越长，则步骤(2)中相应幼苗的GhBZR1基因的相对表达量越高。
3、转基因拟南芥的黄萎病抗性鉴定
实验重复三次，每个株系每次种植10株，具体步骤如下：
(1)在PDA培养基上接种临西2-1，25℃活化培养3～4天。
(2)完成步骤(1)后，挑选单菌落，接种于查氏液体培养基，25℃、180rpm恒温振荡培养3周，得到培养菌液。
(3)完成步骤(2)后，取培养菌液，使用纱布过滤收集病原菌孢子，得到孢子菌液，孢子菌液中临西2-1的浓度为106个/mL。
(4)完成步骤(3)后，取转空载体拟南芥的幼苗、拟南芥bri1-5的幼苗、OEGhBZR11-2的幼苗、OE△GhBZR1 2-5的幼苗、OEGhBZR1△I160 3-22的幼苗或OEGhBZR1△S163G 4-13的幼苗，采用根部接种的方法接种步骤(3)得到的孢子菌液或侵染溶液(接种侵染溶液的幼苗作为对照)，每株拟南芥接种200μL孢子菌液或侵染溶液。
完成步骤(4)的第五天，观察记录拟南芥的黄萎病发病情况，并按照黄萎病病级划分标准(记载于如下文献中：Wang,G.N.，Zhao,G.Y.，Yue,X,W.，Li,Z.K.，Zhang,Y.，ZhangG.Y.，Wu,L.Q.，Wang,S,F.，Ma,Z.Y.Pathogenicity and ISSR Genetic Differentiationof Verticillium dahliae Isolates from Cotton Growing Areas of HebeiProvince.Cotton Science.24,348-357)进行病级调查比例统计结果。
实验结果见图2(A为拟南芥的生长状态，CK为接种侵染溶液，处理为接种孢子菌液；B为病级调查比例统计结果)。结果表明，转空载体拟南芥的幼苗和拟南芥bri1-5的幼苗的黄萎病病级无显著差异。与拟南芥bri1-5的幼苗相比，OEGhBZR1 1-2的幼苗、OE△GhBZR12-5的幼苗、OEGhBZR1△I160 3-22的幼苗和OEGhBZR1△S163G 4-13的幼苗对黄萎病的抗性均显著增强。可见，在拟南芥bri1-5中过表达GhBZR1基因、突变体基因1、转突变体基因2或转突变体基因3均可提高拟南芥bri1-5对黄萎病的抗性。
实施例3、棉花沉默株的获得及鉴定
一、重组质粒PTRV2-GhBZR1的构建和重组农杆菌的获得
1、采用Trizo1法提取生长至14天的陆地棉TM-1幼苗的叶片的总RNA，然后利用反转录酶AMV反转录出第一链cDNA。
2、人工合成引物F1：5'-CGACGACAAGACCCTCACCACTTATCGAAAGGG-3'和R1：5'-GAGGAGAAGAGCCCTATTTCTGGAGGTTGGAG-3'。
3、完成步骤1和2后，以步骤1提取的cDNA为模板，以F1和R1为引物进行PCR扩增，然后纯化、回收，得到约300bp的双链DNA分子。
4、将步骤3中得到双链DNA分子置于含有dATP的T4DNA合成酶缓冲液中，22℃处理30min，然后70℃放置20min，得到片段甲。
5、将载体PTRV2用限制性内切酶PstⅠ酶切8h，回收酶切产物。将该酶切产物置于含有dTTP的T4DNA合成酶缓冲液中，22℃处理30min，然后70℃放置20min，得到载体骨架。
6、将片段甲和载体骨架混合，65℃连接2min，得到重组质粒PTRV2-GhBZR1。
根据测序结果，重组质粒PTRV2-GhBZR1为向载体PTRV2的限制性内切酶PstⅠ的识别序列间插入序列表中序列1自5'末端起第231至531位所示的DNA分子。
将重组质粒PTRV2-GhBZR1导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101/PTRV2-GhBZR1。
将载体PTRV1导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101/PTRV1。
二、棉花沉默株的获得
1、取GV3101/PTRV2-GhBZR1的单菌落，接种至4mL含50mg/L利福平(Rif)和50g/L卡那霉素(Kan)的YEP液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养24h，得到培养菌液1。
2、完成步骤1后，取培养菌液1，按体积比为1：100接种至含50mg/L利福平(Rif)和50g/L卡那霉素(Kan)的YEP液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养6h，得到培养菌液2。培养菌液2的0D600为0.5左右。
3、完成步骤1后，取培养菌液2，5000rpm离心5min，得到沉淀1，然后用50mL侵染溶液重悬，得到侵染液甲。
4、将步骤1～3中的GV3101/PTRV2-GhBZR1替换为GV3101/PTRV1，其它步骤均不变，得到侵染液乙。
5、将步骤3得到的侵染液甲和步骤4得到的侵染液乙混合(体积比为1:1)，得到侵染工作液；用该侵染工作液侵染生长至10天的陆地棉TM-1幼苗的子叶，得到10株陆地棉TM-1拟沉默株，依次将其命名为T1～T10。
6、完成步骤5两周后，采用Trizo1法分别提取10株陆地棉TM-1拟沉默株和生长至24天的陆地棉TM-1幼苗的总RNA，然后利用反转录酶AMV反转录出第一链cDNA。以该cDNA为模板，实时定量PCR检测GhBZR1基因的表达量。
鉴定GhBZR1基因的引物为5’-GAAAGGGATGTAAGCCACCT-3’和5’-GGAAGAGGAGGAAGGACTGA-3’，目的片段如序列表中序列1自5’末端第242至384位所示。
实验结果表明，与陆地棉TM-1幼苗的GhBZR1基因的表达量相比，T1、T3、T5和T8中GhBZR1基因的表达量均显著降低。因此，T1、T3、T5和T8均为陆地棉TM-1沉默株。以T1、T3、T5和T8为研究材料进行后续的实验，在下文统一命名为VIGS-GhBZR1。
按照上述方法，将步骤5中陆地棉TM-1替换为徐州142，得到徐州142沉默株。徐州142沉默株在下文称为VIGS-GhBZR1-Xu142。
三、陆地棉TM-1沉默株的表型鉴定和黄萎病抗性鉴定
1、陆地棉TM-1沉默株现蕾期的表型鉴定
(1)观察陆地棉TM-1和VIGS-GhBZR1现蕾期的表型
实验结果如下：自现蕾期开始，与陆地棉TM-1相比，VIGS-GhBZR1表现出主要由主茎的第一、四、五节间距缩短引起的植株矮化(即株高降低)(图3中A、B和C，CK为陆地棉TM-1，1st为第一节间距，2nd为第二节间距，3rd为第三节间距，4th为第四节间距，5th为第五节间距，6th为第六节间距)、主要由主茎的第一、二、三果枝的夹角减小引起的株型紧凑(图3中D，CK为陆地棉TM-1，1st为第一果枝的夹角，2nd为第二果枝的夹角，3rd为第三果枝的夹角)和叶柄变短(见图3中E，CK为陆地棉TM-1)。
(2)实时定量PCR检测GhBZR1基因的表达量
实验重复三次，每次重复的步骤如下：
①样本的获得
取处于现蕾期的VIGS-GhBZR1的幼嫩叶片，放入液氮保存，得到样本1。
取处于现蕾期的陆地棉TM-1的幼嫩叶片，放入液氮保存，得到样本2。
②实时定量PCR检测GhBZR1基因的表达量
采用Trizo1法提取样本1或样本2的总RNA，然后利用反转录酶AMV反转录出第一链cDNA，将该cDNA作为模板，实时定量PCR检测GhBZR1基因的表达量。
鉴定GhBZR1基因的引物为5’-GAAAGGGATGTAAGCCACCT-3’和5’-GGAAGAGGAGGAAGGACTGA-3’，目的片段如序列表中序列1自5’末端第242至384位所示。
将样本2中GhBZR1基因的表达量作为1，样本1中GhBZR1基因的相对表达量见图3中F。
实验结果表明，VIGS-GhBZR1中GhBZR1基因的相对表达量约为0.35。
(3)叶柄细胞的电镜扫描和实时定量PCR检测苯丙烷代谢相关酶类的九个基因的表达量
对陆地棉TM-1或VIGS-GhBZR1的叶柄细胞进行电镜扫描。结果表明(图3中G)，与陆地棉TM-1相比，VIGS-GhBZR1的叶柄细胞变短。
细胞壁是植物细胞特有的细胞结构，由初生壁与次生壁组成，其中次生壁的合成影响着细胞的大小。在次生壁的木质素合成过程中，苯丙烷的代谢起了重要作用。对陆地棉TM-1或VIGS-GhBZR1中的苯丙烷代谢相关酶类的九个基因(GhPAL1基因、GhC4H1基因、Gh4CL1基因、GhC3H1基因、GhCCoAOMT1基因、GhCCR1基因、GhF5H1基因、GhCOMT基因、GhCAD6基因和GhExp1基因，上述基因均记载于如下文献中：Xu,L.，Zhu,L.，Tu,L.，Liu,L.，Yuan,D.，Jin,L.，Long,L.，and Zhang,X.(2011)Lignin metabolism has a central role inthe resistance of cotton to the wilt fungus Verticillium dahliae as revealedby RNA-Seq-dependent transcriptional analysis andhistochemistry.J.Exp.Bot.62，5607-5621.)的表达量进行检测，结果表明，与陆地棉TM-1相比，VIGS-GhBZR1中GhCCoAOMT1基因、GhCCR1基因、GhF5H1基因、GhCOMT基因、GhCAD6基因的表达均受到不同程度的抑制(图3中H)。
鉴定GhPAL1基因的引物为5’-CCTGGGTCAATCTTTGCTTC-3’和5’-AGGTCTCACCACCGAGTTTC-3’；鉴定GhC4H1基因的引物为5’-GATGCAAAGCTTGGTGGGTATGAC-3’和5’-ACTTGTTAAATCAAAACACCCTTGGCTT-3’；鉴定Gh4CL1基因的引物为5’-AATCATCAAATTCAAAGGCTTTCAAGTG-3’和5’-AGGCGTTGCAATTTAAAAGCCAAATAGATTA-3’；鉴定GhC3H1基因的引物为5’-ACTCTTCAGGGTCCTTCCAC-3’和5’-GAGGCTGCTCGTGTAGTGG-3’；鉴定GhCCoAOMT1基因的引物为5’-AAAGAAGGGCCTGCAATGCCAGTT-3’和5’-GGTAACGGTGGTTCATTTGAGGCGA-3’；鉴定GhCCR1基因的引物为5’-AGGATTGTTGATGACGCCTGAC-3’和5’-GTAGATTCTGCCTTCTCCCAAC-3’；鉴定GhF5H1基因的引物为5’-CGACGGTAGCATAGAACATCC-3’和5’-CAACAAGCAAGATCATTGACCT-3’；鉴定GhCOMT基因的引物为5’-CTTCCTGATTACCCCGACC-3’和5’-TAATTCCAGAAAATCCACCTTTT-3’；鉴定GhCAD6基因的引物为5’-GCTTCCAGCAACATCCACGAC-3’和5’-AGGATTGTTGATGACGCCTGAC-3’；鉴定GhExp1基因的引物为5’-GAAAGGGATGTAAGCCACCT和5’-GGAAGAGGAGGAAGGACTGA-3’。
2、陆地棉TM-1沉默株的棉铃和棉纤维的表型鉴定
(1)观察陆地棉TM-1和VIGS-GhBZR1的棉铃和棉纤维的表型
观察陆地棉TM-1和VIGS-GhBZR1的棉铃和棉纤维，实验结果如下：与陆地棉TM-1相比，结铃期时VIGS-GhBZR1的棉铃生长受到抑制(图4中A，CK为陆地棉TM-1)；与陆地棉TM-1相比，棉纤维成熟后，VIGS-GhBZR1的棉纤维变短，即棉纤维长度减少(图4中B和C，CK为陆地棉TM-1)。
(2)实时定量PCR检测GhBZR1基因、GhExp1基因、GhPFN基因和GhTBU1基因的表达量
GhExp1基因、GhPFN基因和GhTBU1基因(记载于如下文献中：Wang J，Wang H，ZhaoP，Han L，Jiao G，Zheng Y，Huang S，Xia G(2010)Overexpression of a Profilin(GhPFN2)Promotes the Progression of Developmental Phases in Cotton FibersPlant Cell Physiol.51(8)：1276-1290)均为已知的与纤维相关的基因。
实验重复三次，每次重复的步骤如下：
①样本的获得
取VIGS-GhBZR1的开花授粉3天后的棉纤维，放入液氮保存，得到样本1。
取陆地棉TM-1的开花授粉3天后的棉纤维，放入液氮保存，得到样本2。
取VIGS-GhBZR1的开花授粉15天后的棉纤维，放入液氮保存，得到样本3。
取陆地棉TM-1的开花授粉15天后的棉纤维，放入液氮保存，得到样本4。
②实时定量PCR检测GhBZR1基因、GhExp1基因、GhPFN基因和GhTBU1基因的表达量
采用Trizo1法提取样本(样本1、样本2、样本3或样本4)的总RNA，然后利用反转录酶AMV反转录出第一链cDNA，将该cDNA作为模板，以5’-GAAAGGGATGTAAGCCACCT-3’和5’-GGAAGAGGAGGAAGGACTGA-3’为引物，实时定量PCR检测GhBZR1基因的表达量。
按照上述方法，将GhBZR1基因替换为GhExp1基因，得到GhExp1基因的表达量。鉴定GhExp1基因的引物为5’-GAGGGAGCCATTGACAACATCTT-3’和5’-GCGAACAGTTCACAGCTATGTTCA-3’。
按照上述方法，将GhBZR1基因替换为GhPFN基因，得到GhPFN基因的表达量。鉴定GhPFN基因的引物为5’-ACCTTTCTGCCGCTGCTATCG-3’和5’-CGCCCAACCTCTCCACAACC-3’。
按照上述方法，将GhBZR1基因替换为GhTBU1基因，得到GhTBU1基因的表达量。鉴定GhTBU1基因的引物为5’-AAGGAAGCCGAGAATTGCGATTG-3’和5’-CGAGGGAATGGAATAAGGTTTACAGC-3’。
实验结果表明，与陆地棉TM-1相比，VIGS-GhBZR1中GhBZR1基因、GhExp1基因、GhPFN基因和GhTBU1基因的表达均受到不同程度的抑制(图4中D)。开花授粉3天后的棉纤维中：将陆地棉TM-1中GhBZR1基因的表达量作为1，VIGS-GhBZR1中GhBZR1基因的相对表达量约为0.4；将陆地棉TM-1中GhExp1基因的表达量作为1，VIGS-GhBZR1中GhExp1基因的相对表达量约为0.2；将陆地棉TM-1中GhPFN基因的表达量作为1，VIGS-GhBZR1中GhPFN基因的相对表达量约为0.1；将陆地棉TM-1中GhTBU1基因的表达量作为1，VIGS-GhBZR1中GhTBU1基因的相对表达量约为0.2。开花授粉15天后的棉纤维中：将陆地棉TM-1中GhBZR1基因的表达量作为1，VIGS-GhBZR1中GhBZR1基因的相对表达量约为0.5；将陆地棉TM-1中GhExp1基因的表达量作为1，VIGS-GhBZR1中GhExp1基因的相对表达量约为0.1；将陆地棉TM-1中GhPFN基因的表达量作为1，VIGS-GhBZR1中GhPFN基因的相对表达量约为0.3；将陆地棉TM-1中GhTBU1基因的表达量作为1，VIGS-GhBZR1中GhTBU1基因的表达量几乎检测不到。
3、棉花沉默株的黄萎病抗性鉴定
(1)陆地棉TM-1沉默株的黄萎病抗性鉴定
实验重复三次，每个株系每次种植10株，具体步骤如下：
①同实施例2步骤三3中(1)。
②同实施例2步骤三3中(2)。
③同实施例2步骤三3中(3)。
④完成步骤③后，取25℃、培养4周的VIGS-GhBZR1的幼苗和陆地棉TM-1幼苗，采用茎部接种的方法接种步骤③得到的孢子菌液或侵染溶液(接种侵染培养基的作为对照)，每株棉花幼苗接种10mL孢子菌液或侵染溶液。
完成步骤④的第五周，观察记录棉花的黄萎病发病情况并计算致病系数(Wang,G.N.，Zhao,G.Y.，Yue,X,W.，Li,Z.K.，Zhang,Y.，Zhang G.Y.，Wu,L.Q.，Wang,S,F.，Ma,Z.Y.Pathogenicity and ISSR Genetic Differentiation of Verticillium dahliaeIsolates from Cotton Growing Areas of Hebei Province.Cotton Science.24，348-357.)。
实验结果见图5(A为接种孢子菌液的单株棉花的叶片，TM-1为陆地棉TM-1；B为接种孢子菌液的致病系数，TM-1为陆地棉TM-1)。结果表明，与陆地棉TM-1相比，VIGS-GhBZR1的叶片严重黄化甚至枯萎，致病系数较高，对黄萎病的抗性也显著降低。
(2)徐州142沉默株的黄萎病抗性鉴定
实验重复三次，每个株系每次种植10株，具体步骤如下：
①同实施例2步骤三3中(1)。
②同实施例2步骤三3中(2)。
③同实施例2步骤三3中(3)。
④完成步骤③后，取25℃、培养4周的VIGS-GhBZR1-Xu142的幼苗和徐州142的幼苗，采用茎部接种的方法接种步骤③得到的孢子菌液或侵染溶液(接种侵染溶液的作为对照)，每株棉花幼苗接种10mL孢子菌液或侵染溶液。
完成步骤④的第五周，观察记录棉花的黄萎病发病情况并计算致病系数(Wang,G.N.，Zhao,G.Y.，Yue,X,W.，Li,Z.K.，Zhang,Y.，Zhang G.Y.，Wu,L.Q.，Wang,S,F.，Ma,Z.Y.Pathogenicity and ISSR Genetic Differentiation of Verticillium dahliaeIsolates from Cotton Growing Areas of Hebei Province.Cotton Science.24，348-357.)。
实验结果见图5中C。结果表明，与徐州142相比，VIGS-GhBZR1-Xu142的致病系数较高，对黄萎病的抗性也显著降低。
上述结果表明，在徐州142或陆地棉TM-1中沉默GhBZR1基因均可降低其对黄萎病的抗性。

Claims (10)

1.蛋白质，自N末端至C末端依次包括N端元件和C端元件；
所述N端元件的氨基酸序列如序列表中序列2自N末端起第1至158位所示；
所述C端元件的氨基酸序列如序列表中序列2自N末端起第166至313位所示。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为如下a1)或a2)或a3)或a4)或a5)或a6)：
a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
a2)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；
a3)氨基酸序列是序列表中序列6所示的蛋白质；
a4)氨基酸序列是序列表中序列8所示的蛋白质；
a5)在a1)或a2)或a3)或a4)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a6)将a1)或a2)或a3)或a4)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗病性和/或发育性状相关的蛋白质；所述发育性状为株型和/或叶柄长度和/或株高和/或器官大小。
3.编码权利要求1或2所述蛋白质的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)或(b6)所示的DNA分子：
(b1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
(b2)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
(b3)核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；
(b4)核苷酸序列是序列表中序列7所示的DNA分子；
(b5)与(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
(b6)在严格条件下与(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
5.含有权利要求3或4所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
6.d1)或d2)的应用：
d1)权利要求1或2所述蛋白质，或，权力要求3或4所述核酸分子，或，含有权利要求3或4所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在调控植物抗病性中的应用；
d2)权利要求1或2所述蛋白质，或，权力要求3或4所述核酸分子，或，含有权利要求3或4所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育发育性状改变的转基因植物中的应用；
所述发育性状为株型和/或叶柄长度和/或株高和/或器官大小。
7.培育转基因植物的方法一或培育转基因植物的方法二：
所述培育转基因植物的方法一，包括在受体植物中过表达权利要求1或2所述蛋白质，得到转基因植物的步骤；与所述受体植物相比，所述转基因植物具有如下表型：抗病性增加和/或叶柄长度增加和/或株高增加；
所述培育转基因植物的方法二，包括向受体植物中导入抑制权利要求1或2所述蛋白质表达的物质，得到转基因植物的步骤；与所述受体植物相比，所述转基因植物具有如下表型：抗病性降低和/或株高减少和/或第一节间距减小和/或第四节间距减小和/或第五节间距减小和/或株型紧凑和/或第一果枝夹角减小和/或第二果枝夹角减小和/或第三果枝夹角减小和/或叶柄长度减少和/或棉纤维长度减少。
8.如权利要求1或2所述蛋白质，或，权利要求6所述应用，或权利要求7所述的方法，其特征在于：
所述植物或所述受体植物为如下c1)至c8)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)棉花；c4)棉花品种陆地棉TM-1；c5)棉花品种徐州142；c6)十字花科植物；c7)拟南芥；c8)拟南芥bri1-5。
9.如权利要求1或2所述蛋白质，或，权利要求6所述应用，或权利要求7所述的方法，其特征在于：所述抗病性为抗黄萎病。
10.如权利要求1或2所述蛋白质，或，权利要求6所述应用，或权利要求7所述的方法，其特征在于：所述抗病性为抗黄萎病菌引起的病害。
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