CN108004257A - 水稻硫氰酸酶编码基因OsRHOD1;1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了水稻硫氰酸酶编码基因OsRHOD1；1及其应用。一种硫氰酸酶编码基因OsRHOD1；1，序列如SEQ ID NO.1所示。该基因可在提高水稻五价砷的还原效率，增强对五价砷的解毒能力，和/或显著降低植株地上部与根系砷的积累中应用。本发明通过大量实验发现了水稻中的硫氰酸酶编码基因的生物功能，该基因超表达后，提高了水稻对As(V)的还原效率，同时水稻地上部与地下部的As(V)含量降低。超表达该基因显著降低水稻籽粒对As的积累。

Description

水稻硫氰酸酶编码基因OsRHOD1；1及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及水稻硫氰酸酶编码基因OsRHOD1；1及其应用。
背景技术
目前，环境中的重金属污染问题日益突出，其中耕地土壤砷(As)污染也日趋严重。水稻是重要的粮食作物，全球一半左右的人口以水稻为主要粮食作物。由于水稻对砷的富集，人们会通过日常饮食而受到砷的威胁(Meharg et al.,2009；Zhao et al.,2010)。因此解析水稻对As的吸收解毒机制以及通过基因工程技术开发降低水稻籽粒对As的积累的方法十分重要。在土壤中，砷在好氧条件与淹水条件分别以五价砷As(V)和三价砷As(III)的形态存在(Zhao et al., 2010)。As(III)主要通过水通道蛋白被水稻吸收(Ma et al.,2008)，在植物体内，As(III)可以被植物螯合肽(PCs)螯合并被转运到液泡中(Ha et al.,1999；Raab et al.,2005；Liu et al.,2010)或者直接被排出体外进行解毒。而As(V)主要通过磷酸盐转运蛋白被水稻吸收(Abedin et al.,2002；Wu et al.,2011；Kamiya et al.,2013)。吸收到植物体内的As(V)会被还原成As(III)进而被螯合或者排出体外进行解毒。在许多植物中发现砷主要以As(III)的形态存在，因此水稻体内As(V)向As(III) 的还原过程十分重要(Xu et al.,2007；Liu et al.,2010；Zhao et al.,2010)。
目前在水稻中参与植物体内As(V)还原的还原酶基因很少被报道。OsRHOD1；1基因在Genbank中的登录号分别为NP_001045596，这个基因与拟南芥中的砷还原酶基因AtHAC1的同源性为84％。本发明OsRHOD1；1基因在Genbank中被注释为硫氰酸酶(Rhodanese)。
发明内容
本发明的目的是提供水稻硫氰酸酶编码基因。
本发明的目的是提供该基因的应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种硫氰酸酶编码基因OsRHOD1；1，序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的硫氰酸酶编码基因的超表达载体，含有所述的硫氰酸酶编码基因。
所述的超表达载体，优选以pTCK303载体为出发载体，将所述的硫氰酸酶编码基因的开放阅读框序列插入Spe I及BamH I酶切位点间所得。
所述的硫氰酸酶编码基因在提高水稻五价As的还原效率，增强对五价As的解毒能力，和 /或显著降低水稻地上部与根系砷的积累中的应用。
所述的应用优选将所述的硫氰酸酶编码基因构建超表达载体，并导入水稻得到超表达该基因的水稻，从而提高水稻五价As的还原效率，增强对五价As的解毒能力，和/或显著降低植株地上部与根系砷的积累中的应用。
所述的硫氰酸酶编码基因在降低旱作条件下水稻籽粒砷含量中的应用。
本发明所述的超表达载体在提高水稻五价As的还原效率，增强对五价As的解毒能力，和 /或显著降低水稻地上部与根系砷的积累中的应用。
所述的应用，将所述超表达载体导入水稻得到超表达该硫氰酸酶编码基因的水稻，在提高水稻五价As的还原效率，增强对五价As的解毒能力，和/或显著降低植株地上部与根系砷的积累中的应用。
本发明所述的超表达载体在降低旱作条件下水稻籽粒砷含量中的应用。
本发明的有益效果
1、本发明通过系统研究，首次提供了一种硫氰酸酶编码基因OsRHOD1；1及其生物学功能。
2、利用特异引物，通过荧光定量PCR研究了该硫氰酸酶编码基因OsRHOD1；1在水稻中的表达，发现OsRHOD1；1基因在受到As(V)胁迫时，表达量显著提高(图1)。
3、该硫氰酸酶编码基因OsRHOD1；1在大肠杆菌As(V)还原缺陷型突变体中异源表达后，回补了大肠杆菌突变体对As(V)的还原能力(图2)。
4、该硫氰酸酶编码基因OsRHOD1；1突变后，降低了水稻对As(V)的还原效率，同时水稻地上部与地下部积累更多的As(图3)。
5、该硫氰酸酶编码基因OsRHOD1；1超表达后，提高了水稻对As(V)的还原效率，同时水稻地上部与地下部的As(V)含量降低(图4)。
6、超表达该硫氰酸酶编码基因OsRHOD1；1显著降低水稻籽粒对砷的积累(图5)。
附图说明
图1为OsRHOD1；1在水稻地下部和地上部的表达特征。
图2为OsRHOD1；1在大肠杆菌的异源表达后，回补了大肠杆菌突变体对As(V)的还原功能。
A：OsRHOD1；1在大肠杆菌突变体中表达后，在外界1mM As(V)处理72h后，菌液光谱值测定；其中，WT代表野生型水稻，ΔarsC-vector代表转入空载体的大肠杆菌突变体，ΔarsC-RHOD1；1代表转入pET-29a-OsRHOD1；1的大肠杆菌突变体。
B：OsRHOD1；1在大肠杆菌突变体中表达后，外界10μM As(V)处理72h后培养基中As的形态变化；其中EV代表大肠杆菌WC3110突变体，OsRHOD1；1代表转入pET-29a-OsRHOD1；1 的大肠杆菌突变体。
图3为OsRHOD1；1突变体材料与野生型相比，对吸收到体内的As(V)的还原效率显著降低，同时地上部与地下部积累更多的As。
A：OsRHOD1；1突变体中OsRHOD1；1的表达量鉴定；
B：外界10μM As(V)处理48h后突变体与野生型中根部As的形态与含量；
C：外界10μM As(V)处理48h后突变体与野生型中地上部As的形态与含量；
D：突变体与野生型吸收As(V)的效率；
E：突变体与野生型外排As(III)的效率；
F：突变体与野生型材料对吸收到到体内的As(V)的还原效率。
图4为OsRHOD1；1超表达材料与野生型相比，对吸收到体内的As(V)的还原效率显著提高，同时地上部与地下部的As(V)积累量显著降低。
A：OsRHOD1；1超表达材料表达量鉴定；
B：超表达材料与野生型吸收As(V)的效率；
C：超表达材料与野生型外排As(III)的效率；
D：超表达材料与野生型材料对吸收到到体内的As(V)的还原效率；
E：外界10μM As(V)处理48h后超表达材料与野生型中地上部As的形态与含量；
F：外界10μM As(V)处理48h后超表达材料与野生型中根部As的形态与含量。
图5为OsRHOD1；1突变体材料与野生型相比，籽粒中富集更多的As(A图)；而OsRHOD1；1超表达材料与野生型相比，籽粒中As(V)含量显著降低20％左右(B图)。
具体实施方式：
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1硫氰酸酶编码基因OsRHOD1；1在水稻中的表达特征
1)总RNA的提取：将水稻种子经30％次氯酸钠溶液消毒30min后，用无菌水洗涤4-5次，然后用1/2MS培养基培养至2周左右，选择大小一致的幼苗转移至培养桶中，用1/2的Kimura营养液培养一周后用10μM浓度的As(V)处理24h，为提高As(V)对植物的毒害效应，我们采用处理时营养液中不添加磷元素的方法。分别在不同时间点取叶片与根部于液氮中保存，利用植物总RNA提取试剂盒(北京百泰克公司)提取RNA。
2)使用反转录试剂盒(南京诺唯赞公司)进行总cDNA的合成。
3)荧光定量PCR。反转录合成总cDNA第一链后，以其为模板进行荧光定量PCR扩增，并以水稻细胞骨架蛋白基因(OsActin)为内参基因进行表达量校正。OsRHOD1；1定量PCR程序如下：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，40个循环后，72℃7min。基因的序列号和引物设计如下表：
表达分析结果发现基因OsRHOD1；1在根系表达量显著高于地上部，且水稻在受到外界五价砷As(V)胁迫时，该基因在地下部与地上部的表达量均显著提高(图1)。
实施例2硫氰酸酶编码基因OsRHOD1；1在大肠杆菌中的异源表达
1)基因OsRHOD1；1原核表达表达载体的构建与大肠杆菌转化
根据OsRHOD1；1的cDNA，用软件Primer 5.0分别以两基因ORF框设计去终止密码子的扩增引物，在引物的两端分别添加同源序列。设计的特异引物如下：
OsRHOD1；1-29a-F:GATATCGGATCCATGGCGCCTCCCTATGAAAC(SEQ ID NO.6)；
OsRHOD1；1-29a-R:GTGGTGCTCGAGATACATTGTATGAGGAGGAG(SEQ ID NO.7)；
以含有硫氰酸酶编码基因的cDNA克隆为模板用高保真酶GXL(TaKaRa公司)进行PCR扩增，利用特异引物扩增出该基因的ORF。根据表达载体pET-29a上BamHI/XhoI两酶切位点的序列，用软件Primer 5.0设计通用扩增引物：
29a-F:TTCCATGGCTGATATCGGATCC(SEQ ID NO.8)；
29a-R:GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG(SEQ ID NO.9)。
以特异引物PCR扩增产物为模板，利用通用引物扩增出硫氰酸酶编码基因的ORF酶连片段并回收纯化待用。利用BamHI/XhoI限制性内切酶双酶切载体pET-29a获得线性化载体，将酶连片段与线性化载体利用重组克隆试剂盒酶连，得到两基因ORF的原核表达载体，酶切验证与测序验证正确后备用。
2)硫氰酸酶编码基因大肠杆菌转化子的As(V)还原功能回补验证
(1)将pET-29a空载体，含有硫氰酸酶编码基因的pET-29a表达载体分别转入的大肠杆菌突变体 WC3110；该大肠杆菌WC3110突变体为As(V)还原功能丧失的大肠杆菌W3110；
(2)挑取阳性对照野生型大肠杆菌W3110，转入空载体与pET-29a-OsRHOD1；1的大肠杆菌突变体ΔarsC(WC3110)单克隆于LB液体培养液中，在恒温培养箱中以37℃，200rpm摇菌培养至OD600＝0.5；
(3)取1ml菌液于100ml LB培养基中培养，加入As(V)至浓度10μM，并加入IPTG至浓度为1mM诱导基因表达；
(4)培养72h后将菌液离心并吸取上清液，过滤(0.22μm)，利用HPLC-ICP-MS测定培养基中As的形态变化；
本实施例的研究表明硫氰酸酶编码基因OsRHOD1；1在大肠杆菌WC3110突变体中异源表达后，回补了大肠杆菌突变体对As(V)的还原功能(图2)。
实施例3OsRHOD1；1点突变载体的构建
1)利用Crispr-cas9表达系统构建基因OsRHOD1；1的点突变载体，以OsRHOD1；1编码区第一个外显子TGGCGCCTCCCTATGAAACC(SEQ ID NO.10)序列为目标基因片段进行突变。设计突变引物：
CAS9-OsRHOD1；1-F:GTGTTGGCGCCTCCCTATGAAACC(SEQ ID NO.11)；
CAS9-OsRHOD1；1-R:AAACGGTTTCATAGGGAGGCGCCA(SEQ ID NO.12)。
引物反应形成短的目标基因片段短链，连入被Bbs I单酶切的线性载体 SK-OsU6-2-85-sgRNA从而形成SK-OsU6-2-85-OsRHOD1；1-sgRNA中间载体，将该中间载体利用KpnI与HindIII限制性内切酶酶切获得中间片段，同时将SK-35S-CAS9-NOS表达载体利用Hind III与EcoR I酶切获得线性载体。将中间片段与载体同时连入被Kpn I与EcoR I酶切的线性化载体pCambia1300。测序验证正确后将质粒保存备用。
2)将酶连正确的载体Crispr-cas9-OsRHOD1；1转入农杆菌备用。
实施例4OsRHOD1；1超表达载体材料的构建
1)总RNA的提取：同实施例1
2)总cDNA的合成：同实施例1
3)OsRHOD1；1基因全长的获得及超表达载体的构建：
根据OsRHOD1；1全长cDNA序列设计超表达引物，引物序列如下：
overOsRHOD1；1-F:GGATCCATGGCGCCTCCCTATGAAACCAGCG(SEQ ID NO.13)；
overOsRHOD1；1-R:CTAGTTTAATACATTGTATGAGGAGGAGTG(SEQ ID NO.14)；
以水稻cDNA为模板扩增得到OsRHOD1；1开放阅读框序列。含目的基因的PCR产物经回收纯化后连入pMD19-T(TAKARA公司)克隆载体，酶切验证后并测序。测序正确的质粒用Spe I及BamH I双酶切得到含特定酶切位点的基因片段。将目的基因片段连入pTCK303 载体，得到表达载体pTCK303-OsRHOD1；1，经测序验证正确后备用。
4)将酶连正确的载体pTCK303-OsRHOD1；1与pTCK303-OsHAC1；2转入农杆菌备用。
实施例5硫氰酸酶编码基因OsRHOD1；1点突变材料，硫氰酸酶编码基因OsRHOD1；1超表达转基因材料的获得
将实施例3和实施例5中获得的转有Crispr-cas9-OsRHOD1；1；pTCK303-OsRHOD1；1质粒的农杆菌，侵染日本晴水稻愈伤组织，共培养2天后经过选择培养、分化、生根、炼苗得到 T0代转基因植株。
试剂和溶液缩写
本发明中培养基所用到的英文所写缩写表示如下：6-BA(6-苄基腺嘌呤)；Car(羧苄青霉素)； NAA(萘乙酸)；IAA(吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(乙酰丁香酮)；CH(水解酪蛋白)；L-pro(L-脯氨酸)；L-Glu(L-谷氨酰胺)；MES(2-吗啉乙磺酸)；N6(N6大量元素成份溶液)；B5(B5微量元素成份溶液)；AA(AA大量元素成份)；Agar(琼脂)。
溶液与培养基配方
Ⅰ激素配制方法
Ⅱ水稻组培中激素及抗生素的浓度
III水稻组培培养基母液配方
Ⅳ粳稻成熟胚愈伤组织诱导培养基(1L用量)
Ⅴ粳稻成熟胚愈伤组织继代培养基(1L用量)
Ⅵ粳稻共培养培养基(1L用量)
Ⅶ愈伤选择培养基(1L用量)
Ⅷ粳稻分化培养基(1L用量)
Ⅸ粳稻生根培养基(1L用量)
Ⅹ悬浮农杆菌侵染愈伤组织的培养基(AAM感菌液，1L用量)
农杆菌介导的水稻转化
水稻成熟胚愈伤组织的诱导：去皮的水稻种子(一盘14粒)入三角瓶，用体积比70％乙醇浸泡1min(淹没种子)，倒掉体积比70％乙醇，用体积比30％次氯酸钠浸泡30min，然后用灭菌水清洗5-6次直至清亮。用镊子把种子拨到灭菌的滤纸上，吸干水分，最后把日本晴水稻种子置于诱导培养基上，在30℃光照培养箱培养20-30d。
农杆菌培养：挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌(EHA 105)菌液100μL于4mLYEP(含50mg/L Kan和50mg/L Str)培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8～1.0。
感菌共培养：取培养好的菌液500μL于1.5mL离心管中，4℃，4000rmp，离心2min，去上清。用含200μmol/L As的30mL AAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD600的终浓度为 0.01-0.05；将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5min；将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40min；将愈伤组织置于共培养基上，25℃暗培养2.5d；
选择：将愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次，其间需不停的振荡。再用含500mg/L羧苄青霉素(Car)的无菌水清洗1-2遍。最后置于无菌滤纸上沥干2h；将晾干的愈伤转入含500mg/L羧苄青霉素和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28℃，光照培养14d；将长有抗性愈伤的初始愈伤转到含500mg/L羧苄青霉素和80mg/L潮霉素的培养基上进行第二轮选择，28℃，光照培养，直到长出颗粒性的抗性愈伤组织。
抗性愈伤组织的诱导分化和生根：在超净台上挑取从同一愈伤来的颜色鲜黄的抗性愈伤 3-4颗，移入装有分化培养基的塑料广口瓶中(每瓶放置5-7颗)，用封口膜封好，放入恒温培养室中，等待分化成苗(25-30d)。待苗长至2-3cm左右，放入生根培养基中壮苗。
转基因苗移栽：转基因苗从分化到移栽最短时间为两个月左右。将苗根部和茎叶分化得较完好的试管挑出(苗长至试管顶部，就要及时开盖)，打开封口膜，加入适量蒸馏水或无菌水，炼苗3d至7d左右，然后洗去琼脂，移栽到水稻全营养液中生长，检测。
转基因苗的检测：潮霉素筛选：准备生根后经过清洗的水稻苗，取完好的转基因水稻叶片 (叶片颜色正常)0.8～1.5cm放到含有筛选培养基的培养皿中。同时将没有转基因的叶片做为阴性对照，将经过鉴定的阳性苗叶片作为阳性对照。在光照培养箱内倒置培养48h后观察处理情况：叶片变黄、枯萎的是假阳性植株；而颜色不变的叶片是阳性苗。
PCR扩增潮霉素筛选方法：采用微量DNA提取(TPS法)方法，提取DNA。以所提DNA 为模板，进行PCR检测。潮霉素引物为HYG-F:ATCTTAGCCAGACGAGCG GG(SEQ ID NO.15)，HYG-R:ACACAGCCATCGGTCCAGAC(SEQ ID NO.16)。提取转基因植株DNA(GUS 已经检测为阳性的苗)，以DNA为模板进行PCR扩增。产物大小为589bp。
GUS检测：含有将准备好的材料浸泡在染液里，37℃保温过夜，染出蓝色的即为阳性苗。转基因苗的分子鉴定：
1)提取转基因水稻与野生型中花11的DNA，设计扩增引物RHOD1；1-CAS9SF:TTCTAGGCTAGCACTGCACG(SEQ ID NO.17)；RHOD1；1-CAS9SR: GGAGTTGTGTAGATGGCCCT(SEQID NO.18)。PCR扩增并测序，利用比对软件比对突变体扩增片段与野生型扩增片段，分析鉴定位点突变情况。分别采集突变体材料与野生型植株地上部与地下部的植物样品，利用RNA提取试剂盒提取总RNA，并利用反转录cDNA试剂盒合成 cDNA并进行qPCR。从转基因材料中获得OsRHOD1；1的两个纯合点突变株系并命名为 rhod1；1-1,rhod1；1-2(图3A)。
2)提取OsRHOD1；1超表达材料不同株系叶片的总RNA，反转录总cDNA，进行荧光定量PCR鉴定(总RNA的提取，总cDNA的合成，定量PCR方法同实施例1。另外我们随机挑选得到超表达效果明显的OsRHOD1；1超表达材料Ox1；1-1；Ox1；1-2；Ox1；1-3(图4)。
实施例6
OsRHOD1；1的突变体材料和超表达材料对As(V)的吸收实验，具体实施过程如下：
1)将鉴定正确的突变体材料与野生型、超表达材料与野生型用30％次氯酸钠溶液灭菌30min；然后用灭菌水清洗4-5次，将种子于1/2MS培养基中萌发；
2)培养两周后将幼苗转移至1/2Kimura营养液中培养，培养1周后进行处理；
3)每1L培养皿中种植两棵幼苗，每种材料4个重复，以10mM As处理48h(为凸显As(V)的毒害效应，处理时营养液中进行缺磷处理)。
4)处理48h后将收集水稻地上部与地下部，提取植物样品中的As:
(1)收集地上部与地下部样品，并用去离子水清洗
(2)称量0.5g左右的地上部样品，用液氮研磨，加入20ml PBS(2mM NaH2PO4,0.2mM Na2-EDTA,pH 6.0)提取液，超声1h提取植物样品中的As。
(3)将超声后的植物样品以4000rpm离心15min；吸取上清液，并以0.22μm滤膜过滤。将过滤完成的样品备用待测。
5)将地下部样品至于冰浴的漂洗液中(1mM K2HPO4,0.5mm Ca(NO3)2,5mM MES,pH 6.0)浸泡15min,去除附着在根系表面的As。
6)称量0.5g左右的地下部样品，用液氮研磨，加入20ml PBS提取液，超声1h提取植物样品中的As。将超声后的植物样品以4000rpm离心15min；吸取上清液，并以0.22μm滤膜过滤。将过滤完成的样品备用待测。
7)利用HPLC-ICP-MS测定地上部，地下部以及营养液中的As形态。
本实施例表明OsRHOD1；1突变体材料与野生型相比，对吸收到体内的As(V)的还原效率显著降低，同时地上部与地下部积累了更多的As(图3)；OsRHOD1；1超表达材料与野生型相比，对吸收到体内的As(V)的还原效率显著提高，同时地上部与地下部的As(V)积累量显著降低(图4)。
实施例7
OsRHOD1；1突变体，超表达材料以及野生型中籽粒中As总量的测定，具体实施过程如下：
1)选取突变体材料(rhod1；1-1,rhod1；1-2以及背景野生型中花11；超表达材料(Ox1；1-1,Ox1；1-2) 以及背景野生型日本晴。利用1/2MS萌发2周。
2)将幼苗移至5L的塑料桶中，用1/2Kimura营养液培养1周。
3)选取大小一致的幼苗，进行盆栽，以20ppm As(V)浓度进行处理。
4)控制水稻生长过程中的土壤水分，尽量保持以旱作方式进行全生育期盆栽实验
5)收获成熟期水稻，于60℃烘箱烘3d。
6)称取0.25g左右籽粒于消煮管中，添加5ml混酸(HNO3:HClO4＝85:15)进行消煮。
7)以2％HNO3将样品消煮液定容至25ml，充分摇匀并过滤(0.45μm)。
8)利用ICP-MS测定各样品中As含量。
本实施例结果表明OsRHOD1；1突变体材料与野生型相比，籽粒中富集更多的As(图5A)；而 OsRHOD1；1超表达材料与野生型相比，籽粒中As(V)含量显著降低20％左右(图5B)。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 水稻硫氰酸酶编码基因OsRHOD1;1及其应用
<150> 2017103457671
<151> 2017-05-17
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 414
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 1
atggcgcctc cctatgaaac cagcgccgcc ggctctgaat cgccggtgcc ggtggtaacg 60
gtggatgtgg cggcggcgag cgaccttatc acctcggccg gccaccgtta cgtcgacgtc 120
aggacagagg aggaaatgaa caagggccat ctacacaact ccctcaacgt gcccttcatg 180
ttcgtcacgc cgcaagggag ggaaaagaat cctctgtttg tggagcagtt ctcgtcgctg 240
gtgagcaaag aggagcatgt ggttgtgggg tgccaaagcg ggaagaggtc ggagctagca 300
tgcgttgatc tccttgaagc agggttcaag aacgtgaaga acatgggagg aggctacgca 360
gcgtggctcg acaatggatt ccccataaac actcctcctc atacaatgta ttaa 414
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgaacaaggg ccatctacac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gacgagaact gctccacaaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caacacccct gctatgtacg 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catcaccaga gtccaacaca a 21
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gatatcggat ccatggcgcc tccctatgaa ac 32
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtggtgctcg agatacattg tatgaggagg ag 32
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttccatggct gatatcggat cc 22
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtggtggtgg tggtgctcga g 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tggcgcctcc ctatgaaacc 20
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtgttggcgc ctccctatga aacc 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaacggtttc atagggaggc gcca 24
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggatccatgg cgcctcccta tgaaaccagc g 31
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctagtttaat acattgtatg aggaggagtg 30
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atcttagcca gacgagcggg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acacagccat cggtccagac 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttctaggcta gcactgcacg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggagttgtgt agatggccct 20

Claims (9)

1.一种硫氰酸酶编码基因，其特征在于序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的基因的超表达载体，其特征在于含有权利要求1所述的硫氰酸酶编码基因。
3.根据权利要求2所述的超表达载体，其特征在于以pTCK303载体为出发载体，将权利要求1所述基因的开放阅读框序列插入Spe I及BamH I酶切位点间所得。
4.权利要求1所述的硫氰酸酶编码基因在提高水稻五价As的还原效率，增强对五价As的解毒能力，和/或显著降低水稻地上部与根系砷的积累中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于将权利要求1所述基因构建超表达载体，并导入水稻得到超表达权利要求1所述基因的水稻，从而提高水稻五价As的还原效率，增强对五价As的解毒能力，和/或显著降低植株地上部与根系砷的积累中的应用。
6.权利要求1所述的硫氰酸酶编码基因在降低旱作条件下水稻籽粒砷含量中的应用。
7.权利要求2所述的超表达载体在提高水稻五价As的还原效率，增强对五价As的解毒能力，和/或显著降低水稻地上部与根系砷的积累中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于将权利要求2所述超表达载体导入水稻得到超表达权利要求1所述基因的水稻，在提高水稻五价As的还原效率，增强对五价As的解毒能力，和/或显著降低植株地上部与根系砷的积累中的应用。
9.权利要求2所述的超表达载体在降低旱作条件下水稻籽粒砷含量中的应用。
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