CN1793368A - 链霉菌线性质粒中抗砷基因簇 - Google Patents

Abstract

一种基因技术领域的链霉菌线性质粒中抗砷基因簇。本发明整个线性质粒上抗砷基因簇共6个基因及其DNA序列，具体为：砷抗性基因：sasB和sasC 2个基因，砷抗性调节基因：sasR和sasR22个基因，黄素单加氧酶基因：sasO基因，硫氧还蛋白还原酶基因：sasT基因；DNA序列为序列1。本发明提供一种链霉菌FR－008线性质粒上抗砷基因簇，所提供的基因及其蛋白质，抗体可用于环境保护，工业应用上构建新的工程菌。

Description

链霉菌线性质粒中抗砷基因簇

技术领域

本发明涉及的是一种基因簇，特别是一种链霉菌线性质粒中抗砷基因簇，属于生物技术基因领域。

技术背景

砷化物(主要为砷酸盐和亚砷酸盐)作为重金属盐的毒害作用日益为人们所重视，由其所引起的环境问题也应起人们的广泛关注。1968年，Novick报道了金黄色葡萄球菌由质粒介导的砷抗性。1973年，Hedges等人在大肠杆菌中发现环形质粒R773对砷酸盐和亚砷酸盐具有抗性。80年代，Mobley和Chen等确定在环形质粒R773上存在一个抗砷基因操纵子，从而使抗砷基因的概念得以明确。随着研究的深入，不断有新的抗砷基因被发现，它们在介导生物体抗砷的同时，对砷的同族元素锑(Sb)也具有抗性。研究发现，革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的质粒及细菌染色质中均存在抗砷基因操纵子。革兰氏阴性菌抗砷基因操纵子有三个，分别在大肠杆菌质粒R773、质粒R46和染色质中发现。大肠杆菌质粒R773和R46含有由五个基因组成的抗砷基因操纵子，而大肠杆菌染色质仅含三个。他们的基因顺序是arsR、arsD、arsA、arsB、arsC，其功能分别为：arsR编码调节蛋白，是转录抑制蛋白；arsD编码第二个转录抑制蛋白；arsA、arsB编码ATP酶结合泵，泵出亚砷酸盐；arsC编码砷酸盐还原酶，将五价砷还原为三价砷，然后泵出细胞。革兰氏阳性菌抗砷基因操纵子也有三个，可分为金黄色葡萄球菌型和枯草芽孢杆菌型两类。在金黄色葡萄球菌环形质粒pSX267和pI258中存在一个arsRBC抗砷基因簇，它们均由arsR、arsB、arsC三个基因组成，其各自功能与质粒R773相同。枯草芽孢杆菌抗砷基因操纵子，是从枯草芽孢杆菌的染色质基因组中分离出的抗砷基因操纵子，该操纵子也由arsR、arsB、arsC三个基因组成，其各自功能与质粒R773也基本相同。在酿酒酵母质粒中也存在一个抗砷基因操纵子，由三个成簇捧列的抗砷基因组成，分别是ACR1、ACR2和ACR3。ACR1是ACR3的正向(顺式)调节基因。ACR2编码一个砷还原酶蛋白，可以将五价砷还原为三价砷，作用与ArsC相似。ACR3基因受ACR1基因正向调节，编码一个氧阴离子转运通道，作用与细菌ArsB相似。ACR3蛋白锚定在细胞膜上有10个跨膜区，与ArsB不同的是它没有ATP酶结合位点。它捧出亚砷酸盐的能量是利用化学渗透作用。当高浓度的砷化物存在时，ACR基因可以介导对砷化物的抗性。这些砷抗性基因都是位于细菌染色质或环形质粒中，在线形质粒，以及产生抗生素的土壤微生物链霉菌中没有发现砷抗性基因存在。

具有抗砷基因的细菌也显示出在环境保护方面的应用价值。在细胞内融合表达ArsR，与没有过量表达ArsR相比，细胞内的砷酸盐浓度提高了5-60倍。ArsR对砷的高亲和性，能够从污染了50ppb亚砷酸盐的水中，完全将砷除去。利用抗砷基因赋予宿主砷抗性，可以避免砷对在同时伴有砷污染的环境进行生物治理的工程菌的的毒性，提高其相应的环境治理能力。目前，抗砷基因只局限于上述几种微生物中，这些基因只能在近缘的宿主间转移，因此，丰富抗砷基因的来源，可以赋予多种生物治理工程菌的砷抗性，扩大其应用范围。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足和需要解决的技术问题，提供一种链霉菌线性质粒中抗砷基因簇。本发明使这种链霉菌FR-008的sas抗砷基因簇代表了链霉菌中所特有的抗砷基因簇的组成和基因捧列方式，并且可用于环保和一些工程菌的创新和发展。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明整个线性质粒上抗砷基因簇共6个基因及其DNA序列，具体为：砷抗性基因：sasB和sasC 2个基因，砷抗性调节基因：sasR和sasR2 2个基因，黄素单加氧酶基因：sasO基因，硫氧还蛋白还原酶基因：sasT基因；DNA序列为序列1。

所述的6个基因及其DNA序列编码相应抗砷功能蛋白的氨基酸序列，即序列2-7；包括包含序列1中碱基1-375的基因sasR2，包含序列1中碱基424-1,494的基因sasO，包含序列1中碱基1,491-2,603的基因sasB，包含序列1中碱基2,600-2,884的基因sasR，包含序列1中碱基3,004-3,426的基因sasC，包含序列1中碱基3,423-4,397的基因sasT，编码了调节蛋白，亚砷酸转运蛋白，黄素依赖的单加氧酶，砷酸还原酶，硫氧还蛋白还原酶，并提供这些基因所编码酶的氨基酸序列。

所述的抗砷基因，其编码亚砷酸转运蛋白和砷酸还原酶，即sasB和sasC的核苷酸序列或互补序列及其相应的氨基酸序列。

所述的砷抗性的调节基因，即sasR和sasR2的核苷酸序列或互补序列及其相应的氨基酸序列。

编码黄素单加氧酶基因，即sasO的核苷酸序列或互补序列及其相应的氨基酸序列。

编码硫氧还蛋白还原酶基因，参与砷酸还原酶催化五价砷还原成为三价砷，即sasT的核苷酸序列或互补序列及其相应的氨基酸序列。

所述的序列1的互补序列可依据DNA碱基互补原则随时得到，序列1的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)或用限制性内切酶酶切DNA得到。

所述的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明序列的DNA作为探针进行Southern杂交的方法，从Streptomyces ceolicolor A3(2)，Streptomyces sp.F2得到与链霉菌FR-008线性质粒抗砷基因簇同源的基因。

所述的核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或DNA片段可以通过转导、转化、接合转移的方法转入外源宿主，这些外源宿主包括链霉菌，大肠杆菌，芽孢杆菌，酵母，植物，动物和工程菌中，并在外源宿主中表达，赋予宿主亚砷酸盐和砷酸盐抗性。

所述的核苷酸序列或至少部分序列的克隆DNA可用来通过转导、转化、接合转移的方法转入工程菌中，通过调节抗砷基因簇的表达，应用细菌除去砷污染物，达到环境保护的目的。

所述的核苷酸序列可被修饰或突变，修饰或突变的途径包括插入或置换，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，或通过紫外线或化学试剂突变。

本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离需要的蛋白质并可以用于抗体制备，本发明所提供的基因及其蛋白质，抗体可用于环境保护，工业应用上构建新的工程菌。所涉及的核苷酸序列或部分序列的基因或基因簇在异源宿主中表达并通过DNA芯片技术了解它们在宿主代谢链中的功能，所涉及的氨基酸序列或部分序列的多肽可能在去除或替代某个或某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化蛋白动力学特征。

附图说明

图1链霉菌FR-008线性质粒上抗砷基因簇的组成图和缺失部分抗砷基因的抗砷性质

图1中：上半部分显示链霉菌FR-008线性质粒上抗砷基因簇，包含sasR2，sasO，sasB，sasR，sasC，和sasT这一系列共6个基因和位于这些基因上的部分限制性酶切位点，以及链霉菌FR-008线性质粒上抗砷基因簇突变体缺失序列，显示缺失序列1中从sas R2起始密码子上游34bp处NruI位点到sasT终止密码子下游532bp处的PmaCI位点之间4962个碱基，包括了链霉菌FR-008线性质粒上整个抗砷基因簇，被1.4kb的阿泊拉霉素抗性基因替代。下半部显示8个包含序列1中不同区域的亚克隆基因在抗砷基因簇上的位置和8个亚克隆赋予Streptomyces griseus IMRU3570的抗砷性质。

图2链霉菌FR-008线性质粒上抗砷基因簇的抗砷活性。

图2A中：链霉菌FR-008和IMRU3570在分别含有5mM亚砷酸盐和100mM砷酸盐的SFM培养基上的生长情况，FR-008具有砷盐抗性，而IMRU3570则没有。

图2B中：链霉菌FR-008基因文库中含有抗砷基因簇的两个科斯质粒pHZ1239和pHZ1240导入没有抗砷基因簇的链霉菌IMRU3570中，使含有pHZ1239和pHZ1240的链霉菌IMRU3570在分别含有5mM亚砷酸盐和100mM砷酸盐的SFM培养基上生长。进一步证实该抗砷基因簇是负责链霉菌FR-008的砷抗性。

具体实施方式

本发明从链霉菌FR-008中分离一种砷抗性的线性质粒pHZ227，利用线性质粒pHZ227为探针进行Southern杂交，从链霉菌FR-008基因文库中获得包含有其同源序列的46个阳性科斯质粒(cosmid)，对上述阳性克隆进行BamHI+BglII双酶解发现，它们大部分都带有相互重叠的外源片断。选择代表不同区域的8个科斯质粒，发现它们覆盖了pHZ227除去两端约120Kb的区域。从8个科斯质粒中挑出4个覆盖了pHZ227大部分区域并且相互重叠的科斯质粒pHZ1239，pHZ1240，pHZ1244，pHZ1246进行结合转移进入对砷敏感的Streptomyces griseus IMRU3570，其中pHZ1239和pHZ1240赋予了IMRU3570砷抗性。对pHZ1239和pHZ1240的重叠区域进行核苷酸序列测定和分析后，获得一个与砷抗性相关基因同源的一种新颖的sasRBCT型抗砷基因簇，G+C含量达69.9％。包含6个基因，分别是sasR2，sasR，sasB，sasO，sasC，和sasT。6个基因位于3个操纵子，sasR，sasB，和sasO组成一个操纵子，sasB的3’端与sasO的5’端重叠4个碱基(GTGA)；sasC，和sasT组成一个操纵子，并且也有4个重叠碱基(GTGA)；sasR2单独构成一个操纵子。sasB的产物与来自Saccharomyces cerevisiae和Saccharomyces douglasii的Arr3p具有同源性，Arr3p与arsB编码的ArsB蛋白功能相同，是一个亚砷酸转运蛋白，它是镶嵌于细胞膜中的离子通道蛋白。在有ArsA存在时能够利用ArsA水解ATP提供的能量将三价砷泵出细胞外。在没有ArsA时，也可以单独利用化学渗透作用将三价砷捧出细胞外。SasC显示与来自Staphylococcal aereus质粒pI258Staphylococcal xylosus质粒pSX267 Halobacterium sp.(strain NRC-1)质粒pNRC100，Pseudomonas putida KT2440和and Pseudomonas aeruginosa的ArsC具有同源性。ArsC蛋白是砷还原酶，可催化电子转移。五价砷只有通过ArsC还原成为三价砷时，才可以被ArsB泵出胞外，从而使细胞内的砷不会蓄积。SasO显示与来自Burkholderia vietnamiensis G4和Pseudomonas putidaKT2440的黄素单加氧酶具有同源性。SasT显示与来自Streptomyces coelicolorA3(2)，Streptomyces clavuligerus，和Mycobacterium smegmatis的硫氧还蛋白还原酶具有同源性。SasR和SasR2显示与来自Staphylococcal xylosus质粒pSX267，Pseudomonas putida KT2440，Yersinia enterocolitica质粒pYV，Escherichia coli，Chromobacterium violaceum ATCC 12472和Pseudomonasaeruginosa的抗砷基因的阻遏物具有同源性。ArsR与操纵基因的结合位点结合，抗砷基因不转录。在有砷环境下，操纵基因去阻遏，抗砷基因开始转录。

本发明利用在链霉菌FR-008中进行抗砷基因簇的定向敲除，检验抗砷基因簇的功能；利用不具备砷抗性的链霉菌中进行抗砷基因簇的增加，赋予宿主砷抗性。

以下进一步提供实施例，这些实施例只是阐明了得到和应用本发明所提供序列和要素的优选的途径，仅用做说明而并不限制本发明的范围。

实施例1：

缺失链霉菌FR-008线性质粒上抗砷基因簇中所有基因

如图1所示，缺失序列1中从sasR2起始密码子上游34bp的NruI位点到sasT终止密码子下游532bp的PmaCI位点之间4962个碱基。它包括了链霉菌FR-008线性质粒上完整的抗砷基因簇。从质粒pHGF9827上用SmaI-EcoRV酶切一个1.4kb阿泊拉霉素抗性基因，插入到用NruI和PmaCI酶切的pJTU8后，产生质粒pJTU1907，用BglII酶切后，克隆进质粒pHZ1358，构建成基因置换载体pJTU1908，通过结合转移将pJTU1908导入链霉菌FR-008，通过松弛筛选得到基因置换菌株WL1，由聚合酶链式反应(PCR)验证了基因置换菌株的正确性，经过砷抗性实验证明了所得到的基因置换菌株中抗砷基因簇被阻断。此基因置换证明分离到的序列(序列1)确实是负责链霉菌FR-008的砷抗性。

这提供了一个通过完全敲除链霉菌FR-008线性质粒上抗砷基因簇，以检验链霉菌FR-008线性质粒上抗砷基因簇的功能。还提供了一种获得线性质粒上大片段DNA敲除的技术手段。

实施例2：

链霉菌中进行抗砷基因簇的增加

如图2所示，链霉菌FR-008基因文库中含有抗砷基因簇的两个科斯质粒pHZ1239和pHZ1240导入突变体WL1中，含有pHZ1239和pHZ1240的抗砷基因簇缺失的突变体WL1，在分别含有5mM亚砷酸盐和100mM砷酸盐的SFM培养基上生长。另外，链霉菌FR-008基因文库中含有抗砷基因簇的两个科斯质粒pHZ1239和pHZ1240导入没有抗砷基因簇的链霉菌IMRU3570中，含有pHZ1239和pHZ1240的链霉菌IMRU3570在分别含有5mM亚砷酸盐和100mM砷酸盐的SFM培养基上生长。进一步证实该抗砷基因簇是负责链霉菌FR-008的砷抗性。

这提供了一个通过抗砷基因簇的增加，使没有砷抗性的宿主获得了砷抗性的方法。

实施例3：

链霉菌中进行抗砷基因的增加

将含有链霉菌FR-008线性质粒上抗砷基因簇上不同基因插入整合型质粒pSET152，构建成一系列带有不同抗砷基因的质粒，整合进没有抗砷基因簇的链霉菌IMRU3570中，证实带有sasB和sasC基因的质粒pJTU91，pJTU92，pJTU94，pJTU96和pJTU1910，转化链霉菌IMRU3570后，使链霉菌IMRU3570具有亚砷酸盐和砷酸盐抗性。带有sasB，缺失sasC基因的质粒pJTU98和pJTU99，转化链霉菌IMRU3570后，使链霉菌IMRU3570只具有具有亚砷酸盐抗性，而没有砷酸盐抗性。缺失sasB基因的质粒pJTU93，转化链霉菌IMRU3570后，使链霉菌IMRU3570既没有亚砷酸盐抗性也没有砷酸盐抗性。证实SasB是一个亚砷酸转运蛋白，SasC蛋白是砷还原酶，在单独有SasB时只有亚砷酸抗性，当两者同时存在时，才同时具有亚砷酸盐和砷酸盐抗性。

这提供了一个通过抗砷基因的增加，使没有砷抗性的宿主获得了砷抗性的方法。

以下根据本发明的内容提供基因序列：

序列列表：

                        SEQUENCE LISTING

<110>上海交通大学

<120>链霉菌线性质粒中一个抗砷基因簇

<160>7

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>4397

<212>DNA

<213>链霉菌FR-008(Streptomyces sp.FR-008)

<400>1

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ccctggacgc cgagcgctac ctcgccgccc gcggcgtggc acagaccgaa ccggcgaccg   4380

ctgccgtccc tgtctga                                                  4397

<210>2

<211>124

<212>PRT

<213>链霉菌FR-008

<400>2

Met Cys Gln His Arg Arg Met Ser Asn Thr Lys Val Leu Pro Leu Leu

1               5                   10                  15

Glu Pro Glu Ser Val Ala Pro Cys Cys Pro Pro Leu Thr Glu Arg Pro

            20                  25                  30

Phe Thr Ala Glu Glu Ala Glu Arg Thr Ala Lys Met Phe Lys Ala Leu

        35                  40                  45

Gly Asp Pro Val Arg Leu Arg Leu Phe Ser Ala Val Ala Ser His Pro

    50                  55                  60

Ser Gly Glu Ala Cys Val Cys Asp Ile Ser Asp Val Gly Val Ser Gln

65                  70                  75                  80

Pro Thr Val Ser His His Leu Lys Lys Leu Lys Glu Ala Gly Leu Leu

                85                  90                  95

Gly Ser Glu Arg Arg Gly Thr Trp Val Tyr Tyr Arg Val Glu Ala Ser

            100                 105                 110

Val Leu Ala Ala Met Gly Gln Leu Leu Thr Ala Arg

        115                 120

<210>3

<211>356

<212>PRT

<213>链霉菌FR-008

<400>3

Val Asn Gln His Ala Asp Val Val Val Val Gly Gly Gly Gln Ala Gly

1               5                   10                  15

Leu Ala Ala Gly Tyr Tyr Leu Arg Arg Gln Gly Gly Leu Asp Phe Val

            20                  25                  30

Val Leu Asp Ala Asp Pro Val Pro Gly Gly Ser Trp Gln His Met Trp

        35                  40                  45

Asp Ser Leu His Leu Phe Ser Pro Ala Glu His Ser Ser Leu Pro Gly

    50                  55                  60

Arg Leu Met Pro Ala Gln Ala Gly Glu Thr Tyr Pro Asp Ala Arg His

65                  70                  75                  80

Val Val Asp Tyr Leu Thr Asp Tyr Glu Lys Arg Tyr Asp Leu Pro Val

                85                  90                  95

Gln His Gly Thr Arg Val Asp Ala Val Arg Arg Asp Ala Gly Arg Leu

            100                 105                 110

Leu Val Glu Ala Asp Thr Gly Thr Trp Arg Ala Arg Ala Val Ile Ser

        115                 120                 125

Ala Thr Gly Ser Trp Ser Arg Pro Phe Leu Pro Ala Val Pro Gly Arg

    130                 135                 140

Glu Val Phe Thr Gly Arg Gln Leu His Thr Val Asn Tyr Arg Ser Pro

145                 150                 155                 160

Ala Asp Phe Thr Gly Gln Arg Val Ile Val Val Gly Gly Gly Asn Ser

                165                 170                 175

Gly Ala Gln Val Ala Ala Asp Leu Ala Leu Asp Gly Arg Val Glu Leu

            180                 185                 190

Thr Trp Val Thr Gln Arg Pro Pro Arg Phe Leu Ala Asp Asp Ile Asp

        195                 200                 205

Gly Arg Ala Leu Phe Asp Val Ala Thr Ala Arg Arg Arg Ala Leu Glu

    210                 215                 220

Glu Gly Arg Ser Asp Thr Gly Gly Val Ala Ser Leu Gly Asp Ile Val

225                 230                 235                 240

Ala Val Pro Pro Val Arg Gln Ala Arg Asp Ala Gly Leu Leu Lys Ala

                245                 250                 255

Ser Pro Met Phe Val Arg Leu Glu Gly Asp Gly Val Val Trp Ala Asp

            260                 265                 270

Gly Thr Arg Ala Glu Ala Asp Ala Val Val Trp Cys Thr Gly Phe Arg

        275                 280                 285

Pro Ala Leu Ser His Leu Ala Pro Leu Gly Leu Arg Gly Thr Arg Gly

    290                 295                 300

His Ile Pro Thr Ala Gly Thr Arg Ala Val Asp Glu Pro Arg Leu His

305                 310                 315                 320

Leu Leu Gly Tyr Gly Asp Trp Thr Gly Pro Ala Ser Ala Thr Leu Ile

                325                 330                 335

Gly Val Gly Arg Pro Ala Arg Asp Ala Ala Arg Glu Ile Ala Asp Leu

            340                 345                 350

Leu Ala Ser Arg

        355

<210>4

<211>370

<212>PRT

<213>链霉菌FR-008

<400>4

Val Thr Ala Thr Glu Pro Thr Thr Ala Pro Ala Pro Ala Gly Gly Gly

1               5                   10                  15

Asp Asp Ser Ile Val Lys Lys Leu Ser Thr Leu Asp Arg Tyr Leu Ala

            20                  25                  30

Val Trp Ile Leu Ile Ala Met Ala Val Gly Leu Gly Leu Gly Arg Val

        35                  40                  45

Ile Pro Gly Leu Asn Asp Ala Leu Ala Lys Val Glu Ile Gly Gly Ile

    50                  55                  60

Ser Leu Pro Ile Ala Leu Gly Leu Leu Ile Met Met Tyr Pro Val Leu

65                  70                  75                  80

Ala Lys Val Arg Tyr Asp Lys Leu Asp Ala Val Thr Gly Asp Arg Lys

                85                  90                  95

Leu Met Ile Ser Ser Leu Val Ile Asn Trp Ile Leu Gly Pro Ala Val

            100                 105                 110

Met Phe Ala Leu Ala Trp Ile Phe Leu Pro Asp Leu Pro Glu Tyr Arg

        115                 120                 125

Thr Gly Leu Ile Ile Val Gly Leu Ala Arg Cys Ile Ala Met Val Ile

    130                 135                 140

Ile Trp Asn Asp Leu Ala Cys Gly Asp Arg Glu Ala Ala Ala Val Leu

145                 150                 155                 160

Val Ala Leu Asn Ser Val Phe Gln Val Ile Ala Phe Gly Leu Leu Gly

                165                 170                 175

Trp Phe Tyr Leu Asp Leu Leu Pro Gly Trp Leu Gly Leu Gly Asp Gly

            180                 185                 190

Glu Asn Leu Asp Ile Ser Met Trp Glu Ile Ala Leu Asn Val Val Ile

        195                 200                 205

Phe Leu Gly Val Pro Leu Leu Ala Gly Phe Leu Thr Arg Arg Val Gly

    210                 215                 220

Glu Lys Lys Met Gly Arg Glu Gly Tyr Glu Gln Lys Phe Leu Pro Lys

225                 230                 235                 240

Ile Gly Pro Trp Ala Leu Tyr GIy Leu Leu Phe Thr Ile Val Ile Leu

                245                 250                 255

Phe Ala Leu Gln Gly Lys Thr Ile Thr Ser Gln Pro Leu Asp Val Val

            260                 265                 270

Arg Ile Ala Leu Pro Leu Leu Val Tyr Phe Ala Val Met Phe Phe Gly

        275                 280                 285

Thr Phe Leu Leu Gly Lys Gly Leu Gly Leu Ala Tyr Asp Arg Thr Thr

    290                 295                 300

Thr Leu Ala Phe Thr Ala Ala Gly Asn Asn Phe Glu Leu Ala Ile Ala

305                 310                 315                 320

Val Ala Ile Ala Thr Phe Gly Val Thr Ser Gly Gln Ala Leu Ser Gly

                325                 330                 335

Val Val Gly Pro Leu Ile Glu Val Pro Val Leu Ile Gly Leu Val Tyr

            340                 345                 350

Val Ala Leu Ala Trp Arg Arg Lys Phe Ala Pro Gly Ala Val Thr Thr

        355                 360                 365

Ala Pro

    370

<210>5

<211>94

<212>PRT

<213>链霉菌FR-008

<400>5

Val Ile Arg Val Leu Gly Asp Pro Leu Arg Leu Gln Ile Val Thr Leu

1               5                   10                  15

Leu Ala Arg Glu Thr Leu Cys Thr Thr His Leu Val Glu Glu Thr Gly

            20                  25                  30

Ala Lys Gln Thr Asn Leu Ser Asn His Met Lys Val Leu Arg Glu Ala

        35                  40                  45

Gly Ile Val Glu Thr Glu Pro Cys Gly Arg Phe Thr Tyr Tyr Lys Leu

    50                  55                  60

Lys Pro Glu Val Leu Thr Gly Leu Ser Glu Gln Phe Ala Asp Leu Ala

65                  70                  75                  80

Ala Ser Ala Arg Thr Ala Ala Glu Asn Lys Arg Ala Cys Pro

                85                  90

<210>6

<211>140

<212>PRT

<213>链霉菌FR-008

<400>6

Met Ala Asp Lys Pro Ser Val Leu Phe Val Cys Val His Asn Ala Gly

1               5                   10                  15

Arg Ser Gln Met Ala Ala Ala Trp Leu Thr His Leu Ala Gly Asp Arg

            20                  25                  30

Leu Glu Val Arg Ser Ala Gly Ser Asn Pro Gly Thr Ala Val Asn Pro

        35                  40                  45

Ala Ala Val Glu Ala Met Ala Glu Val Gly Ile Asp Ile Ser Ala Glu

    50                  55                  60

Thr Pro Lys Ile Leu Thr Val Asp Ala Val Lys Glu Ser Asp Val Cys

65                  70                  75                  80

Ile Thr Met Gly Cys Gly Asp Thr Cys Pro Val Phe Pro Gly Lys Arg

                85                  90                  95

Tyr Leu Asp Trp Lys Leu Lys Asp Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Ala

            100                 105                 110

Val Arg Pro Ile Arg Asp Glu Ile Lys Thr Leu Val Glu Gly Leu Ile

        115                 120                 125

Ala Glu Ile Ala Pro Glu Lys Pro Glu Ala Thr Ala

    130                 135                 140

<210>7

<211>324

<212>PRT

<213>链霉菌FR-008

<400>7

Val Ser Glu Ile Arg Glu Val Val Ile Ile Gly Ser Gly Pro Ala Gly

1               5                   10                  15

Tyr Thr Ala Ala Leu Tyr Thr Ala Arg Ala Gln Leu Arg Pro Val Leu

            20                  25                  30

Phe Gly Ser Ser Ile Phe Val Gly Gly Ser Leu Thr Thr Thr Thr Glu

        35                  40                  45

Val Glu Asn Phe Pro Gly Phe Pro Glu Gly Val Asp Gly Pro Val Leu

    50                  55                  60

Met Glu Asn Met Arg Ala Gln Ala Glu Lys Phe Gly Ala Glu Met Ile

65                  70                  75                  80

Asp Asp Asp Ile Val Ala Val Asp Leu Thr Gly Asp Ile Lys Leu Leu

                85                  90                  95

Thr Asp Ser Ala Gly Thr Val His Arg Ala Lys Thr Val Ile Ile Ala

            100                 105                 110

Thr Gly Ser Gly Phe Arg Lys Leu Gly Leu Pro Asn Glu Asp Glu Leu

        115                 120                 125

Ser Gly Arg Gly Val Ser Trp Cys Ala Thr Cys Asp Gly Phe Phe Phe

    130                 135                 140

Arg Asp Arg Asp Ile Val Val Val Gly Gly Gly Asp Thr Ala Met Glu

145                 150                 155                 160

Glu Ala Thr Phe Leu Thr Arg Phe Ala Lys Ser Val Thr Val Val His

                165                 170                 175

Arg Arg Ser Thr Leu Arg Ala Ser Lys Val Met Gln Asp Arg Ala Phe

            180                 185                 190

Ser Asp Asp Lys Ile Ser Phe Ala Phe Asp Ser Glu Ile Ala Glu Ile

        195                 200                 205

Lys Asp Thr Gly Gly Met Leu Gly Gly Val Val Leu Arg Asp Val Leu

    210                 215                 220

Thr Gly Ala Thr Arg Asp Leu Asp Val Thr Gly Leu Phe Ile Ala Ile

225                 230                 235                 240

Gly His Asp Pro Arg Thr Glu Leu Phe Thr Gly Gln Val Glu Leu Asp

                245                 250                 255

Asp Glu Gly Tyr Ile Lys Val Asp Ser Pro Ser Thr Arg Thr Asn Leu

            260                 265                 270

Pro Gly Val Phe Ala Ala Gly Asp Val Val Asp His Ile Tyr Arg Gln

        275                 280                 285

Ala Ile Thr Ala Ala Gly Thr Gly Ala Ala Ala Ala Leu Asp Ala Glu

    290                 295                 300

Arg Tyr Leu Ala Ala Arg Gly Val Ala Gln Thr Glu Pro Ala Thr Ala

305                 310                 315                 320

Ala Val Pro Val

Claims (7)

1、一种链霉菌线性质粒中抗砷基因簇，其特征在于，整个线性质粒上抗砷基因簇共6个基因及其DNA序列，具体为：砷抗性基因：sasB和sasC2个基因，砷抗性调节基因：sasR和sasR22个基因，黄素单加氧酶基因：sasO基因，硫氧还蛋白还原酶基因：sasT基因；DNA序列为序列1。

2、根据权利要求1所述的链霉菌线性质粒中抗砷基因簇，其特征是，所述的6个基因及其DNA序列编码相应抗砷功能蛋白的氨基酸序列，即序列2-7；包括包含序列1中碱基1-375的基因sasR2，包含序列1中碱基424-1,494的基因sasO，包含序列1中碱基1,491-2,603的基因sasB，包含序列1中碱基2,600-2,884的基因sasR，包含序列1中碱基3,004-3,426的基因sasC，包含序列1中碱基3,423-4,397的基因sasT，编码了调节蛋白，亚砷酸转运蛋白，黄素依赖的单加氧酶，砷酸还原酶，硫氧还蛋白还原酶，并提供这些基因所编码酶的氨基酸序列。

3、根据权利要求1所述的链霉菌线性质粒中抗砷基因簇，其特征是，所述的抗砷基因，其编码亚砷酸转运蛋白和砷酸还原酶，即sasB和sasC的核苷酸序列或互补序列及其相应的氨基酸序列。

4、根据权利要求1所述的链霉菌线性质粒中抗砷基因簇，其特征是，所述的砷抗性的调节基因，即sasR和sasR2的核苷酸序列或互补序列及其相应的氨基酸序列。

5、根据权利要求1所述的链霉菌线性质粒中抗砷基因簇，其特征是，所述的编码黄素单加氧酶基因，即sasO的核苷酸序列或互补序列及其相应的氨基酸序列。

6、根据权利要求1所述的链霉菌线性质粒中抗砷基因簇，其特征是，所述的编码硫氧还蛋白还原酶基因，参与砷酸还原酶催化五价砷还原成为三价砷，即sasT的核苷酸序列或互补序列及其相应的氨基酸序列。

7、根据权利要求1或者2所述的链霉菌线性质粒中抗砷基因簇，其特征是，所述的核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或DNA片段通过转导、转化、接合转移的方法转入外源宿主，这些外源宿主包括链霉菌，大肠杆菌，芽孢杆菌，酵母，植物，动物和工程菌中，并在外源宿主中表达，赋予宿主亚砷酸盐和砷酸盐抗性。

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