CN1685057A

CN1685057A - 在芽孢杆菌细胞的色素缺陷突变体中产生生物物质的方法

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Publication number: CN1685057A
Application number: CNA038232081A
Authority: CN
Inventors: 玛丽亚·唐; 艾伦·斯洛马; 戴维·斯滕伯格; 赖金·贝尔
Original assignee: Novozymes Biotech Inc
Current assignee: Novozymes Inc
Priority date: 2002-07-26
Filing date: 2003-07-25
Publication date: 2005-10-19
Anticipated expiration: 2023-07-25
Also published as: WO2004011609A3; AU2003254196A8; US20040096944A1; AU2003254196A1; EP1537229A2; US7666625B2; DK1537229T3; EP1537229A4; US20090098606A1; EP1537229B1; US20100330618A1; WO2004011609A2; US7476516B2; US8124376B2; CN100567501C

Abstract

本发明涉及产生异源生物物质的方法，包括：(a)在有益于异源生物物质产生的条件下培养亲代芽孢杆菌细胞的突变体，其中(i)突变体细胞含有第一核酸序列和第二核酸序列，所述第一核酸序列指导异源生物物质合成，所述第二核酸序列在参与红色色素生成的cypX和yvmC基因的至少一个中包含修饰，和(ii)突变体细胞与在相同条件下培养的亲代芽孢杆菌细胞相比，红色色素生成有缺陷；和(b)从培养基中回收异源生物物质。本发明也涉及芽孢杆菌细胞的突变体和产生该突变体的方法。

Description

在芽孢杆菌细胞的色素缺陷突变体中产生生物物质的方法

发明背景

发明领域

本发明涉及在芽孢杆菌(Bacillus)细胞的色素缺陷突变体中产生异源生物物质的方法、获得芽孢杆菌细胞的色素缺陷突变体的方法，以及芽孢杆菌细胞的色素缺陷突变体。

相关技术的描述

普切明(pulcherrimin)是极美酸(pulcherriminic acid)和铁离子螯合形成的浅红色色素。普切明由取代的吡嗪环构成，其在第2和第5位结合异丁基，但其它结构细节略有不同(Kuffer等，1967，Archiv für Mikrobiologic 56：9-21)。

MacDonald，1967，Canadian Journal of Microbiology13：17-20，已经描述了将普切明从蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)分离并将其转化成游离酸极美酸。Uffen和Canale-Parola，1972，Journal of Bacteriology 111：86-93，描述了通过枯草芽孢杆菌合成极美酸。

芽孢杆菌是非常成熟的产生天然蛋白和重组蛋白或者其它生物物质的宿主细胞系统。然而，具有增加蛋白的表达和分泌的所需特性的芽孢杆菌宿主可以不必具有对所述细胞产生的生物物质成功地进行发酵、回收和纯化所最期望的特性。这些过程可以不是最佳的，因为色素形成需要在目标生物物质的回收和纯化期间除去或者色素可以与生物物质共纯化。

因此，本发明的一个目的是提供改良的芽孢杆菌宿主，其既具有表达商用量的生物物质的能力又具有在红色色素生成中的缺陷。

发明概述

本发明涉及产生异源生物物质的方法，包括：

(a)在适合产生异源生物物质的条件中，培养亲代芽孢杆菌细胞的突变体，其中(i)所述突变体细胞含有第一核酸序列和第二核酸序列，所述第一核酸序列指导异源生物物质的合成，所述第二核酸序列在参与红色色素生成的cypX和yvmC基因的至少一个中包含修饰，且(ii)所述突变体细胞与在相同条件下培养的亲代芽孢杆菌细胞相比，红色色素生成有缺陷；和

(b)从所述培养基中回收所述异源生物物质。

本发明也涉及芽孢杆菌细胞的红色色素缺陷突变体和产生芽孢杆菌细胞的红色色素缺陷突变体的方法。

附图说明

图1A和1B显示cypX基因的基因组DNA序列和其推断的氨基酸序列(分别是SEQ ID NOS：1和2)。

图2A和2B显示yvmA基因的基因组DNA序列和其推断的氨基酸序列(分别是SEQ ID NOS：3和4)。

图3显示yvmB基因的基因组DNA序列和其推断的氨基酸序列(分别是SEQ ID NOS：5和6)。

图4A和4B显示yvmC基因的基因组DNA序列和其推断的氨基酸序列(分别是SEQ ID NOS：7和8)。

图5是pMRT084的限制酶图谱。

图6是pMRT086的限制酶图谱。

图7是pMRT126的限制酶图谱。

图8是pMRT128的限制酶图谱。

图9是pMRT121的限制酶图谱。

图10是pMRT123的限制酶图谱。

图11是pMRT124的限制酶图谱。

发明详述

本发明涉及产生异源生物物质的方法，包括：(a)在益于产生异源生物物质的条件中培养亲代芽孢杆菌细胞的突变体，其中(i)所述突变体细胞含有第一核酸序列和第二核酸序列，所述第一核酸序列指导异源生物物质的合成，所述第二核酸序列在参与红色色素生成的cypX和yvmC基因的至少一个中包含修饰，且(ii)所述突变体细胞与在相同条件下培养的亲代芽孢杆菌细胞相比，红色色素生成有缺陷；以及(b)从所述培养基中回收所述异源生物物质。。

本发明的优点是在芽孢杆菌发酵液中消除或减少了红色色素。红色色素的消除或减少有利于目标生物物质的回收和纯化。

在本发明的方法中，据信红色色素是普切明，因为当将芽孢杆菌培养物的固体或液体培养基在无铁离子的条件下培养，然后暴露于铁离子时，培养物和/或细胞变成了浅红色。此外，分离的色素溶于碱，不溶于水和有机溶剂，紫外光-可见光光谱与以前公开的极美酸光谱一致(见，Canale-Parola，1963，Archiv für Midrobiologie 46：414-427)。术语“普切明”在这里定义为极美酸的铁螯合物或铁盐。极美酸是普切明的游离酸，其中普切明由取代的吡嗪环构成，其在第2和第5位结合异丁基，在其它结构细节中略有不同(Kuffer等，1967，同上)。

术语“修饰”在这里定义为，在基因或者其转录或翻译所需的调控元件中引入、取代、或除去一个或多个核苷酸；基因破坏；基因转变；基因缺失；或者cypX和yvmC基因中至少一个基因发生随机突变或特异突变。cypX和/或yvmC基因的缺失可以是部分缺失或者是全部缺失。

短语“红色色素生成有缺陷”在这里定义为，不产生可检测到的红色色素的芽孢杆菌突变体细胞，或者是，与在相同条件下培养的亲代芽孢杆菌细胞相比，突变体细胞产生的红色色素优选至少少约25％，更优选至少少约50％，甚至更优选地至少少约75％，最优选地至少少约95％。可使用现有技术中公知的方法(见，例如，Kuffer等，1967，同上)测定本发明的芽孢杆菌突变体细胞产生的红色色素的水平。然而，由于无论使用的培养基是复合培养基还是基本培养基，色素都吸附到细胞上，因此通过对细胞进行离心就可以观察到红色色素的存在或缺乏。在基本培养基中，可以在上清液中观察到红色色素，但是随着培养基组成变得更复杂以及被培养基组分染色，培养基组分的颜色可以掩盖细胞上清液中红色色素的存在或缺乏。

在本发明的方法中，亲代芽孢杆菌细胞可以是产生红色色素的野生型芽孢杆菌细胞或其突变体。在本发明实践中使用的芽孢杆菌细胞包括，但不限于，嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、Bacillus clausii、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌、和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞。在优选的实施方案中，芽孢杆菌细胞是解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在更优选的实施方案中，亲代芽孢杆菌细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的实施方案中，亲代芽孢杆菌细胞是Bacillus clausii细胞。在另一个更优选的实施方案中，亲代芽孢杆菌细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的实施方案中，亲代芽孢杆菌细胞是枯草芽孢杆菌细胞。

芽孢杆菌细胞的红色色素缺陷突变体可使用现有技术中公知的方法，例如，插入、破坏、替代、或者缺失，通过减少或消除cypX和yvmC基因中至少一个基因的表达来构建。基因中被修饰或者灭活的部分可以是，例如，编码区或者表达编码区所需的调控元件。这种调控或控制序列的实例可以是启动子序列或其有功能的部分，即，足以影响核酸序列表达的部分。有可能被修饰的其它控制序列包括，但不限于，前导区、前肽序列、信号序列、转录终止子、和转录激活因子。

芽孢杆菌突变体细胞可通过用基因缺失技术消除或减少cypX和yvmC基因中至少一个基因的表达来构建。基因缺失技术能够除去该基因的一部分或全部，从而消除它们的表达。在这种方法中，基因缺失可以用包含所述基因的5’和3’侧邻接区的质粒通过同源重组完成。所述5’和3’邻接区可以在许可温度引入芽孢杆菌细胞，例如，引入其温度敏感质粒(如pE194)中，与第二选择性标记结合，从而使该质粒变得在所述细胞中可以被接受(become established)。接着将细胞转移到非许可温度，选出已将所述质粒含有在之一整合到染色体的一个同源侧翼区中的那些细胞。对质粒整合的选择通过对第二选择性标记的选择来实现。整合之后，将细胞转移到许可温度进行几次传代，但不进行选择，由此刺激在第二同源侧翼区发生重组事件。将细胞铺平板以获得单菌落，检查这些菌落是否丢失上述两种选择性标记(见，例如，Perego，1993，在A.L.Sonneshein，J.A.Hoch，和R.Losick所编的Bacillus subtilus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria，Chapter 42，American Society of Microbiology，Washington，D.C.)。

芽孢杆菌突变体细胞也可通过在基因或其转录或翻译所需的调控元件中引入、取代、或者除去一个或更多个核苷酸来构建。例如，可插入或除去核苷酸，以便引入终止密码子、除去起始密码子、或者使可读框发生移码。可根据现有技术中的已知方法，通过定点诱变或者PCR诱变完成这种修饰。见，例如，Botstein和Shortle，1985，Science 229：4719；Lo等，1985，Proceedings of the National Academy oif Sciences USA 81：2285；Higuchi等，1988，Nucleic Acids Research 16：7351；Shimada，1996，Meth. Mol.Biol. 57：157；Ho等，1989，Gene 77：61；Horton等，1989，Gene 77：61；和Sarkar和Sommer，1990，BioTechniqques 8：404。

芽孢杆菌突变体细胞也可通过基因破坏技术构建，即在一个或多个负责红色色素的基因中插入整合质粒，该质粒含有与所述基因同源的核酸片段，它将产生双份同源区并在所述双份同源区之间掺入载体DNA。如果插入的载体将基因的启动子与编码区分离，或者中断编码序列以至于产生非功能性基因产物，那么这样的基因破坏可消除基因表达。受到破坏的构建物可以只是带有与所述基因同源的5’和3’区的选择性标记基因。选择性标记能够鉴别含有被破坏的基因的转化体。

芽孢杆菌突变体细胞也可通过基因转变的方法构建(见，例如，Iglesias和Trautner，1983，Molecular General Genetics 189：73-76)。例如，在基因转变方法中，相应于所述基因的核苷酸序列经体外诱变产生缺陷的核酸序列，然后将该序列转化到亲代芽孢杆菌细胞中产生缺陷基因。通过同源重组，缺陷的核酸序列替代内源基因。最好是缺陷的基因或基因片段也编码可用于选择含有缺陷基因转化体的标记。例如，可将缺陷基因连同选择性标记引入到非复制型或温度敏感型质粒上。在不允许质粒复制的条件下，通过对标记的选择完成质粒整合的选择。通过检查菌落是否丧失选择性标记和是否获得突变基因，完成导致基因替代的第二重组事件的选择(见，例如，Perego，1993，同上)。或者，如下所述，缺陷核酸序列可以含有基因的一个或多个核苷酸的插入、取代、或缺失。

也可通过公认的反义技术，使用与基因的核酸序列互补的核苷酸序列构建芽孢杆菌突变体细胞(Parish和Stoker，1997，FEMS Microbiology Letters154：151-157)。更具体地，可通过引入与基因的核酸序列互补的核苷酸序列减少或消除芽孢杆菌细胞的基因表达，该核苷酸序列可在细胞中转录并且能够与细胞中产生的mRNA杂交。在使互补的反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，翻译成蛋白的量因而减少或消除。

也可使用现有技术中公知的方法，通过随机或特异诱变的方法进一步构建芽孢杆菌突变体细胞，这些方法包括，但不限于，化学诱变(见，例如，Hopwood，The Isolation of Mutants in Methods in Microbiology(J.R.Norris和D.W.Ribbons编辑)pp 363-433，Academic Press，New York，1970)和转座(见，例如，Youngman等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：2305-2309)。可通过将亲代细胞进行诱变并且筛选基因表达已经减少或消除的突变体细胞进行基因的修饰。可通过，例如，使用适当的物理或化学诱变剂，使用适当的寡核苷酸，或者对DNA序列进行产生诱变的PCR，进行特异的或随机的诱变。此外，可通过使用这些诱变方法中的任意组合进行诱变。

适于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、N-甲基-N’-亚硝基胍(NTG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸钠、甲酸、和核苷酸类似物。当使用这类试剂时，经典地是通过在适当的条件下，在存在选择性诱变剂时，培养将要诱变的亲代细胞，选择显示基因表达减少或无表达的突变细胞完成诱变。

如这里所述，在本发明的方法中，可以修饰红色色素的产生中所涉及的芽孢杆菌细胞的cypX基因或yvmC基因，或者两者。根据Berka等，2002，Molecular Microbiology 43：1331-1345的方案，通过芽孢杆菌ORFs微阵列(microarray)分析，鉴定了cypX-yvmC操纵子是在红色色素形成中所涉及的潜在位点。应当理解的是，术语“第二核酸序列”可以包括cypX和yvmC基因之一或两者。

在一个优选的实施方案中，cypX包括与SEQ ID NO：1具有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，甚至更优选至少85％，最优选至少90％，甚至最优选至少95％同源性的核酸序列。在最优选的实施方案中，cypX包括SEQ ID NO：1的核酸序列。在另一个最优选的实施方案中，cypX由SEQID NO：1的核酸序列组成。

在优选的实施方案中，yvmC包括与SEQ ID NO：3具有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，甚至更优选至少85％，最优选至少90％，甚至最优选至少95％同源性的核酸序列。在最优选的实施方案中，yvmC包括SEQ ID NO：3的核酸序列。在另一个最优选的实施方案中，yvmC由SEQID NO：3的核酸序列组成。

为了本发明的目的，通过Wilbur-Lipman法(Wilbur和Lipman，1983，Proceedings of the National Academy of Science USA 80：726-730)，使用LASERGENE^TM MEGALIGN^TM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)，用同一性表和下列多重序列对比参数：间隙罚分为10和间隙长度罚分为10，测定两个核酸序列之间的同源性程度。配对(Pairwise)对比参数是：Ktuple＝3，间隙罚分＝3，窗口＝20。

可使用从其它产生红色色素的微生物来源的，与这里描述的，在红色色素的产生中涉及的核酸序列同源或互补的核酸序列，修饰所选芽孢杆菌菌株中的相应基因。

在优选的实施方案中，在芽孢杆菌突变体细胞中红色色素的产生中所涉及基因的修饰不用选择性标记标记。

可通过在反选择(counter-selection)培养基上培养突变体，除去选择性标记基因。选择性标记基因含有其5’和3’末端侧翼的重复序列，当对突变体细胞进行反选择时，该重复序列将有利于通过同源重组选择性标记基因的环出。也可以通过同源重组的方法，通过将含有缺陷基因的5’和3’区，但缺乏选择性标记基因的核酸片段引入到突变体细胞中，随后通过在反选择培养基上的选择，除去选择性标记基因。通过同源重组，用缺乏选择性标记基因的核酸片段替换含有选择性标记基因的缺陷基因。也可以使用现有技术中的其它已知方法。

应当理解的是，本发明的方法不限于获得芽孢杆菌突变体细胞的特定模式。可在构建产生生物物质的细胞的任何步骤中，将在红色色素的产生中所涉及基因的修饰引入到亲代细胞中。优选在指导异源生物物质合成的基因引入前，已将芽孢杆菌突变体细胞变成缺乏红色色素。

在本发明的另一方面，芽孢杆菌突变体细胞可另外含有修饰，例如，对生物物质的产生、回收或应用有害的其它基因的缺失或破坏。在优选的实施方案中，芽孢杆菌细胞是缺乏蛋白酶的细胞。在更优选的实施方案中，芽孢杆菌细胞含有aprE和nprE的破坏或缺失。在另一个优选的实施方案中，芽孢杆菌细胞不产生孢子。在另一个更优选的实施方案中，芽孢杆菌细胞含有spoIIAC的破坏或缺失。在另一个优选的实施方案中，芽孢杆菌细胞含有在表面活性素(surfactin)合成中所涉及基因中的一个基因，例如，srfA，srfB，srfC，和srfD的破坏或缺失。见，例如，美国专利No.5,958,728。其它基因，例如，也可以破坏或缺失对生物物质的产生、回收或应用有害的amyE基因。

在本发明的方法中，当在相同产生条件下培养时，优选芽孢杆菌突变体细胞至少产生与相应亲代芽孢杆菌细胞相同量的生物物质。在更优选的实施方案中，当在相同产生条件下培养时，突变细胞比相应亲代芽孢杆菌细胞产生至少高约25％，优选至少高约50％，更优选至少高约75％，最优选至少高约100％的生物物质。

使用现有技术中的已知方法，在适合产生异源生物物质的营养培养基中培养芽孢杆菌突变体细胞。例如，可在合适的培养基中和在允许生物物质表达和/或分离的条件下，在实验室或工业使用的发酵罐中，通过摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批(fed-batch)、或固态发酵)培养细胞。使用现有技术中的已知方法，在含有碳和氮源以及无机盐的合适的营养培养基中进行培养。合适的培养基可从商品供应商那里买到，或者可根据已公开的成分(例如，在美国典型培养物保藏中心(the AmericanType Culture Collection)的目录中公开的成分)制备。可从培养基中直接回收分泌的生物物质。

可使用现有技术中对生物物质特异的已知方法检测生物物质。这些检测方法可包括使用特异抗体、高效液相层析、毛细层析、酶产物的形成、酶底物的消失、或SDS-PAGE。例如，可使用酶测定的方法测定酶的活性。对于许多酶来说，测定酶活性的方法在现有技术中是已知的(见，例如，D.Schomburg和M.Salzmann(编辑)，Enzyme Handbook，Springer-Verlag，NewYork，1990)。

可通过现有技术中的已知方法分离得到的生物物质。例如，可从培养基中通过常规方法分离目标多肽，这些方法包括，但不限于，离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸发或沉淀。接着可进一步通过现有技术中的各种已知方法纯化分离的多肽，这些方法包括，但不限于，层析(例如，离子交换层析、亲和层析、疏水层析、层析聚集、和大小排阻层析)、电泳方法(例如，制备型等电聚焦(IEF))、差异溶解(例如，硫酸铵沉淀)、或抽提(见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)。可从培养基中分离目标代谢物，例如，通过抽提、沉淀、或差异溶解、或现有技术中的任何已知方法。接着可使用适合代谢物的方法进一步纯化分离的代谢物。

异源生物物质可以是任何生物聚合物或代谢物。生物物质可通过构成生物合成或代谢途径中的单个基因或一系列基因编码。因此，术语“指导异源生物物质合成的第一核酸序列”应当被理解为包括在生物物质的产生中所涉及的一个或多个基因。术语“异源生物物质”在这里被定义为不是宿主细胞产生的生物物质；天然生物物质，其中进行结构的修饰改变天然的生物物质，例如，改变天然多肽的蛋白序列；或者由于通过重组DNA技术对宿主细胞的处理，例如，使用更强的启动子，导致其表达量上改变的天然生物物质。

在本发明的方法中，生物聚合物可以是任何一种生物聚合物。术语“生物聚合物”在这里被定义为具有相同、相似或相异亚单位(单体)的链(或聚合物)。生物聚合物可以是，但不限于，核酸、多胺、多元醇、多肽(或聚酰胺)、或者多糖。

在优选的实施方案中，生物聚合物是多肽。多肽可以是任何具有目标生物活性的多肽。术语“多肽”在这里并不意味着是指特定长度的编码产物，因此，该术语包括肽、寡肽以及蛋白。术语“多肽”也包括两个或更多结合起来形成编码产物的多肽。多肽也包括杂种多肽，其包括从至少两个不同多肽中获得的部分或全部多肽序列的组合，其中一个或多个多肽可以与芽孢杆菌细胞异源。多肽进一步包括上述多肽和杂种多肽的天然等位基因变异和基因工程变异。

优选地，异源多肽是抗体、抗原、抗菌肽、酶、生长因子、激素、免疫膨胀物(immunodilator)、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白、或转录因子。

在优选的实施方案中，异源多肽是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、或连接酶。在更优选的实施方案中，多肽是α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精、糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖脑苷脂酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、突变酶、氧化酶、果胶降解酶、过氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、尿激酶、或木聚糖酶。

在优选的实施方案中，生物聚合物是多糖。多糖可以是任何多糖，包括，但不限于，粘多糖(例如，肝素和透明质酸)和含氮的多糖(例如，壳多糖)。在更优选的实施方案中，多糖是透明质酸。

在本发明的方法中，代谢物可以是任何代谢物。代谢物可被一种或多种基因编码。术语“代谢物”包括初级代谢产物和次生代谢物。初级代谢产物是细胞的初级或一般代谢的产物，其与能量代谢、生长、和结构有关。次生代谢物是次生代谢的产物(见，例如，R.B.Herbert，The Biosynthesis ofSecondary Metabolites，Chapman和Hall，New York，1981)。

初级代谢物可以是，但不限于，氨基酸、脂肪酸、核苷、核苷酸、糖、甘油三酯、或维生素。

次生代谢物可以是，但不限于，生物碱、香豆素、黄酮类化合物、聚酮化合物、奎宁、类固醇、或萜。在优选的实施方案中，次生代谢物是抗生素、拒食剂、引诱剂、杀菌剂、杀真菌剂、激素、杀虫剂、或灭鼠剂。

在本发明的方法中，芽孢杆菌细胞的突变体是重组细胞，含有指导异源生物物质，例如，多肽，合成的核酸序列，其有利于在生物物质的重组产生中使用。优选用含有指导异源生物物质合成的核酸序列的载体转化细胞，随后将载体整合到染色体内。“转化”意思是将含有核酸序列的载体引入到宿主细胞内，维持载体成为染色体的组成部分或者成为自我复制的染色体外载体。整合通常被认为是一种优势，因为核酸序列更有可能被稳定维持在细胞内。通过同源重组、非同源重组、或转座将载体整合到染色体内。

可从任何原核的、真核的、或其它来源，例如，古细菌中获得指导异源生物物质合成的核酸序列。至于本发明的目的，这里使用的与给定的来源有关的术语“获得”意味着生物物质是通过来源或通过已将来源的基因插入到其中的细胞产生的。

在本发明的方法中，芽孢杆菌细胞的突变体可用于重组产生芽孢杆菌细胞的天然生物物质。可通过重组方法产生天然物质，例如，通过将指导生物物质合成的基因置于不同启动子的调控下提高物质的表达、通过使用，例如，信号序列，加速其运输到细胞外、或者增加指导芽孢杆菌细胞正常产生的生物物质合成的基因的拷贝数。因此，在术语“异源生物物质”的范围内，本发明也包括天然生物物质的这样的重组产生，在某种程度上这样的表达包括使用不属于芽孢杆菌细胞的遗传元件，或者使用经过操作，以不在宿主细胞中正常存在的方式起作用的天然元件。

用于分离或克隆指导生物物质合成的核酸序列的技术在现有技术中是已知的，包括从基因组DNA中分离、从cDNA中制备、或它们的组合。例如，可通过使用公知的聚合酶链反应(PCR)，从这样的基因组DNA中进行核酸序列的克隆。见，例如，Innis等，1990，PCR Protocols：A Guide to Methodsand Applicatio。n，Academic Press，New York。克隆过程可包括切除和分离含有指导生物物质合成的核酸序列的期望核酸片段、将该片段插入到载体分子中以及将重组载体掺入到将复制核酸序列的多拷贝或克隆的芽孢杆菌细胞内。核酸序列可以是基因组序列、cDNA序列、RNA序列、半合成序列、合成起点序列、或它们的任一组合。

在本发明的方法中，生物物质是异源多肽，这种多肽也可包括融合多肽，其中在多肽或其片段的N-末端或C-末端融合另一个多肽。通过将编码一种多肽的核酸序列(或其部分)融合到编码另一种多肽的核酸序列(或其部分)上产生融合多肽。现有技术中产生融合多肽的技术是已知的，包括连接编码多肽的编码序列，使得它们符合读框，并且在相同启动子和终止子的调控下表达融合多肽。

“核酸构建物”这里定义为核酸分子，单链或双链，其从天然存在的基因中分离，或者对其进行修饰以含有不同于天然存在方式结合和并列的核酸片段。当核酸构建物含有编码序列的表达所需的所有调控序列时，术语核酸构建物可以与术语表达盒具有相同的含义。术语“编码序列”这里定义为当将其置于下述调控序列的调控下时，被转录成mRNA并且翻译成目标生物物质的序列。通常通过5’-端的翻译起始密码子ATG和3’-端的翻译终止密码子确定编码序列的边界。编码序列可包括，但不限于，DNA、cDNA、以及重组核酸序列。

可以各种方式操纵指导生物物质合成的分离的核酸序列，为生物物质的表达作准备。在其插入到载体之前，核酸序列的操作可以是期望的或必须的，这取决于表达载体或芽孢杆菌宿主细胞。利用克隆方法修饰核酸序列的技术在现有技术中是公知的。

在与调控序列相容的条件下，可将含有指导生物物质合成的核酸序列的核酸构建物，可操作地连接到能够在芽孢杆菌细胞突变体中指导编码序列表达的一个或多个调控序列上。

术语“调控序列”这里定义为包括核酸序列的编码序列的表达所必需的或有利于表达的所有元件。每个调控序列对于指导生物物质合成的核酸序列可以是天然的或是异源的。这些调控序列包括，但不限于，前导区、启动子、信号序列以及转录终止子。最小限度，调控序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。可以为调控序列提供用于引入特异性限制酶切位点目的的接头，便于将调控序列和指导生物物质合成的核酸序列的编码区相连。

调控序列可以是合适的启动子序列，一种被芽孢杆菌细胞识别，用于核酸序列表达的核酸序列。启动子序列含有介导生物物质表达的转录调控序列。启动子可以是在所选芽孢杆菌细胞中显示转录活性的任何核酸序列，可从指导细胞外或细胞内的生物物质合成的基因中获得，与芽孢杆菌细胞同源，或异源。指导本发明核酸构建物转录的合适的启动子的实例，具体在芽孢杆菌细胞中，是那些从大肠杆菌(E.coli)lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌maltogenic淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、以及原核β-内酰胺酶基因中获得的启动子(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedingsof the National Academy of Sciences USA 75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA80：21-25)。更多的启动子描述在Scientific American，1980，242：74-94中的“Useful proteins from recombinant bacteria”；和在J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，Molecular Clonin，A Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor，New York中。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，一种被芽孢杆菌细胞识别终止转录的序列。将终止子序列可操作地连接到指导生物物质合成的核酸序列的3’末端。在本发明中可使用在所选芽孢杆菌细胞中起作用的任何终止子。

调控序列也可以是合适的前导序列，对通过芽孢杆菌细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区。前导序列被可操作地连接到指导生物物质合成的核酸序列的5’末端。在本发明中可使用在所选的芽孢杆菌细胞中起作用的任何前导序列。

调控序列也可以是信号肽编码区，其编码连接到能指导所表达多肽进入细胞分泌途径的多肽氨基末端的氨基酸序列。信号肽编码区可以是多肽的天然序列或者可从异源来源中获得。核酸序列的编码序列的5’端可以内在地含有在翻译读框中与编码所分泌多肽的编码区片段天然连接的信号肽编码区。或者，编码序列的5’末端可含有与编码所分泌多肽的编码序列部分异源的信号肽编码区。由于编码序列正常不含有信号肽编码区，异源信号肽编码区可以是必须的。或者，为了提高多肽相对于与编码序列正常相连的天然信号肽编码区的分泌，异源信号肽编码区可以仅替换天然信号肽编码区。可从芽孢杆菌种的淀粉酶或蛋白酶基因中获得信号肽编码区。然而，在本发明中可使用能够指导所表达的多肽进入所选芽孢杆菌细胞分泌途径的任何信号肽编码区。

芽孢杆菌细胞有效的信号肽编码区是从下列基因中获得的信号肽编码区：芽孢杆菌NCIB 11837(maltogenic)淀粉酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶基因、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA基因。Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews57：109-137描述了更多的信号肽。

在本发明的方法中，可使用含有核酸序列、启动子以及转录和翻译终止信号的重组表达载体用于重组产生多肽或其它生物物质。可将上述各种核酸和调控序列连接起来制备重组表达载体，该载体可包括一个或多个适当的限制性酶切位点，允许指导多肽或生物物质合成的核酸序列在这些位点上的插入或者取代。或者，核酸序列可通过将核酸序列或含有该序列的核酸构建物插入到合适的表达载体中进行表达。在产生的表达载体中，将编码序列置于载体中，使得编码序列被可操作地与适当的表达调控序列相连，可以导致分泌。

重组表达载体可以是能方便地进行重组DNA过程并且能导致核酸序列表达的任何载体。载体的选择总是视载体与将引入载体的芽孢杆菌细胞之间的相容性而定。载体可以是线性的或闭合的环状质粒。载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外的实体存在的载体，载体的复制不受染色体复制的影响，例如，质粒、染色体外的元件、微型染色体、或人工染色体。载体可含有确保自我复制的任何方法。或者，当引入到芽孢杆菌细胞中时，载体可以是一种被整合到基因组中并且与其整合的染色体一同复制的载体。载体系统可以是单一载体或质粒，或者是两个或多个载体或质粒，它们共同含有被引入到芽孢杆菌细胞基因组中的全部DNA或转座子。

当被引入到芽孢杆菌细胞中时，载体可以被整合到芽孢杆菌细胞基因组中。对于整合，载体可以依赖指导生物物质合成的核酸序列，或者通过同源重组将载体稳定整合到基因组中的载体的任何其它元件。或者，载体可含有通过同源重组指导整合到芽孢杆菌细胞基因组内的额外的核酸序列。该额外的核酸序列能够使载体在染色体中的精确位置整合到芽孢杆菌细胞基因组中。为了增加在精确位置上整合的可能性，整合的元件应当优选含有足够核苷酸数量的核酸，如100到1,500个碱基对，优选400到1,500个碱基对，最优选800到1,500个碱基对，它们与对应的靶序列高度同源以提高同源重组的可能性。整合的元件可以是与芽孢杆菌细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合的元件可以是非编码或编码核酸序列。

为了自主复制，载体可进一步含有使载体在考虑的芽孢杆菌细胞中自主复制的复制起点。细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌(E.coli)中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1。复制起点可以是具有突变导致其功能在芽孢杆菌细胞中是温度敏感的复制起点(见，例如，Ehrlich，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA75：1433)。

可将多于一个拷贝的指导目标生物物质合成的核酸序列引入到芽孢杆菌细胞中，扩大核酸序列的表达。可使用现有技术中的公知方法，通过将序列的至少一个额外拷贝整合到芽孢杆菌细胞基因组中以及选择转化体从而获得核酸序列的稳定扩增。在WO 94/1496中描述了一种获得基因组DNA序列扩增的便利方法。

载体优选含有允许方便选择转化细胞的一个和多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供杀虫剂抗性、重金属抗性、营养缺陷型原养型等特性。细菌选择性标记的实例是枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因、或者赋予抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、红霉素、氯霉素或四环素的标记。此外，可通过共转化方式进行选择，例如，如在WO 91/09129中所述，选择性标记是在独立的载体上。

用于将上述元件连接起来构建重组表达载体的方法对于本领域技术人员来说是公知的方法(见，例如，Sambrook等，1989，同上)。

芽孢杆菌细胞的转化体可通过下列方法产生，例如，通过原生质转化(见，例如，Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)、通过使用感受态细胞(见，例如，Young和Spizize，1961，Journal ofBacteriology 81：823-829，或者Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal ofMolecular Biology 56：209-221)、通过电穿孔(见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)、或者通过接合(见，例如，Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169：5271-5278)。

本发明也涉及获得亲代芽孢杆菌细胞突变体的方法，包括：(a)将含有在红色色素的产生中所涉及的cypX和yvmC基因中至少一种的修饰的第一核酸序列引入到芽孢杆菌细胞中；和(b)从步骤(a)中鉴定含有修饰核酸序列的突变体细胞，其中突变体细胞不产生红色色素。

本发明进一步涉及亲代芽孢杆菌细胞突变体，含有指导异源生物物质合成的第一核酸序列以及包含在红色色素的产生中所涉及的cypX和yvmC基因中至少一种的修饰的第二核酸序列，其中，当在相同条件下培养时，突变体细胞产生比亲代芽孢杆菌细胞更少的红色色素。

本发明通过下列实施例进一步描述，下列实施例不应当被解释为对本

发明范围的限定。

实施例

所有引物和寡核苷酸都由MWG Biotech，Inc.，High Point，NC提供。

使用Anagnostopoulos和Spizizen，1961，Journal of Bacteriology 81：741-746描述的方法将枯草芽孢杆菌菌株制备成感受态。

用ABI 3700测序仪仪(Sequencing)(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)进行DNA测序。

实施例1：使用DNA微阵列鉴定cypX-yvmC和yvmB-yvmA操纵子

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili)RB128株是根据美国专利No.5,891,701的方法获得的枯草芽孢杆菌A164Δ5株(删除spoIIAC，aprE，nprE，amyE，和srfC基因的枯草芽孢杆菌ATCC 6051A)。枯草芽孢杆菌RB128株含有编码芽孢杆菌麦芽糖生成(maltogenic)淀粉酶的异源基因。根据下列方案，通过枯草芽孢杆菌RB128株的N-甲基-N’亚硝基胍(NTG)诱变获得枯草芽孢杆菌BRG1株。用三种分别产生98.2％、99.5％和99.9％杀死率的不同浓度的N-甲基-N’亚硝基胍(NTG)：0.26mg/ml、0.53mg/ml和1.06mg/ml处理生长到对数期的枯草芽孢杆菌RB128株细胞。在24孔板的1ml孔内，每个处理组的100微升细胞过度生长到6倍。将生长晕在10％甘油中保藏，并在-80℃中冻存。对于每种处理，文库的大小分别是大约15500、4200和250个突变体。从0.26mg/ml NTG处理的枯草芽孢杆菌RB128株中分离枯草芽孢杆菌BRG1突变体，在40-41℃，pH 7±0.2的1.5升培养基中培养BRG1 48小时，其中每升培养基由50克水解蛋白、6.5克KH₂PO₄、4.5克Na₂HPO₄、3.0克(NH₄)₂SO₄、2.0克柠檬酸钠-2H₂O、3.0克MgSO₄、0.15毫克生物素、0.5克CaCl₂-2H₂O、和痕量金属组成。以每小时每升8克的最大速率向发酵提供糖。用空气以每分钟1到2升的速度向培养物喷射，并以1300rpm的速度搅拌培养物。与枯草芽孢杆菌RB128株整个肉汤的颜色是深褐色的相比，枯草芽孢杆菌BRG1株的整个肉汤的颜色是淡褐色的。在整个枯草芽孢杆菌RB128株肉汤的细胞沉淀中可以看到红色色素，而在枯草芽孢杆菌BRG1株的细胞沉淀中没有观察到红色色素。

从枯草芽孢杆菌RB128和BRG1株的6、12、24、29和46小时发酵样品(10ml)中获取总细胞RNA。从储藏在-80℃的发酵样品中制备的细胞沉淀中获取RNA。为了制备RNA，将冷冻的细胞沉淀在1ml焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水中重悬，使用Fast RNA Blue kit(Bio 101，Inc.，Vista，CA)制备9个复制品。然后将复制品汇合到一个试管中用以制备cDNA探针。

制备每个时间点的10个复制的cDNA靶，并且根据Berka等，2002，Molecular Microbiology 43：1331-1345和Kane等，2000，Nucleic AcidsResearch 28：4552-4557描述的方法，与枯草芽孢杆菌的ORFs PCR片段微阵列杂交。根据Eisen和Burn，1999，Methods in Enzymology 303：179-205的方法，用Cy5(Amersham Corporation，Arlington Heights，IL)标记枯草芽孢杆菌RB128株的cDNA，而用Cy3(Amersham Corporation，Arlington Heights，IL)标记枯草芽孢杆菌BRG1株的cDNA。分别用在532nm和632nm处工作的固态激光检测Cy3(一种绿色荧光染料)和Cy5(红色荧光染料)报道分子。用QuantArray(PerkinElmer Lifesciences，Inc.，Boston，MA)扫描阵列并格式化用于分析，将数据输入到GeneSpring(Silicon Genetics，Inc.，Redwood City，CA)中进行最终分析。用斯坦福大学(Stanford University)的SAM Exceladd-in(Tusher等，2001，Proceedings of the National Academy of Sciences USA98：5116-5121)对复制的载玻片进行统计学意义分析。cypX-yvmC和yvmB-yvmA操纵子被鉴定为在红色色素，普切明的形成中涉及的潜在位点(cypX：图1，SEQ ID NOs：1和2，登记号BG12580；yvmC：图2，SEQ ID NOs：3和4，登记号BG14121；yvmB：图3，SEQ ID NOs：5和6，登记号BG11018；以及yvmA：图4，SEQ ID NOs：7和8，登记号BG14120)。与枯草芽孢杆菌RB128株相比，在12-46小时时间点，枯草芽孢杆菌BRG1株中的cypX-yvmC和yvmB-yvmA操纵子一致下调。

使用两个与枯草芽孢杆菌ORFs寡核苷酸微阵列杂交的复制cDNA靶，进行第二微阵列实验。寡核苷酸购于Compugen，Inc.，Jamesburg，NJ，并且根据Berka等，2002，同上描绘的方法，将寡核苷酸以10μM的浓度印在聚L-赖氨酸覆盖的载玻片上，形成每个载玻片上4个枯草芽孢杆菌基因组的密度。根据上述方法标记枯草芽孢杆菌RB128和BRG1株的cDNAs。使用GenePix 4000B扫描仪和GenePix Pro version 4.1软件(Axon Instruments，Inc.，Union City，CA)扫描阵列并格式化用于分析。用上述SAM Excel add-in对复制的基因组进行统计学意义分析，并将经鉴定为有意义的基因输入到GeneSpring version 4.2中。在这种第二微阵列的实验中，仅cypX-yvmC操纵子被鉴定为在红色色素形成中所涉及的潜在位点。

实施例2：枯草芽孢杆菌MaTa17株的构建

使用引物1和2，从枯草芽孢杆菌BRG1株中PCR扩增cypX-yvmC和yvmB-yvmA操纵子，作为单一片段。

引物1：5’-CATGGGAGAGACCTTTGG-3’(SEQ ID NO：9)

引物2：5’-GTCGGTCTTCCATTTGC-3’(SEQ ID NO：10)

扩增反应(50μl)由下列物质构成：200ng枯草芽孢杆菌BRG1株染色体DNA、引物1和2每种0.4μM、dATP，dCTP，dGTP，和dTTP每种200μM、含有1.5mM MgCl₂的1X Expand^TM High Fidelity缓冲液、以及2.6单位的Expand^TM High Fidelity PCR系统酶混合物(Roche Diagnostic Corporation，Indiabapolis，IN)。根据生产商的要求(Genomic DNA Handbook，QIAGEN，Inc.，Valencia，CA，1999-2001，pp.38-47)，使用QIAGEN tip-20柱(QIAGEN，Inc.，Valencia，CA)获得枯草芽孢杆菌BRG1株染色体DNA。在RoboCycler 40热循环仪(Stratagene，Inc，La Jolla，CA)中进行扩增反应，反应程序是：1个循环，95℃3分钟；10个循环，每个循环95℃ 1分钟，58℃ 1分钟，以及68℃ 4分钟；20个循环，每个循环95℃ 1分钟，58℃ 1分钟，68℃ 4分20秒；随后1个循环，72℃ 7分钟。使用0.8％琼脂糖-25mM Tris碱-25mM硼酸盐-0.5mM乙二胺四乙酸二钠缓冲液(0.5X TBE)凝胶，通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物。

根据生产商的要求(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)，使用TA-TOPO克隆试剂盒将得到的含有cypX-yvmC和yvmB-yvmA操纵子的片段克隆到pCR2.1中，并且转化到大肠杆菌(E.coli)OneShot^TM细胞中。在每毫升补充了100μg氨苄青霉素的酵母-胰蛋白胨(2X YT)琼脂平板上选择转化体。根据生产商的要求，使用QIAGEN tip-20柱从几个转化体中分离质粒DNA，并用M13(-20)前向引物、M13反向引物以及下列所示引物3-18，通过DNA测序进行证实。M13(-20)前向引物和M13反向引物是从Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA获得。得到的质粒称为pMRT084(图5)。

引物3：5’-CGACCACTGTATCTTGG-3’(SEQ ID NO：11)

引物4：5’-GAGATGCCAAACAGTGC-3’(SEQ ID NO：12)

引物5：5’-CATGTCCATCGTGACG-3’(SEQ ID NO：13)

引物6：5’-CAGGAGCATTTGATACG-3’(SEQ ID NO：14)

引物7：5’-CCTTCAGATGTGATCC-3’(SEQ ID NO：15)

引物8：5’-GTGTTGACGTCAACTGC-3’(SEQ ID NO：16)

引物9：5’-GTTCAGCCTTTCCTCTCG-3’(SEQ ID NO：17)

引物10：5’-GCTACCTTCTTTCTTAGG-3’(SEQ ID NO：18)

引物11：5’-CGTCAATATGATCTGTGC-3’(SEQ ID NO：19)

引物12：5’-GGAAAGAAGGTCTGTGC-3’(SEQ ID NO：20)

引物13：5’-CAGCTATCAGCTGACAG-3’(SEQ ID NO：21)

引物14：5’-GCTCAGCTATGACATATTCC-3’(SEQ ID NO：22)

引物15：5’-GATCGTCTTGATTACCG-3’(SEQ ID NO：23)

引物16：5’-AGCTTTATCGGTGACG-3’(SEQ ID NO：24)

引物17：5’-TGAGCACGATTGCAGG-3’(SEQ ID NO：25)

引物18：5’-CATTGCGGAGACATTGC-3’(SEQ ID NO：26)

从枯草芽孢杆菌BRG1中扩增并克隆到质粒pMRT084中的cypX-yvmC和yvmB-yvmA操纵子和已公开的枯草芽孢杆菌168序列(Kunst等，1997，Nature 390：249-256)之间的DNA序列比较显示，这些序列完全相同。为了产生删除了这些操纵子的枯草芽孢杆菌株，用BsgI消化质粒pMRT084以删除cypX-yvmC和yvmB-yvmA操纵子的大部分，在每端留下约500个碱基。根据生产商(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)的要求，用T4DNA聚合酶和虾碱性磷酸酶(SAP)处理消化过的BsgI DNA。用SmaI消化质粒pECC1(Youngman等，1984，Plasmid 12：1-9)。根据生产商的要求，使用QIAquick DNA提取试剂盒(QIAGEN，Inc.，Valencia，CA)从0.8％琼脂糖-0.5X TBE凝胶中分离pMRT084的大约5100bp的片段和含有氯霉素抗性基因(cat)的pECC1的大约1600bp的片段、将这两个片段连接、并根据生产商(Stratagene，Inc.，La Jolla，CA)的要求转化大肠杆菌(E.coli)XL1 Blue细胞。在每毫升补充了100μg氨苄青霉素的2X YT琼脂平板上选择转化体。使用引物19和20，通过PCR扩增，鉴定带有删除了cypX-yvmC和yvmB-yvmA操纵子大部分的正确质粒的转化体。在50μl反应液中进行PCR扩增，反应液由1ng质粒DNA、每种引物0.4μM、dATP，dCTP，dGTP，和dTTP每种200μM、含有2.5mM MgCl₂的1X PCR缓冲液II(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)、以及2.5单位AmpliTaq Gold^TM DNA聚合酶(AppliedBiosystems，Inc.，Foster City，CA)组成。反应在RoboCycler 40热循环仪中进行，反应程序是：95℃ 10分钟，1个循环；25个循环，每个循环是：95℃1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟；以及72℃ 7分钟，1个循环。使用0.8％琼脂糖-0.5X TBE凝胶显示PCR产物。这个构建物称为pMRT086(图6)。

引物19：5’-TAGACAATTGGAAGAGAAAAGAGATA-3’(SEQ ID NO：27)

引物20：5’-CCGTCGCTATTGTAACCAGT-3’(SEQ ID NO：28)

将质粒pMRT086用ScaI线性化，并在每毫升0.2μg氯霉素时转化到枯草芽孢杆菌RB128感受态细胞中。在每毫升含有5μg氯霉素的胰蛋白胨血琼脂碱(TBAB)平板上选择转化体，在37℃生长16小时。使用QIAGEN tip-20柱，根据生产商的要求，从几个转化体中制备染色体DNA。使用引物3和19、3和20、4和19、以及3和20，通过PCR筛选经PCR删除cypX-yvmC和yvmB-yvmA操纵子的氯霉素抗性菌落。在50μl反应液中进行PCR扩增，反应液由200ng染色体DNA、每种引物0.4μM、dATP，dCTP，dGTP，和dTTP每种200μM、含有2.5mM MgCl₂的1X PCR缓冲液II、以及2.5单位AmpliTaq Gold^TM DNA聚合酶构成。反应在RoboCycler 40热循环仪中进行，反应程序是：95℃ 10分钟，1个循环；25个循环，每个循环是：95℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟；以及72℃ 7分钟，1个循环。使用0.8％琼脂糖-0.5X TBE凝胶显示PCR产物。所得的删除了cypX-yvmC和yvmB-yvmA的枯草芽孢杆菌RB128株称为枯草芽孢杆菌MaTa17。

使用实施例1中所描述的相同的培养基和条件对枯草芽孢杆菌MaTa17进行发酵。48小时后，枯草芽孢杆菌MaTa17株没有产生可观测到的红色色素。此外，在实施例1中的第二DNA微阵列分析鉴定了cypX-yvmC操纵子是红色色素合成中涉及的唯一操纵子，而下面的实施例3和4显示cypX或yvmC基因的删除对于红色色素的消除是必需的。因此，为了检验红色色素的消除有用，在各种枯草芽孢杆菌株，如枯草芽孢杆菌A164Δ5(美国专利No.5,891,701)、枯草芽孢杆菌RB194和RB194 RB197(WO 03/054163)，以及在这里描述的其它枯草芽孢杆菌株中删除cypX基因，红色色素的消除将有益于产物的回收。

实施例3：枯草芽孢杆菌A164Δ5ΔcypX株的构建

为了证明cypX基因在红色色素合成中所起的作用，从枯草芽孢杆菌A164Δ5(美国专利No.5,891,701)中删除cypX基因。使用质粒pMRT122(WO03/054163)转化枯草芽孢杆菌A164Δ5感受态细胞。在每毫升补充了1μg红霉素和25μg林可霉素的TBAB-琼脂平板上选择转化体，并将转化体在30℃培养24-48小时。通过坎贝尔型(Campbell-type)整合将删除的cypX基因引入到枯草芽孢杆菌A164Δ5的染色体中，通过在45℃培养新划线的枯草芽孢杆菌A164Δ5(pMRT122)细胞平板16小时，选择产生枯草芽孢杆菌株A164Δ5::pMRT122的健康生长的菌落。将几个健康生长的菌落接种到1毫升LB肉汤培养基中并在30℃，250rpm过夜培养。使用10μl的培养细胞连续传代至少3次。最后一次传代后，将培养的细胞在LB琼脂平板上划线分离，并在37℃培养16小时。挑取单个菌落以复制的方式接种到LB琼脂平板和每毫升补充了1μg红霉素和25μg林可霉素的TBAB平板上，在37℃生长16小时。使用REDextract-N-Amp^TM Plant PCR试剂盒(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)，根据下列步骤分离潜在整合体的染色体DNA：将单个芽孢杆菌菌落接种到100μl提取液(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)中，在95℃培养10分钟，然后用等体积的稀释液(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)稀释。根据生产商的要求，使用4μl提取的DNA以及REDextract-N-AmpPCR反应混合物和引物12和21进行PCR。在RoboCycler 40热循环仪中进行PCR反应，反应程序是：95℃ 9分钟，1个循环；3个循环，每个循环是：95℃1分钟，52℃ 1分钟，72℃ 1分钟；27个循环，每个循环是：95℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃ 1分钟；以及72℃ 5分钟，1个循环。在0.8％琼脂糖-0.5X TBE凝胶中显示PCR产物。所得的菌株称为枯草芽孢杆菌A164Δ5ΔcypX。在每升补充了0.5％蔗糖、0.15mg生物素、24mg硫酸铁、9.6mg硫酸锰、3mg硫酸铜、6mg氯化锌以及0.06％柠檬酸的Spizizen’s基本盐-琼脂(SMS)平板(Anagnostopoulos和Spizizen，1961，supra)上显示枯草芽孢杆菌中红色色素的存在或丧失。当与枯草芽孢杆菌A164Δ5比较时，枯草芽孢杆菌A164Δ5ΔcypX似乎是无色的。

引物21：5’-CATGGGAGAGACCTTTGG-3’(SEQ ID NO：29)

实施例4：枯草芽孢杆菌A164Δ5ΔyvmC株的构建

为了验证cypX和/或yvmC是否负责红色色素的合成，将yvmC基因删除，留下完整的cypX基因。用EcoRI和HindIII消化质粒pMRT074(WO 03/054163)和pMRT084。使用QIAquick DNA纯化试剂盒，根据生产商的要求，从2％琼脂糖-0.5X TBE凝胶中分离pMRT074的大约4300 bp的片段和pMRT084的大约1700 bp的片段，将这两个片段连接，并用于转化枯草芽孢杆菌168Δ4感受态细胞。在每毫升补充了1μg红霉素和25μg林可霉素的TBAB-琼脂平板上选择转化体，在30℃培养24小时。通过用DraI的限制酶切分析，在0.8％琼脂糖-0.5X TBE凝胶上鉴定携带正确质粒的转化体。得到的构建物称为pMRT126(图7)。

将质粒pMRT126用Ecl136II/Eco47III消化以删除yvmC基因，将消化后的片段连接，并用于转化枯草芽孢杆菌A168Δ4。在每毫升补充了1μg红霉素和25μg林可霉素的TBAB-琼脂平板上选择转化体，在30℃培养24小时。通过用DraI限制酶切分析，在0.8％琼脂糖-0.5X TBE凝胶上鉴定携带正确质粒的转化体。得到的质粒称为pMRT128(图8)。

将质粒pMRT128用于转化枯草芽孢杆菌A164Δ5感受态细胞。在每毫升补充了1μg红霉素和25μg林可霉素的TBAB-琼脂平板上选择转化体，在30℃培养24-48小时。通过坎贝尔型(Campbell-type)整合将删除的yvmC基因引入到枯草芽孢杆菌164Δ5的染色体中，通过在45℃培养新划线的枯草芽孢杆菌A164Δ5(pMRT128)细胞平板16小时，选择健康生长的菌落。将几个健康生长的菌落接种到1毫升LB肉汤培养基中，在30℃，250rpm过夜培养。使用10μl培养细胞连续传代至少3次。最后一次传代后，将培养的细胞在LB琼脂平板上划线分离，并在37℃培养16小时。挑取单个菌落，以复制的方式接种到LB琼脂平板、每毫升补充了1μg红霉素和25μg林可霉素的TBAB平板和含有实施例3中描述的痕量金属的SMS平板上，在37℃生长16-48小时。如在实施例3中描述的，使用REDextract-N-Amp^TM Plant PCR试剂盒(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)分离红霉素敏感菌落的染色体DNA，使用实施例3中描述的PCR循环条件，用引物7和10，通过PCR筛选删除的yvmC基因。在0.8％琼脂糖-0.5X TBE凝胶中显示PCR产物。在含有痕量金属的Spizizen’s基本盐-琼脂(SMS)平板上显示枯草芽孢杆菌中红色色素的存在或丧失。当与野生型菌株比较时，yvmC缺失的菌株似乎是无色的，该菌株称为枯草芽孢杆菌A164Δ5ΔyvmC。

实施例5：枯草芽孢杆菌菌株的发酵

根据WO 03/054163中描述的方法构建枯草芽孢杆菌RB187、RB194和RB197株，在含有1.5升基本盐培养基的3升发酵罐中进行培养，其中基本盐培养基由每升6.5克KH₂PO₄、4.5克Na₂HPO₄、3.0克(NH₄)₂SO₄、2.0克柠檬酸钠、3.0克MgSO₄·7H₂O、0.15克生物素、15克糖、0.5克CaCl₂·2H₂O和痕量元素组成。以每小时每升2克糖的速率向发酵提供糖。以每分钟1到2升的速度用空气向培养物喷射，并以1250rpm的速度搅拌培养物。在pH7.0±0.2和32-37℃温度下维持发酵。用枯草芽孢杆菌RB187株进行发酵，经过12小时，在整个肉汤培养基上清液和细胞沉淀中可见红色色素产物，强化发酵的剩余物，直到48小时仍然可见红色色素产物。用枯草芽孢杆菌RB194和RB197株进行发酵，没有观察到红色色素产物。表1总结了在本发明中所评价菌株的红色色素合成的结果。

表1.所评价菌株红色色素合成的总结

菌株	参照	基因缺失	红色色素
菌株	参照	基因缺失	红色色素	枯草芽孢杆菌MaTa17枯草芽孢杆菌RB187枯草芽孢杆菌RB194枯草芽孢杆菌RB197枯草芽孢杆菌A164Δ5ΔcypX枯草芽孢杆菌A164Δ5ΔyvmC地衣芽孢杆菌SJ1904ΔcypX	实施例2WO 03/054163WO 03/054163WO 03/054163实施例3实施例4实施例6	CypX、yvmC、yvmA和yvmB无CypX、yvmC、yvmA和yvmBcypXcypXyvmCcypX	无有无无无无无

实施例6：地衣芽孢杆菌SJ1904ΔcypX株的构建

用引物22和23 PCR扩增地衣芽孢杆菌SJ1904的cypX基因(美国专利No.5,733,753)。

引物22：5’-GAATTCGCAGGAGGAACGAGTATG-3’(SEQ ID NO：30)

引物23：5’-AAGCTTGAAGATCAGTGAGGCAGC-3’(SEQ ID NO：31)

扩增反应(50μl)由200ng地衣芽孢杆菌SJ1904染色体DNA、引物22和23每种0.4μM、dATP，dCTP，dGTP和dTTP每种200μM、含有1.5mM MgCl₂的1X Expand^TM高保真缓冲液、以及2.6单位的Expand^TM高保真PCR系统酶混合物(Roche Diagnostic Corporation，Indianapolis，IN)构成。根据生产商的要求，使用QIAGEN tip-20柱获得地衣芽孢杆菌SJ1904染色体DNA。扩增反应在RoboCycler 40热循环仪中进行，反应程序是：94℃ 2分钟，1个循环；30个循环，每个循环是：94℃ 1分钟，52℃ 1分钟，68℃ 2分钟；随后72℃ 7分钟，1个循环。使用0.8％琼脂糖-0.5X TBE凝胶，通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物。根据生产商的要求，使用TA-TOPO克隆试剂盒将得到的含有cypX基因的片段(大约1300bp)克隆到pCR2.1中，并用于转化大肠杆菌(E.coli)OneShot^TM细胞。在每毫升补充了100μg氨苄青霉素的2X YT琼脂平板上选择转化体。根据生产商的要求，使用QIAGEN tip-20柱分离几个转化体的质粒DNA，用M13(-20)前向引物和M13反向引物，通过DNA测序进行检验。得到的质粒称为pMRT121(图21)。

用NruI和PmlI消化质粒pMRT121删除cypX基因，在每一端留下约350bp，将两个片段连接起来，根据生产商的要求用于转化大肠杆菌(E.coli)XL1Blue细胞。在每毫升补充了100μg氨苄青霉素的2X YT琼脂平板上选择转化体，并在37℃培养16小时。通过用DraI限制酶切分析，在2％琼脂糖-0.5XTBE凝胶上鉴定携带正确质粒的转化体。得到的构建物称为pMRT123(图10)。

用EcoRI和HindIII消化质粒pMRT074和pMRT123。根据生产商的要求，使用QIAquick DNA纯化试剂盒从0.8％琼脂糖-0.5X TBE凝胶中分离pMRT123的大约700bp的片段和pMRT074的大约4300bp的片段，将两个片段连接，用于转化枯草芽孢杆菌A168Δ4感受态细胞。在每毫升补充了1μg红霉素和25μg林可霉素的TBAB-琼脂平板上选择转化体，在30℃培养24小时。通过用DraI限制酶切分析，在2％琼脂糖-0.5X TBE凝胶上鉴定携带正确质粒的转化体。得到的构建物称为pMRT124(图11)。

根据Xue等，1999，Journal of Microbiological Methods 34：183-191描述的方法，使用质粒pMRT124转化地衣芽孢杆菌SJ1904电感受态(electrocompetent)细胞。电穿孔后，在补充了0.2μg/ml红霉素的LBSM培养基(含有0.5M山梨糖和0.38M甘露醇的Luria-Bertani)中培养细胞2.5到3小时，将细胞铺于每毫升补充了1μg红霉素和25μg林可霉素的TBAB-琼脂平板上，在30°培养24-48小时。通过坎贝尔型(Campbell-type)整合将质粒pMRT124中的删除的cyp基因引入到地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)SJ1904染色体中，通过在50℃培养新划线的地衣芽孢杆菌A164Δ5(pMRT124)细胞平板16小时，选择健康生长的菌落。将几个健康生长的菌落接种到1毫升LB肉汤培养基中，在30℃，250rpm过夜培养。使用10μl培养细胞连续传代至少3次。最后一次传代后，将培养的细胞在LB琼脂平板上划线分离，并在37℃培养16小时。挑取单个菌落，以复制的方式接种到LB琼脂平板和每毫升补充了1μg红霉素和25μg林可霉素的TBAB平板上，在37℃生长16小时。如在实施例3中描述的，使用REDextract-N-Amp^TM Plant PCR试剂盒分离红霉素敏感菌落的染色体DNA，使用实施例3中描述的PCR循环条件，用引物22和23，通过PCR筛选删除的cypX基因。在0.8％琼脂糖-0.5X TBE凝胶中显示PCR产物。得到的菌株称为地衣芽孢杆菌SJ1904ΔcypX。通过将地衣芽孢杆菌SJ1904和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)SJ1904ΔcypX补充了痕量金属的Spizizen’s基本盐-琼脂(SMS)平板上(实施例3)一起划线，显示地衣芽孢杆菌所形成的红色色素的存在或丧失。平板在37℃培养48小时。当与对照菌株比较时，cypX缺失的菌株似乎是无色的，提示红色色素形成的丧失是通过删除cypX基因完成的。

实施例7：从RB187上清液中分离红色色素

通过用6N HCl将40ml上清液的pH调整到1.5，分离枯草芽孢杆菌RB187株的肉汤培养基中发现的红色色素。将酸化的肉汤培养基在94℃培养30分钟，通过在SORVALL 6000B离心机(SORVALL，Inc.，Newtown，CT)中以2500rpm，4℃离心20分钟，沉淀色素。将红色色素用20ml HPLC级水离心洗涤3次，溶于10ml碱性甲醇中，并根据Canale-Parola，1963，Archiv fürMikrobiologie 46：414-427描述的方法，在过量氯化铁存在的情况下通过酸化将pH调整到1.5，回收红色色素。在2M NaOH中红色色素从600nm到200nm的光谱分析产生了在242nm、280nm和242nm处出现高峰的吸收光谱。这种纯化色素的紫外可见光谱与Canale-Parola发现的普切明吸收光谱相似。溶于碱性甲醇、不溶于酸、以及特有的吸收光谱共同强烈地提示红色色素就是普切明。

本发明在这里的描述和要求不应当被限于这里所公开的具体的实施方案的范围内，因为这些实施方案只是本发明几个方面的实例。任何等同的实施方案应当被认为是在本发明的保护范围之内。甚至，对于那些本领域技术人员来说，除了那些这里所显示和描述的之外，本发明的各种改进相对于前面的描述将是显而易见的。这样的改进也应当落入附加的权利要求的范围之内。至于冲突，包括定义的本发明的公开将会控制。

这里引用各种参考，其公开的全部内容一并参考。

序列表

<110>诺维信生物技术公司(NOVOZYMES BIOTECH，INC.)

<120>在缺乏色素的芽孢杆菌细胞突变体中生产生物物质的方法

<130>10302.200-W0

<150>US 60/398,853

<151>2002-07-26

<160>31

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1215

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>1

atgagccaat cgattaaatt gtttagtgtg ctttctgatc aatttcaaaa caatccatat 60

gcttattttt cacaactgcg ggaggaagat ccggttcatt atgaagagtc gatagacagt 120

tattttatca gccgctatca tgatgtccgc tatatccttc agcatccgga tatcttcacg 180

acgaaatcac ttgttgagcg tgccgaacca gtcatgcgag gccctgtgct ggcccaaatg 240

catggaaaag aacactctgc caaaagaaga attgtagtga gaagctttat cggtgacgca 300

ctggatcatc tgtctccatt gattaaacaa aatgcagaaa acttgttagc gccttatctt 360

gaaagaggga aaagtgatct cgtcaatgat tttggaaaga cgtttgcggt gtgcgtcacg 420

atggacatgc tcgggctgga taaaagagac catgaaaaaa tctctgagtg gcacagcgga 480

gttgccgatt ttatcacgag tatctctcaa tctcctgaag cgcgggcaca ttcgttatgg 540

tgcagcgaac agctttccca atacttgatg ccggtcatta aagaacgtcg cgtcaatccg 600

ggatcagatt taatttcgat cctatgtact tctgaatatg aaggcatggc gctgtcggac 660

aaggatatac tcgcactgat tcttaatgtg ctgttagccg caacggaacc ggctgataag 720

acgctggcac tgatgatcta ccatttgctc aacaatcctg agcagatgaa tgatgttttg 780

gctgaccgtt cgttagttcc gagagccatt gcggagacat tgcgttataa accgccggtt 840

cagctgattc cgcggcagct gtcccaagat acagtggtcg gcggtatgga aatcaaaaaa 900

gatacgattg ttttttgtat gatcggtgcg gctaaccggg accctgaagc atttgaacag 960

cctgacgtgt ttaatattca tcgggaagat cttggtatca agagcgcttt tagcggcgcc 1020

gcccggcatc tcgctttcgg atccggcatt cataactgtg taggagcagc ttttgccaaa 1080

aacgaaatcg aaattgtagc taatattgtg ctggataaga tgcggaatat cagattagag 1140

gaagattttt gttatgctga gtccggtctg tatacacgcg gacctgtttc acttctcgtt 1200

gcgtttgacg gggca 1215

<210>2

<211>405

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>2

Met Ser Gln Ser Ile Lys Leu Phe Ser Val Leu Ser Asp Gln Phe Gln

1 5 10 15

Asn Asn Pro Tyr Ala Tyr Phe Ser Gln Leu Arg Glu Glu Asp Pro Val

20 25 30

His Tyr Glu Glu Ser Ile Asp Ser Tyr Phe Ile Ser Arg Tyr His Asp

35 40 45

Val Arg Tyr Ile Leu Gln His Pro Asp Ile Phe Thr Thr Lys Ser Leu

50 55 60

Val Glu Arg Ala Glu Pro Val Met Arg Gly Pro Val Leu Ala Gln Met

65 70 75 80

His Gly Lys Glu His Ser Ala Lys Arg Arg Ile Val Val Arg Ser Phe

85 90 95

Ile Gly Asp Ala Leu Asp His Leu Ser Pro Leu Ile Lys Gln Asn Ala

100 105 110

Glu Asn Leu Leu Ala Pro Tyr Leu Glu Arg Gly Lys Ser Asp Leu Val

115 120 125

Asn Asp Phe Gly Lys Thr Phe Ala Val Cys Val Thr Met Asp Met Leu

130 135 140

Gly Leu Asp Lys Arg Asp His Glu Lys Ile Ser Glu Trp His Ser Gly

145 150 155 160

Val Ala Asp Phe Ile Thr Ser Ile Ser Gln Ser Pro Glu Ala Arg Ala

165 170 175

His Ser Leu Trp Cys Ser Glu Gln Leu Ser Gln Tyr Leu Met Pro Val

180 185 190

Ile Lys Glu Arg Arg Val Asn Pro Gly Ser Asp Leu Ile Ser Ile Leu

195 200 205

Cys Thr Ser Glu Tyr Glu Gly Met Ala Leu Ser Asp Lys Asp Ile Leu

210 215 220

Ala Leu Ile Leu Asn Val Leu Leu Ala Ala Thr Glu Pro Ala Asp Lys

225 230 235 240

Thr Leu Ala Leu Met Ile Tyr His Leu Leu Asn Asn Pro Glu Gln Met

245 250 255

Asn Asp Val Leu Ala Asp Arg Ser Leu Val Pro Arg Ala Ile Ala Glu

260 265 270

Thr Leu Arg Tyr Lys Pro Pro Val Gln Leu Ile Pro Arg Gln Leu Ser

275 280 285

Gln Asp Thr Val Val Gly Gly Met Glu Ile Lys Lys Asp Thr Ile Val

290 295 300

Phe Cys Met Ile Gly Ala Ala Asn Arg Asp Pro Glu Ala Phe Glu Gln

305 310 315 320

Pro Asp Val Phe Asn Ile His Arg Glu Asp Leu Gly Ile Lys Ser Ala

325 330 335

Phe Ser Gly Ala Ala Arg His Leu Ala Phe Gly Ser Gly Ile His Asn

340 345 350

Cys Val Gly Ala Ala Phe Ala Lys Asn Glu Ile Glu Ile Val Ala Asn

355 360 365

Ile Val Leu Asp Lys Met Arg Asn Ile Arg Leu Glu Glu Asp Phe Cys

370 375 380

Tyr Ala Glu Ser Gly Leu Tyr Thr Arg Gly Pro Val Ser Leu Leu Val

385 390 395 400

Ala Phe Asp Gly Ala

405

<210>3

<211>1218

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>3

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gaatcattcc atgtttccac agctatggtg aacctgtcag tctcagtttt tatgattgtg 180

acagcaataa tgcaaattat attaggagcg atcattgatt ttaaaggcgc tcggatcgtc 240

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tttaccttgt ttctgatatt cagaatgata caggcagccg gttccgcagc actgcctctt 360

attgctgcca caacgatcgg acagctgttt acaggaaatg aacgcgggag tgcaatggga 420

acgtatcaaa tgctcctgtc tgtcgcaccg gctattgctc cagttctagg aggattcata 480

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ctggtgacaa acagcatcac ctttcctaaa gattctccaa ctgaatctat gcagcaagcc 600

aaaggcaatg tgttcgctca ttataaatca atatttacaa atcgaacagg gaacgtcatt 660

ttgactttaa gttttgttct ctttttcatt tattttgcag taattgtcta cctcccaata 720

ttgctgacag agcattacca tatagatgtg ggtatagcag gactgttata tttgccgctg 780

gcgctgagca cgattgcagg tacgtttctg tttaaaagaa tacaggcaaa aatcgggctg 840

cacaccttgt ttatcggaag caatgtgatt gccgcctgca gcatcatttt atttgctgtt 900

acacattccg tttctctcgt tctcatggct ctgacgctgg cactgtttgg catctcgatg 960

ggggttattc ctcccttgta ctctacaatg attactaatg aatttgagca caacagaggg 1020

agtgcaatcg gaatgtttaa ctttatccga tatacaggca tggcagcagg tccgatggta 1080

tctgcctact tgctcacaat gatgccgtct gccatgtcct ttagcctcct aggccttgga 1140

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caaaaaaagc accacatg 1218

<210>4

<211>406

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>4

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Met Val Asn Leu Ser Val Ser Val Phe Met Ile Val Thr Ala Ile Met

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100 105 110

Ala Gly Ser Ala Ala Leu Pro Leu Ile Ala Ala Thr Thr Ile Gly Gln

115 120 125

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Gly Gly Ala Ala Gly Tyr Glu Gly Ile Phe Trp Ile Leu Ala Ala Ile

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Gly Val Ile Pro Pro Leu Tyr Ser Thr Met Ile Thr Asn Glu Phe Glu

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His Asn Arg Gly Ser Ala Ile Gly Met Phe Asn Phe Ile Arg Tyr Thr

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Pro Ser Ala Met Ser Phe Ser Leu Leu Gly Leu Gly Phe Ala Ala Leu

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<210>5

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<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

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gaacaaaaag cgaacacttc acttcagcaa ttttttaagg aggccgcaga agaggatgta 120

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cccattaata atgccggaat tgccagaaaa atgaacttat cgaaagcgaa tgtaacgaaa 240

atcagcacaa aactgatcaa ggaagaattc attaacagct atcagctgac agataacaaa 300

aaagaagttt attttaaatt aacccgtaaa ggcagacgga ttttcgactt acatgagaaa 360

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<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

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<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

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<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

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115 120 125

Tyr Gln Leu Leu Arg Gln Glu Val Glu His Ala Phe Phe Glu Gln Pro

130 135 140

His Phe Arg His Ala Cys Leu Asp Met Ser Arg Glu Ala Ile Ile Gly

145 150 155 160

Arg Ala Arg Gly Val Ser Leu Met Met Glu Glu Val Ser Glu Asp Met

165 170 175

Leu Asn Leu Ala Val Glu Tyr Val Ile Ala Glu Leu Pro Phe Phe Ile

180 185 190

Gly Ala Pro Asp Ile Leu Glu Val Glu Glu Thr Leu Leu Ala Tyr His

195 200 205

Arg Pro Trp Lys Leu Gly Glu Lys Ile Ser Asn His Glu Phe Ser Ile

210 215 220

Cys Met Arg Pro Asn Gln Gly Tyr Leu Ile Val Gln Glu Met Ala Gln

225 230 235 240

Met Leu Ser Glu Lys Arg Ile Thr Ser Glu Gly

245 250

<210>9

<211>18

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>9

catgggagag acctttgg 18

<210>10

<211>17

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>10

gtcggtcttc catttgc 17

<210>11

<211>17

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>11

cgaccactgt atcttgg 17

<210>12

<211>17

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>12

gagatgccaa acagtgc 17

<210>13

<211>16

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>13

catgtccatc gtgacg 16

<210>14

<211>17

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>14

caggagcatt tgatacg 17

<210>15

<211>16

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>15

ccttcagatg tgatcc 16

<210>16

<211>17

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>16

gtgttgacgt caactgc 17

<210>17

<211>18

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>17

gttcagcctt tcctctcg 18

<210>18

<211>18

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>18

gctaccttct ttcttagg 18

<210>19

<211>18

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>19

cgtcaatatg atctgtgc 18

<210>20

<211>17

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>20

ggaaagaagg tctgtgc 17

<210>21

<211>17

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>21

cagctatcag ctgacag 17

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>22

gctcagctat gacatattcc 20

<210>23

<211>17

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>23

gatcgtcttg attaccg 17

<210>24

<211>16

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>24

agctttatcg gtgacg 16

<210>25

<211>16

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>25

tgagcacgat tgcagg 16

<210>26

<211>17

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>26

cattgcggag acattgc 17

<210>27

<211>26

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>27

tagacaattg gaagagaaaa gagata 26

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>28

ccgtcgctat tgtaaccagt 20

<210>29

<211>18

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>29

catgggagag acctttgg 18

<210>30

<211>24

<212>DNA

<213>地衣形芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)

<400>30

gaattcgcag gaggaacgag tatg 24

<210>31

<211>24

<212>DNA

<213>地衣形芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)

<400>31

aagcttgaag atcagtgagg cagc 24

Claims

1.一种产生异源生物物质的方法，包括：

(a)在适合产生异源生物物质的培养基中培养亲代芽孢杆菌细胞的突变体，其中(i)所述突变体细胞含有第一核酸序列和第二核酸序列，所述第一核酸序列指导异源生物物质的合成，所述第二核酸序列在参与红色色素生成的cypX和yvmC基因的至少一个中包含修饰，且(ii)所述突变体细胞与在相同条件下培养的亲代芽孢杆菌细胞相比，红色色素生成有缺陷；和

(b)从所述培养基中回收所述异源生物物质。

2.权利要求1的方法，其中第二核酸序列的至少一个基因是cypX。

3.权利要求1的方法，其中第二核酸序列的至少一个基因是yvmC。

4.权利要求1-3中任意一项的方法，其中第一核酸序列编码的生物物质是生物聚合物。

5.权利要求4的方法，其中生物聚合物选自核酸、聚酰胺、多胺、多元醇、多肽或多糖。

6.权利要求5的方法，其中多肽是选自抗原、酶、生长因子、激素、免疫膨胀物、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白、或转录因子。

7.权利要求6的方法，其中酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、或连接酶。

8.权利要求5的方法，其中多糖是壳多糖、肝素、玻璃酸(hyaluronan)、或透明质酸。

9.权利要求1-3中任意一项的方法，其中第一核酸序列编码的生物物质是代谢物。

10.权利要求1的方法，其中第一核酸序列包含生物合成途径或代谢途径。

11.权利要求1-10中任意一项的方法，其中突变体细胞含有指导生物物质合成的第一核酸序列的至少两个拷贝。

12.权利要求1-11中任意一项的方法，其中芽孢杆菌细胞是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、Bacillus clausii、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌细胞。

13.权利要求1-11中任意一项的方法，其中芽孢杆菌细胞是枯草芽孢杆菌细胞。

14.权利要求1-11中任意一项的方法，其中芽孢杆菌细胞是地衣芽孢杆菌细胞。

15.权利要求1-14中任意一项的方法，其中突变体细胞产生的红色色素比在相同条件下培养的亲代芽孢杆菌细胞产生的红色色素至少少约25％。

16.权利要求1-14中任意一项的方法，其中与在相同条件下培养的亲代芽孢杆菌细胞相比，突变体细胞不产生可检测到的红色色素。

17.权利要求1-16中任意一项的方法，其中突变体细胞进一步在一或多种编码蛋白酶的基因中包含修饰。

18.权利要求17的方法，其中基因是nprE和/或aprE。

19.权利要求1-18中任意一项的方法，其中突变体细胞进一步在一或多种选自spoIIAC、srfA、srfB、srfC、srfD、或amyE的基因中包含修饰。

20.亲代芽孢杆菌细胞的突变体，含有第一核酸序列和第二核酸序列，所述第一核酸序列指导异源生物物质的合成，所述第二核酸序列在参与红色色素生成的cypX和yvmC基因的至少一个中包含修饰，其中突变体细胞与在相同条件下培养的亲代芽孢杆菌细胞相比，红色色素生成有缺陷。

21.权利要求20的突变体细胞，其中第二核酸序列的至少一个基因是cypX。

22.权利要求20的突变体细胞，其中第二核酸序列的至少一个基因是yvmC。

23.权利要求20-22中任意一项的突变体细胞，其中第一核酸序列编码的生物物质是生物聚合物。

24.权利要求23的突变体细胞，其中生物聚合物选自核酸、聚酰胺、多胺、多元醇、多肽或多糖。

25.权利要求24的突变体细胞，其中多肽是选自抗原、酶、生长因子、激素、免疫膨胀物、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白、或转录因子。

26.权利要求25的突变体细胞，其中酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、或连接酶。

27.权利要求24的突变体细胞，其中多糖是壳多糖、肝素、玻璃酸、或透明质酸。

28.权利要求20-22中任意一项的突变体细胞，其中第一核酸序列编码的生物物质是代谢物。

29.权利要求20的突变体细胞，其中第一核酸序列包含生物合成途径或代谢途径。

30.权利要求20-29中任意一项的突变体细胞，其含有指导生物物质合成的第一核酸序列的至少两个拷贝。

31.权利要求20-30中任意一项的突变体细胞，其中芽孢杆菌细胞是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、Bacillusclausii、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌细胞。

32.权利要求20-30中任意一项的突变体细胞，其是枯草芽孢杆菌细胞。

33.权利要求20-30中任意一项的突变体细胞，其是地衣芽孢杆菌细胞。

34.权利要求20-33中任意一项的突变体细胞，与在相同条件下培养的亲代芽孢杆菌细胞相比，突变体细胞产生的红色色素至少少约25％。

35.权利要求20-33中任意一项的突变体细胞，与在相同条件下培养的亲代芽孢杆菌细胞相比，突变体细胞不产生可检测到的红色色素。

36.权利要求20-35中任意一项的突变体细胞，其进一步在一或多种编码蛋白酶的基因中包含修饰。

37.权利要求36的突变体细胞，其中所述基因是nprE和/或aprE。

38.权利要求20-37中任意一项的突变体细胞，其进一步在一或多种选自spoIIAC、srfA、srfB、srfC、srfD、或amyE的基因中包含修饰。

39.获得亲代芽孢杆菌细胞的突变体的方法，包括：

(a)将第一核酸序列和第二核酸序列引入亲代芽孢杆菌细胞中，所述第一核酸序列指导异源生物物质的合成，所述第二核酸序列在参与红色色素生成的cypX和yvmC基因的至少一个中包含修饰；和

(b)鉴定来自步骤(a)的含有修饰核酸序列的突变体细胞，其中突变体细胞与在相同条件下培养的亲代芽孢杆菌细胞相比，红色色素生成有缺陷。

40.权利要求39的方法，其中第二核酸序列的至少一个基因是cypX。

41.权利要求39的方法，其中第二核酸序列的至少一个基因是yvmC。

42.权利要求39-41中任意一项的方法，其中第一核酸序列编码的生物物质是生物聚合物。

43.权利要求42的方法，其中生物聚合物选自核酸、聚酰胺、多胺、多元醇、多肽或多糖。

44.权利要求43的方法，其中多肽是选自抗原、酶、生长因子、激素、免疫膨胀物、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白、或转录因子。

45.权利要求44的方法，其中酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、或连接酶。

46.权利要求43的方法，其中多糖是壳多糖、肝素、玻璃酸、或透明质酸。

47.权利要求39-41中任意一项的方法，其中第一核酸序列编码的生物物质是代谢物。

48.权利要求39的方法，其中第一核酸序列包含生物合成途径或代谢途径。

49.权利要求39-48中任意一项的方法，其中突变体细胞含有指导生物物质合成的第一核酸序列的至少两个拷贝。

50.权利要求39-49中任意一项的方法，其中芽孢杆菌细胞是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、Bacillus clausii、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌细胞。

51.权利要求39-49中任意一项的方法，其中芽孢杆菌细胞是枯草芽孢杆菌细胞。

52.权利要求39-49中任意一项的方法，其中芽孢杆菌细胞是地衣芽孢杆菌细胞。

53.权利要求39-52中任意一项的方法，其中突变体细胞产生的红色色素比在相同条件下培养的亲代芽孢杆菌细胞产生的红色色素至少少约25％。

54.权利要求39-52中任意一项的方法，其中与在相同条件下培养的亲代芽孢杆菌细胞相比，突变体细胞不产生可检测到的红色色素。

55.权利要求39-54中任意一项的方法，其中突变体细胞进一步在一或多种编码蛋白酶的基因中包含修饰。

56.权利要求55的方法，其中基因是nprE和/或aprE。

57.权利要求39-56中任意一项的方法，其中突变体细胞进一步在一或多种选自spoIIAC、srfA、srfB、srfC、srfD、或amyE的基因中包含修饰。