CN1720329A - 来自红球菌属的新表达系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含来自红串红球菌的kstD启动子的分离的多核苷酸。该多核苷酸可以非常有利地用作可控制的转录激活子。通过给所述分离的多核苷酸提供编码所述启动子的转录调节子的核苷酸序列可以提供所述控制功能。在本发明中，这种转录调节子可以外部诱导，例如通过甾族化合物的引入。在本发明的可供选择的实施方案中，分离的多核苷酸可以包含作为kstD启动子的转录调节子的kstR基因或其同系物或功能部分。

Description

来自红球菌属的新表达系统
发明领域
本发明涉及来自红球菌属(Rhodococcus)，更具体地说来自红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)的启动子，其调节和这个启动子及其调节在异源应用中作为表达系统的用途。
发明背景
放线菌(Actinomycetes)，和特别是红球菌属细菌以其代谢复杂分子的能力而闻名。几种红球菌属种能够降解燃料、苯、甚至TNT，因此涉及生化途径和细胞工厂的微生物学领域广泛研究了它们。在氧化天然和人为的碳氢化合物以及为生物圈的生物地球化学过程的积极参与者的微生物当中，如有助于地球上产生不含碳氢化合物的大气的微生物，红球菌属占据主要的位置。
几种红球菌属种也降解天然的植物甾醇，其通过甾族化合物形成作为途径中间体而进行。这些甾族化合物可以反过来用作制备药物活性化合物的前体。
为了大量制备作为微生物的途径中间体的药物前体化合物，常规转化制备型菌株以优化目的基因的表达和/或为了达到中间体的蓄积而阻断某些代谢途径。这种转化常常包括蛋白的异源表达。随着红球菌属和其它放线菌属(如分枝杆菌属(Mycobacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)、诺卡氏菌属(Nocardia)、棒杆菌属(Corynebacterium)和短杆菌属(Brevibacterium)种)细菌用于异源蛋白表达的增加，对于提高这种表达的调节和对于分子工具有增长的需要。
目前，用经典诱变分离了具有期望性质的突变株，如紫外线照射，但是由于遗传不稳定性和/或生物转化效率低，这些菌株常常不足以用于生产过程。分子限定的(构建的)突变株将比经典诱变产生的突变株呈现重要的优点。构建的突变株遗传上更稳定并且引入的突变代表明确的基因修饰。转化构建基因工程菌株也可以利用化学试剂阻断某些陈旧途径。用于主要阻断酶活性的化学试剂大多数常常不具有反应特异性并且可能抑制其它重要的酶反应，其可能对生物转化效率有消极效果。通过利用基因工程限定的突变株将克服这种问题。
甾族化合物代谢中一种重要的酶，其可以例如在红串红球菌中发现，是3-甾酮Δ1-脱氢酶(KSTD1，EC 1.3.99.4)，其基因存在于所谓的kstD1位点(van der Geize，R.等人，2000.Appl.Environm.Microbiol.66：2029-2036)。尽管众所周知甾族化合物分解代谢基因的分子组成在不同的红球菌种之间可能有差异，但是在几个其它细菌中已经发现了这个基因的同源物，如简单节杆菌(Arthrobactersimplex)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、限定诺卡氏菌(Nocardiarestrictus)、珊瑚色诺卡氏菌(Nocardia corallina)、不透明诺卡氏菌(Nocardia opaca)和偶发分枝杆菌(Mycobacteriumfortuitum)。Van der Geize等在WO 01/31050中已经公开了红串红球菌株SQ1的kstD基因序列并描述为SEQ ID NO：1。
已知来自相同菌株的同工酶KSTD2，其相应基因kstD2。已经表明kstD1基因的破坏不完全消除3-甾酮Δ1-脱氢酶(KSTD)活性并且由于同工酶的存在而保持活性(Van der Geize等，2002.Microbiology148：3285-3292；WO 01/31050)。
KSTD活性对于甾核降解是必需的，而且甾族化合物中间体蓄积需要kstD基因失活。基因失活是分析基因功能和引入代谢阻断的有效方法。用携带选择性标记的非复制型载体进行的基因破坏是基因失活的常用方法。
人们发现应用3-酮-Δ4-甾族化合物可以诱导基因破坏突变株红串红球菌SDH420中的野生型KSTD活性，如4-雄甾烯-3，17-二酮，表明甾族化合物依赖性调节机制的存在。kstD基因座上游鉴定了一个基因(ORF2)，其功能迄今无人知道，但被称作携带TetR家族的阻抑蛋白共有序列的推定调节基因(Van der Geize，R.等人，2000.Appl.Environ.Microbiol.66：2029-2036)。
现在已经发现kstD1基因启动子存在于红串红球菌的kstD基因座，和这个启动子是通过该细菌ORF2的基因产物的抑制来调节的，此后命名为kstR。现在也已经发现用甾族化合物诱导表达可以克服由kstR基因产物造成的kdtD启动子抑制。kstD基因-kstR组合阻抑系统的性质使其特别适于在细菌中表达异源蛋白，如放线菌科的细菌。
发明概述
在一个方面，本发明涉及包含来自红串红球菌的启动子的分离的多核苷酸，其特征在于所述启动子是kstD启动子。
该多核苷酸可以非常有利地用作可控制的转录激活。通过给所述分离的多核苷酸提供编码所述启动子的转录调节的核苷酸序列可以提供所述控制功能。在本发明中，这种转录调节可以在外部诱导，如通过甾族化合物的引入。
在本发明可供选择的实施方案中，该分离的多核苷酸可以包含作为kstD启动子的转录调节子的kstR基因或其同源物或功能部分。
由于本发明分离的多核苷酸可以非常有利地用作异源表达系统，因此本发明的多核苷酸可以进一步包含与所述所述启动子可操作连接的编码多肽的核苷酸序列。
为了提供转移了表达系统的细菌的可选择性状，该多核苷酸可以进一步包含编码选择性标记、反选择性标记和/或报道基因的这种序列。
在另一方面，本发明涉及包含本发明分离的多核苷酸的重组载体。这种重组载体合适地包含代表多克隆位点的核苷酸序列。
本发明也涉及构建基因修饰的微生物菌株的方法，该微生物缺乏降解甾核的能力，该方法包括制备根据本发明的多核苷酸和用所述多核苷酸转化所述菌株。
在另一方面，本发明涉及本发明的重组载体转化的宿主细胞。所述宿主细胞优选是来自放线菌目的细菌。非常合适的宿主细胞是属于放线菌科、棒状杆菌科、分枝杆菌科、诺卡氏菌科、短杆菌科或微球菌科的细菌，尤其是红球菌属的细菌。
在另一方面，本发明涉及在宿主细胞中制备目的蛋白的方法，包括用本发明的重组载体转化宿主细胞。
在另一方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸的微生物表达系统。
在又一方面，本发明涉及目的蛋白组成型表达的方法，包括用多核苷酸构建体转化宿主细胞，其中所述蛋白编码区的表达在kstD启动子控制下。
在另一方面，本发明涉及甾族化合物诱导异源蛋白表达的用途，其中表达在kstD启动子控制下，所述甾族化合物取消(lifting)kstR基因产物发挥的阻抑功能。
附图简述
图1是构建kstR非标记基因缺失的诱变质粒pREG104的示意图。
图2是来源于pRESQ的红球菌表达载体pRESX的示意图(Van derGeize，R.等人，2002.Mol.Microbiol.45：1007-1018)。闭合的实曲线棒表示kstD启动子区域。开放的实曲线棒表示编码自主复制的红球菌基因。aphII编码卡那霉素抗性。
发明详述
这里使用的术语“多核苷酸”是指任何长度的多聚形式的核苷酸，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，这个术语包括双链和单链DNA和RNA。
这里使用的术语“重组多核苷酸”意指基因组、cDNA、半合成或合成来源的多核苷酸，根据其来源或操作：它(1)不与天然与其相关联的多核苷酸的全部或一部分相关联；或(2)与除天然与其连接的多核苷酸之外的多核苷酸连接；或(3)天然不存在。
这里使用的“转化”是指外源多核苷酸向宿主细胞的插入，不管用于插入的方法是什么，例如直接吸收、转导、f-配对或电穿孔法。外源多核苷酸可以维持在非整合载体上，例如质粒，或可供选择地，可以整合到宿主细胞基因组中。
“宿主细胞”是指含有载体和支持该载体复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，或真核细胞如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞。优选，宿主细胞是放线菌目的细菌细胞。
这里使用的术语“可操作连接”是指并列(juxtaposition)，其中所述的元件是允许它们以其预定方式发挥功能的关系。与另一控制序列和/或编码序列“可操作连接”的控制序列以编码序列在与控制序列相适合的条件下转录和/或表达的方式连接。通常，可操作连接是指所连接的核酸序列是邻近的，并且在需要连接两个蛋白编码区之处，是邻近的或在同一阅读框中。
这里使用的“启动子”是指导(结构)基因转录的DNA序列。典型地，启动子位于基因的5′区，最接近(结构)基因的转录起始位点。如果启动子是诱导型启动子，那么转录率随响应诱导剂而增加。相反，如果启动子是组成型启动子，则转录率不受诱导剂调节。
术语“多肽”是指氨基酸的聚合物并且不涉及产物的具体长度，因此，肽、寡肽和蛋白都包括在多肽的定义内。这个术语也不涉及或排斥多肽的表达后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等等。包括在该定义内的是，例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸)的多肽。具有取代键，以及本领域已知的天然存在或非天然存在的修饰的多肽。
这里使用的关于核酸的“异源”是来源于外来物种的核酸，或，如果来自相同物种，是在与天然状态不同的天然基因组基因座进行故意人为干预得到的。例如，与异源结构基因可操作连接的启动子来自不同于结构基因所来源的物种，或如果来自相同物种，则该启动子和基因天然不是可操作连接。异源蛋白可以来源于外来物种，或如果来自相同物种，则是通过异源核酸表达产生的。
“阻抑蛋白”是能够识别并结合位于结构基因5′区的DNA序列(操纵子)中所含的核苷酸序列的蛋白。阻抑蛋白与其同性质(cognate)操纵子的结合引起结构基因转录的抑制。
“增强子”是可以增加转录效率的DNA调节元件，不论该增强子相对于转录起始位点的距离或方向怎样。
术语“分离的”是指物质，如核酸，其实质上或本质上不含在其天然存在环境中发现的正常伴有的或与其相互作用的成分。分离的DNA分子是已经分开并且不再整合到其所来源的生物体基因组DNA的DNA片段。
术语“表达”是指基因产物的生物合成。
“表达载体”是包含在宿主细胞表达的基因的DNA分子。典型地，基因表达处于某些调节元件的控制下，包括组成型或诱导型启动子、调节元件和/或增强子。这种基因“可操作连接”调节元件并且其表达在该调节元件的“控制下”。
术语“选择性标记”是指编码代谢性状的多核苷酸序列，其允许转基因和非转基因生物的分离，主要是指抗生素抗性的提供。选择性标记是例如编码卡那霉素抗性标记的aphII。
术语“反选择性标记”是指一种多核苷酸序列，它的表达是致死性的，而不是引起抗性，选择性标记通常就是这样。反选择性标记是例如编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶的sacB基因，在蔗糖存在下，其表达是致死性的。
这里使用的术语“报道基因”是指编码可以被鉴定的基因产物的基因。报道基因包括但不限于氯霉素乙酰转移酶、[β]-半乳糖苷酶、萤光素酶和绿荧光蛋白。报道基因产物的鉴定方法包括但不限于酶试验和荧光试验。报道基因和检测其产物的试验是本领域熟知的并且例如在Current Protocols in Molecular Biology，eds.Ausubel等，Greene Publishing and Wiley-Interscience：New York(1987)及定期更新物中描述。
如红球菌属的ORF2表示的序列，在SEQ ID NO：4中描述，已经被视为染色体基因簇的一部分且含有kstD1基因(Van der Geize，R.等，2000.Appl.Environ.Microbiol.66：2029-2036)，其中据说它编码TetR型阻抑蛋白(命名为kstR)。然而，直到现在从未公开阻抑功能行使或取消(lifted)的环境。而且，kstR的阻抑功能和kstD1基因启动子之间的关系至今仍未确立。
在简单节杆菌中，已经描述了kstD基因和编码ORF的推定阻抑蛋白(命名为kdsR)的类似基因组组成(Molnar，I.等人，1995.Mol.Microbiol.15：895-905)。在这种情况下，已经确定阻抑蛋白和甾族化合物酶表达之间没有关系。
kstD1基因的启动子区尚未精确确定。kstD1基因的起始密码子和kstR基因开始处(与kstD1基因相比以倒序存在)之间的区域是大约158个碱基对的序列，其含有kstD1基因启动子的启动子和推测也含有kstR的启动子。万一这个启动子双向工作，则kstD1启动子也可以驱动编码阻抑蛋白的基因表达。
根据本发明的启动子是驱动kstD基因在红球菌属中表达的启动子并且它优选包含根据SEQ ID NO：3的158个碱基对的核苷酸序列或其截短形式(如删除5′末端)，其仍具有启动子的功能能力，即驱动它控制表达的蛋白表达。如何得到启动子缺失突变体是本领域熟知的，以及鉴定这种缺失突变体启动子的活性所需的试验无需过多劳动且是本领域技术人员熟知的。各种参考文献中描述了实施本发明有用的多核苷酸操作技术，如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndEd.，Vol.1-3，eds.Sambrook等人，Cold Spring Harbor LaboratoryPress (1989)或Current Protocols in Molecular Biology，eds.Ausubel等人，Greene Publishing and Wiley-Interscience：New York(1987)及其定期更新物。
本领域技术人员将知晓鉴定kstD启动子活性片段的方法，该方法可以包括，例如，测定mRNA转录或需要添加功能性启动子的来自报道基因的多肽表达。为了确定能够控制与其可操作连接的编码序列转录和/或表达的活性kstD启动子片段的存在，本领域技术人员将容易理解可以随即进行启动子功能性测试。为了确定启动子功能性，这种测试例如可以包括本发明启动子和报道基因在载体中的可操作连接，将载体引入合适宿主，将宿主暴露在适于表达的条件下，和确定报道基因产物的存在。
虽然SEQ ID NO：3给出了启动子(包括启动子元件)的核苷酸序列，但是应认识到可以进行核苷酸取代，它不影响启动子或启动子元件的功能。
本领域技术人员将认识到可以对这里公开的kstD启动子序列进行点突变和缺失，而不改变该序列活化转录的能力。此外，可以获得kstD启动子的活性片段。类似的方法可以用于鉴定kstD启动子的活性片段。鉴定kstD启动子的活性片段的其它方法是常规的并且是本领域熟知的。例如，可以合成kstD启动子的重叠片段并克隆入合适的表达载体以确定活性kstD启动子片段。类似地，点突变可以引入公开的kstD启动子序列，使用例如定点诱变或合成在一个或多个预定位置具有随机核苷酸的序列。
本发明包括包含kstD启动子或其活性片段的分离的多核苷酸作为实施方案。这些分离的多核苷酸含有小于大约50％，优选小于大约70％，和更优选小于大约90％的与kstD启动子通常天然相关联的染色体遗传物质。“基本上由kstD启动子组成”的分离的多核苷酸缺乏来源于kstD所在染色体的其它启动子。这些术语“分离的”和“基本上由…组成”类似地适用于kstR阻抑元件。例如，基本上由kstR阻抑蛋白组成的分离的多核苷酸缺乏位于kstR所在染色体上的多核苷酸材料，例如分别是增强子或启动子。
可以用本领域已知技术制备包含或基本上由kstD启动子和编码kstR阻抑蛋白或其活性片段组成的分离的多核苷酸(如Sambrook等)。这些技术包括例如使用这里提供的序列信息提供引物和探针以PCR扩增kstD基因组克隆的特殊区域，或通过化学合成，或通过重组方法。
使用这里提供的序列信息，通过本领域技术人员已知的任何技术可能制备包含kstD启动子或其活性片段的重组多核苷酸，以及可能包含这里描述的其它kstD转录调节元件的重组多核苷酸。
在实验部分，显示启动子受阻抑蛋白调节，推测是与该启动子结合并因此抑制其控制的蛋白表达。包含kstD启动子的重组多核苷酸也可以包含kstR阻抑蛋白的编码序列(如SEQ ID NO：4所述)，该序列引起kstD促进基因转录的抑制并提供该细胞接触诱导物而被取消的调节机制，例如如下所述。
包含kstD启动子的重组多核苷酸也可以包含与启动子可操作连接的编码序列，在该启动子控制下引起编码序列转录。编码序列可以编码同源或异源多肽。然而，它们也可以编码转录形式下期望的其它部分。例如，编码序列可以编码尤其是与转录因子结合的诱骗(decoy)多核苷酸、反义RNAs、和感兴趣的各种多肽(例如作为细胞内疫苗的病毒蛋白，作为标记的蛋白等等)、为商业目的的多肽，也就是说在表达kstD蛋白的细胞中待表达的多肽、和特别是在细胞代谢调节和制备药物前体中有用的蛋白。
对于启动子控制下蛋白的细胞外表达，可以在启动子和编码目的基因的DNA之间插入信号序列。提供这种信号序列以允许蛋白靶向至特殊的细胞区室。优选这些信号序列是马红球菌(R.equi)中存在并存放于Genbank登录号为AJ242746的编码胆固醇氧化酶的基因的信号序列(也见Navas，J.等人，2001.J.Bacteriol.183：4796-4805)。
该启动子可以用于任何宿主细胞，但是优选原核生物宿主细胞，更优选来自放线菌目的细菌，如属于放线菌科、棒状杆菌科、分枝杆菌科、诺卡氏菌科、短杆菌科、微球菌科等的那些细菌。更优选它是红球菌属、分枝杆菌属、节杆菌属、诺卡氏菌属、棒状杆菌属或短杆菌属的细菌。最优选它是红球菌属的细菌，如Rhodococcusaetherovorans、嗜粪红球菌(Rhodococcus coprophilus)、马红球菌(Rhodococcus equi)、Rhodococcus erythreus、红串红球菌、成束红球菌(Rhodococcus fascians)、圆红球菌(Rhodococcusgloberulus)、Rhodococcus jostii、Rhodococcus koreensis、Rhodococcus maanshanensis、海生红球菌(Rhodococcusmarinonascens)、混浊红球菌(Rhodococcus opacus)、渗滤红球菌(Rhodococcus percolatus)、Rhodococcus pyridinivorans、椿象红球菌(Rhodococcus rhodnii)、紫红色红球菌(Rhodococcusrhodochrous)、赤红球菌(Rhodococcus rubber)、Rhodococcustukisamuensis、Rhodococcus wratislaviensis、佐氏红球菌(Rhodococcus zopfii)等种的细菌菌株。
具有启动子，不具有阻抑蛋白的基因的细菌宿主细胞也是本发明的一部分。优选这个宿主细胞是2002年10月9日保藏在德意志微生物保藏中心的保藏号为DSM15231的红串红球菌RG10。在这个细菌中，如实施例1所示，已经删除了编码抑制蛋白的基因。
其中已经删除了抑制基因的这种宿主细胞可以用于蛋白的表达。优选(尽管宿主细胞可能仍具有其内源kstD启动子)控制目的蛋白表达的具有本发明kstD启动子的载体应该导入细胞。构建这种载体和这种载体转化或转染宿主细胞对于本领域技术人员来说是常规的。因此，如实施例1所示，kstD启动子将不被抑制且充当组成型启动子。
应理解包含分离的kstD启动子或其活性片段的根据本发明的宿主细胞包括已经被转化的原始细胞的后代。当然，由于自然、偶然或有意突变，单一亲本细胞的后代在形态学或基因组或总DNA互补物上也许不一定与原始亲本完全相同。
认识到kstD启动子元件而不是kstR内特殊的核苷酸或区域可能被鉴定为调节所需的。通过分析许多启动子突变体的功能能力由该元件的精细结构切割可能定位这些核苷酸区域。利用聚合酶链式反应(PCR)技术可以产生单一碱基突变。美国专利4,683,202。突变启动子区域可以使用标准技术克隆回到报道构建体并通过转染合适细胞和检测报道基因功能来评价。这个分析也将鉴定不影响启动子功能的核苷酸改变。
本发明的更多方面是使用阻抑蛋白及其诱导性进行受控表达，通过给细胞提供编码阻抑蛋白的序列和编码需要可控制表达的蛋白的序列，在那里那个序列与kstD启动子可操作连接。kstR阻抑蛋白的序列可以包含在与目的kstD启动子基因构建体相同的表达构建体上，但是也可以在不同的构建体上。还可以宿主细胞已含有阻抑基因，该基因位于质粒或染色体上。然后，用包含kstD启动子的构建体转化这种宿主细胞而建立表达系统。类似地，该宿主细胞可以已含有控制目的基因表达的启动子。然后编码阻抑蛋白的基因的插入将在阻抑蛋白产生时终止目的基因的表达并且取消阻抑蛋白功能可以再次诱导表达。而且，kstR阻抑蛋白序列的表达可以在组成型启动子控制下。
用kstD-kstR系统控制目的基因表达的更多方法是通过在原处kstD启动子之后插入目的基因的编码序列来取代正常在kstD启动子控制下的kstD基因。这可以通过本领域通常已知的技术来完成，如同源重组和/或使用重组酶及其识别位点如cre-lox系统。
添加具有3-酮-Δ4功能性的化合物可以取消(lift)由kstR基因产物发挥的kstD启动子的抑制。尤其是如4-雄烯-3，17-二酮(AD)、1，4-androstadiene-3，17-二酮(ADD)、酯-4-单烯-3，17-二酮、睾酮、黄体酮、降二酮(nordione)、7α-甲基-降二酮、11-亚甲基-降二酮的这种化合物，以及如孕烯醇酮和二氢睾酮(17β-OH-5α-雄甾烷-3酮)、19-OH-7-脱氢-雄烯-3，17-二酮和9α-羟基-4-雄烯-3，17-二酮(90HAD)的化合物能够取消(lift)kstD启动子的抑制。
也可以鉴定可供选择的调节化合物。例如，在kstD启动子控制下表达报道基因产物的细胞具有鉴定调节kstD启动子活性的试剂的用途。因此，在kstD启动子控制下表达报道基因产物的宿主细胞具有筛选的用途，本发明进一步的目的是提供鉴定调节kstD启动子活性的化合物的方法。该方法包括含有kstD启动子的细胞接触待确定的至少一种具有调节kstD启动子活性的能力的化合物。然后监测由调节引起的该细胞的改变。
实施例
实施例1.kstR非标记基因缺失后kstD的组成型表达
构建kstR非标记基因缺失的诱变质粒pREG104，该基因编码红串红球菌SQ1中kstD基因的转录调节子(编码3-甾酮Δ1-脱氢酶KSTD1)(图1)。简言之，用限制性内切酶NruI和BalI消化pSDH205(Van der Geize，R.等，2000. Appl. Environ. Microbiol.66：2029-2036)，随后自身连接产生质粒pREG103。含有kstR基因缺失的pREG103的EcoRI DNA片段随后克隆入EcoRI消化的pK18mobsacB载体产生pREG104。使用pREG104通过如(Van der Geize R.等人，2001.FEMS Microbiol.Lett.205：197-202)所述的sacB反选择方法从红串红球菌SQ1分离kstR非标记基因缺失突变株红串红球菌RG10。使用正向引物(REG-FOR)5’GGCGACGTTGCCGAGAATT 3’和反向引物(REG-REV)5’TCAGTGTCGTGAGAGATTCA 3’通过聚合酶链式反应(PCR)证实真实的kstR基因缺失。由亲本株SQ1基因组DNA(对照)得到618bp的PCR扩增子。用kstR基因缺失突变株RG10的基因组DNA，扩增子减少为393bp，证实kstR基因缺失。
通过突变株RG10和亲本株SQ1的细胞在葡萄糖(20mM)矿物质培养基(mineral medium)(1g·l-1NH4NO3，0.25g·l-1K2HPO4，0.25g·l-1MgSO4·7H2O，5mg·l-1 NaCl，5mg·l-1 FeSO4·7H2O(pH7.2))中30℃生长3天，随后甾族化合物(0.5g·l-1 4-雄烯-3，17-二酮(AD))诱导5小时，检查组成型KstD1表达。作为对照，使用无甾族化合物诱导的细胞培养。AD溶于DMSO(50mg·ml-1)并添加到高压灭菌的培养基中。用200ml磷酸缓冲液(KH2PO42.72g·l-1；K2HPO43.48g·l-1；MgSO4·7H2O 2.46g·l-1；pH7.2)洗涤细胞沉淀(30分钟；7,300xg；4℃)。两次通过弗氏压碎器(140Mpa)破坏洗涤细胞悬浮液(5ml)。细胞抽提物以25,000xg离心20分钟除去细胞碎片。KSTD活性染色的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测kstD表达(Van der Geize，R.等，2000.Appl.Environ.Microbiol.66：2029-2036)(表1)。由菌株RG10的无诱导细胞制备的无细胞抽提液发现KSTD1活性条带，表明kstR基因缺失引起kstD基因的组成型表达(表1)。
表1.KSTD1活性染色的非变性PAGE检测的kstR非标记基因缺失时的组成型kstD表达。
甾族化合物诱导(AD或90HAD)        kstD表达
  亲本株SQ1   kstR突变株RG10
    -+     -+     ++
实施例2.微生物的甾族化合物Δ1-脱氢作用下KstD2的组成型表达
使用pREG104(图1，见实施例1)构建kstR基因缺失突变株红串红球菌RG9(Van der Geize，R.等，2002. Mol. Microbiol.45：1007-1018)，记做红串红球菌RG17。因此菌株RG17是kstD kstD2kshA1 kstR四部分基因缺失突变株，除了kstD启动子的转录调节子之外，缺乏3-甾酮Δ1-脱氢酶(KSTD1和KSTD2)和3-甾酮9α-羟化酶(KSH)活性。由于这个突变株的kstD kstD2 kshA表型，菌株RG17代谢4-雄烯-3，17-二酮(AD)、1，4-androstadiene-3，17-二酮(ADD)和9α-羟基-4-雄烯-3，17-二酮(90HAD)完全被阻断。
为在红串红球菌SQ1(Van der Geize，R.等人，2000.Appl.Environ.Microbiol.66：2029-2036)的kstD启动子控制下表达基因，构建红球菌属表达载体。使用kstD启动子，包含kstR基因缺失的红串红球菌突变株中基因的表达将是组成型的，因为缺乏kstD表达的阻抑蛋白。使用正向引物5’ATAAAGCTTATCGATTATGTGTCCCGGCCGCGAAC3’和反向引物5’ATAGGTAC CATATGTGCGTCCTTACTCCAAGAGGG3’，通过PCR扩增(25循环：30秒95℃，30秒64℃，30秒72℃，使用Taq聚合酶)从红串红球菌SQ1染色体DNA分离kstD启动子区(158bp)。NdeI位点(下划线)并入扩增子以能够在kstD基因的ATG起始密码子精确克隆目的基因。扩增子(175bp)平端连接入穿梭载体pRESQ(Van der Geize，R.等，2002.Mol.Microbiol.45：1007-1018)的唯一SnaBI限制性位点，所得红球菌属表达载体记做pRESX(图2)。
使用正向引物5′GCG CATATGGCTAAGAATCAGGCACCC3’(NdeI位点被下划线)和反向引物5′GCG GGATCCCTACTTCTCTGCTGCGTGATG 3’(BamHI位点被下划线)，采用PCR从亲本株SQ1的染色体DNA分离编码红串红球菌SQ1中KSTD2同工酶的kstD2基因(条件：见上)。导入的NdeI和BamHI位点用于将kstD2扩增子连接入NdeI/BglII消化的pRESX载体。所得质粒记做pRESX-KSTD2。
用电转化法将质粒pRESX-KSTD2导入红串红球菌株RG17(Van derGeize，R.等，2000.Appl.Environ.Microbiol.66：2029-2036)，一个转化体用于AD生物转化。在卡那霉素(200μg·ml-1)存在下，100mlYG15(15g·l-1酵母提取物，15g·l-1葡萄糖)培养基中28℃(200rpm)生长的培养物中实施由KSTD2引起的AD生物转化为ADD。生长直到晚期指数生长期后(5至9的OD600)，添加AD(1g·l-1在0.1％[体积/体积]吐温80中)，随后几天AD生物转化为ADD。对于HPLC分析，培养样品用甲醇/水(70∶30)稀释5倍并过滤(0.45μm)。HPLC(用250-by3-mm反相Lichrosorb 10RP18柱[Varian Chrompack International，Middelburg，The Netherlands]，在254nm下UV检测，和液相甲醇-水[60∶40]35℃)分析甾族化合物。
用带有pRESX-KSTD2的红串红球菌株RG17的细胞的生物转化实验表明KSTD2甾族化合物Δ1-脱氢酶活性的存在导致AD生物转化为ADD至接近完成。相比之下，具有野生型KSTD1和KSTD2同工酶，但KSH反应被阻断的红球菌属突变株，AD转变为ADD，产量通常不超过50％，可能是由于调节机制(Van der Geize，R.等，2002.Mol.Microbiol.45：1007-1018)。
实施例3.kshA同工基因kshA2的表达互补kshA突变表型
UV诱导的红球菌属突变株的互补实验分离的DNA片段的核苷酸测序后鉴定了红串红球菌SQ1(Van der Geize，R.等，2002.Mol.Microbiol. 45：1007-1018)的kshA基因的同源物(homologue)。红串红球菌SQ1含有至少两个kshA同工基因，记做kshA和kshA2。
红串红球菌RG2-红串红球菌SQ1(Van der Geize，R.等，2002.Mol. Microbiol. 45：1007-1018)的kshA基因缺失突变株，显示不在补充AD(0.25g·l-1)作为唯一碳和能量来源的矿物质琼脂板(1g·l-1NH4NO3，0.25g·l-1 K2HPO4，0.25g·l-1 MgSO4·7H2O，5mg·l-1 NaCl，5mg·l-1FeSO4·7H2O(pH7.2)，1.5％琼脂)上生长。因此，这些生长条件下kshA2不在红串红球菌RG2中表达。
pRESX中kshA2基因位于kstD启动子的控制下。为了完成这点，使用正向引物5’GGC CATATGTTGACCACAGACGTGACGACC 3’(NdeI位点被下划线)和反向引物5’GCC ACTAGTTCACTGCGCTGCTCCTGCACG 3’(SpeI位点被下划线)，通过PCR以红串红球菌染色体DNA为模板扩增kshA2基因。所得kshA2扩增子首先连接入EcoRV消化的pBlueScript(II)KS(pKSH311)，并随后以NdeI/SpeI片段亚克隆入NdeI/SpeI消化的pRESX，产生pKSH312。
用电转化将质粒pKSH312导入红串红球菌RG2，所得转化体复制铺在含有0.25g·l-1 AD作为唯一碳和能量来源的矿物质琼脂培养基中。所有转化体能够在AD矿物质培养基中生长，表明kshA2在kstD启动子控制下表达和互补kshA突变表型。
实施例4.诱导甾族化合物和组成型表达。
为了评估甾族化合物能够诱导KstD基因的阻抑蛋白-启动子系统，在具有1，4-androstadiene-3，17-二酮(ADD)、睾酮、黄体酮、降二酮、雌酮(estron)、7α-甲基-降二酮、11-亚甲基-降二酮、二氢睾酮(17βOH-5α-雄甾烷-3-酮、19OH-7-脱氢-雄烯-3，17-二酮和孕烯醇酮的诱导条件下检测如上所述的红串红球菌SQ1(野生型)和红串红球菌RG10(kstR突变株)的细胞培养物。4-雄烯-3，17-二酮(AD)诱导作为阳性对照。
从诱导培养物，如上指出制备无细胞抽提物并使用DCPIP作为电子受体和AD作为底物检测KSTD活性。发现除雌酮(estron)之外，所有检测的甾族化合物都能够诱导红串红球菌SQ1中的KSTD活性。对于所有检测的甾族化合物，该活性水平不相同。天然凝胶上对照证实KSTD1活性确认在所有阳性例子中诱导。
此外，调查了KSTD1是否在红串红球菌RG10中组成型表达。从AD诱导的细胞培养物和从非诱导的细胞培养物制备无细胞抽提物。使用DCPIP作为电子受体和AD作为底物检测这些提取物的KSTD活性。为了比较，用红串红球菌SQ1实施相同程序。
发现在红串红球菌RG10的诱导以及非诱导培养物中，存在KSTD活性。另一方面，在红串红球菌SQ1中，仅仅在AD诱导的培养物中检测到KSTD活性。天然凝胶上对照证实KSTD1活性确实在所有阳性例子中诱导。
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 0-1-1
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 1 以下指出说明书中涉及的保藏微生物或其它生物材料页行 108-9
 1-1
 1-2
 1-3 保藏鉴定保藏机构名称保藏机构地址保藏日期保藏号 德意志微生物保藏中心Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，德国2002年10月9日(09.10.2002)DSMZ 15231
 1-3-1
 1-3-2
 1-3-3
 1-3-4
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                   序列表
<110>Akzo Nobel N.V.
<120>来自红球菌属的新表达系统
<130>
<140>
<141>
<160>13
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>1543
<212>DNA
<213>红串红球菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1533)
<400>1
atg cag gac tgg acc agc gag tgc gac gtg ttg gta gtc ggc tcc ggc    48
Met Gln Asp Trp Thr Ser Glu Cys Asp Val Leu Val Val Gly Ser Gly
  1               5                  10                  15
ggc gga gcg ctg acc ggc gca tat acc gcc gct gct cag gga ttg acg    96
Gly Gly Ala Leu Thr Gly Ala Tyr Thr Ala Ala Ala Gln Gly Leu Thr
             20                  25                  30
acg atc gtc ctc gag aaa acc gat cgt ttc ggc ggg acc tcc gcc tac    144
Thr Ile Val Leu Glu Lys Thr Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ser Ala Tyr
         35                  40                  45
tcg ggc gcc tcg atc tgg ctc cca ggt acc cag gtg cag gaa cgc gcc    192
Ser Gly Ala Ser Ile Trp Leu Pro Gly Thr Gln Val Gln Glu Arg Ala
     50                  55                  60
gga ctt ccc gac tcg acc gag aat gcc cgc acc tat ctg cgc gcg ttg    240
Gly Leu Pro Asp Ser Thr Glu Asn Ala Arg Thr Tyr Leu Arg Ala Leu
 65                  70                  75                  80
ctc ggt gac gcc gag tcc gag cgc cag gac gcc tac gtc gag acc gct    288
Leu Gly Asp Ala Glu Ser Glu Arg Gln Asp Ala Tyr Val Glu Thr Ala
                 85                  90                  95
ccc gct gtc gtc gct cta ctc gag cag aac ccg aac atc gaa ttc gag    336
Pro Ala Val Val Ala Leu Leu Glu Gln Asn Pro Asn Ile Glu Phe Glu
        100                     105                 110
ttc cgt gcg ttc ccc gac tac tac aaa gcc gaa ggc cgg atg gac acg    384
Phe Arg Ala Phe Pro Asp Tyr Tyr Lys Ala Glu Gly Arg Met Asp Thr
    115                     120                 125
gga cgc tcc atc aac cct ctc gat ctc gat ccc gcc gac atc ggt gac    432
Gly Arg Ser Ile Asn Pro Leu Asp Leu Asp Pro Ala Asp Ile Gly Asp
    130                 135                 140
ctc gco ggc aag gtg cgt ccg gaa ctg gac caa gac cgc acc ggt cag    480
Leu Ala Gly Lys Val Arg Pro Glu Leu Asp Gln Asp Arg Thr Gly Gln
145                 150                 155             160
gat cat gct ccc ggc ccg atg atc ggt ggg cgc gca ctg atc ggc cgt    528
Asp His Ala Pro Gly Pro Met Ile Gly Gly Arg Ala Leu Ile Gly Arg
                165                 170                 175
ctg ctg gcc gca gtt cag agc acc ggt aag gca gaa ctt cgc acc gaa    576
Leu Leu Ala Ala Val Gln Ser Thr Gly Lys Ala Glu Leu Arg Thr Glu
            180                 185                 190
tcc gtc ctc acc tcc ctg atc gtg gaa gac ggc cgt gtt gtc ggc gcc    624
Ser Val Leu Thr Ser Leu Ile Val Glu Asp Gly Arg Val Val Gly Ala
        195                 200                 205
gag gtc gaa tcc ggc ggc gaa acc cag cga atc aag gcg aac cgc ggt    672
Glu Val Glu Ser Gly Gly Glu Thr Gln Arg Ile Lys Ala Asn Arg Gly
    210                 215                 220
gtc ctg atg gca gca ggc ggc atc gaa ggc aac gcc gag atg cgt gag    720
Val Leu Met Ala Ala Gly Gly Ile Glu Gly Asn Ala Glu Met Arg Glu
225                 230                 235                 240
cag gca ggc acc ccc ggc aag gcg atc tgg agt atg ggt ccc ttc ggc    768
Gln Ala Gly Thr Pro Gly Lys Ala Ile Trp Ser Met Gly Pro Phe Gly
                245                 250                 255
gcc aac acc ggc gac gcg atc tct gcc ggt att gct gtc ggc ggc gca    816
Ala Asn Thr Gly Asp Ala Ile Ser Ala Gly Ile Ala Val Gly Gly Ala
            260                 265                 270
aca gcc ttg ctc gat cag gcg tgg ttc tgc ccc ggc gtc gag cag ccc    864
Thr Ala Leu Leu Asp Gln Ala Trp Phe Cys Pro Gly Val Glu Gln Pro
        275                 280                 285
gac ggc agc gcc gcc ttc atg gtc ggc gtt cgc ggt ggg ctc gtc gtc    912
Asp Gly Ser Ala Ala Phe Met Val Gly Val Arg Gly Gly Leu Val Val
    290                 295                 300
gac agc gcc ggt gag cgc tac ctc aac gag tcg ctt ccg tac gac cag    960
Asp Ser Ala Gly Glu Arg Tyr Leu Asn Glu Ser Leu Pro Tyr Asp Gln
305                 310                 315                 320
ttc gga cga gcc atg gat gct cac gac gac aac ggt tct gcc gtg ccg    1008
Phe Gly Arg Ala Met Asp Ala His Asp Asp Asn Gly Ser Ala Val Pro
                325                 330                 335
tcg ttc atg atc ttc gac tcg cgc gag ggt ggc gga ctg ccc gcc atc    1056
Ser Phe Met Ile Phe Asp Ser Arg Glu Gly Gly Gly Leu Pro Ala Ile
            340                 345                 350
tgc atc ccg aac acg gcg ccc gcc aag cac ctc gaa gcc gga acg tgg    1104
Cys Ile Pro Asn Thr Ala Pro Ala Lys His Leu Glu Ala Gly Thr Trp
        355                 360                 365
gtc ggt gcc gac act ctc gaa gaa ctc gct gcc aag acc gga cta ccg    1152
Val Gly Ala Asp Thr Leu Glu Glu Leu Ala Ala Lys Thr Gly Leu Pro
    370                 375                 380
gcc gac gca ttg cgc agc act gtc gaa aag ttc aac gat gcc gca aaa    1200
Ala Asp Ala Leu Arg Ser Thr Val Glu Lys Phe Asn Asp Ala Ala Lys
385                 390                 395                 400
ctg ggc gtc gac gaa gag ttc cat cgc ggc gaa gac ccg tac gac gcg    1248
Leu Gly Val Asp Glu Glu Phe His Arg Gly Glu Asp Pro Tyr Asp Ala
                405                 410                 415
ttc ttc tgc cca ccc aac ggc ggt gcg aat gcg gca ctg acg gcc atc    1296
Phe Phe Cys Pro Pro Asn Gly Gly Ala Asn Ala Ala Leu Thr Ala Ile
            420                 425                 430
gag aac gga ccg ttc tac gcg gcc cgc atc gtc ctc agt gac ctc ggc    1344
Glu Asn Gly Pro Phe Tyr Ala Ala Arg Ile Val Leu Ser Asp Leu Gly
        435                 440                 445
acc aag ggc gga ttg gtc acc gac gtc aac ggc cga gtc ctg cgt gct    1392
Thr Lys Gly Gly Leu Val Thr Asp Val Asn Gly Arg Val Leu Arg Ala
    450                 455                 460
gac ggc agc gcc atc gac ggc ctg tac gcc gcc ggc aac acg agc gcg    1440
Asp Gly Ser Ala Ile Asp Gly Leu Tyr Ala Ala Gly Asn Thr Ser Ala
465                 470                 475                 480
tca ctg agc ggc cgc ttc tac ccc ggc ccc gga gtt cca ctc ggc acg    1488
Ser Leu Ser Gly Arg Phe Tyr Pro Gly Pro Gly Val Pro Leu Gly Thr
                485                 490                 495
gct atg gtc ttc tcg tac cga gca gct cag gac atg gcg aag taa        1533
Ala Met Val Phe Ser Tyr Arg Ala Ala Gln Asp Met Ala Lys
            500                 505                 510
cgcagttcaa                                                         1543
<210>2
<211>511
<212>PRT
<213>红串红球菌
<400>2
Met Gln Asp Trp Thr Ser Glu cys Asp Val Leu Val Val Gly Ser Gly
  1               5                  10                  15
Gly Gly Ala Leu Thr Gly Ala Tyr Thr Ala Ala Ala Gln Gly Leu Thr
             20                  25                  30
Thr Ile Val Leu Glu Lys Thr Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ser Ala Tyr
         35                  40                  45
Ser Gly Ala Ser Ile Trp Leu Pro Gly Thr Gln Val Gln Glu Arg Ala
     50                  55                  60
Gly Leu Pro Asp Ser Thr Glu Asn Ala Arg Thr Tyr Leu Arg Ala Leu
 65                  70                  75                  80
Leu Gly Asp Ala Glu Ser Glu Arg Gln Asp Ala Tyr Val Glu Thr Ala
                 85                  90                  95
Pro Ala Val Val Ala Leu Leu Glu Gln Asn Pro Asn Ile Glu Phe Glu
            100                 105                 110
Phe Arg Ala Phe Pro Asp Tyr Tyr Lys Ala Glu Gly Arg Met Asp Thr
        115                 120                 125
Gly Arg Ser Ile Asn Pro Leu Asp Leu Asp Pro Ala Asp Ile Gly Asp
    130                 135                 140
Leu Ala Gly Lys Val Arg Pro Glu Leu Asp Gln Asp Arg Thr Gly Gln
145                 150                 155                 160
Asp His Ala Pro Gly Pro Met Ile Gly Gly Arg Ala Leu Ile Gly Arg
                165                 170                 175
Leu Leu Ala Ala Val Gln Ser Thr Gly Lys Ala Glu Leu Arg Thr Glu
            180                 185                 190
Ser Val Leu Thr Ser Leu Ile Val Glu Asp Gly Arg Val Val Gly Ala
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Glu Val Glu Ser Gly Gly Glu Thr Gln Arg Ile Lys Ala Asn Arg Gly
    210                 215                 220
Val Leu Met Ala Ala Gly Gly Ile Glu Gly Asn Ala Glu Met Arg Glu
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Ala Asn Thr Gly Asp Ala Ile Ser Ala Gly Ile Ala Val Gly Gly Ala
            260                 265                 270
Thr Ala Leu Leu Asp Gln Ala Trp Phe Cys Pro Gly Val Glu Gln Pro
        275                 280                 285
Asp Gly Ser Ala Ala Phe Met Val Gly Val Arg Gly Gly Leu Val Val
    290                 295                 300
Asp Ser Ala Gly Glu Arg Tyr Leu Asn Glu Ser Leu Pro Tyr Asp Gln
305                 310                 315                 320
Phe Gly Arg Ala Met Asp Ala His Asp Asp Asn Gly Ser Ala Val Pro
                325                 330                 335
Ser Phe Met Ile Phe Asp Ser Arg Glu Gly Gly Gly Leu Pro Ala Ile
            340                 345                 350
Cys Ile Pro Asn Thr Ala Pro Ala Lys His Leu Glu Ala Gly Thr Trp
        355                 360                 365
Val Gly Ala Asp Thr Leu Glu Glu Leu Ala Ala Lys Thr Gly Leu Pro
    370                 375                 380
Ala Asp Ala Leu Arg Ser Thr Val Glu Lys Phe Asn Asp Ala Ala Lys
385                 390                 395                 400
Leu Gly Val Asp Glu Glu Phe His Arg Gly Glu Asp Pro Tyr Asp Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Cys Pro Pro Asn Gly Gly Ala Asn Ala Ala Leu Thr Ala Ile
            420                 425                 430
Glu Asn Gly Pro Phe Tyr Ala Ala Arg Ile Val Leu Ser Asp Leu Gly
        435                 440                 445
Thr Lys Gly Gly Leu Val Thr Asp Val Asn Gly Arg Val Leu Arg Ala
    450                 455                 460
Asp Gly Ser Ala Ile Asp Gly Leu Tyr Ala Ala Gly Asn Thr Ser Ala
465                 470                 475                 480
Ser Leu Ser Gly Arg Phe Tyr Pro Gly Pro Gly Val Pro Leu Gly Thr
                485                 490                 495
Ala Met Val Phe Ser Tyr Arg Ala Ala Gln Asp Met Ala Lys
            500                 505                 510
<210>3
<211>158
<212>DNA
<213>红串红球菌
<400>3
atcatcgatt atgtgtcccg gccgcgaacg accgcgctaa ttctctcacc tggaccaccc 60
atctcggcat attgcccgct cagtgggacc tggcatggcc ttccagtgcc gtgcggtatt 120
ccgtggacac cccaccctct tggagtaagg acgcaatg    158
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：引物
<400>4
ggcgacgttg ccgagaatt                         19
<210>5
<211>624
<212>DNA
<213>红串红球菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(624)
<400>5
atg ggg gcg acg ttg ccg aga att gcc gag gtc agg gac gct gct gag   48
Met Gly Ala Thr Leu Pro Arg Ile Ala Glu Val Arg Asp Ala Ala Glu
  1               5                  10                  15
ccc agt tcg gac gag cag cgg gcg cgc cat gtg cgg atg ctg gaa gcg   96
Pro Ser Ser Asp Glu Gln Arg Ala Arg His Val Arg Met Leu Glu Ala
             20                  25                  30
gcc gcc gaa ttg ggg acc gag aaa gaa ctc tca cgg gtt cag atg cac   144
Ala Ala Glu Leu Gly Thr Glu Lys Glu Leu Ser Arg Val Gln Met His
         35                  40                  45
gaa gtt gcc aag cgg gca ggc gtg gcc atc ggc act ctc tac cgc tat   192
Glu Val Ala Lys Arg Ala Gly Val Ala Ile Gly Thr Leu Tyr Arg Tyr
     50                  55                  60
ttc cct tcg aag acg cac ctc ttc gtc gct gtg atg gtc gag cag ate   240
Phe Pro Ser Lys Thr His Leu Phe Val Ala Val Met Val Glu Gln Ile
 65                  70                  75                  80
gat cag atc ggc gac agt ttc gcc aag cat cag gtg cag tcg gcc aat   288
Asp Gln Ile Gly Asp Ser Phe Ala Lys His Gln Val Gln Ser Ala Asn
                 85                  90                  95
ccg cag gac gcc gtg tac gag gtc ctg gtg cgc gcg act cgc ggg tta   336
Pro Gln Asp Ala Val Tyr Glu Val Leu Val Arg Ala Thr Arg Gly Leu
            100                 105                 110
ctg cgt cgg ccg gcc ctt tcg act gcg atg ctg cag tcg tcc agt acc   384
Leu Arg Arg Pro Ala Leu Ser Thr Ala Met Leu Gln Ser Ser Ser Thr
        115                 120                 125
gcc aac gtc gcg acg gtg ccg gac gtg ggc aag atc gat cgc ggc ttc   432
Ala Asn Val Ala Thr Val Pro Asp Val Gly Lys Ile Asp Arg Gly Phe
    130                 135                 140
cgg cag atc atc ctc gat gcg gcc ggg atc gag aac ccg acc gag gaa   480
Arg Gln Ile Ile Leu Asp Ala Ala Gly Ile Glu Asn Pro Thr Glu Glu
145                 150                 155             160
gac aac acc ggg ttg cgt ctg ctg atg cag ctg tgg ttc ggg gtc atc   528
Asp Asn Thr Gly Leu Arg Leu Leu Met Gln Leu Trp Phe Gly Val Ile
                165                 170                 175
caa tcg tgc ctc aac ggt cga att tcc atc ccg gat gcg gag tac gac    576
Gln Ser Cys Leu Asn Gly Arg Ile Ser Ile Pro Asp Ala Glu Tyr Asp
            180                 185                 190
atc cgc aag ggg tgc gac ctg ctt ctg gtg aat ctc tca cga cac tga    624
Ile Arg Lys Gly Cys Asp Leu Leu Leu Val Asn Leu Ser Arg His
        195                 200                 205
<210>6
<211>208
<212>PRT
<213>红串红球菌
<400>6
Met Gly Ala Thr Leu Pro Arg Ile Ala Glu Val Arg Asp Ala Ala Glu
  1               5                  10                  15
Pro Ser Ser Asp Glu Gln Arg Ala Arg His Val Arg Met Leu Glu Ala
             20                  25                   30
Ala Ala Glu Leu Gly Thr Glu Lys Glu Leu Ser Arg Val Gln Met His
         35                  40                  45
Glu Val Ala Lys Arg Ala Gly Val Ala Ile Gly Thr Leu Tyr Arg Tyr
     50                  55                  60
Phe Pro Ser Lys Thr His Leu Phe Val Ala Val Met Val Glu Gln Ile
 65                  70                  75                  80
Asp Gln Ile Gly Asp Ser Phe Ala Lys His Gln Val Gln Ser Ala Asn
                 85                  90                  95
Pro Gln Asp Ala Val Tyr Glu Val Leu Val Arg Ala Thr Arg Gly Leu
            100                 105                 110
Leu Arg Arg Pro Ala Leu Ser Thr Ala Met Leu Gln Ser Ser Ser Thr
        115                 120                 125
Ala Asn Val Ala Thr Val Pro Asp Val Gly Lys Ile Asp Arg Gly Phe
    130                 135                 140
Arg Gln Ile Ile Leu Asp Ala Ala Gly Ile Glu Asn Pro Thr Glu Glu
145                 150                 155                 160
Asp Asn Thr Gly Leu Arg Leu Leu Met Gln Leu Trp Phe Gly Val Ile
                165                 170                 175
Gln Ser Cys Leu Asn Gly Arg Ile Ser Ile Pro Asp Ala Glu Tyr Asp
            180                 185                 190
Ile Arg Lys Gly Cys Asp Leu Leu Leu Val Asn Leu Ser Arg His
        195                 200                 205
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：引物
<400>7
tcagtgtcgt gagagattca                                           20
<210>8
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：引物
<400>8
ataaagctta tcgattatgt gtcccggccg cgaac                          35
<210>9
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：引物
<400>9
ataggtacca tatgtgcgtc cttactccaa gaggg                          35
<210>10
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：引物
<400>10
gcgcatatgg ctaagaatca g gcaccc                                  27
<210>11
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：引物
<400>11
gcgggatccc tacttctctg ctgcgtgatg                                30
<210>12
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：引物
<400>12
ggccatatgt tgaccacaga cgtgacgacc                                30
<210>13
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：引物
<400>13
gccactagtt cactgcgctg ctcctgcacg                                30

Claims (22)

1.包含来自红球菌属(Rhodococcus)的启动子的分离的多核苷酸，其特征在于所述启动子是kstD启动子。
2.根据权利要求1的多核苷酸，其中所述红球菌属是红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)。
3.根据权利要求1或2的多核苷酸，其特征在于它包含来自SEQID NO：3的序列的核苷酸1-158或其功能部分。
4.根据权利要求1-3的多核苷酸，进一步包含编码所述启动子的转录调节子的核苷酸序列。
5.根据权利要求4的多核苷酸，其中所述核苷酸序列的表达由甾族化合物控制。
6.根据权利要求5的多核苷酸，其中所述调节子包含kstR基因或其同系物或功能部分。
7.根据前述任一项权利要求的多核苷酸，进一步包含与所述启动子可操作连接的编码多肽的核苷酸序列。
8.根据前述任一项权利要求的多核苷酸，进一步包含选择性标记、反选择性标记和/或报道基因。
9.根据前述任一项权利要求的多核苷酸，进一步包含信号序列。
10.包含根据权利要求1-9任一项的多核苷酸的重组载体。
11.根据权利要求10的重组载体，进一步包含具有多克隆位点的核苷酸序列。
12.用根据权利要求10或11的重组载体转化的宿主细胞。
13.根据权利要求12的宿主细胞，其中所述宿主细胞是来自放线菌目(Actinomycetales)的细菌。
14.根据权利要求13的细菌宿主细胞，其中所述宿主细胞选自属于放线菌科(Actinomycetaceae)、棒状杆菌科(Corynebacterineae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)或微球菌科(Micrococcaceae)的细菌。
15.根据权利要求13的细菌宿主细胞，其中所述宿主细胞选自属于红球菌属的细菌。
16.根据权利要求13的细菌宿主细胞，其中所述宿主细胞是保藏在德意志微生物保藏中心的保藏号为DSM15231的红串红球菌RG10。
17.根据权利要求12-16任一项的宿主细胞，其不含有功能性kstR基因或其同系物或功能部分。
18.在宿主细胞中产生目的蛋白的方法，包含用权利要求10或11的重组载体转化宿主细胞。
19.包含根据权利要求1-9任一项的多核苷酸的微生物表达系统。
20.目的蛋白的组成型表达的方法，包括用多核苷酸构建体转化根据权利要求17的宿主细胞，其中所述蛋白编码区的表达在kstD启动子控制下。
21.甾族化合物诱导异源蛋白表达的用途，其表达在kstD启动子控制下，所述甾族化合物取消由kstR基因产物发挥的阻抑蛋白功能。
22.鉴定调节kstD启动子活性的化合物的方法，包括将根据权利要求12-17任一项的宿主细胞暴露于至少一种待确定其调节kstD启动子活性的能力的化合物，和监测所述细胞调节kstD启动子的活性。
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