CN1219883C - 改造合成的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因CrylC* - Google Patents
改造合成的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因CrylC* Download PDFInfo
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Abstract
一个改造合成的编码苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的基因CrylC*。其特征在于：通过系列方法，设计并合成一个苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因CrylC*；与原CrylCa5基因的5′端1890个核苷酸的序列比较，该基因编码蛋白的氨基酸组成不变，植物偏爱性密码子的使用频率如图2所示，消除了原始基因中的富含AT序列和存在的反向重复序列以及不明确的真核基因内含子序列，C+G含量为44.64%，与原始序列的同源性为84.0%，编码序列的5′端添加有引导序列(SEQ ID NO：3)和3′端添加加尾识别信号序列(SEQ ID NO：4)。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，属于对苏云金芽孢杆菌(Bt)杀虫晶体蛋白(ICP)基因的一种创新。具体涉及到：部分改变原始基因的密码子组成，保留原基因中编码杀虫晶体蛋白的N端毒性区的DNA序列，部分去除原基因中编码C端的DNA序列，在5’端添加提高基因表达效率的引导序列和在3’端添加加尾识别序列，改造合成用于转基因植物中高效表达的杀虫基因Cry1C*。
背景技术
虫害是造成农业生产损失的一个重要因素。据统计，虫害每年给农业生产造成的直接经济损失高达13％。
化学杀虫剂曾对防治虫害、稳定农业生产做出过重要贡献。随着人们对化学杀虫剂环境危害的认识、环保意识的日益加强，对环境安全的生物杀虫剂已成为研究的热点。在生物杀虫剂中，目前研究最清楚、应用最成功的是一类Bt制剂。Bt制剂的有效成分是Bt杀虫晶体蛋白(ICP)。Bt杀虫晶体蛋白(ICP)是苏云金芽孢杆菌在芽孢形成过程中产生的。但生产上也发现，Bt制剂存在着不稳定的问题，一方面在田间易被雨水冲刷流失，药效短；另一方面，因为Bt杀虫剂的活性成份是蛋白质，在阳光中紫外线的照射下易被分解而失效。植物转基因的成功为Bt杀虫晶体蛋白的应用提供了一条崭新途径。
Bt杀虫晶体蛋白(ICP)是由Bt基因编码产生。许多ICP的氨基酸序列存在不同程度的同源性。1989年，Hfte和Whiteley(Hfte H and Whiteley HR，Microbio.Rev.，53：241-255)根据ICP的杀虫谱及氨基酸序列的同源性将当时发现的大约42个基因分为五大类、15个亚类。其中前四类为晶体蛋白的基因家族(Cry)，第五类被称为细胞溶解蛋白基因(Cyt)。CryI基因编码对鳞翅目昆虫有毒性的CryI蛋白，CryII基因编码对鳞翅目和双翅目昆虫有毒性的CryII蛋白，CryIII基因编码对鞘翅目昆虫有毒性的CryIII蛋白，CryIV基因编码对双翅目昆虫有毒性的CryIV蛋白。由于新的杀虫基因的不断分离鉴定，根据Hfte和Whiteley的双重分类方法，1992年，Feitelson等(Feitelson et al.，Bio/Technology，10：271-275，1992)对原有的分类进行了补充，将Bt基因分为7大类，29亚类。除原来的5大类，新增加了CryV和CryVI两大类。随着新Bt基因数量的不断增加，人们发现原有的分类方法存在氨基酸同源性与杀虫特异性相互矛盾的问题。因此，在1995年无脊椎病理学会年会上专门成立了由Crickmore等人组成的Bt基因命名委员会，提出了以杀虫蛋白氨基酸序列同源性为唯一标准的分类命名体系，将Bt基因分为17大类、36亚类(Crickmore et al，1995)，1996年增补为21大类、44亚类；至2002年8月2日，Bt基因达到42大类、110亚类，总计200多个Bt基因序列。
典型的ICP由两部分组成，N端的活性片段和C端的结构片段，带有结构片段的ICP被称为原毒素。它经过蛋白酶的消化作用后，产生有活性的毒性肽。最近有人指出，在N端的活性片段又分为毒性区和细胞结合区。当Bt杀虫晶体蛋白被靶昆虫取食后，经溶解和酶解两个步骤产生活性毒素分子，释放出的活性毒素可穿过昆虫中肠道滋养层细胞空隙直接与消化道上皮细胞作用。细胞结合区与昆虫中肠道上皮细胞的受体特异结合后，毒性区直接作用于细胞膜，使细胞膜穿孔，破坏细胞的渗透平衡，最后引起细胞的裂解。
1987年，Vaeck等(Vaeck et al.，Nature，328：33-37，1987)、Barton等(Barton et al.，PlantPhysiol.85：1103-1109，1987)、Fischoff等(fischoff et al.，Bio/Technology，5：807-813，1987)获得了转Bt基因植物。但他们获得的这些早期的转Bt基因植株的抗虫性都很弱，难以检测出mRNA的转录，蛋白质表达量很低。造成Bt基因在植物中表达量低的原因有许多：例如，1、野生Bt基因中富含AT序列，在植物中表达的mRNA不稳定；2、野生Bt基因中可能存在真核基因的内含子切割位点、转录终止信号序列，造成转录本不完整或转录本的异常加工；3、微生物与植物在翻译中对密码子的使用频率上有很大差异，使翻译效率降低；4、真核基因的5’-UTR序列与原核基因有很大的不同，以及真核基因的3’端需要加尾识别信号序列。因此，要使得Bt基因在转基因植物中高效表达，必须对野生Bt基因进行有效的改造。
1990年，Adang等(Adang et al，EP0359472，1990)通过调整野生基因的A+T含量和密码子的使用频率，使其与双子叶植物基因保持一致，去除了影响基因在植物中表达的AATGAA，合成了一个新Btt基因：新基因与原基因的同源性为85％，A+T含量下降到正常植物基因的水平(55％)。利用改造的基因转化植物，Bt蛋白的表达量得到提高。
1991年，Perlak等(Perlak et al，PNAS USA，7164 88：3324-3328 1991)在不改变晶体蛋白氨基酸序列的情况下，对CrylAb基因进行了部分改造或通过人工合成进行完全改造，选用植物偏爱的密码子，部分去除了原序列中干扰基因在植物中表达的元件，如ATTTA序列，获得了PM和FM基因；结果，转PM和FM基因植物的目标蛋白表达量获得提高。
1992年，郭三堆等人(郭三堆等，中国发明专利申请号：95119563.8)通过双链合成DNA方法，人工合成了全长1824bp的Cry1Ab和Cry1Ac融合的GFM杀虫基因，结果Bt毒蛋白在植物中的表达量大幅度提高，全合成基因比原基因的表达量提高了约100倍。之后，许多科学工作者对Bt杀虫基因进行了大量的改造研究，并利用改造的Bt杀虫基因做了大量的植物转化工作，为培育Bt抗虫植物打下了基础。据不完全统计，至今已有部分改良或人工合成的Bt基因(用于转基因植物)专利四十多项。
典型的CryI基因的编码杀虫晶体蛋白约130kD，而目前改造合成的大多数CryI基因为部分去除编码杀虫晶体蛋白C端的DNA序列的切短基因。以上列举的三个实例均为切短编码序列的基因改造。对已经发表的改造Cry1基因的序列分析可以看出，保留原始基因5’端编码约70kB蛋白的DNA序列就能满足植物转基因的需要。
发明内容
本发明的目的在于人工改造合成新的Cry1C*基因(DNA)序列。
本发明通过以下方案实现：
一种被命名为Cry1C*的苏云金芽孢杆菌(Bt)DNA序列，它具有核苷酸编码序列表SEQID NO：1所示的序列。还具有如序列表SEQ ID NO：2所示的5’端非编码的引导序列和序列表SEQ ID NO：3所示的3’端的加尾识别的序列。
所述的的编码核苷酸序列SEQ ID NO：1的C+G含量为44.62％，与原始DNA序列的同源性为84.0％。
所述的DNA序列的密码子组成如图1所示。
所述的DNA序列，包括该DNA序列在植物细胞中的表达，更进一步的在植物转基因抗虫育种上的应用。
具体步骤包括：
(1)以Cry1Ca5为蓝本，除去3’端编码128个氨基酸的384个核苷酸，得到5’端编码630个氨基酸的含1890个核苷酸的序列。
(2)根据植物对密码子使用的偏爱性，在保持氨基酸组成不变的情况下，用植物基因高频使用密码子部分置换1890个核苷酸的序列的密码子，初步获得一个改造的DNA序列。
(3)排除DNA序列中存在的典型的造成植物基因转录本不稳定的富含AT序列以及常用限制性内切酶位点，然后通过置换密码子的方法进行改正。
(4)用改进的编码序列的正链和对应的负链进行Blast2分析，通过置换密码子的方法排除基因内存在大的反向重复序列。
(5)确定Cry1C*基因如序列表SEQ ID NO：1所示的编码序列。
(6)在确定的Cry1C*基因的编码序列的5’端添加如序列表SEQ IDNO：2所示的序列，在3’端添加如序列表SEQ ID NO：3所示的序列。
(7)在序列两端加上进一步克隆需要的限制性内切酶识别位点序列。最终确定Cry1C*基因如序列表SEQ ID NO：4所示的序列。
(8)化学合成如序列表SEQ ID NO：4所示的序列。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是设计的Cry1C*的编码序列
序列表SEQ ID NO：2是Cry1C*的5’端引导序列：
序列表SEQ ID NO：3是Cry1C*的3’端加尾识别信号和转录终止序列：
序列表SEQ ID NO：4是合成的Cry1C*基因序列
图1：是本发明涉及的植物基因密码子使用频率的比较分析；
图2：本发明的Cry1C*与原Cry1Ca5的5’端1890个核苷酸的序列的密码子特征比较。
具体实施方式
实施例1植物基因密码子偏爱性分析
从Genbank中取984条植物基因编码序列及20条高度表达的植物核糖体蛋白基因编码序列，分别统计密码子使用频率处理如图1。从中可以看出，植物基因的密码子的第三位摇摆碱基偏爱使用G或C。
实施例2：Cry1C*编码序列与原Cry1Ca5的5’端1890个核苷酸的序列的密码子特征比较
从Genbank中查找Cry1Ca序列，共获得6条，分别为Cry1Ca1、Cry1Ca2、Cry1Ca3、Cry1Ca4、Cry1Ca5和Cry1Ca6。从中选择序列最短的Cry1Ca5，部分去除其3’端编码序列，保留5’端编码630个氨基酸的1890个核苷酸的序列。依据表1统计结果，采用植物基因高频使用密码子部分置换1890个核苷酸的序列的对应密码子，部分去除其中的ATTTA、AATGAA等富含AT序列和不明确的内含子序列，以及排除基因中存在的大的反向重复序列和常用限制性内切酶识别位点序列；设计出目标合成的Cry1C*基因的编码序列如序列表SEQID NO：1所示。目标合成的Cry1C*基因的密码子特征如图2所示。
实施例3合成的Cry1C*的编码序列特征分析
将原Cry1Ca5的1890个核苷酸的序列与合成的Cry1C*编码序列进行Blast2分析，两条序列的同源性为84.0％。碱基组成的统计结果为：原始基因的C+G％为36.55％，新合成基因的C+G％为44.62％。编码的氨基酸序列的Blast2分析显示，两者编码的氨基酸序列完全一致。
实施例4提高基因转录本在植物细胞中的稳定性和表达效率的末端序列的添加
通过对植物基因的5’端引导序列的结构分析，设计序列2，该序列如序列表序列表SEQID NO：2所示，并加在Cry1C*基因编码序列的5’端。另设计的序列如序列表SEQ ID NO：3所示，该序列添加在Cry1C*基因编码序列的3’端。
实施例5进一步克隆的限制性内切酶识别位点序列的添加
根据基因进一步克隆的需要，在设计序列的5’端添加BamH I内切酶识别位点序列ggatcc，3’端添加Sac I、BamH I和Hind III内切酶识别位点序列gagctcggatccaagctt。
实施例6Cry1C*基因的合成
通过以上步骤，设计出改造合成的Cry1C*基因序列如序列表序列表SEQ ID NO：4所示。然后通过化学合成该基因，装载在质粒载体pUC18上。
实施例7合成基因在大肠杆菌细胞中表达和表达产物的毒性检测
将合成的Cry1C*基因构建到大肠杆菌质粒表达载体pGEX-KG，转化大肠杆菌DH10B；接种单菌落至20mL LB培养基培养4小时，加入IPTG诱导表达试剂，继续培养2-3小时；然后离心收集菌体，加入20mL无菌水重悬；液氮反复冻溶6次，离心去菌体，上清液喂食鳞翅目昆虫菜青虫和二化螟；毒性鉴定结果见表3和表4：
表3合成基因表达产物对菜青虫的毒性鉴定
| 一、喂食24小时的统计结果 | 处理(三次重复) | 试虫数(只) | 平均死亡率(％) | 校正死亡率(％) |
| 清水 | 18 | 5.56 | ||
| 空白载体 | 18 | 11.11 | 5.88 | |
| Cry1C* | 18 | 22.22 | 17.64 | |
| 二、喂食48小时的统计结果 | 处理(三次重复) | 试虫数(只) | 平均死亡率(％) | 校正死亡率(％) |
| 清水 | 18 | 5.56 | ||
| 空白载体 | 18 | 22.22 | 17.64 | |
| Cry1C* | 18 | 66.67 | 64.71 |
表4合成基因表达产物对二化螟的毒性鉴定
| 一、喂食48小时的统计结果 | 处理(三次重复) | 试虫数(只) | 平均死亡率(％) | 校正死亡率(％) |
| 清水 | 30 | 0 | 0 | |
| 空白载体 | 30 | 10.0 | 10.0 | |
| Cry1C* | 30 | 36.67 | 36.67 | |
| 二、喂食72小时的统计结果 | 处理(三次重复) | 试虫数(只) | 平均死亡率(％) | 校正死亡率(％) |
| 清水 | 30 | 0 | 0 | |
| 空白载体 | 30 | 16.67 | 16.67 | |
| Cry1C* | 30 | 80.0 | 78.57 |
SEQUENCE LISTING
<110>华中农业大学
<120>改造合成的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因Cry1C*
<130>
<140>02139018.9
<141>2002-09-20
<160>5
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1896
<212>DNA
<213>苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1896)
<223>
<400>1
atg gag gag aac aat cag aac cag tgt atc cct tac aat tgt ctt tct 48
Met Glu Glu Asn Asn Gln Asn Gln Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu Ser
1 5 10 15
aat cct gaa gaa gtt ctt ttg gat gga gaa agg atc tca act ggt aac 96
Asn Pro Glu Glu Val Leu Leu Asp Gly Glu Arg Ile Ser Thr Gly Asn
20 25 30
tca tca att gac atc tct ctc tca ctt gtt cag ttc ttg gtt tct aac 144
Ser Ser Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Val Gln Phe Leu Val Ser Asn
35 40 45
ttt gtg cca gga gga gga ttc ctt gtt gga ctt atc gac ttc gtt tgg 192
Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Leu Val Gly Leu Ile Asp Phe Val Trp
50 55 60
gga atc gtt gga cct tct caa tgg gat gca ttt ctc gtt cag atc gaa 240
Gly Ile Val Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile Glu
65 70 75 80
cag ctc atc aac gaa aga atc gct gag ttc gct agg aat gct gct att 288
Gln Leu Ile Asn Glu Arg Ile Ala Glu Phe Ala Arg Asn Ala Ala Ile
85 90 95
gct aac ctt gaa gga ctt gga aac aac ttc aac atc tac gtg gag gca 336
Ala Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Asn Phe Asn Ile Tyr Val Glu Ala
100 105 110
ttc aag gaa tgg gaa gaa gat cct aac aac cca gca acc agg acc aga 384
Phe Lys Glu Trp Glu Glu Asp Pro Asn Asn Pro Ala Thr Arg Thr Arg
115 120 125
gtg atc gat agg ttc cgt atc ctt gat gga ctt ctt gaa agg gac att 432
Val Ile Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu Leu Glu Arg Asp Ile
130 135 140
cct agc ttt agg atc tct gga ttt gaa gtt cca ctt ctc tct gtt tac 480
Pro Ser Phe Arg Ile Ser Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr
145 150 155 160
gct caa gct gct aat ctc cat ctt gct atc ctt aga gat tct gtg atc 528
Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ala Ile Leu Arg Asp Ser Val Ile
165 170 175
ttc gga gaa aga tgg gga ttg aca acc atc aac gtg aac gag aac tac 576
Phe Gly Glu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Ile Asn Val Asn Glu Asn Tyr
180 185 190
aac aga ctc atc agg cac atc gat gag tac gct gat cac tgt gct aac 624
Asn Arg Leu Ile Arg His Ile Asp Glu Tyr Ala Asp His Cys Ala Asn
195 200 205
act tac aac cgt gga ctc aac aac ctt cct aag tct acc tat caa gat 672
Thr Tyr Asn Arg Gly Leu Asn Asn Leu Pro Lys Ser Thr Tyr Gln Asp
210 215 220
tgg atc aca tac aac cga ctt agg aga gac ctt aca ttg act gtt ctt 720
Trp Ile Thr Tyr Asn Arg Leu Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val Leu
225 230 235 240
gat atc gct gct ttc ttt cca aac tat gac aat agg aga tat cca att 768
Asp Ile Ala Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Asn Arg Arg Tyr Pro Ile
245 250 255
cag cca gtt ggt caa ctt aca agg gaa gtt tac act gac cca ctc atc 816
Gln Pro Val Gly Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu Ile
260 265 270
aac ttc aac cca cag ctt cag tct gtt gct cag ctt cct acc ttc aac 864
Asn Phe Asn Pro Gln Leu Gln Ser Val Ala Gln Leu Pro Thr Phe Asn
275 280 285
gtt atg gag agc agc gca atc aga aat cct cac ctc ttc gac atc ttg 912
Val Met Glu Ser Ser Ala Ile Arg Asn Pro His Leu Phe Asp Ile Leu
290 295 300
aac aac ctt aca atc ttt acc gat tgg ttt agt gtt gga cgt aac ttc 960
Asn Asn Leu Thr Ile Phe Thr Asp Trp Phe Ser Val Gly Arg Asn Phe
305 310 315 320
tac tgg gga gga cat cga gtg atc tct agc ctc atc gga ggt ggt aac 1008
Tyr Trp Gly Gly His Arg Val Ile Ser Ser Leu Ile Gly Gly Gly Asn
325 330 335
atc aca tct cct atc tac gga aga gag gct aac cag gag cct cca aga 1056
Ile Thr Ser Pro Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asn Gln Glu Pro Pro Arg
340 345 350
tca ttc act ttc aac gga cct gtg ttc agg act ctt tca aat cct act 1104
Ser Phe Thr Phe Asn Gly Pro Val Phe Arg Thr Leu Ser Asn Pro Thr
355 360 365
ctt cga ctt ctt cag caa cct tgg cca gct cca cca ttc aac ctt cgt 1152
Leu Arg Leu Leu Gln Gln Pro Trp Pro Ala Pro Pro Phe Asn Leu Arg
370 375 380
ggt gtt gaa gga gtt gag ttc tct aca cct aca aac agc ttc acc tat 1200
Gly Val Glu Gly Val Glu Phe Ser Thr Pro Thr Asn Ser Phe Thr Tyr
385 390 395 400
cgt gga aga ggt act gtt gat tct ctt act gaa ctt cca cct gag gac 1248
Arg Gly Arg Gly Thr Val Asp Ser Leu Thr Glu Leu Pro Pro Glu Asp
405 410 415
aac agt gtg cca cct cgt gaa gga tac agt cat cgt ctt tgt cat gca 1296
Asn Ser Val Pro Pro Arg Glu Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ala
420 425 430
acc ttc gtt caa aga tct gga aca cct ttc ctt aca act ggt gtt gtg 1344
Thr Phe Val Gln Arg Ser Gly Thr Pro Phe Leu Thr Thr Gly Val Val
435 440 445
ttc tct tgg act cat cgt agt gca act ctt acc aac aca att gat cca 1392
Phe Ser Trp Thr His Arg Ser Ala Thr Leu Thr Asn Thr Ile Asp Pro
450 455 460
gag agg atc aac cag atc cct ctt gtg aaa gga ttc aga gtt tgg gga 1440
Glu Arg Ile Asn Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe Arg Val Trp Gly
465 470 475 480
gga acc tct gtg att aca gga cca gga ttc aca gga ggt gat atc ctt 1488
Gly Thr Ser Val Ile Thr Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu
485 490 495
cga aga aac acc ttt ggt gac ttc gtt tct ctt caa gtg aac atc aac 1536
Arg Arg Asn Thr Phe Gly Asp Phe Val Ser Leu Gln Val Asn Ile Asn
500 505 510
tca cca atc acc caa aga tac cgt ctt aga ttt cgt tac gct tct agt 1584
Ser Pro Ile Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Ser
515 520 525
agg gat gca cga gtt atc gtt ctt aca gga gct gca tct aca gga gtg 1632
Arg Asp Ala Arg Val Ile Val Leu Thr Gly Ala Ala Ser Thr Gly Val
530 535 540
gga ggt caa gtt agt gtg aac atg cct ctt cag aaa act atg gag atc 1680
Gly Gly Gln Val Ser Val Asn Met Pro Leu Gln Lys Thr Met Glu Ile
545 550 555 560
gga gag aac ctc aca tct aga aca ttc aga tac acc gac ttc agt aat 1728
Gly Glu Asn Leu Thr Ser Arg Thr Phe Arg Tyr Thr Asp Phe Ser Asn
565 570 575
cct ttc tca ttc aga gct aat cca gac atc atc ggt atc agt gaa caa 1776
Pro Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile Ile Gly Ile Ser Glu Gln
580 585 590
cct ctc ttc ggt gca ggt tct atc agt agc ggt gaa ctt tac atc gac 1824
Pro Leu Phe Gly Ala Gly Ser Ile Ser Ser Gly Glu Leu Tyr Ile Asp
595 600 605
aag atc gag atc atc ctt gca gat gca aca ttt gaa gca gaa tct gac 1872
Lys Ile Glu Ile Ile Leu Ala Asp Ala Thr Phe Glu Ala Glu Ser Asp
610 615 620
ctt gaa aga gca caa aag tag tga 1896
Leu Glu Arg Ala Gln Lys
625 630
<210>2
<211>630
<212>PRT
<213>苏云金芽胞杆菌(Bacillus tburingiensis)
<400>2
Met Glu Glu Asn Asn Gln Asn Gln Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Glu Glu Val Leu Leu Asp Gly Glu Arg Ile Ser Thr Gly Asn
20 25 30
Ser Ser Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Val Gln Phe Leu Val Ser Asn
35 40 45
Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Leu Val Gly Leu Ile Asp Phe Val Trp
50 55 60
Gly Ile Val Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile Glu
65 70 75 80
Gln Leu Ile Asn Glu Arg Ile Ala Glu Phe Ala Arg Asn Ala Ala Ile
85 90 95
Ala Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Asn Phe Asn Ile Tyr Val Glu Ala
100 105 110
Phe Lys Glu Trp Glu Glu Asp Pro Asn Asn Pro Ala Thr Arg Thr Arg
115 120 125
Val Ile Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu Leu Glu Arg Asp Ile
130 135 140
Pro Ser Phe Arg Ile Ser Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr
145 150 155 160
Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ala Ile Leu Arg Asp Ser Val Ile
165 170 175
Phe Gly Glu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Ile Asn Val Asn Glu Asn Tyr
180 185 190
Asn Arg Leu Ile Arg His Ile Asp Glu Tyr Ala Asp His Cys Ala Asn
195 200 205
Thr Tyr Asn Arg Gly Leu Asn Asn Leu Pro Lys Ser Thr Tyr Gln Asp
210 215 220
Trp Ile Thr Tyr Asn Arg Leu Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val Leu
225 230 235 240
Asp Ile Ala Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Asn Arg Arg Tyr Pro Ile
245 250 255
Gln Pro Val Gly Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu Ile
260 265 270
Asn Phe Asn Pro Gln Leu Gln Ser Val Ala Gln Leu Pro Thr Phe Asn
275 280 285
Val Met Glu Ser Ser Ala Ile Arg Asn Pro His Leu Phe Asp Ile Leu
290 295 300
Asn Asn Leu Thr Ile Phe Thr Asp Trp Phe Ser Val Gly Arg Asn Phe
305 310 315 320
Tyr Trp Gly Gly His Arg Val Ile Ser Ser Leu Ile Gly Gly Gly Asn
325 330 335
Ile Thr Ser Pro Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asn Gln Glu Pro Pro Arg
340 345 350
Ser Phe Thr Phe Asn Gly Pro Val Phe Arg Thr Leu Ser Asn Pro Thr
355 360 365
Leu Arg Leu Leu Gln Gln Pro Trp Pro Ala Pro Pro Phe Asn Leu Arg
370 375 380
Gly Val Glu Gly Val Glu Phe Ser Thr Pro Thr Asn Ser Phe Thr Tyr
385 390 395 400
Arg Gly Arg Gly Thr Val Asp Ser Leu Thr Glu Leu Pro Pro Glu Asp
405 410 415
Asn Ser Val Pro Pro Arg Glu Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ala
420 425 430
Thr Phe Val Gln Arg Ser Gly Thr Pro Phe Leu Thr Thr Gly Val Val
435 440 445
Phe Ser Trp Thr His Arg Ser Ala Thr Leu Thr Asn Thr Ile Asp Pro
450 455 460
Glu Arg Ile Asn Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe Arg Val Trp Gly
465 470 475 480
Gly Thr Ser Val Ile Thr Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu
485 490 495
Arg Arg Asn Thr Phe Gly Asp Phe Val Ser Leu Gln Val Asn Ile Asn
500 505 510
Ser Pro Ile Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Ser
515 520 525
Arg Asp Ala Arg Val Ile Val Leu Thr Gly Ala Ala Ser Thr Gly Val
530 535 540
Gly Gly Gln Val Ser Val Asn Met Pro Leu Gln Lys Thr Met Glu Ile
545 550 555 560
Gly Glu Asn Leu Thr Ser Arg Thr Phe Arg Tyr Thr Asp Phe Ser Asn
565 570 575
Pro Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile Ile Gly Ile Ser Glu Gln
580 585 590
Pro Leu Phe Gly Ala Gly Ser Ile Ser Ser Gly Glu Leu Tyr Ile Asp
595 600 605
Lys Ile Glu Ile Ile Leu Ala Asp Ala Thr Phe Glu Ala Glu Ser Asp
610 615 620
Leu Glu Arg Ala Gln Lys
625 630
<210>3
<211>100
<212>DNA
<213>苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)
<220>
<221>5′UTR
<222>(1)..(100)
<223>
<400>3
agactcactc tgagcgtcgt cacacgcagc ttgtgcggga tatcatttgc ctgtaaccgg 60
tttccttaaa gcgaaaaccc ccccacccaa aggtaaggct 100
<210>4
<211>315
<212>DNA
<213>苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)
<220>
<221>3′UTR
<222>(1)..(315)
<223>
<400>4
tgacgaattc ccgatctagt aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg 60
cgcgctatat tttgttttct atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa 120
aaacccatct cataaataac gtcatgcacc tgaatagatc ttggacaagc gttaggccta 180
tctgtgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 240
atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 300
cgatcgggga aattc 315
<210>5
<211>2407
<212>DNA
<213>苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(2407)
<223>
<400>5
cggatccaga ctcactctga gcgtcgtcac acgcagcttg tgcgggatat catttgcctg 60
taaccggttt ccttaaagcg aaaacccccc cacccaaagg taaggctatg gaggagaaca 120
atcagaacca gtgtatccct tacaattgtc tttctaatcc tgaagaagtt cttttggatg 180
gagaaaggat ctcaactggt aactcatcaa ttgacatctc tctctcactt gttcagttct 240
tggtttctaa ctttgtgcca ggaggaggat tccttgttgg acttatcgac ttcgtttggg 300
gaatcgttgg accttctcaa tgggatgcat ttctcgttca gatcgaacag ctcatcaacg 360
aaagaatcgc tgagttcgct aggaatgctg ctattgctaa ccttgaagga cttggaaaca 420
acttcaacat ctacgtggag gcattcaagg aatgggaaga agatcctaac aacccagcaa 480
ccaggaccag agtgatcgat aggttccgta tccttgatgg acttcttgaa agggacattc 540
ctagctttag gatctctgga tttgaagttc cacttctctc tgtttacgct caagctgcta 600
atctccatct tgctatcctt agagattctg tgatcttcgg agaaagatgg ggattgacaa 660
ccatcaacgt gaacgagaac tacaacagac tcatcaggca catcgatgag tacgctgatc 720
actgtgctaa cacttacaac cgtggactca acaaccttcc taagtctacc tatcaagatt 780
ggatcacata caaccgactt aggagagacc ttacattgac tgttcttgat atcgctgctt 840
tctttccaaa ctatgacaat aggagatatc caattcagcc agttggtcaa cttacaaggg 900
aagtttacac tgacccactc atcaacttca acccacagct tcagtctgtt gctcagcttc 960
ctaccttcaa cgttatggag agcagcgcaa tcagaaatcc tcacctcttc gacatcttga 1020
acaaccttac aatctttacc gattggttta gtgttggacg taacttctac tggggaggac 1080
atcgagtgat ctctagcctc atcggaggtg gtaacatcac atctcctatc tacggaagag 1140
aggctaacca ggagcctcca agatcattca ctttcaacgg acctgtgttc aggactcttt 1200
caaatcctac tcttcgactt cttcagcaac cttggccagc tccaccattc aaccttcgtg 1260
gtgttgaagg agttgagttc tctacaccta caaacagctt cacctatcgt ggaagaggta 1320
ctgttgattc tcttactgaa cttccacctg aggacaacag tgtgccacct cgtgaaggat 1380
acagtcatcg tctttgtcat gcaaccttcg ttcaaagatc tggaacacct ttccttacaa 1440
ctggtgttgt gttctcttgg actcatcgta gtgcaactct taccaacaca attgatccag 1500
agaggatcaa ccagatccct cttgtgaaag gattcagagt ttggggagga acctctgtga 1560
ttacaggacc aggattcaca ggaggtgata tccttcgaag aaacaccttt ggtgacttcg 1620
tttctcttca agtgaacatc aactcaccaa tcacccaaag ataccgtctt agatttcgtt 1680
acgcttctag tagggatgca cgagttatcg ttcttacagg agctgcatct acaggagtgg 1740
gaggtcaagt tagtgtgaac atgcctcttc agaaaactat ggagatcgga gagaacctca 1800
catctagaac attcagatac accgacttca gtaatccttt ctcattcaga gctaatccag 1860
acatcatcgg tatcagtgaa caacctctct tcggtgcagg ttctatcagt agcggtgaac 1920
tttacatcga caagatcgag atcatccttg cagatgcaac atttgaagca gaatctgacc 1980
ttgaaagagc acaaaagtag tgaccaacgt atttatatca gaaaatagat gagtcgaaat 2040
taaaagctta tacccgttaa tgacaaaaaa taaataaaaa cgaattcccg atctagtaac 2100
atagatgaca ccgcgcgcga taatttatcc tagtttgcgc gctatatttt gttttctatc 2160
gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta atcataaaaa cccatctcat aaataacgtc 2220
atgcacctga atagatcttg gacaagcgtt aggcctatct gtgcattaca tgttaattat 2280
tacatgctta acgtaattca acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg 2340
attcaatctt aagaaacttt attgccaaat gtttgaacga tcggggaaat tcgagctcgg 2400
atcccaa 2407
Claims (5)
1、一种改造合成的被命名为Cry1C*的苏云金芽孢杆菌基因，它具有核苷酸编码序列表SEQ ID NO：1所示的序列，还具有如序列表SEQ ID NO：2所示的5’端非编码的引导序列和序列表SEQ ID NO：3所示的3’端的加尾识别序列。
2、权利要求1所述的一种改造合成的被命名为Cry1C*的苏云金芽孢杆菌基因，其特征在于，编码序列的C+G含量为44.64％，它与原始基因的同源性为84.0％；其密码子组成如图2所示。
3、一种改造合成的被命名为Cry1C*的苏云金芽孢杆菌基因的制备方法，其特征在于，按照下列步骤：
(1)以Cry1Ca5为蓝本，除去3’端编码128个氨基酸的384个核苷酸，得到5’端编码630个氨基酸的含1890个核苷酸的序列；
(2)根据植物对密码子使用的偏爱性，在保持氨基酸组成不变的情况下，用植物基因高频使用密码子部分置换1890个核苷酸的序列的密码子，初步获得一个改造的DNA序列；
(3)排除DNA序列中存在的典型的造成植物基因转录本不稳定的富含AT序列以及常用限制性内切酶位点，然后通过置换密码子的方法进行改正；
(4)用改进的编码序列的正链和对应的负链进行Blast2分析，通过置换密码子的方法排除基因内存在大的反向重复序列；
(5)确定Cry1C*基因如序列表SEQ ID NO：1所示的编码序列。
(6)在确定的Cry1C*基因的编码序列的5’端添加如序列表SEQ ID NO：2所示的序列，在3’端添加如序列表SEQ ID NO：3所示的序列；
(7)在序列两端加上进一步克隆需要的限制性内切酶识别位点序列，最终确定Cry1C*基因如序列表SEQ ID NO：4所示的序列；
(8)化学合成如序列表SEQ ID NO：4所示的序列。
4、权利要求1-2任一项所述的一种改造合成的被命名为Cry1C*的苏云金芽孢杆菌基因在转基因植物中的应用。
5、权利要求1-2任一项所述的一种改造合成的被命名为Cry1C*的苏云金芽孢杆菌基因在植物转基因抗虫育种中的应用。
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